KR20160036045A

KR20160036045A - 프로테아제 저항성 펩타이드 리간드

Info

Publication number: KR20160036045A
Application number: KR1020167003397A
Authority: KR
Inventors: 스테파노 메네가티; 벤자민 쥐. 보베이; 루벤 쥐. 카보넬
Original assignee: 노쓰 캐롤라이나 스테이트 유니버시티
Priority date: 2013-07-15
Filing date: 2014-07-15
Publication date: 2016-04-01
Also published as: RU2016104651A; ZA201600449B; PH12016500101A1; CA2918221A1; SG11201600272WA; US20160159859A1; US10266566B2; MX2016000666A; EP3022220A4; EP3022220A1; WO2015009701A1; JP2016527231A; AU2014290229A1; CN105658659A

Abstract

본 발명은 일반적으로 신규 프로테아제 저항성 펩타이드 리간드 및 그의 용도의 발견에 관한 것이다. 구체적으로는, 본 발명은 생물학제(biological)에 결합할 수 있는 3 내지 20 개의 아미노산을 갖고 하나 이상의 염기성 아미노산(들) 및/또는 방향족 아미노산을 포함하고, 아미노산 중 하나 이상이 비-천연 아미노산 유사체로 치환된, 프로테아제 저항성 펩타이드를 제공한다.

Description

프로테아제 저항성 펩타이드 리간드 {PROTEASE-RESISTANT PEPTIDE LIGANDS}

<관련 출원에 대한 상호 참조>

본원은 프로테아제 저항성 펩타이드 리간드에 대한 2013년 7월 15일에 출원된 미국 가출원 61/846326호, 메네가티(Menegatti) 등, 대리인 서류 번호 NS13002USV의 이익을 주장하며 이는 전체로서 참조문헌으로 본원에 포함된다.

<기술 분야>

본 발명은 일반적으로 신규 프로테아제 저항성 펩타이드 리간드의 발견에 관한 것이다.

치료 및 연구 응용을 위한 포유류 혈청으로부터의 면역글로불린 정제는 상당한 산업적, 의료적, 및 경제적 가치의 이슈이다. 다클론성 항체-기재 치료제는 복수의 항원결정인자 및 표적에 대해 다가 상호작용을 나타내고 따라서 일부 질병의 예방 또는 치료에 가장 적합하다. 혈장-유래 다클론성 정맥내 면역글로불린(IVIG) 제제는 면역결핍 환자에서의 전염병의 예방적 방지에 성공적으로 적용되었고 자가면역 및 염증 문제에 대한 사용이 증가한다. 지금까지, IVIG는 세계 혈액 제제 시장에서 주요 혈장 제품이고, 연간 소비가 꾸준히 증가하고 있다. 동물 혈장 유래 다클론성 항체는 또한 현재 면역분석 제조 및 치료용 및 진단용 수단 설계를 위한 연구에 사용되고 있다.

포유류 혈청으로부터의 다클론성 항체의 친화도 정제는 현재 대부분 단백질 리간드, 예를 들어 단백질 A 및 단백질 G의 사용에 기초한다. 그러나 이들 단백질 리간드는, 예를 들어 1) 높은 비용(흡착제 리터 당 $ 15,000 - 20,000), 2) 낮은 화학적 및 생화학적 안정성, 3) 제품 메인스트림에서의 리간드 단편 침출과 관련된 위험의 결과를 갖는 면역원성, 및 4) 용리된 단백질의 생물 활성을 위협하는, 높은 결합 친화도로 인한 가혹한 용리 조건의 여러 단점이 있다. 또한, 단백질 A는 인간 IgG3 및 여러 동물 면역글로불린과 결합하지 않는다. 단백질 G는, 모든 인간 IgG 서브클래스에 결합하지만, 또한 인간 및 동물 혈장 및 그의 분획 내의 주요 단백질인 알부민에 상당한 결합을 나타낸다.

이러한 문제를 극복하기 위해, 펩타이드, 아미노산, 트리아진 스캐폴드 및 친티오 화합물 기재 합성 리간드가 항체의 정제에 제안되었다. 본 연구단은 Fc 부위를 통해 IgG와 결합하고, 따라서 단백질 A의 결합 메커니즘을 모방하는 세 헥사펩타이드 리간드, HWRGWV, HYFKFD 및 HFRRHL(서열 1 내지 3)을 확인했다. 특히, 펩타이드 HWRGWV은 세포 배지, CHO 세포 배양 상청액, 유전자삽입 우유 및 유청, 식물 추출물, 및 인간 혈장의 콘 분획 II+III을 포함한 다양한 복합적인 출처로부터 IgG를 단리할 수 있는 능력을 더 특징으로 한다. 이들 실험에서 비롯한 생성물 수율 및 순도는 단백질 A 매질로 얻어진 것에 항상 필적했다.

그러나, 인간 혈장으로부터의 다클론성 항체 정제에 사용될 때 단백질 리간드 및 합성 펩타이드 리간드 모두가 당면하는 문제는 그 안에 존재하는 단백질 분해 효소, 특히 트립신 및 α-키모트립신의 작용이다. 트립신은 리신 및 아르기닌 잔기의 카르복시측에서 펩타이드 사슬을 자르는 세린 프로테아제이다. 키모트립신은 티로신, 트립토판, 및 페닐알라닌과 같은 소수성 잔기의 카르복시측에서 펩타이드 사슬을 자른다. 포유류 혈청에 반복 및/또는 지속적으로 노출되면, 단백질 또는 펩타이드 리간드는 이러한 엔도프로테아제에 의해 분해된다. 이러한 엔도프로테아제에 의한 단백질 A의 분해, 및 이에 의한 값비싼 친화도 수지의 수명의 감소를 방지하기 위해, 주입 전에 원료에 효소 억제제가 첨가된다. 이들 억제제는, 그러나, 그 자체로 상당한 추가적인 비용을 나타낸다.

특정 비-제한적 실시태양에서, 본 발명은 생물학제(biological)에 결합할 수 있는 3 내지 20 개의 아미노산을 갖고 하나 이상의 염기성 아미노산(들) 및/또는 방향족 아미노산을 포함하고, 아미노산 중 하나 이상이 비-천연 아미노산 유사체로 치환된, 프로테아제 저항성 펩타이드를 제공한다. 비-천연 아미노산 유사체는 표 6에 열거된 것일 수 있다.

프로테아제 저항성 펩타이드는 4합체, 5합체, 6합체, 7합체, 8합체, 9합체, 10합체, 11합체, 12합체, 13합체, 14합체, 15합체, 16합체, 17합체, 18합체, 또는 19합체일 수 있다. 프로테아제 저항성 펩타이드는 헥사펩타이드이고 비-천연 아미노산(들)로 치환되기 전에 서열 HWRGWV, HYFKFD 및 HFRRHL(서열 1 내지 3)을 갖는다.

프로테아제 저항성 펩타이드는 1개의 비-천연 아미노산을 가질 수 있다. 다르게는, 2, 3, 4, 또는 5개의 비-천연 아미노산을 가질 수 있다. 펩타이드는 10 중 1 아미노산이 비-천연 아미노산으로 치환된 것일 수 있다(10 %). 다르게는, 19 중 1 아미노산이 치환된 것일 수 있다(~5 %). 10 중 2 아미노산이 치환되거나(20 %) 6 중 2 아미노산이 치환된 것일 수 있다(33 %). 50 % 비-천연 아미노산, 예를 들어, 6 중 3 또는 8 중 4 등일 수 있다.

천연 펩타이드가 글루타민을 함유하면, N-γ-에틸-글루타민으로 치환되어 프로테아제 저항성 펩타이드를 형성할 수 있다. 천연 대응물이 글루탐산을 함유하면, 카르복시-글루탐산으로 치환될 수 있다. 천연 펩타이드가 프롤린을 함유하면, 프로테아제 저항성 펩타이드는 2번 수소가 벤질, OH, 또는 페닐로 치환된 프롤린을 가질 수 있다. 천연 펩타이드가 페닐알라닌을 함유하면, 프로테아제 저항성 펩타이드는 페닐알라닌 중의 하나 이상의 방향족 수소가 아미노기, 에톡시기, 에틸기, 메톡시기, 메틸기, OH 또는 페닐로 치환될 수 있다. 천연 펩타이드가 티로신을 함유하면, 프로테아제 저항성 펩타이드는 티로신 중의 하나 이상의 방향족 수소가 아미노기, 에톡시기, 에틸기, 메톡시기, 메틸기, OH 또는 페닐로 치환될 수 있다. 천연 펩타이드가 아르기닌을 함유하면, 이는 시트룰린으로 치환되거나 메틸화되어 프로테아제 저항성 펩타이드를 형성할 수 있다. 유사하게, 천연 펩타이드 내의 아미노기는 메틸 아미노 또는 디메틸 아미노기로 치환될 수 있다, 예를 들어, 리신 내의 아미노 수소(들)이 메틸화되어 프로테아제 저항성 펩타이드를 형성할 수 있다.

프로테아제 저항성 펩타이드는 엔도펩티다아제 또는 엑소펩티다아제에 의한 소화에 저항성일 수 있다. 한 비-제한적 실시태양에서, 엔도펩티다아제는 알파-키모트립신 또는 트립신일 수 있다.

본 발명은 또한 프로테아제 저항성 펩타이드에 커플링된 고체 지지체를 포함한다. 고체 지지체는 수지 비드, 예를 들어, 도요펄(Toyopearl)과 같은 수지일 수 있다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 생물학제가 고체 지지체에 결합하도록 적합한 조건에서 프로테아제 저항성 펩타이드를 갖는 고체 지지체를 생물학제와 접촉시키는 단계; 고체 지지체 및 결합된 생물학제를 세척하는 단계; 및 생물학제를 고체 지지체로부터 용리하여 생물학제를 정제하는 단계를 포함하는 생물학제 정제 방법을 제공한다. 생물학제는 항체일 수 있다.

본 발명은 또한 고체 지지체 및 프로테아제 저항성 펩타이드를 포함하는 진단용 키트를 제공한다.

도 1. 다음 서열의 클러스터 #1: a) HWRGWV, b) HFRRHL, (서열 1, 3) c) HW_MetCitDW_MetV, 및 d) HF_MetCitCitHL (서열 4 내지 5)
도 2. 패널 (A)-(D)는 천연 펩타이드 결합제 및 변성 펩타이드 결합제의 단백질 분해 소화를 나타낸다.
도 3. 흡착제를 사용한 인간 혈장의 콘 분획 II+III으로부터의 IgG 크로마토그래피 정제의 SDS-PAGE(환원 조건).
도 4. 결합 완충액의 상이한 염 농도에서 수행된 인간 혈장의 콘 분획 II+III으로부터의 IgG 크로마토그래피 정제의 SDS-PAGE(환원 조건).

치료 및 연구 목적을 위한 포유류 혈청으로부터의 면역글로불린 정제는 바이오기술 및 바이오제조와 상당히 관련 있는 이슈이다[1, 2]. 혈장-유래 다클론성 정맥내 면역글로불린(IVIG) 제제는 면역결핍 환자에서의 전염병의 예방적 방지에 성공적으로 적용되었고 자가면역 및 염증성 장애에 대한 용도가 증가하고 있다[3, 4]. 지금까지, IVIG는 세계 혈액 제제 시장에서 주요 혈장 제품이고, 연간 소비가 꾸준히 증가하고 있다[5]. 또한, 면역화된 동물 혈청 유래 다클론성 항체는 면역분석, 치료적 처치 및 새로운 약물 전달 방법 개발을 위한 의학 연구에 현재 사용되고 있다[6-9]. 꽤 오래되었지만 여전히 단일클론성 항체 개발을 위한 강력한 연구 수단인 하이브리도마 기술에서의 경우와 같이 혈청 또한 단일클론성 항체의 출처가 될 수 있다[10]. 하이브리도마 콜로니가 고 농도의 소 혈청을 주로 갖는 배지에서 성장하면, 이들 유체로부터의 단일클론성 항체 정제는 동물 출처로부터의 다클론성 항체 회수와 사실 닮았다[11]. 항체 정제에 가장 흔히 사용되는 친화도 리간드인 단백질 A 및 단백질 G는 이 형태의 항체 정제에 적합하지 않다[12, 13]. 높은 비용, 낮은 화학적 안정성, 면역원성, 및 낮은 해리 상수(~ 10^-8 M)로 인한 가혹한 용리 조건의 알려진 문제에 더하여, 일부 추가적인 문제가 있다[14, 15]. 단백질 A는 인간 IgG₃ 서브클래스에 결합하지 않고, 마우스 IgG₁ 및 소 IgG₁에 약한 결합을 나타내고, 염소 및 마우스 IgG 또는 닭 IgY의 서브클래스에 결합하지 않는다[16]. 단백질 G는, 모든 인간 IgG 서브클래스 및 대부분의 동물 항체에 결합하지만, 혈장 및 혈청에서 주된 단백질 성분인 알부민을 또한 포획하기 때문에, 혈장으로부터의 항체 정제에 보통 사용되지 않는다[17]. 알부민 결합 부위가 없는 단백질 G의 조작된 형태가 개발되었지만[18], 이는 매우 비싸고 안정성 및 면역원성의 문제가 여전히 염려된다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 단백질 리간드에 비해 더 가격이 적당하고 화학적으로 강성이고, 덜 독성이고 덜 면역원성인 합성 리간드가 항체 정제를 위해 개발되어 왔다[19, 20].

본 연구단은 Fc 부위를 통해 IgG에 결합함으로써 단백질 A의 결합 메커니즘을 모방하는 세 펩타이드 리간드, HWRGWV, HYFKFD 및 HFRRHL(서열 1 내지 3)을 확인했다[21-23]. 이러한 서열은 모든 인간 항체 서브클래스 뿐만 아니라 여러 동물(소, 마우스, 토끼, 염소, 라마, 및 조류) 항체에 결합하고, 인간 혈장의 콘 분획 II+III을 포함한 여러 출처로부터 단일클론성 및 다클론성 항체를 정제하는 데에 사용되었다[24-26]. 이들 연구 모두에서, 생성물 수율 및 순도는 항상 단백질 A에 의해 얻어진 것에 필적하는 것으로 확인되었다. 그러나, 더 약한 결합 강도(K_D ~ 10^-5 - 10^-6 M)로 인해, 더 온화한 조건(pH 4.0 - 5.0)에서 친화도 컬럼으로부터 항체 용리될 수 있게 함으로써, 응집을 방지하고 활성을 유지한다. 이들 펩타이드 리간드 흡착제의 화학적 안정성 및 동적 결착력(DBC)을 증가시키기 위해 많은 연구가 또한 수행되었다. 이러한 최적화 연구의 결과로, HWRGWV-도요펄(서열 6) 흡착제는 연속적인 사용 사이클에 걸쳐 0.5 M NaOH에 대해 높은 저항성 및 50 g/L 범위 내의 DBC 값을 나타냈다[27, 28]. 따라서 이들 리간드는 혈청 및 혈장으로부터 단일클론성 및 다클론성 항체의 산업 규모 친화도 정제의 발전을 가능하게 할 수 있다.

동물 혈장으로부터 다클론성 항체의 정제에 사용될 때 단백질 및 합성 펩타이드 리간드 모두가 당면하는 문제는 트립신 및 α-키모트립신과 같은 단백질 분해 효소의 존재이다[29, 30]. 이러한 프로테아제는 염기성(아르기닌 및 리신) 및 방향족(트립토판, 페닐알라닌, 및 티로신) 아미노산 각각의 카르복시 말단에서 펩타이드 사슬을 자른다[31, 32]. 친화도 흡착제를 혈청에 지속적으로 노출시키면, 트립신 및 α-키모트립신은 단백질 또는 펩타이드 리간드의 현저한 분해를 일으켜 그 결과 결합 능력을 상실하게 한다. 단백질 A / G와 같은 단백질 리간드의 경우, 이 문제는 제품 메인스트림 내의 면역원성 단편의 배출로 인해 심화된다. 예방 조치로, 주입 전에 프로테아제 효소 억제제가 원료 혼합물에 종종 첨가된다[33]. 그러나 이들 억제제는 비싸고 최종 생성물에서 제거될 필요가 있다.

이러한 문제의 근본적인 해결책은 비-천연 아미노산을 포함하는 펩타이드 리간드 변종을 만드는 것이다. 이들 변종은 우수한 표적 친화도 및 선택성과 프로테아제에 대한 높은 저항성을 조합할 것으로 기대된다. 베르돌리바(Verdoliva) 등은 천연 L-형과 달리 프로테아제에 의해 인식 및 공격되지 않는 아미노산의 D-입체이성질체를 사용한 펩타이드 리간드 합성을 제안했다[34, 35]. D-아미노산은, 그러나, 매우 비싸고 단백질 용리 및 수지 위생화 각각에 사용되는 산 및 알칼리 용액에 의해 아미노산 관능기에 일어나는 것과 같은 다른 종류의 화학적 분해에 취약하다[36-39]. 이러한 장애를 극복하기 위해, 원래의 서열의 표적 친화도 및 선택성을 유지하면서도 높은 효소 저항성 및 화학적 안정성을 나타내는 펩타이드 변종을 생성하기 위해 D-아미노산 대신 화학적 변성 형태의 L-아미노산이 사용될 수 있다. 이를 위해, 다음의 세 단계를 포함하는 이들 리간드의 설계 및 확인을 위한 방법이 본원에서 제시된다: 1) 비-천연 아미노산을 사용한 공지된 펩타이드 리간드의 변종의 가상 라이브러리 설계, 2) 분자 도킹 모의실험에 의한 표적 생체 분자에 대한 인실리코(in-silico) 라이브러리 스크리닝, 3) 크로마토그래피 수지 상의 선택된 변종 합성 및 프로테아제에 대한 표적 결합 및 저항성에 대한 생성된 흡착제 시험. 항체 결합성 펩타이드 HWRGWV, HYFKFD, 및 HFRRHL(서열 1 내지 3) 내의 트립토판, 페닐알라닌, 티로신, 및 리신을 알킬화된 유사체로 치환했고, 아르기닌 대신 시트룰린을 사용했다.

N_in-포르밀-트립토판 및 4-카르바모일-페닐알라닌을 사용하고, 또한 HWRGWV에서 글리신을 아스파르트산으로 치환하여 다른 변종을 생성했다. 이어서 도킹 소프트웨어 HADDOCK(버전 2.1)를 사용하여 IgG(Ser383 - Asn389)의 pFc 부분 내의 알려진 HWRGWV 결합 부위에 대해 라이브러리를 스크리닝했다[40, 41]. 이 프로그램은 단백질-펩타이드 상호작용을 모의실험하고 외부 소프트웨어를 통해 반 데르 발스 상호작용, 수소 결합, 변형 패널티, 소수성 효과, 원자 접촉 에너지, 약화된 반 데르 발스 상호작용, 부분 정전기, 결합 자유 에너지의 추가적인 추정, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 및 물의 존재의 평가에 기초하여 결합 자유 에너지를 추정한다[40-45]. 선택된 서열을 폴리메타크릴레이트-기재 크로마토그래피 수지 도요펄 AF-아미노-650M 위에 직접 합성하고 IgG 결합 및 트립신 및 α-키모트립신에 대한 저항성에 대해 시험했다. 서열 HW_MetCitGW_MetV, HF_MetCitCitHL, 및 HY_MetF_MetK_(Met)2F_MetD(서열 4, 5, 7)를 인간 혈장의 콘 분획 II+III으로부터 다클론성 항체(IVIG)를 정제하기 위해 선택했다.

마지막으로, 부모 펩타이드 HWRGWV 및 그의 변종 HW_MetCitGW_MetV 및 Ac-HW_MetCitGW_MetV(서열 8 내지 9)의 결합 메커니즘을 비교하기 위해 IgG 수율 및 순도에 대한 결합 완충액의 전도도의 영향에 대한 연구를 수행했다. 후자는 결합 완충액의 더 낮은 전도도에서 HWRGWV보다 높은 IVIG 수율 및 순도를 얻음으로써, 대규모 하류 공정을 위해 현저한 비용 절감을 제공하는 것으로 나타났다.

한 비-제한적 실시태양에서, 본 방법은 네 단계를 포함할 수 있다:

1 - 비-천연 변성 아미노산을 사용한 공지된 펩타이드 리간드의 변종의 라이브러리 설계;

2 - 분자 도킹 모의실험을 통한 표적 생체 분자에 대한 펩타이드 변종의 라이브러리 스크리닝에 의한 리간드 부분집합의 선택;

3 - 크로마토그래피 수지 위에 종래의 Fmoc/tBu 커플링 화학에 의해 선택된 리간드 합성;

4 - 다음에 대해 친화도 흡착제를 크로마토그래피 시험: a) 표적 생체 분자의 결합 및 b) 크로마토그래피 절차에서 사용된 화학제제 및 단백질 분해 효소에 대한 저항성.

1 - 펩타이드 리간드 HWRGWV의 변종 설계

펩타이드 변종의 가상 라이브러리(표 1)를 설계했다.

표 1. 분자 모델링 연구에 사용된 펩타이드

2 - 분자 모델링

펩타이드 변종에 대한 코디네이트 파일을 PYMOL[PyMOL 분자 그래픽 시스템, 버전 1.2r3pre, 슈뢰딩거, LLC]을 사용하여 생성했다. 변성을 위한 파라미터 및 위상학 파일은 가장 일치하는 천연 잔기를 관찰하고 그 성질을 복사하여 비-천연 아미노산 후보를 설계함으로써 결정했다. N_in-메틸화 및 포르밀화 트립토판을 표준 트립토판 잔기에 대한 파라미터 및 위상학 파일에 기초하여 설계했다. 4-메틸-, 4-메톡시-, 및 카르바모일- 페닐알라닌을 표준 페닐알라닌 잔기에 대한 파라미터 및 위상학 파일에 기초하여 설계했고, 특히 카르바모일 관능기는 아스파라긴으로부터 얻었다. 시트룰린은 아르기닌의 탄소 델타 및 아스파라긴에 기초하여 모델링했다. 메틸화 및 디메틸화 리신, Lys(Me) 및 Lys(Me)₂에 대한 파일은 HADDOCK에 이미 코딩되었다. 관능기 위의 전기적 중성을 유지하도록 HADDOCK 내의 천연 아미노산의 모든 다른 파라미터 및 위상학 파일과 동일하게 단일 원자 상의 부분 전하를 배정했다. 아미노산 변성에 대한 위상학 및 파라미터 파일의 검증을 위해 파라미터 및 위상학 파일 변성을 PRODRG 서버에의 제출에 대해 확인했다. hIgG에 대한 코디네이트 파일을 RCSB 단백질 데이터 뱅크(PDB, 1FCC)로부터 얻었다 [Structure. 1995 Mar 15;3(3):265-78. Crystal structure of the C2 fragment of streptococcal protein G in complex with the Fc domain of human IgG.Sauer-Eriksson AE, Kleywegt GJ, Uhlen M, Jones TA.]. hIgG 위의 잔기 Ser383-Asn389(SNGQPEN)(서열 15)는 "활성"인 것으로 정의하고 리간드 도킹을 위한 표적 부분으로 사용했다. 펩타이드 리간드와 hIgG 위의 단백질 A 결합 부위(잔기 341-443) 사이의 상호작용을 방지하기 위한 전반적인 제한으로 단백질 A를 표적 PDB 파일에 포함시켰다. 분자 모델링을 프로그램 HADDOCK(버전 2.1)을 사용하여 수행했다 [S.J. de Vries, A.D.J. van Djik, M. Krzeminski, M. van Dijk, A. Thureau, V. Hsu, T. Wassenaar, A.M. Bonvin, Proteins: Struc. Funct. & Bioinformatic 69 (2007) 726. and C. Dominguez, R. Boelens, A.M. Bonvin, J. Am. Chem. Soc. 125 (2003) 1731.]. 각 펩타이드 변종에 대해, 잔기 1-2를 hIgG의 잔기 389-387에 표적화하고, 잔기 3-4를 hIgG 386-383의 잔기에 표적화하고, 잔기 5-6은 표적화하지 않았다. 도킹 과정에서 디폴트 HADDOCK 파라미터를 사용했다. 프로그램 프로핏(ProFit)(http://www.bioinf.org.uk/software/profit/)을 사용하여 4의 최소 클러스터 크기 및 2.5 Å 이하의 RMSD(제곱 평균 거리)를 배정함으로써 생성된 도킹된 구조를 클러스터로 구분했다. 도킹 에너지가 가장 낮은 답의 육안 관찰에 기초한 각 서열에 대한 선택된 모든 클러스터를 세 그룹, dComplex, XScore (HPScore, HMScore, HSScore, -log(Kd), 및 Δ_iG), 및 FireDock(global, attractive VdW, repulsive VdW, ACE, 및 수소 결합)으로 구분된 12 개의 채점 함수에 따라 분석했다 [Wang, R., Y. Lu, and S. Wang, Comparative evaluation of 11 scoring functions for molecular docking. J Med Chem, 2003. 46(12): p. 2287-303 and Andrusier, N., et al., Principles of flexible protein-protein docking. Proteins, 2008. 73(2): p. 271-89 AND Mashiach, E., et al., FireDock: a web server for fast interaction refinement in molecular docking. Nucleic Acids Res, 2008. 36(Web Server issue): p. W229-32. and Liu, S., et al., A physical reference state unifies the structure-derived potential of mean force for protein folding and binding. Proteins, 2004. 56(1): p. 93-101]. 서열 순위를 이렇게 컴파일하여, 개별 함수에 따라 얻어진 점수 값에 따라 서열을 순차적으로 나열했다. 이 순위를 마지막으로 합하고 평균해서 서열의 최종 리스트를 얻었고, 낮은 점수가 높은 친화도를 나타낸다.

정의

용어 "생물학제"는 생물약제 또는 생물치료제, 예를 들어 치료용 단백질을 포함한다. 이는 효소 및/또는 조절 활성을 갖는 단백질 치료제; 또는 특수한 결합 활성을 갖는 단백질, 예를 들어 단일클론성 항체 또는 Fc-융합 단백질; 또는 단백질 백신; 또는 진단 단백질일 수 있다. 생물학제는 혈액 인자와 같은 살아있는 생물로부터 단리되거나 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 문헌 [Strohl and Knight, Curr Opin Biotech, (2009) 20:668-672]을 참조하기 바라며, 그 내용은 전체로서 참조문헌으로 본원에 포함된다. 본원에서 사용되는 생물학제는 바이러스 및 미생물, 예를 들어 박테리아, 진균, 단세포 또는 다세포 생물을 또한 포함한다. 일부 비-제한적 실시태양에서, 생물학제는 병원성 단백질, 예를 들어 프리온, 또는 병원성 미생물, 예를 들어 박테리아 등일 수 있다.

넬슨(Nelson) 등 및 니에리(Nieri) 등은 최근 치료용 항체 시장 또는 임상 개발 및 그의 생산 기술을 검토했다. 문헌 [Nelson et al. 2010 Nat Rev Drug Disc 9 767-774]; 문헌 [Nieri et al. 2009 Curr Top Med Chem 16 753-779].

완전 인간 항체는 CHO 세포 배양을 통해 그리고 유전자삽입 동물 및 식물에 의해 또한 생산될 수 있다. 풀사이즈 인간 단일클론성 항체는 현재 유전자삽입 동물(예를 들어, 소, 염소)의 젖에서 추출된다. 문헌 [Redwan 2009 J Immunoass Immunochem 30 262-290]. 담배와 같은 식물 또한, 항체 제조를 위해 사용된다. 담배는 담배 바이러스를 사용하여 유전자감염시키기 비교적 쉽다. 문헌 [Yusibov et al. 2011 Hum Vacc 7(3) 313-321].

"생체고분자"는 하나 이상의 종류의 반복 단위의 고분자이다. 생체고분자는 천연 생물학제 시스템에서 찾을 수 있고 특히 올리고당류 및 다당류, 펩타이드(폴리펩타이드 및 단백질을 포함하도록 사용되는 용어), 및 폴리뉴클레오티드s(DNA 및 RNA를 포함하도록 사용되는 용어)를 포함하고, 또는 펩토이드 및 펩타이드 핵산(PNA)과 같이 인공 생합성에 의해 생산될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "생체고분자"는 아미노산 또는 아미노산 유사체, 당 또는 당 유사체, 또는 뉴클레오티드 또는 비-뉴클레오티드 군으로 구성되거나 이를 함유하는 천연 화합물 유사체와 같은 생물학적 활성을 갖는 합성 화합물을 포함한다.

일부 실시태양에서 치환은 보존적 아미노산 치환일 수 있다. 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는 보존적 아미노산 치환의 예는 다음을 포함한다: 세린에 대해 알라닌, 이소류신에 대해 발린, 글루타민산염에 대해 아스파르트산염, 세린에 대해 트레오닌, 글리신에 대해 알라닌, 트레오닌에 대해 알라닌, 아스파라긴에 대해 세린, 발린에 대해 알라닌, 글리신에 대해 세린, 페닐알라닌에 대해 티로신, 프롤린에 대해 알라닌, 아르기닌에 대해 리신, 아스파라긴에 대해 아스파르트산염, 이소류신에 대해 류신, 발린에 대해 류신, 글루타민산염에 대해 알라닌, 글리신에 대해 아스파르트산염, 및 이들 변화의 역. 예를 들어 문헌 [Neurath et al., The Proteins, Academic Press, New York (1979)]을 참조하기 바라며, 그의 관련 부분은 참조문헌으로 본원에 포함된다. 또한, 한 그룹 내의 한 아미노산을 동일한 그룹내의 다른 아미노산으로 치환하는 것은 보존적 치환이고, 그룹은 다음과 같다: (1) 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 노르류신, 및 페닐알라닌: (2) 히스티딘, 아르기닌, 리신, 글루타민, 및 아스파라긴; (3) 아스파르트산염 및 글루타민산염; (4) 세린, 트레오닌, 알라닌, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 및 시스테인; 및 (5) 글리신, 프롤린, 및 알라닌.

용어 "고체 지지체"는 중합체 또는 무기 특성의 친수성 매크로다공성 물질을 갖는 물질을 의미하고 본 발명에 사용될 수 있다. 고체 지지체는 무기 물질, 유기 물질 및 그의 조합을 포함한다. 이는 히드록실화 고체 지지체 또는 히드록실화 컴포지트 고체 지지체일 수 있다. 고체 지지체는 아크릴아미드 유도체, 아가로오스, 셀룰로오스, 키틴, 키토산, 덱스트린, 유리, 자철광, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알코올, 실리카, 실리콘, 지르코니아, 및 그의 조합일 수 있다. 고체 지지체 물질은 구형일 수 있는 다공성 비드 형태일 수 있다. 다르게는, 지지체는 다른 규칙적 또는 불규칙적 형태를 갖는 입자 또는 갈라진 형태일 수 있다. 적합한 고체 지지체 물질의 다른 예는 멤브레인, 반투성 멤브레인, 모세관, 마이크로어레이, 모노라이트, 알루미나로 구성된 멀티-웰 플레이트, 알루미나 지지된 중합체, 또는 다당류를 포함한다. 본 발명의 고체 지지체는 강성 또는 비-강성 가요성 물질, 예를 들어 직물 또는 부직물일 수 있다. 적합한 비-강성 가요성 물질은 멤브레인(기술분야에서 공지된 여러 기술로 제조된 캐스트, 부직물, 또는 마이크로- 또는 나노- 섬유)일 수 있다.

바람직한 고체 지지체 물질은 단백질의 비-특이적 결합이 최소이고 pH 및 이온 강도의 변화와 같은 본 발명에 사용되는 정제 과정뿐만 아니라 유기 합성에 사용되는 조건에 물리적 및 화학적으로 저항성인 것들이다. 본 발명에 사용되는 고체 지지체는 아크릴레이트 고분자일 수 있다. 아크릴레이트 고분자의 예는 폴리메타크릴레이트, 폴리히드록시 메타크릴레이트, 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴로니트릴 및 다른 아크릴레이트 유도체를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 바람직한 비-제한적 실시태양에서, 고체 지지체는 메타크릴레이트 고분자이다.

조성물 및 키트

본 발명은 진단 분석일 수 있는 분석에서 본원에서 기술하는 프로테아제 저항성 결합제 펩타이드를 사용하여 관심있는 특정 표적의 종류 및 수준을 검출 및/또는 측정하기 위한 조성물 및 키트를 제공한다. 본 발명의 분석을 수행하기 위한 키트는 통상적으로, 적합한 용기 수단, (i) 본 발명의 프로테아제 저항성 결합제 펩타이드를 포함하는 탐침; (ii) 탐침의 존재를 검출하기 위한 라벨; 및 (iii) 관심있는 표적을 측정하기 위한 사용법을 포함한다. 키트는 하나 이상의 프로테아제 저항성 결합제 펩타이드를 포함할 수 있고, 예를 들어, 제1 프로테아제 저항성 펩타이드 및/또는 제2 및/또는 제3 및/또는 추가적인 프로테아제 저항성 펩타이드가 관심있는 표적에 특이적으로 결합하고 인식한다. 키트의 용기 수단은 하나 이상의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 및/또는 본 발명의 제1 프로테아제 저항성 펩타이드가 보관 및/또는 적절히 부분화 될 수 있는 다른 용기를 일반적으로 포함할 것이다. 제2 및/또는 제3 및/또는 추가적인 성분이 제공되는 경우, 키트는 또한 일반적으로 이 성분이 보관될 수 있는 제2, 제3 및/또는 다른 추가적인 용기를 포함할 것이다. 다르게는, 용기는 각 시약이 본 발명에 따른 상이한 마커에 특이적으로 결합하는 하나 초과의 프로테아제 저항성 펩타이드의 혼합물을 함유할 수 있다. 본 발명의 키트는 또는 통상적으로 시판을 위해 프로테아제 저항성 펩타이드 탐침을 밀봉하여 보관하기 위한 수단을 포함할 것이다. 이러한 용기는 주사기 및/또는 바람직한 바이알이 보관되는 블로우-몰딩된 플라스틱 용기를 포함할 수 있다.

키트는 본 발명의 방법에 따른 그 안에 포함된 키트 성분의 사용 방법 뿐만 아니라 양성 및 음성 대조물을 더 포함할 수 있다.

달리 정의되지 않은 경우, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 관사 "한" 및 "하나"는 그 관사의 문법적 대상(들)의 하나 또는 그 이상(즉, 적어도 하나)을 의미하도록 본원에서 사용된다. 예를 들어, "한 요소는" 하나 이상의 요소를 의미한다.

명세서를 통해 단어 "포함하는" 또는 "포함하다"와 같은 변형은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소의, 정수 또는 단계의 군의 포함을 의미하도록 이해될 것이고, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소의, 정수 또는 단계의 군을 배제하지 않는다. 본 발명은, 청구항에 기술된 단계, 요소, 및/또는 시약을 적절히 "포함하거나", 이로부터 "구성되거나", 이로부터 "본질적으로 구성"될 것이다.

청구항은 임의의 선택적 요소를 배제하도록 작성될 수 있다는 것을 또한 알아야 한다. 이와 같이, 이 언급은 청구된 요소의 언급과 관련한 "단독으로", "오직" 등과 같은 배타적 용어의 사용, 또는 "소극적" 한정의 사용에 대한 선행되는 근거의 역할을 하도록 의도된다.

값의 범위가 제공되는 경우, 문맥상 명백히 다르게 언급되지 않은 한 하한의 십분의 일 단위까지, 그 범위의 상한 및 하한 사이의 각각의 사이에 있는 값이 또한 구체적으로 개시된 것으로 이해된다. 언급된 범위 내의 임의의 언급된 값 또는 사이에 있는 값 사이의 각 작은 범위 및 그 언급된 범위 내의 임의의 다른 언급되거나 사이에 있는 값은 본 발명에 포함된다. 이러한 작은 범위의 상한 및 하한은 범위에 독립적으로 포함되거나 배제될 수 있고, 두 한계 중 하나 이상이 작은 범위에 포함되거나 포함되지 않은 각 범위 또한 본 발명에 포함된다(언급된 범위 내의 임의의 명시적으로 제외된 한계). 언급된 범위가 한계 중 하나 이상을 포함하는 경우, 이들 중 하나 이상을 배제하는 범위 또한 본 발명에 포함된다.

다음의 실시예는 본 발명을 더욱 설명하고 본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아니다. 특히, 본 발명은 기술된 특정 실시태양에 한정되지 않고, 물론 변할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 사용되는 용어는 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 목적이고 제한하려는 목적이 아니라는 것을 또한 이해할 것이며, 본 발명의 범위는 오직 첨부된 청구항에 의해 제한될 것이다.

6. 실시예

선택된 펩타이드 변종의 합성

물질

펩타이드 합성을 위한 보호된 아미노산 및 커플링제를 켐임펙스 인크.(ChemImpex Inc.)(미국 일리노이주 우드 데일 소재)로부터 구입했다. 트립신, α-키모트립신, 디이소프로필에틸아민(DIPEA), 피페리딘, 트리플루오로아세트산(TFA), 트리이소프로필실란(TIPS), 에탄디티올(EDT), 페닐실란, 티오아니솔, 나트륨 디에틸디티오카르바메이트, 인돌, 인산 완충 식염수 (PBS) pH 7.4, 및 카이저(Kaiser) 시험 키트는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로부터 구입했다. N,N'-디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄(DCM), HPLC 등급 아세토니트릴 및 물, 나트륨 아세테이트, 염화나트륨, 빙초산을 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)(미국 펜실베니아주 피츠버그)으로부터 구입했다. 도요펄 AF-아미노-650M 수지를 토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience)(미국 펜실베니아주 킹스 오브 프러시아)로부터 구입했다.

방법

각 선택된 서열을 200 mg의 도요펄 AF-아미노-650M 수지(d = 75-150 마이크로미터, 아미노기 밀도 = 0.4 mmol/g) 위에 합성했다. 연속적인 질소 흐름 및 35C의 온도에서 테플론 프릿(Teflon frit)이 구비된 폴리프로필렌 튜브 내에서 25 분 동안 각 아미노산 커플링 단계를 수행했다. DMF에서 10 분 동안 수지를 헹군 후, 3 mL의 건조 DMF 내의 Fmoc-Ala-OH(기재 수지 관능기 밀도에 비해 3 당량 몰 과량), HCTU (3 당량) 및 DIPEA(6 당량)로 한 번의 커플링을 수행했다. 4 mL의 DMF 내의 아세트산 무수물 및 DIPEA(50 당량)을 사용하여 아세틸화 단계를 30 분 동안 실온에서 수행했다. 이어서 20 분 동안 5 mL의 DMF 내의 20% 피페리딘으로 인큐베이션하여 Fmoc 보호를 제거했다.

펩타이드 서열을 종래의 Fmoc/tBu 방법을 통해 합성했다. 각 아미노산에 대해, Fmoc-아미노산(2 당량), HCTU(2 당량) 및 DIPEA(4 당량)의 무수 DMF 용액(2.5 mL)을 수지에 첨가했다. 카이저(Kaiser) 시험으로 모니터링하면서 모든 이용가능한 아미노기를 포화시키기 위해 각 아미노산에 대해 두번의 커플링을 수행했다. 20 분 동안 5 mL의 DMF 내의 20% 피페리딘으로 마지막 아미노산 위의 Fmoc 보호를 제거하고 각 배치의 수지를 두 표본으로 나누고, 그 중 하나를 위에서 나타낸 대로 아세틸화했다. 수지를 DMF 및 DCM으로 헹군 후, TFA/DCM/인돌(70/28/2)을 함유하는 절단 혼합물을 사용하여 1.5 시간 동앝 펩타이드 탈보호를 수행했다. 이어서 수지를 DCM 및 DMF로 충분히 헹구고 마지막으로 진공에서 건조했다.

친화도 흡착제의 크로마토그래피 시험

물질

동결건조된 형태의 인간 다클론성 면역글로불린 G(IgG)를 에퀴테크-바이오, 인크.(Equitech-Bio, Inc.)(미국 텍사스주 컨빌 소재)로부터 구매했다. 모든 연구는 실온에서 수행했다. 2487 UV 검출기가 통합된 워터스 626 LC 시스템(미국 매사추세츠주 소재 워터스)을 모든 크로마토그래피 실행에 대해 사용했다. 30 mm 길이 x 2.1 mm 내경의 마이크로보어 스테인리스 강 컬럼은 알테크-어플라이드 사이언스(Altech-Applied Science)(미국 펜실베니아주 서머셋 소재)로부터 구입했다. 모든 실험은 실온에서 수행했다.

펩타이드 리간드의 IgG 결합 및 단백질 분해 효소에 대한 저항성의 크로마토그래피 평가

모든 수지(각 35 mg)를 30 mm x 2.1 mm 내경 마이크로보어 컬럼(0.1 mL)(미국 펜실베니아주 서머셋 소재 올테크-어플라이드 사이언스(Alltech-Applied Science))에 패킹하고 20 %v/v 메탄올로 팽윤시켰다. PBS, pH 7.4로 평형 후, PBS 내의 hIgG의 10 mg/mL 용액을 사용하여 세 IgG 결합 시험을 수행했다. 결합 시험 사이에, 수지를 트리스 HCl 완충액, pH 8.5 내의 트립신 또는 α-키모트립신의 0.15 mg/mL 용액에 접촉시켰다. 다섯 번의 주입 모두에 사용된 크로마토그래피 프로토콜은 다음과 같았다. 100 마이크로리터의 원료 샘플을 0.05 mL/min(87 cm/h)의 유속으로 컬럼에 로딩했다. 0.2 mL/min(348 cm/h)의 유속으로 2 mL 평형 완충액을 사용한 세척 단계 후, 0.4 mL/min(696 cm/h)의 유속으로 4 mL의 0.2M 아세테이트 완충액 pH 4.0을 사용하여 용리를 수행했다. 마지막으로, 흡착제를 4 mL의 0.85% 인산으로 재생했다. 흡착제 HWRGWV-, HYFKFD-, 및 HFRRHL- 도요펄(서열 6, 16, 17) 수지를 대조물로 사용했다. 280 nm에서의 흡광으로 용리액을 모니터링했다.

흡착제 HW _Met CitGW _Met V -, HY _Met F _Met K _(Met)2 F _Met D - 및 HF _Met CitCitHL - 도요펄(서열 18 내지 20) 수지를 사용한 인간 혈장의 콘 분획 II+III으로부터의 IVIG 정제

콘 분획 II+III을 PBS, pH 7.4에 용해시켜 대략 5 mg/mL의 IgG 농도를 얻고 폴 코포레이션(Pall Corporation)(미국 뉴욕주 포트 워싱턴 소재)의 0.44 μm 및 0.22 μm 필터를 사용하여 순차적으로 여과했다. 위에서 기술한 대로 각 펩타이드 수지를 패킹하고 팽창시켰다. 0.25 M NaCl을 함유하는 PBS 완충액을 사용한 평형 후, 100 μL의 원료 샘플을 0.05 mL/min(87 cm/h)의 유속으로 컬럼에 로딩했다. 컬럼을 2 mL의 평형 완충액으로 0.2 mL/min(348 cm/h)의 유속으로 세척한 후, 0.4 mL/min(696 cm/h)의 유속으로 4 mL의 0.2 M 아세테이트 완충액 pH 5.0으로 용리를 수행했다. 4 mL의 0.85 % 인산에 이어 4 mL의 아세테이트 완충액(pH 4.0) 내의 2 M 요소를 사용하여 세정 및 재생을 수행했다. 도요펄 AF-r단백질 A-650F 수지를 양성 대조물로 사용했다. 제조사의 지시에 따라, 크로마토그래피 프로토콜은 PBS, pH 7.4과의 결합(0.05 mL/min의 유속으로) 및 0.1 M 글리신 완충액 pH 2.5으로의 용리(0.4 mL/min의 유속으로)를 포함했다. 280 nm에서의 흡광도로 용리액을 모니터링했다. 분획을 수집하고 아래에서 기술한 대로 IgG 순도 및 수율 분석에 사용했다.

흡착제 Ac- HWRGWV - 및 Ac- HW _Met CitGW _Met V - 도요펄 (서열 21 내지 22) 수지를 사용한 인간 혈장의 콘 분획 II+III으로부터의 IgG 정제에 대한 전도도의 영향

앞에서 기술한 대로 수지를 패킹하고 팽창시키고, 주입을 위한 콘 분획 II+III을 앞에서 기술한 대로 제조했다. 결합 완충액의 전도도의 영향을 PBS에 첨가된 0, 0.135 및 0.25 M NaCl에서 연구했다. 결합 완충액을 사용한 평형 후, 100 μL의 원료를 0.05 mL/min(87 cm/h)의 유속으로 컬럼에 로딩했다. 크로마토그래피 프로토콜 및 분획 수집은 위에서 기술한 대로 수행했다.

수율 및 순도에 대한 샘플 분석

수집된 분획 내의 IgG의 양을 1 mL HiTrap 단백질 G 컬럼을 사용하여 HPLC에 의해 정량했다. IgG의 수율을 로딩된 총 IgG에 대한 용리된 IgG의 비로 계산했다. 용리된 분획 내의 IgG의 순도를 엑스셀 슈퍼락^TM 미니-셀(Xcell SuperLock^TM Mini-Cell) 시스템(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재 라이프사이언시즈(LifeSciences) 제조) 내의 NuPAGE^® 노벡스(Novex) 4-12% 비스-트리스 겔을 사용하여 환원 조건하에서 도데실 황산 나트륨 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 평가했다. 5 μL의 NuPAGE^® LDS 완충액 및 2 μL의 NuPAGE^® 환원제를 13 μL의 샘플에 첨가하고 생성된 혼합물을 10 분 동안 끓여서 샘플 준비를 수행했다. 심플블루^TM세이프스테인(SimpleBlue^TM SafeStain)을 사용하여 겔을 쿠마씨-염색했다. 이미지제이(ImageJ) 1.32j 소프트웨어(미국 메릴린드 베데스다 소재 국립보건원)를 사용한 쿠마씨-염섹된 겔의 농도계 분석에 의해 IgG 순도를 측정했다. 25 및 50 KDa에서의 IgG 밴드에 대응하는 총 면적의 비율로 생성물의 순도를 계산했다.

결과 및 논의

7개의 비-천연 아미노산, 즉 N_in-메틸-트립토판, N_in-포르밀-트립토판, 4-메틸-페닐알라닌, 4-카르바모일-페닐알라닌, O-메틸-티로신, e,e-디메틸-리신, 및 시트룰린을 이 연구를 위해 선택했다. 기본 구조로 각 대응하는 표준 아미노산에 대해 사용가능한 파일을 사용하여 이들 잔기의 파라미터 및 위상학 파일을 생성했다. 표준 잔기 상의 가장 일치하는 모이어티를 복사하고 전기적 중성을 담보하기 위해 전하 분포를 조절하여 측 사슬 관능기에의 변성을 도입했다. 생성된 파라미터 및 위상학 파일 변성을 아미노산 변성의 파라미터화에 대한 표준 검증 방법인 PRODRG 서버에의 제출에 대해 확인했다. 이렇게, 펩타이드 서열의 가상 라이브러리를 생성하고 HADDOCK 2.1을 사용하여 hIgG에 대해 스크리닝했다[S.J. de Vries, A.D.J. van Djik, M. Krzeminski, M. van Dijk, A. Thureau, V. Hsu, T. Wassenaar, A.M. Bonvin, Proteins: Struc. Funct. & Bioinformatic 69 (2007) 726. and C. Dominguez, R. Boelens, A.M. Bonvin, J. Am. Chem. Soc. 125 (2003) 1731.].

물리적으로 의미있는 도킹을 수행하기 위해, 양(Yang) 등에 의한 기존 발견에 기초한 몇 가지 제약을 모의실험에 도입했다. 먼저, hIgG의 Fc 단편의 프로테아제 소화의 MS 분석은 단백질 A 결합 부위(hIgG 위의 잔기 341-443)로부터 분명하게 확인된 루프 Ser383-Asn 389(SNGQPEN)를 포함하는 pFc 세그먼트 위의 HWRGWV에 대한 추정 결합 서열을 밝혀냈다[23]. 이 결과는 펩타이드 HWRGWV가 hIgG 결합을 위해 단백질 A와 경쟁하지 않는다는 관찰과 일치했다. 두번째로, 펩타이드 서열의 첫 번째 세 아미노산, 즉, 히스티딘에 이은 방향족 및 염기성 잔기를 포함하는 기본 모티프는, IgG 결합에서 중요하다. 이는 헥사펩타이드의 고체상 라이브러리의 스크리닝에 의해 확인된 서열 HWRGWV, HYFKFD, 및 HFRRHL(서열 1 내지 3)에서 발견된 공통서열에 의해 증명되었다[21]. 이 상동성에 기초하여, 두 서열 HYFKFD 및 HFRRHL이 HWRGWV와 동일한 hIgG 결합 부위와 상호작용한다고 여기는 것이 타당하다.

마지막으로, 펩타이드의 C-말단이 크로마토그래피 수지의 표면으로 묶이기 때문에, 헥사펩타이드 리간드의 잔기 5 및 6은 IgG 표적화에서 단지 보통의 역할만 할 것이다. 이 정보에 기초하여, hIgG 위의 잔기 Ser383-Asn389를 "활성"인 것으로 정의하고 리간드 도킹을 위한 표적으로 사용했다. 모든 활성 잔기는 프로그램 NACCESS에 의해 정의된 40 % 초과의 상대 용매 접근성을 나타낸다[Campbell & Thornton (1991) J.Mol.Biol.220, 507-530].

또한, 각 펩타이드 변종에서, 잔기 1-2를 hIgG 위의 잔기 389-387에 표적화하고, 잔기 3-4를 잔기 386-383에 표적화하고, 잔기 5 및 6은 할당되지 않고 원하는 임의의 IgG 위의 잔기와 상호작용하도록 두었다. 평가의 편향을 최소화하기 위해, 다음의 일반 원칙을 도킹 모의실험으로부터 생성된 복합물을 선택하기 위해 고안했다: 1) 디폴트 클러스터링 RMSD 컷오프는 보통 7.5Å으로 설정되는 반면, 분자 도킹의 마지막 단계에서 각 서열에 대해 결정된 모든 구조를 2.5Å의 엄격한 RMSD(제곱 평균-거리) 컷오프, 및 4 구조의 최소 클러스터 크기로 클러스터링했다. 2.) 분석을 위해 사용된 구조는 각 클러스터로부터 가장 에너지적으로 선호되는 도킹된 구조였다. 3) 각 클러스터를 알려진 3차원 구조의 주어진 단백질-리간드 복합체의 결합 친화도를 추정하는 경험식 채점 함수인 채점 방법 dComplex, XScore, 및 FireDock을 사용하여 분석했다.

이들 함수는 반 데르 발스 상호작용, 수소 결합, 변형 패널티, 소수성 효과, 원자 접촉 에너지, 약화된 반 데르 발스 상호작용, 부분 정전기, 결합 자유 에너지의 추가적인 추정 및 쌍극자-쌍극자 상호작용을 설명한다 [Wang, R., Y. Lu, and S. Wang, Comparative evaluation of 11 scoring functions for for molecular docking. J Med Chem, 2003. 46(12): p. 2287-303 and Andrusier, N., et al., Principles of flexible protein-protein docking. Proteins, 2008. 73(2): p. 271-89 and Mashiach, E., et al., FireDock: a web server for fast interaction refinement in molecular docking. Nucleic Acids Res, 2008. 36(Web Server issue): p. W229-32. and Liu, S., et al., A physical reference state unifies the structure-derived potential of mean force for protein folding and binding. Proteins, 2004. 56(1): p. 93-101]. 한 특정 방법의 결과로 편향되지 않도록 복수의 채점 방법을 사용한 복합 접근법을 채용했다. 각 클러스터를 각 채점 방법에서의 개별 점수에 따라 순위화하고 이렇게 얻어진 개별 순위를 합하고 평균했다. 원래의 서열 및 여러 선택된 변종에 대한 최종 순위를 표 2에 나타낸다. 도 1은 다음 서열의 클러스터 #1을 나타낸다: a) HWRGWV, b) HFRRHL, c) HW _Met CitDW _Met V, 및 d) HF _Met CitCitHL (서열 1, 3, 4, 5)

도킹 모의실험이 서열 당 복수의 클러스터를 생성했지만, 많은 경우에서 클러스터 #1은 상기한 복합 채점 방법으로부터 구조의 최고 수 뿐만 아니라 최저 평균 값을 나타냈다. 이러한 재현성은 잘 수행된 도킹 모의실험의 표시이고 주 클러스터보다 상당히 낮은 에너지로 나타나는 외부 것들의 배제를 가능하게 한다. HWRGWV 및 HFRRHL을 변종 HWCitGWV 및 HFCitCitHL과 비교하여(서열 1, 3, 10, 23), 전자가 주로 표적 항체와 접촉하는 반변, 후자는 주로 수소 결합을 갖는다는 것을 알았다. 이는 아르기닌을 함유하는 원래의 서열에 비해 약간 다른 특히 정전기적 성분과 관련한 변종의 결합 메커니즘을 나타낸다. 사실, 양으로 하전된(pH 7.4에서) 아르기닌을 전기적으로 중성인 시트룰린으로 치환함으로써, 결합의 정전기적 성분은 상당히 감소된다. 한편, 이는 펩타이드 변종의 표적 항체에 대한 예측된 결합 자유 에너지가 원래의 서열에 비해 낮도록 하고, 이는 결국 전자가 후자보다 낮은 결합력을 가질 수 있다는 것을 시사한다. 한편, 이는 변종이 음으로 하전된 단백질, 특히 생성물 순도를 낮추는 알부민의 비특이적 정전기적 결합이 덜 되게 할 수 있다. 이러한 차이는 크로마토그래피 프로토콜, 특히 IgG 수율 및 순도에 대한 결합 완충액의 전도도의 영향에 직접적인 영향이 있고, 본원에서 논의된다.

HWRGWV 및 HFRRHL의 다른 변종을 포르밀-트립토판 및 카르바모일-페닐알라닌을 사용하여 설계했지만, 어느 쪽도 좋은 점수를 얻지 못했다. 또 하나의 변종 HW_MetCitDW_MetV(서열 4)를, 아스파르트산과 IgG 위의 잔기 383-386 (SNGQ)(서열 24) 사이의 수소 결합을 잠재적으로 형성함으로써 친화도를 증가시키기 위한 목적으로 글리신을 아스파르트산으로 치환하여 생성했다. 그러나 기대와 달리 이 서열은 더 낮은 점수를 받았다. HYFKFD 및 그의 두 변종 HY_MetF_MetK_MetF_MetD 및 HY_MetF_MetK_(Met)2F_MetD(서열 2, 13, 7)를 또한 실행했지만, 평균적으로 HWRGWV, HFRRHL, 및 그의 변종과 비교하여 더 낮은 친화도를 나타내는, 더 좋지 않은 점수를 얻었다.

표 2에 열거된 서열을 모두 약 0.12 meq/g의 밀도로 도요펄 수지 위에 합성했다. 이렇게 얻어진 각 흡착제를 크로마토그래피 컬럼(0.1 mL)에 패킹하고 IgG 결합에 대해 시험했다. 통과액 및 용리 분획을 모으고 단백질 G 크로마토그래피에 의해 분석하여 IgG 수율을 평가했다(표 2). 각 서열에 대한 평균 순위와 수율의 비교는 도킹 모의실험과 항체 결합 실험 결과가 잘 일치한다는 것을 나타낸다. 이는 가상 라이브러리 설계, 도킹 제한 배정, 및 모의실험 결과 분석이 잘 수행되었고 펩타이드 변종 선택을 위한 유효한 전략을 이룬다는 것을 확인시켜준다.

표 2. 원래의 펩타이드 서열 및 그의 변종에 대해 얻어진 예측된 결합 자유 에너지, 도킹 순위, 및 IgG 수율. (서열 ***)

IgG 결합 및 단백질 분해 효소에 대한 저항성에 의한 펩타이드 리간드의 크로마토그래피 평가

표 2에 보고된 결과에 기초하여, 원래의 서열 HWRGWV, HFRRHL, 및 HYFKFD(서열 1 내지 3), 및 그의 변종 HW_MetCitGW_MetV, HF_MetCitCitHL, 및 HY_MetF_MetK_(Met)2F_MetD(서열 4, 5, 7)을 효소 소화에 대한 저항성에 대해 시험했다. 서열 HW_MetCitGW_MetV, HF_MetCitCitHL을 각각의 원래의 펩타이드의 최상의 변종으로 선택한 반면, HY_MetF_MetK_Met2F_MetD는 음성 대조물로 사용했다. 마지막으로, 중간 변종으로, 따라서 한 효소에만 저항성을 보일 것으로 기대되는 HWCitGWV 및 HW_MetRGW_MetV의 두 서열을 더 선택했다. 각 흡착제에 대해 다섯 번의 연속적인 크로마토그래피를 실행했다. 먼저, PBS 내의 10 mg/mL로 순수한 인간 다클론성 IgG 용액을 주입하여 임의의 효소와의 접촉 전의 각 흡착제에 대한 IgG 수율을 평가했다. 네 펩타이드 변종 모두 이 최초 실행에 대해 91% 초과의 수율을 냈다. 이어서 수지를 10 분 동안 트리스 완충액 pH 8.5 내의 α-키모트립신 용액에 접촉시켰다. 컬럼에 로딩된 효소의 양은 베르돌리바(Verdoliva) 등에 의해 수행된 대로 1:100 펩타이드:효소의 질량비였다[35]. 수지를 헹군 후, 이어서 IgG의 제2 주입을 수행하여 α-키모트립신에 의한 펩타이드 리간드 소화로 인한 결합력 손실을 평가했다. 이어서 수지를 제2 효소 용액, 즉, 동일한 펩타이드:효소 비의 트리스 완충액 pH 8.5 내의 트립신에 접촉시켰다. 마지막으로 제2 효소 처리 후 각 수지의 잔기 결합력을 추정하기 위해 제3 IgG 주입을 수행했다. 도 4는 흡착제 HW_MetCitGW_MetV-도요펄, HW_MetRGW_MetV-도요펄, HWCitGWV-도요펄, 및 HWRGWV-도요펄(서열 18,25, 26, 6) 수지에 대한 세 IgG 주입의 크로마토그램을 나타낸다.

HWRGWV는 트립신 및 α-키모트립신 두 효소 모두에 의해 분명히 분해된 반면에, 두 효소 처리 후 결합력의 손실에 의해 나타나는 바와 같이(도 2, a), 그의 변종 HW_MetCitGW_MetV는 그 중 어떤 것에 의해서도 완전히 영향받지 않았다(도 2, d). 예상대로, 중간체 변종 HW_MetRGW_MetV 및 HWCitGWV는 단지 하나의 효소, α-키모트립신 및 트립신 각각에 대해 저항성을 나타낸다(도 2, b 및 c). 다른 흡착제로 얻어진 결과를 표 3에 요약하고, 이는 처리 전(제1 실행) 및 α-키모트립신 처리 후(제2 IgG 주입) 및 트립신 처리 후(제3 IgG 주입) 후의 IgG 수율 값을 나타낸다.

도 2 패널 (A)-(D)는 천연 펩타이드 결합제 및 변성 펩타이드 결합제의 단백질 분해 소화를 나타낸다.

(A)의 크로마토그램은 단백질 분해 효소 둘 다가 원래의 펩타이드 리간드를 소화함을 나타낸다. 먼저, 트립신이 R을 공격하고, 이어서 α-키모트립신이 W에서 자른다.

(B)의 크로마토그램은 α-키모트립신이 변성된 W_M로 인해펩타이드를 절단하지 않지만, 트립신은 R에서 펩타이드를 절단한다는 것을 나타낸다.

(C)의 크로마토그램은 유사한 거동을 나타내지만, 트립신은 시트룰린이 R을 대체하기 때문에 효과가 없다.

(D)의 크로마토그램은 W를 W_M로 및 R을 시트룰린으로 대체함으로 인해, 어느 효소에 의한 분해도 나타내지 않는다.

복합 매질로부터의 친화도 정제에 대해 여러 다른 펩타이드 서열이 확인되었다. 마우스 복수액으로부터 항-과립 대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF) 단일클론성 항체 포획을 위해 합성 테트라펩타이드 라이브러리로부터 서열 APAR(서열 27)을 선택했다. 암종-관련 MUC1 뮤신에 대항하는 항체를 사용한 항원결정인자 맵핑에 의해 펩타이드 리간드 PDTRPAP(서열 28)를 확인했다. 에르리히(Ehrlich)와 동료들은 인간화 항-Tac IgG1 항체(HAT)의 pFc 단편에 대한 바이오패닝을 통해 파지-디스플레이 라이브러리로부터 펩타이드 서열 EPIHRSTLTALL(서열 29)을 단리했다. 파시나(Fassina) 및 동료들은 IgG의 Fc 부위에 결합하는 TG19318 또는 PAM(단백질 A 모방제)으로도 알려진 트리펩타이드 4합체(Arg-Thr-Tyr)₄-Lys₂-Lys-Gly(서열 30)를 확인했다. 최근, 룬트(Lund) 등은 아르기닌(A) 및 글리신(G) 및 합성, 방향족 산, 2,6-디-t-부틸-4-히드록시벤질 아크릴레이트(D)를 포함하는 D₂AAG(서열 31)라고 불리는 IgG 정제를 위한 펩타이드 리간드를 제시했다. 항체 정제에 대해 알려진 이들 펩타이드 리간드 모두는 트립신 및/또는 α-키모트립신에 의해 단백질 분해되기 쉽게 만드는 방향족(트립토판, 페닐알라닌, 티로신) 또는 염기성 아미노산(리신 및 아르기닌)을 함유한다. 따라서 여기에서 제안되는 방법은 프로테아제 저항성 펩타이드 변종의 설계에 대해 매우 넓은 유효성을 갖는다. 따라서 효소에 의한 절단에 저항성인 펩타이드 리간드 변종을 만드는 것이 가능하다. 이들 리간드는 동물 혈장으로부터 IgG 및 관심있는 임의의 다른 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다.

추가적으로 말하면, 본원의 발명이 단백질 분해 효소를 함유할 수 있는 임의의 바람직한 체액으로부터 정제될 모든 종류의 표적 생체 분자에 대해 일반적으로 유효한 생화학적으로 안정한 펩타이드 리간드 제조에 대해 보고되었지만 표적 생체 분자에 대한 리간드 변종 설계 및 그의 스크리닝 과정을 자동화하는 것이 가능하다는 것을 알아야 한다. 천연 아미노산을 포함하는 주어진 펩타이드 리간드에 대해, 소프트웨어는 변성 아미노산을 사용하여 펩타이드 변종의 라이브러리를 생성할 것이다. 이 설계 유닛은 또한 설계된 서열을 표적 분자에, 또는 보다 이상적으로는 표적 분자 위의 알려진 결합 부위에 도킹하는 이어지는 도킹 모듈과 연관될 것이다. 이 소프트웨어 패키지는 전문적인 도킹 프로그램을 갖지 않은 사용자에게 매우 유용할 것이다.

표 3 - 수지를 효소 용액과 접촉시키기 전후의 IgG 수율 값

리간드 HFRRHL 및 그의 유도체 HF_MetCitCitHL로 얻어진 결과는 HWRGWV 및 HW_MetCitGW_MetV와 매우 비슷하다. 서열 HWRGWV는 트립신에 대해 이상적인 기재이고, 이는 아르기닌과 관련된 C-위치의 글리신이 펩타이드로의 효소의 공격을 입체적으로 선호하기 때문일 가능성이 높다. 펩타이드 HFRRHL 또한 트립신에 대해 우수한 기재이지만, 서열 위의 아르기닌의 접근이 효소 공격을 약간 낮춘다. 대신 HYFKFD는 트립신의 공격의 영향을 거의 받지 않는데, 이는 펩타이드 위의 효소 활성 부위의 유효한 앵커링을 지연시킬 수 있는 리신을 둘러싼 잔기의 입체 장애때문일 수 있다. 그의 변종 HY_MetF_MetK_(Met)2F_MetD는 단백질 분해에 대해 높은 저항성을 보이지만, 낮은 수율 값은 서열이 단백질 회수에 부적합하다는 것을 나타낸다.

서열에 따라 다르긴 하지만, 이러한 결과는 유사한 항체 결합 특성을 유지하면서 천연 아미노산을 유사한 합성 잔기로 치환하는 것을 명확히 입증한다.

도킹 모의실험에 의해 예측된 원래의 서열의 결합 특성은 효소 소화에 대한 높은 저항성을 부여한다. 방향족 아미노산의 메틸화는 α-키모트립신에 의한 단백질 분해 공격을 현저히 낮추지만, 시트룰린 및 메틸화 리신의 사용은 트립신의 작용을 완전히 방해하는 것으로 보인다. 제안된 치환 중 가장 중요해보임에도 불구하고, 결합의 정전기적 요소를 낮추는 한, 시트룰린이 표적 결합 및 생화학적 저항성 모두의 측면에서 뛰어난 치환체인 것으로 증명되었다.

흡착제 HW _Met CitGW _Met V-, HF _Met CitCitHL-, 및 HY _Met F _Met K _(Met)2 F _Met D-도요펄 수지를 사용한 인간 혈장의 콘 분획 II+III으로부터의 IVIG 정제

IVIG 정제에 대한 제안된 리간드 변종의 적용가능성을 평가하기 위해, 인간 혈장의 콘 분획 II+III으로부터 다클론성 항체를 정제하기 위해 서열 HW_MetCitGW_MetV, HF_MetCitCitHL, 및 HY_MetF_MetK_(Met)2F_MetD를 사용했다. 원래의 펩타이드 리간드를 양성 대조물로 사용했다. 콘 II+III 페이스트의 미가공 원료를 PBS에 희석하여 원료 샘플을 제조하고 컬럼에 주입하기 전에 여과에 의해 고체 입자를 제거했다. 이 연구에 채용된 크로마토그래피 프로토콜은 이전의 최적화에서 유래했고 결합 완충액으로 PBS 내의 0.25 M NaCl의 사용 및 용리를 위한 0.2 M 아세테이트 완충액 pH 5.0을 포함했다[24]. 분획을 수집하고 단백질 G 크로마토그래피 및 SDS-PAGE(도 3)에 의해 평가하여 IgG 수율 및 순도 각각을 평가했다. 결과 요약을 표 4에 나타낸다.

표 4 . 인간 혈장의 콘 분획 II+III으로부터 정제된 IgG의 수율 및 순도. IgG 순도는 도 3에 보고된 쿠마씨-염색된 SDS-PAGE의 농도계 분석에 의해 측정된다.

변종 HW_MetCitGW_MetV 및 HF_MetCitCitHL로 얻어진 생성물 수율 및 순도는 원래의 서열 및 단백질 A에 의해 주어진 결과와 잘 비교된다. 소량의 알부민이 용리된 분획에서 검출될 수 있지만(도 3), 두 리간드 모두 매우 높은 생성물 수율 및 순도를 제공한다. 대부분의 관찰가능한 오염물질은 단순히 컬럼을 통과하고 다른 면역글로불린, 즉 IgA 및 IgM의 일부 결합이 발생할 수 있지만, 용리 조건(pH 5.0)은 용리된 분획에서 이들의 존재를 최소화하도록 선택된다[49]. 변종 HY_MetF_MetK_(Met)2F_MetD는 높은 생성물 순도를 제공했지만, 수율면에서의 성취는 낮았다. 후자는 위의 결과에 기초하여 예상되지만, 용리된 분획의 높은 IgG 순도는 예상되지 않는다. 알킬화된 아미노산의 사용으로 인한 높은 서열 소수성에도 불구하고, 소수성 상호작용에 의한 불순물의 비-특이적 결합이 거의 없다는 것이 놀랍다.

펩타이드 변종에 의해 결합된 알부민 및 다른 불순물의 양이 원래의 서열로 관찰된 것보다 일관되게 낮다는 것 또한 흥미롭다. 이는 종래의 발견 및 도킹 모의실험에 의해 제공된 정보에 비추어 설명할 수 있다. 예를 들어 pH 7.4에서 아르기닌 위에 하나 및 펩타이드 N-말단 위의 다른 하나의 두 양전하를 갖는 원래의 서열 HWRGWV는 정전기적 상호작용에 의해 혈장 내에 존재하는 가장 풍부한 음으로 하전된 단백질인 알부민(pI = 4.7)을 포획하는 것으로 확인되었다. 알부민 및 유사한 단백질 불순물의 이러한 비-특이적 결합을 피하기 위해, 생성물 수율 및 순도 면에서 최적의 절충을 가져오는 최적 수준까지 염화나트륨을 첨가함으로써 결합 완충액의 전도도를 증가시켰다[25]. 그러나 염의 사용은 정제 과정에의 추가적인 비용을 의미한다. 양으로 하전된 잔기를 시트룰린 및 디메틸화 리신과 같은 전기적으로 중성인 아미노산으로 대체하는 것은 결합 완충액 내에 존재하는 염의 양에도 불구하고 정전기적 결합의 정도를 내재적으로 낮출 수 있게 한다. 이러한 발견은, 리간드 변종에 의해 주어진 더 높은 순도를 설명하지만(표 3), 수율 및 순도에 대한 염의 영향에 대한 심도있는 연구를 필요로 하고, 이는 아래의 단락에 나타낸다.

흡착제 HWRGWV-도요펄, Ac-HWRGWV-도요펄, HW _Met CitGW _Met V-도요펄, 및 Ac-HW _Met CitGW _Met V-도요펄(서열 6, 32, 18, 22) 수지를 사용한 인간 혈장의 콘 분획 II+III으로부터의 IgG 정제에의 전도도의 영향

결합의 정전기적 요소의 정도를 확인하기 위해, 결합 완충액의 전도도가 생성물 수율 및 순도에 미치는 영향을 상이한 전하 값 및 분포를 갖는 네 개의 펩타이드 리간드를 사용하여 연구했다: a) 원래의 HWRGWV, b) 그의 아세틸화 버전 Ac-HWRGWV, c) 변종 HW_MetCitGW_MetV, 및 d) 그의 아세틸화 버전 Ac-HW_MetCitGW_MetV.

콘 분획 II+III으로부터 IVIG를 정제하기 위해 네 서열을 사용했다. HWRGWV를 사용한 IVIG 정제의 종래의 연구에서 위에서 언급한대로, PBS + 0.25 M NaCl을 최적의 결합 완충액으로 선택했다. 앞의 단락에서 얻어진 결론은 양으로 하전된 아미노산을 중성 잔기로 치환하는 것이 리간드의 정전기적 거동을 감소시키고 따라서 생성물 순도를 높일 것이라는 가설로 이어졌다. 이 가설을 확인하기 위해, 위에서 열거한 서열 및 PBS 내에 0 M, 0.13 M, 및 0.25 M NaCl을 포함하는 세 결합 완충액을 사용하여 결합 연구를 반복했다. 도 4는 네 흡착제 각각을 사용하여 상이한 전도도에서 얻어진 SDS-PAGE 결과를 나타내고, 표 9는 생성물 수율 및 순도의 결과 값을 나타낸다. 도 3. 다음의 흡착제를 사용한 인간 혈장의 콘 분획 II+III으로부터의 IgG의 크로마토그래피 정제의 SDS-PAGE(환원 조건): a) HWRGWV-도요펄 수지 및 HW _Met CitGW _Met V-도요펄 수지; b) HFRRHL-도요펄 수지 및 HF _Met CitCitHL-도요펄 수지; 및 c) HYFKFD-도요펄 수지 및 HY _Met F _Met K _(Met)2 F _Met D-도요펄 수지. 라벨: FT - 통과액 분획; EL - 용리 분획.

도 4. 결합 완충액 내 상이한 염 농도에서 수행된 인간 혈장의 콘 분획 II+III으로부터의 IgG 크로마토그래피 정제의 SDS-PAGE (환원 조건): a) HWRGWV 및 Ac-HWRGWV, b) HW_MetCitGW_MetV 및 Ac-HW_MetCitGW_MetV. 라벨: FT - 통과액 분획; EL - 용리 분획.

표 5. 상이한 염 농도의 결합 완충액을 사용하여 인간 혈장의 콘 분획 II+III으로부터 정제된 IgG 수율 및 순도. IgG 순도는 도 4에 보고된 쿠마씨-염색된 SDS-PAGE의 농도계 분석에 의해 평가했다.

표 5가 나타내는 대로, 펩타이드 위의 양전하 수를 낮추면 IgG 순도가 높아진다. 예상대로, 생성물 순도에 대한 결합 완충액의 전도도의 영향은 두개의 양전하를 갖고 따라서 정전기력의 차폐에 가장 민감한 HWRGWV의 경우 매우 명확하지만, Ac-HW_MetCitGW_MetV의 경우 전도도의 영향은 거의 무시할 수 있을 정도이다. 후자와 HW_MetCitGW_MetV 및 원래의 서열과 아세틸화된 형태의 비교는, 펩타이드 N-말단의 아세틸화가 아르기닌을 시트룰린으로 치환하는 것에 비해 생성물 수율 및 순도에 미치는 영향이 적다는 것을 나타낸다. 저 전도도 결합 완충액을 사용하여 Ac-HW_MetCitGW_MetV로 얻어진 IgG 순도(93%)는 HWRGWV(81% - 83%)를 사용하여 얻어진 임의의 값보다 높다. 특히, 변종에 대해 결합의 Δ_iG가 원래의 서열보다 약간 낮을 것으로 예측한 도킹 계산 결과에 기초하여 어느 정도 감소가 예상되었지만, 높은 순도는 90 % 초과로 안정하게 유지되는 수율을 희생하여 달성되지 않았다. 서열 Ac-HW_MetCitGW_MetV는 작은 펩타이드 리간드 친화도 크로마토그래피에 기초한 항체 정제의 가격이 적당하고 강성인 방법을 위한 많은 요구되는 특징을 갖는다.

결론

본 연구는 표적 친화도 및 선택성, 및 생화학적 안정성의 뛰어난 특성을 갖는 비-천연 아미노산을 포함하는 작은 펩타이드 리간드의 설계를 위한 전략을 제공한다. 공지된 펩타이드 서열, 특히 표적 생체 분자 위의 결합 부위에 대해 사용가능한 정보에 기초하고, 최신 모델링 수단을 사용하여, 본 방법은 결합 메커니즘을 편리하게 수정하거나 화학 및 생물학제 약제, 예를 들어 강산 및 강염기, 및 단백질 분해 효소에 대한 안정성을 부여하기 위한 주요 아미노산 잔기를 비-천연 변종으로 치환하는 것에 관한 것이다. 세 항체 결합성 펩타이드, HWRGWV, HYFKFD, 및 HFRRHL을 모델로 사용하여 더 높은 단백질 분해 저항성을 보이고 높은 표적 친화도 및 선택성을 유지하는 리간드 변종을 개발했다. 콘 분획 및 하이브리도마 세포 배양액과 같은 혈장-기재 유체로부터 회수된 항체의 높은 가치로 인해, 이 연구는 펩타이드에 주요 혈장 프로테아제, 트립신 및 α-키모트립신에 대한 생화학적 안정성을 부여하는 것을 목표로 했다. 이를 위해, 방향족 및 염기성 아미노산을 메틸화 변종 및 시트룰린으로 치환하고, 분자 도킹 소프트웨어 HADDOCK을 사용하여 IgG 위의 펩타이드 결합 부위(Ser383 - Asn389)에 대해 인실리코 스크리닝함으로써 변종의 가상 라이브러리를 설계했다.

도킹 계산 결과에 기초하여 선택된 펩타이드 변종을 크로마토그래피 수지 위에 합성하고 단백질 분해에 대한 저항성 및 인간 혈장의 콘 분획 II+III으로부터의 IVIG 정제에 대해 시험했다. 이들 변종은 부모 서열에 필적하는 표적 친화도 및 훨씬 높은 생화학적 저항성을 갖는다. 또한, HWRGWV-관련 변종의 IgG 결합 메커니즘의 정전기적 요소에 대한 심도있는 연구 결과로 원래의 HWRGWV에 비해 높은 선택성을 나타내는 서열 Ac-HW_MetCitGW_MetV를 확인했다. 흡착제 Ac-HW_MetCitGW_MetV-도요펄 수지는 알부민 및 다른 불순물의 본질적으로 낮은 결합을 나타냈고, 이는 높은 IgG 순도를 유지하기 위해 결합 완충액에 필요한 염의 양이 낮고 따라서 정제 비용이 더 낮다는 것을 의미한다.

여기에서 사용되는 접근법은 생체 분자를 표적화하는 임의의 작은 합성 또는 천연 펩타이드 리간드에 일반적으로 유효하다. 일단 결합 부위가 가까운 근사로 알려지면, 분자 도킹에 대한 신뢰할 수 있는 프로그램을 사용하여 빠르고 저렴하게 큰 라이브러리를 설계 및 스크리닝할 수 있다. 이들 수단은, 결합 강도의 근사한 추정을 제공하는 것에 더하여, 리간드-표적 상호작용의 성질과 관련된 직관을 또한 제공한다. 아미노산 치환의 적절한 선택은 펩타이드 리간드의 생화학적 특성을 미세조절할 수 있게 한다. 특히, 전하 뿐만 아니라 소수성 및 친수성기의 분포를 바꿈으로써, 생화학적 안정성에 더하여 친화도 및 선택성을 향상시킬 수 있다. 화학적 분해되기 쉬운 아미노산, 예를 들어, 알칼리 조건에서 탈아미드화되는 아스파라긴 및 글루타민을 대신한 합성 변종의 사용은, 가혹한 화학 약품이 단백질 용리 및 컬럼 세정 및 위생화에 사용되는, 친화도 크로마토그래피를 위한 펩타이드 리간드 설계에 특히 적합하다. 화학적 분해 정도의 감소는 더 긴 흡착제 수명을 의미한다.

본원에서 제시된 접근법은 또한 단백질 활성 메커니즘의 바탕을 이루는 비-공유 상호작용의 근본적인 연구에 부합한다. 적합한 아미노산을 사용하여 특정 결합 성분을 억제 또는 활성화함으로써, 바이오인지 현상을 연구하고 표적과 리간드 사이의 특정한 상호작용을 제어하는 작은 생체 분자를 설계할 수 있다. 이 연구는 여러 측면에서 표적 항체 결합에서 단백질 A를 능가하는 작은 펩타이드 변종을 제시함으로써 이 방향의 예를 제공한다. 이러한 발견은 바이오 분리 및, 보다 일반적으로는 바이오기술에서의 다양한 응용을 갖는 최적의 합성 단백질 모방제를 향한 전진을 나타낸다.

참조문헌

본 발명을 그의 자세한 설명과 함께 기술하였지만, 전술한 설명은 본 발명의 범위를 설명하려는 것이지 제한하려는 것이 아님을 이해할 것이다. 본 발명의 다른 측면, 이점, 및 변형은 아래에 제시된 청구항의 범위에 속한다. 이 명세서에서 언급된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 각 개별적인 간행물 또는 특허 출원이 명시적 및 개별적으로 참조문헌으로 포함되도록 표시된 것과 같이 참조문헌으로 본원에 포함된다.

표 6 - 비-천연 아미노산 예

SEQUENCE LISTING <110> North Carolina State University " Menegatti, Stefano" " Bobay, Benjamin" " Carbonell, Ruben" <120> Protease-Resistant Peptide Ligands <130> 127/83 PCT <140> PCT/US2014/046660 <141> 2014-07-15 "<150> 61/846,326" <151> 2013-07-15 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 1 His Trp Arg Gly Trp Val 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 2 His Tyr Phe Lys Phe Asp 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 3 His Phe Arg Arg His Leu 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> METHYLATION <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Citrulline <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> METHYLATION <400> 4 His Trp Xaa Asp Trp Val 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> CITRULLINE <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> CITRULLINE <400> 5 His Phe Xaa Xaa His Leu 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> TOYOPEARL <400> 6 His Trp Arg Gly Trp Val 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> DIMETHYLATION <400> 7 His Tyr Phe Lys Phe Asp 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> CITRULLINE <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> METHYLATION <400> 8 His Trp Xaa Gly Trp Val 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> CITRULLINE <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> METHYLATION <400> 9 His Trp Xaa Gly Trp Val 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> CITRULLINE <400> 10 His Trp Xaa Gly Trp Val 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> METHYLATION <400> 11 His Trp Arg Gly Trp Val 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> FORMYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> CITRULLINE <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> FORMYLATION <400> 12 His Trp Xaa Gly Trp Val 1 5 <210> 13 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> METHYLATION <400> 13 His Tyr Phe Lys Phe Asp 1 5 <210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> CARBOXYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> CITRULLINE <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> CITRULLINE <400> 14 His Phe Xaa Xaa His Leu 1 5 <210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 15 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 1 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> TOYOPEARL <400> 16 His Tyr Phe Lys Phe Asp 1 5 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> TOYOPEARL <400> 17 His Phe Arg Arg His Leu 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> CITRULLINE <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> TOYOPEARL <400> 18 His Trp Xaa Gly Trp Val 1 5 <210> 19 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> DIMETHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> TOYOPEARL <400> 19 His Tyr Phe Lys Phe Asp 1 5 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> CITRULLINE <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> CITRULLINE <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> TOYOPEARL <400> 20 His Phe Xaa Xaa His Leu 1 5 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> TOYOPEARL <400> 21 His Trp Arg Gly Trp Val 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> CITRULLINE <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> TOYOPEARL <400> 22 His Trp Xaa Gly Trp Val 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> CITRULLINE <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> CITRULLINE <400> 23 His Phe Xaa Xaa His Leu 1 5 <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 24 Ser Asn Gly Gln 1 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> METHYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> TOYOPEARL <400> 25 His Trp Arg Gly Trp Val 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> CITRULLINE <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> TOYOPEARL <400> 26 His Trp Xaa Gly Trp Val 1 5 <210> 27 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 27 Ala Pro Ala Arg 1 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 28 Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 1 5 <210> 29 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 29 Glu Pro Ile His Arg Ser Thr Leu Thr Ala Leu Leu 1 5 10 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 30 Arg Thr Tyr Arg Thr Tyr Arg Thr Tyr Arg Thr Tyr Lys Lys Lys Gly 1 5 10 15 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 31 Asp Asp Ala Ala Gly 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthetic <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> ACETYLATION <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> TOYOPEARL <400> 32 His Trp Arg Gly Trp Val 1 5

Claims

생물학제(biological)에 결합할 수 있는 3 내지 20 개의 아미노산을 포함하고 하나 이상의 염기성 아미노산(들) 또는 방향족 아미노산을 포함하고, 아미노산 중 하나 이상이 비-천연 아미노산 유사체로 치환된, 프로테아제 저항성 펩타이드.
제1항에 있어서, 비-천연 아미노산 유사체가 표 6에 열거된 것인, 프로테아제 저항성 펩타이드.
제1항에 있어서, 펩타이드가 헥사펩타이드인, 프로테아제 저항성 펩타이드.
제1항에 있어서, 프로테아제 저항성 펩타이드가 헥사펩타이드이고 비-천연 아미노산 유사체(들)로 치환되기 전에 서열 HWRGWV, HYFKFD 및 HFRRHL(서열 1 내지 3)을 갖는, 프로테아제 저항성 펩타이드.
제1항에 있어서, 펩타이드가 엔도펩티다아제에 의한 소화에 저항성인, 프로테아제 저항성 펩타이드.
제1항에 있어서, 펩타이드가 엑소펩티다아제에 의한 소화에 저항성인, 프로테아제 저항성 펩타이드.
제1항에 있어서, 엔도펩티다아제가 알파-키모트립신인, 프로테아제 저항성 펩타이드.
제1항에 있어서, 엔도펩티다아제가 트립신인, 프로테아제 저항성 펩타이드.
제1항에 기재된 프로테아제 저항성 펩타이드에 커플링된 고체 지지체.
생물학제가 고체 지지체에 결합하도록 적합한 조건에서 제9항에 기재된 고체 지지체를 생물학제와 접촉시키는 단계; 고체 지지체 및 결합된 생물학제를 세척하는 단계; 및 생물학제를 고체 지지체로부터 용리하여 생물학제를 정제하는 단계를 포함하는, 생물학제 정제 방법.
제10항에 있어서, 생물학제가 항체인, 방법.
제9항에 기재된 고체 지지체를 포함하는 진단용 키트.