JP3811524B2 - リガンドとして有用なペプチド - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はリガンドとして有用なペプチド、その製造方法及び免疫グロブリンリガンドとしてのその使用に関するものである。
さらに詳述すると、本発明は免疫グロブリンの一定部分にそれ自体を非共有的に結合し得るペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
抗体としても知られる免疫グロブリンは、診断及び治療分野で極めて重要である。事実、免疫グロブリンは先ず第一に生物学的流体中の化合物の同定及び定量化用に有用な試薬として広く使用される一方、第二に治療上重要な生理学的方法中に含まれる生物学的分子にそれ自体結合し得る薬剤として使用される。前述の重要性を考慮して、免疫グロブリンの製造特に精製は産業的観点から極めて重要である。
【０００３】
免疫グロブリンは動物の血清又は適当な細胞系の培養により得られる。
免疫グロブリンの精製は従来のクロマトグラフィー技術、例えばイオン交換又はゲル濾過、又は好ましくはスタフィロコッカス オウレウス（Staphylococcus aureus ）から得られ免疫グロブリンの一定部分にそれ自体特定的に結合し得るプロテインＡの固定化により製造したカラムを用いるカラムクロマトグラフィー（ジェー．シオダールの論文「ヨーロピアン ジャーナル オブ バイオケミストリー」第７８巻第４７１〜４９０頁１９７７年）により行なわれる。然し、プロテインＡはプロテインＡを用いて精製した生成物の汚染を防止する為には、抽出起源に由来して注意深い制御と精製を必要とするので、大規模に使用するには多大な制約がある。また、プロテインＡは、ビールス又は核酸部分等の生物学的汚染物を除去するのに用いられる薬剤の存在下で、変性条件に対し極めて安定ではない。最後に、プロテインＡの製造コストは極めて高くつき、大規模に精製する場合の使用を制限する。
【０００４】
従って、免疫グロブリンの一定部分を認識する能力に関する限り、低コストで製造できれば、プロテインＡを模倣し得る合成リガンドに対する多大な需要が依然として存在する。また、合成物が起源なので、生物学的汚染物が存在しなくなる。
今や、これ等の諸特性は、アルギニン、トレオニン及びチロシンのアミノ酸残基を有するペプチドにより示されることが見出された。
【０００５】
特に、前述の諸特性は、次の配列を有するペプチドにより示されることを見出した。
−HN−X₁−Thr −X₂−CO− ．．．．．（Ｓ）
式中で、
X₁はＬ又はＤ構造を有するアルギニン又はチロシンのアミノ酸残基を示し、
X₂はＬ又はＤ構造を有するチロシン又はアルギニンのアミノ酸残基を示し、
ThrはＬ又はＤ構造を有するトレオニンのアミノ酸残基を示し、
X₂がチロシンの場合にはX₁はアルギニンを示し、X₂がアルギニンの場合にはX₁はチロシンを示す。
配列（Ｓ）のアミノ酸残基の少なくとも一者以上がＤ構造を有することが好ましい。
配列（Ｓ）のアミノ酸残基の二者又は三者の全てがＤ構造を有することが特に好ましい。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の第一の目的は、次式（１）
（ H₂N−X₁−Thr −X₂−CO）_n −R ．．．（１）
（式中のX₁とX₂は互いに異なる基であって、Ｌ又はＤ構造のアルギニン又はチロシンのアミノ酸残基を示し、トレオニン及びチロシンの水酸基とアルギニンのグアニジン部分とは水酸基とグアニジン部分とを夫々保護するペプチド化学により常用される化合物により保護されている場合もあり、 ThrはＬ又はＤ構造を有するトレオニンのアミノ酸残基を示し、ｎは１、２、３又は４を示し、Rはｎが２、３又は４の場合には二量体、三量体又は四量体を生成するのに適する基を示し、ｎが１の場合には RはOH基、単独アミノ酸残基又はアミノ酸残基が７以下のペプチド鎖を示す）で表されるペプチドを提供するにある。
【０００７】
ここで「二量体」、「三量体」及び「四量体」の語は、２、３又は４ケの配列（Ｓ）を有するペプチドを意味する。
二量体（ｎ＝２）を生成するのに好適な基の代表的一例はリシン残基である。三量体（ｎ＝３）を生成するのに好適な基の代表的一例は、式 Lys−Lys で表わされるジペプチドリシル−リシンである。四量体（ｎ＝４）を生成するのに好適な基の代表的一例は、式 Lys−Lys(ε−Lys)で表される分枝鎖状トリペプチドである。
式（１）を有する四量体の代表的一例は、次式（Ａ）
(H₂N−X₁−Thr −X₂−CO)₄−Lys₂−Lys −Gly −OH ．．．．（Ａ）
（式中のX₁とX₂は前述したものを示し、トレオニン及びチロシンの水酸基とアルギニンのグアニジン部分とは水酸基とグアニジン部分とを夫々保護するペプチド化学により常用される化合物により保護されている場合もある）で表される。
ペプチド合成にあたって水酸基を保護する保護基は、文献に多数報告されている（ニューヨーク市フリーマン社１９９２年発行の使用者への案内書に記載されているジー．エー．グラントの論文「合成ペプチド」）。
【０００８】
前述の保護基の代表的例は、第３級ブチル（tBu)（ジー．ラ ジョイェ、エー．グリビッチ、ジェー．ジー．アダムソン「合成」第５７１〜５７２頁１９９０年）とベンジル基（ヨジマの論文「テトラヘドロン」第４４号第８０５〜８１９頁（１９８８年））である。
アルギニンのグアニジン部分を保護するのに有用な多数の基も、文献から多数知られている（ニューヨーク市フリーマン社１９９２年発行の使用者への案内書に記載されているジー．エー．グラントの論文「合成ペプチド」）。
前述の保護基の代表的例は、2,2,5,7,8 −ペンタメチルクロマン−6 −スルホニル(Pmc) と4 −メトキシ−2,3,6 −トリメチル−ベンゼン（Mtr)である（ラマージュ エンド グリーンの論文「テトラヘドロン レターズ」第２８号第２２８７頁１９８７年と藤野等の論文「ケミカル ファーマシューティカル ブーリチン」第２９号第２８２５頁１９８１年）。
【０００９】
かくて保護した式（１）の化合物の代表的例は、実施例１（ｄ）の化合物 Boc−D −Arg(Pbf)−D −Thr(tBu)−D −Tyr(tBu)−OMe と、実施例２の (H₂N −Arg(Pmc)− Thr(OtBu)−Tyr(OtBu) −CO)₄−Lys₂Lys −Gly −OHである。
ｎが１で Rがアミノ酸残基数１〜７のペプチドである場合、配列中に含まれる全てのアミノ酸は、互いに異なるもの又は同じものであって良く、Ｌ又はＤ構造を有する。Ｄ構造がＬ構造より好適である。また、単純で安価なアミノ酸が好ましい。
【００１０】
ｎが１の場合の Rの特定の例は、Gly 又はAla 、Gly −Gly 、Gly −Ala 、Ala −Gly 、Ala −Ala 、Gly −Gly −Gly 、Ala −Ala −Ala 、Gly −Gly −Gly −Gly 、Gly −Gly −Gly −Gly −Gly 、Gly −Ala −Gly −Ala −Gly 、Ala −Gly −Ala −Gly −Ala −Gly −Ala である。
式（１）のペプチドは従来の液相ペプチド製造技術と固体相ペプチド製造技術の双方により、容易に製造できる。
固体相ペプチド製造技術による製造は自動合成機により行うのが好適である。好適な自動合成機の代表的な一例は、米国カリホルニア州フォスター市のアプライド バイオシステムス社から販売されている４３１型である。製造は同社から推奨されている合成処理により行うのが好ましく、そのような合成処理は文献に多数記載されている既知方法に基づいて通常行う（１９８９年のオクスフォードＩＲＬプレス発行の「実用的接近」中のアサートン及びシェパードの論文「固体相ペプチド合成」）。
【００１１】
本発明の第３の目的は、前述の免疫グロブリン又はその混合物の分離工程において、少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンと錯体を生成する式（１）の化合物の使用を提供するにある。
式（１）の化合物との非共有結合により錯体を生成し得る免疫グロブリンは、例えばマウスIgG 、ラットIgG 、チキンIgY 、山羊IgG 、牛IgG 、ヒトIgG 、ヒトIgＡ及び他の種のこれ等の免疫グロブリンであり、ヒトIgM 及び他の種のIgM である。
【００１２】
免疫グロブリンの分離生成方法の代表的一例は、
（ｉ）少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンに対しそれ自体を非共有的に結合し得る化合物を、アフィニティークロマトグラフィーの支持体上に固定化する段階と、
（ii）前述のアフィニティークロマトグラフィーの支持体をクロマトグラフィーカラム中に充填する段階と、
(iii)免疫グロブリンと固定化した化合物との間の相互作用を促進し得る緩衝剤を用いて、前述のクロマトグラフィーカラムを平衡化する段階と、
（iv) 少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンを有する流体を前述のカラムに負荷させる段階と、
（ｖ）免疫グロブリンと固定化した化合物との間の相互作用を妨げることなく不純物を溶離し得る少なくとも一種以上の液体を用いて前述のカラムを洗浄する段階と、
（vi）カラム上に先に吸着した前述の免疫グロブリンを解離性溶離剤により溶離する段階とを有する免疫グロブリンの分離精製方法において、少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンに対しそれ自体を非共有的に結合し得る化合物が式（１）の化合物である（式中のX₁、X₂、n 、R 及び Thrは上述したと同じものを示す）ことを特徴とする免疫グロブリンの分離精製方法である。
【００１３】
（ｉ）〜（vi）の段階は、従来技術により行う。
アフィニティークロマトグラフィーの支持体は、ペプチド及びプロテインとの直接結合の為にエポキシド基を用いてアフィニティークロマトグラフィーの支持体を予め活性化することが好ましい。好適な支持体の代表的例は、スウェーデンのファーマシア社から市販されている樹脂活性化したＣＨセファロース（登録商標名）４Ｂ、米国ウォータース社から市販されている樹脂プロテイン−パック（登録商標名）、ドイツ国ローム エンド ハース社から市販されている樹脂ユーペルギット（登録商標名）Ｃ３０Ｎ又は米国ビオラッド社から市販されているものである。
【００１４】
段階（ｉ）はｐＨが８．５〜９．０の弱塩基性緩衝溶液の存在下で実施することが好ましい。
段階(iii) は中性緩衝剤、例えばｐＨ６．５の２５ミリモルのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ溶液又はｐＨ７．０の５０ミリモルの燐酸塩緩衝剤溶液、を用いて行うことが好ましい。
段階（ｖ）は低イオン強度の中性緩衝剤、例えばｐＨ６．５の２５ミリモルのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ溶液を用いて行うことが好ましい。
段階（ｖ）で有用な解離性溶離液は、例えば酸性又は塩基性溶液である。代表的な例はｐＨ２．５の酢酸水性溶液又はｐＨ９．０の重炭酸ナトリウム水性溶液である。
【００１５】
この分離精製技術は広く文献に記載されている（１９９４年発行のジャーナルオブ クロマトグラフィー第６５８号第２３７〜２５８頁に記載されているエス．アール．ナラヤナンの論文「プロテインの予備的アフィニティークロマトグラフィー」と、オランダ国アムステルダムのエヌ．エルゼヒールのワーク エンド ブルドン第７巻第２部に記載されたシー．アール．ローウェの論文「生化学及び分子生物学における実験室技術」と、１９７８年発行の免疫化学第１５巻第４２９号に記載されたエイ等の論文）。
【００１６】
本発明の化合物は周知のＥＬＩＳＡ技術により免疫グロブリン又は免疫グロブリン混合物の定性的又は定量的測定に用いることもできる。
ＥＬＩＳＡ技術による免疫グロブリン又は免疫グロブリン混合物の定量的測定方法の代表的一例は、
（ｉ）少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンに対しそれ自体を非共有的に結合し得る化合物をＥＬＩＳＡ測定用のマイクロタイタープレート上に固定化する段階と、
（ii）測定しようとする単数又は複数の免疫グロブリンを含有する試料を前述のマイクロタイタープレート上で培養する段階と、
(iii)前述のマイクロタイタープレートを洗浄する段階と、
（iv）かくて生成した固定化した錯化合物／免疫グロブリンを検査する段階と、を有する免疫グロブリン又はその混合物の試験方法において、
少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンに対しそれ自体を非共有的に結合し得る化合物が式（１）の化合物である（式中のX₁、X₂、n 、R 及び Thrは女子下津市田と同じものを示す）ことを特徴とする免疫グロブリン又はその混合物の試験方法である。
【００１７】
ＥＬＩＳＡ技術による免疫グロブリンの分析的測定方法は、文献に広く記載されている（英国オクスフォード市ブラックウエルのジョンストン エンド トルペの論文「実地での免疫化学」１９８７年）。
段階（ｉ）ではプラスチックス製、例えばＰＶＣ製のマイクロタイタープレートに９６ケの凹みを設け、種々な量（０〜５０μｇ／凹み）のリガンドを含有するｐＨ９．０の０．１M の重炭酸ナトリウム溶液を充填したものを用いることが好ましい。２４時間の培養後、過剰の溶液を除去し、燐酸塩緩衝剤を用いてマイクロタイタープレートを洗浄し、凹みに３％牛アルブミン溶液を充填して、特定の相互作用部位を根絶する。
【００１８】
段階（ii）では燐酸塩緩衝剤を用いてマイクロタイタープレートを洗浄し、凹みに好ましくはビオチンを用いて誘導体化した免疫グロブリン含有溶液を充填する。次いでマイクロタイタープレートを２０〜３７℃で４〜１８時間培養する。
段階(iii) での洗浄は燐酸塩緩衝剤を用いて行うのが好ましい。
段階（iv）はペルオキシダーゼに抱合したアビジンの溶液を各凹みに添加することにより行う。２時間の培養後、マイクロタイタープレートを洗浄する。洗浄は再び燐酸塩緩衝剤を用いるのが好ましい。次いで O−フェニレンジアミン溶液を添加し、適当なELISA 読取機により色の生成を検出する。
本発明のこれ等の特色及びその他の特色は、以下の実施例と図面の説明からさらに明瞭になるであろう。
【００１９】
図１は兎の粗血清から免疫グロブリンを精製することを示す図であり、図２は兎の血清の精製から誘導した画分のポリアクリルアミド ゲル上での電気泳動分析を示す図である。
式（１）の化合物の固体相合成は、米国カリホルニア州フォスター市のアプライド バイオシステムスから市販されている４３１Ａ型自動ペプチド合成機とソフトウエア バージョン1.1を用い、製造者により推奨されている合成処理に従い、文献に広く報告されている既知の技術方法（英国オクスフォード市ＩＲＬプレス発行の「実際の試み」に記載されたアサートン エンド シェパードの論文「固体相ペプチドの合成」１９８８年）に基づいて行なった。
【００２０】
【実施例】
以下の実施例は本発明を一そう良く説明する為のもので、如何なる意味でも本発明を限定するものではない。実施例中で「Cat.No. 」はカタログ番号を示す。
〔実施例１〕
アミノ酸がＤ構造を有する式（１）のペプチド（ X ₁ が Arg であり、 X ₂ が Tyr であり、 n が１であり、 R が OH であるもの）の溶液調製
この合成は保護されたペプチド Z−D −Thr(ｔBu) −D −Tyr(ｔBu) −OMe の調製から始まり、次いでこれを先ずNdテルミナスのZ 保護基を除去し、アルギニンアミノ酸と結合させて誘導体 Boc−D −Arg(Pbf)−D −Thr(tBu)−D −Tyr(tBu)−OMe を得、然る後完全に脱保護して式（１）のペプチドとした。
【００２１】
a) H − D − Tyr(tBu) − OMe （分子量２５１ amu ）の調製
H−D −Tyr(tBu)−OH（３．５５ｇ、１５ミリモル、バッヘム ファインケミカリーエン社製、カタログ番号Ｆ−２１７０）を１００ｍｌのCh₃OH に懸濁し−１５℃に冷却した懸濁液に、３．５４ｇのSOCl₂(３０ミリモル、アルドリッヒ社製、カタログ番号２３，０４６−４）を添加した。室温で２時間次いで９０℃で２時間振盪した後、溶媒を蒸発により除去し、残留物を KOH上で一夜乾燥した。かくて、４．２１ｇの粗生成物を塩酸塩（１４．７ミリモル）として得た。収率９８％。
【００２２】
b) Z − D − Thr( ｔ Bu) − D − Tyr( ｔ Bu) − OMe （分子量５４１ amu ）の調製
７．２１ｇ（１０ミリモル）の Z−D −Thr(ｔBu) −D −Tyr(ｔBu) −OMe （ＤＣＨＡ、バッヘム ファインケミカリーエン社製、カタログ番号Ｃ−１４８０）と１．６５ｍｌ（１６．２ミリモル）の N−メチル モルホリン（ＮＭＭ、シグマ社製、カタログ番号Ｍ−７８８９）とを７５ｍｌの乾燥した N−メチル ピロリドン（ＮＭＰ）に溶解した溶液に、振盪しながら−１０℃で、２．１２ｍｌ（１６．２ミリモル）のイソブチルクロロホルミエート（ＩＢＣＦ、シグマ社製、カタログ番号Ｉ−３２５３）を９ｍｌの CHCl₃中に希釈した溶液を滴加した。２０分後、４．２１ｇ（１４．７ミリモル）の H−D −Tyr(tBu)−OMe ・HCl と１．７５ｍｌのＮＭＭとを７５ｍｌのＮＭＰに溶解した溶液を滴加した。次いで、約３ｍｌのＮＭＭをさらに添加して、ｐＨを７．５〜８．０とした。
【００２３】
反応混合物を０℃で２時間振盪した後、−夜室温で振盪した。
析出した塩を炉別し、溶液をAcOEt −ヘキサンを溶離液として用いるシリカゲル上のフラッシュ クロマトグラフィーにより濃厚化した。所望の生成物（４．２３ｇ、７．４５ミリモル）を純粋な油状物（ＴＬＣ）の形で得た。
【００２４】
c) H−D −Thr(tBu)−D −Tyr(tBu)−OMe( 分子量４０７ amu) の調製
４．０３ｇの Z−D −Thr(tBu)−D −Tyr(tBu)−OMe(７．４５ミリモル）を２５０ｍｌのCH₃OH 中に溶解した。活性炭上に担持した１０％のPd８５０ｍｇ（フルカ社製、カタログ番号７５９９０）を添加した後、振盪しながら室温の溶液上に水素気流を４時間流した。この水素化反応をＴＬＣによりモニターした。触媒を濾別し、濾液の蒸発後、２．８８ｇ（７．０８ミリモル、収率９５％）の H−D −Thr(tBu)−D −Tyr(tBu)−OMe を純粋な油状物（ＴＬＣ）の形で得た。
【００２５】
d) Boc−D −Arg(Pbf)−D −Thr(tBu)−D −Tyr(tBu)−OMe( 分子量９１６ amu ）の調製
３．７３ｇ（７．０８ミリモル）の Boc−D −Arg(Pbf)−OH（バッヘム ファインケミカリエン社製、カタログ番号Ａ−３７５０）を７５ｍｌの乾燥したＮＭＰ中に溶解した清澄な溶液であって０．８５ｍｌ（７．７９ミリモル）のＮＭＰを含有するものを、振盪しながら−１０℃に冷却した。次いで、１．０２ｍｌ（７．７９ミリモル）のＩＢＣＦを６ｍｌの CHCl₃中に希釈した溶液を滴加した。３０分後、２．８８ｇ（７．０８ミリモル）の H−L −Thr(tBu)−L −Tyr(tBu)−OMe を７５ｍｌのCHCl₃ 中に溶解した溶液を２０分で滴下した。反応混合物を０℃で２時間常温で一夜維持した。溶媒を真空蒸発させ、粗生成物をAcOEt −ヘキサンを溶離液として用いるシリカゲルカラム上のフラッシュ クロマトグラフィーにより精製した。かくて、５．５８ｇ（６．０８ミリモル、収率８６％）の Boc−D −Arg(Pbf)−D −Thr(tBu)−D −Tyr(tBu)−OMe を純粋な油状物（ＴＬＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣ）として得た。
【００２６】
e) H − D − Arg − D − Thr − D − Tyr − OH ( 分子量４３８ａｍｕ）の調製
前述の油状物を次の組成を有する混合物１００ｍｌを用いて２時間処理した。
【表１】

【００２７】
トリフルオロ酢酸の真空蒸発により溶液を約１０ｍｌに濃縮し、１５０ｍｌの低温エチルエーテルの添加により粗ペプチド性物質を析出させた。析出剤の除去後、１００ｍｌの低温エチルエーテルを用いて順次に洗浄して、スカベンジャーがより良く可溶化するようにした。全てのペプチド性物質を５０ｍｌのH₂O/CH₃CN/TFA の50/50/0.1 比の溶液中に溶解した後、凍らせ、凍結乾燥した。
かくて、４．３２ミリモルに相当する１．８９ｇのトリペプチド H−D −Arg −D −Thr −D −Tyr −OHを回収した。収率７１％。生成物の一分液５μｇをＲＰ−ＨＰＬＣ分析したところ、純度９７％であった。
【００２８】
同様に作業して次の化合物をさらに調製した。
H −L −Arg −L −Thr −L −Tyr −OH
H −L −Tyr −L −Thr −L −Arg −OH
H −D −Tyr −D −Thr −D −Arg −OH
調製収率、最終純度及び実験的に質量分光法により測定した分子量は、次の表２に示す通りであった。
【００２９】
【表２】

【００３０】
〔実施例２〕
アミノ酸がＬ構造を有する場合の式（１）のペプチド（式中で X ₁ が Arg を示し、 X ₂ が Tyr を示し、ｎ＝４であり、Ｒ＝ Lys-Lys( ε Lys) − Gly を示す）の固体相調製
このペプチドの調製は、米国アプライド バイオシステムス社の４３１型の自動ペプチド合成機を用い、Fmoc/HOBt/DCC の方法（ケミカル ベリヒテ第１０３号第７８８〜７９８頁１９７０年に記載されたダブリュ．コーニヒとアール ガイガーの論文）により、製造者が推奨する様式に基づいて行なった。
【００３１】
この調製は０．１ミリモル規模で行ない、N-末端アミノ基をFmoc基で保護したグリシン（クロロトリチリクロリドリック、ノボビオケム社製、カタログ番号０４−１２−２８００、０．１ミリモル）を用いて予め誘導体化したペプチド合成用酸不安定樹脂から出発し、これを最初の合成サイクル中で３．０ミリモルのピペリシン（Ｎ−メチル−２−ビロリドン（ＡＢＩ社製、カタログ番号４００６２９）中に２０％）を用いて室温で１４分間振盪する処理により保護を解除した。
保護を解除した樹脂を、２．５ｍｌのＮ−メチル−２−ピロリドン（メルク社製、カタログ番号８０６０７２）を５回用いて、室温で振盪しながら９分間洗浄した。
【００３２】
次いで、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、アプライド バイオシステムス社製、カタログ番号４００６６２）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、アプライド バイオシステムス社製、カタログ番号４００６６３）の溶液を用いる培養により相応するベンゾトリアゾール化合物活性エステルに予め変性したアミノ酸Fmoc−Lys(Fmoc)(ノバビオケム キャタリスト社製、カタログ番号０４−１２−１０８５）酸を結合させた。α位及びε位のFmoc保護基の除去後、Fmoc−Lys(Fmoc)(ノバビオケム キャタリスト社製、カタログ番号０４−１２−１０８５）の２回目の結合を達成して、中央の四量体コアＲを生成した。次いで、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、アプライド バイオシステムス社製、カタログ番号４００６６２）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、アプライド バイオシステムス社製、カタログ番号４００６６３）の溶液を用いる培養により相応するベンゾトリアゾール化合物活性エステルに予め変性したFmoc−Tyr(tBu)−OH（バッヘム ファインケミカリーエン社製、カタログ番号Ｂ−１２５５）酸を結合させた。
【００３３】
この樹脂／活性化したアミノ酸の懸濁液を５１分間振盪した。チロシン残基の結合中、トレオニン樹脂の活性化を達成した。１ミリモルのFmoc−Thr(tBu)−OH（バッヘム ファインケミカリーエン社製、カタログ番号Ｂ−１２４５）を、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、アプライド バイオシステムス社製、カタログ番号４００６６２）及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、アプライド バイオシステムス社製、カタログ番号４００６６３）の溶液を用いる培養により相応するベンゾトリアゾール化合物活性エステルに変性した。
【００３４】
チロシンの結合が終了したとき、樹脂をＮ−メチル−ピロリドン（ＮＭＰ）を用いて入念に洗浄した。Fmoc基の除去はＮＭＰ中に溶解した２０％のピペリシン３ｍｌを用いる処理により達成した。ＮＭＰを用いて数回洗浄した後、予め活性化したアミノ酸トレオニンを樹脂上に移送した。結合反応は５１分間続き、その時間中第三のアミノ酸アルギニンを活性化した。誘導体Fmoc−Arg(Pbf)−OH（バッヘム ファインケミカリーエン社製、カタログ番号Ｂ−２３７５）を用いた。活性化方法はトレオニンの活性化と同様であった。
【００３５】
トレオニンのアシル化とそれに続くピペリジンを用いるFmoc基の除去の後、活性化したアルギニンを結合段階用に樹脂上に移送した。過剰のアミノ酸を除去する為所要の洗浄を行ないアルギニン残基上においてもFmoc基を脱保護した後、樹脂を先ずＮＭＰを用いて次いでジクロロメタン（ＤＣＭ）を用いて入念に洗浄した。最後に樹脂をアルゴン気流により乾燥した。215.8 mgの樹脂を回収した。
樹脂を酢酸（メルク社製、カタログ番号６３）、ジクロロメタン（メルク社製、カタログ番号６０５０）及びエタノール（メルク社製、カタログ番号８００６）の８０：１０：１０V/V 比の混合物を用いて処理することにより、次式
(H₂N-Arg(Pmc)-Thr(OtBu)-Tyr(OtBu)-CO)₄-Lys₂-Lys-Gly-OH
で表される充分に保護された四量体を調製した。
【００３６】
この処理は樹脂からのペプチドの脱着を可能とするが、アミノ酸側鎖の保護基の脱着を可能とはしない。
或いは又、実施例１の表１に示した組成を有するトリフルオロ酢酸及びスカベンジャーの混合物１０ｍｌを用いて樹脂を処理することにより、次式
(H₂N-Arg−Thr-Tyr-CO)₄-Lys₂-Lys-Gly-OH
で表される充分に脱保護された四量体が得られる。
【００３７】
前述の樹脂溶液を真空下でトリフルオロ酢酸を蒸発させることにより、約１ｍｌに濃縮した。３０ｍｌの低温エチルエーテルの添加により、粗ペプチド性物質を析出させた。析出剤の除去後、３０ｍｌの低温エチルエーテルを用いて第２回の洗浄を行ない、スカベンジャーをさらに可溶化した。全てのペプチド性物質を５ｍｌのH₂O/CH₃CN/TFA の50/50/0.1 比の溶液中に溶解した後、凍らせ、凍結乾燥した。
１０３．８ｍｇの四量体性トリペプチド（H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr-)₄-Lys₂-Lys-COOHを回収した。生成物の一部分５μｇをＲＰ−ＨＰＬＣ分析したところ、純度が９７％に近かった。
同様に実施して、表３に示す化合物をさらに調製した。
【００３８】
【表３】

【００３９】
〔実施例３〕
活性化したＣＨ−セファロース４Ｂ上の実施例１及び２のペプチドの固定とアフィニティー クロマトグラフィーにより血清からの免疫グロブリンの精製 式(H-L-Arg-L-Thr-L-Tyr-)₄-Lys₂-Lys-Gly-OH で表されるペプチド（５ｍｇ）をｐＨ９．０の０．１M 重炭酸ナトリウム緩衝液５ｍｌ中に溶解し、次いで１．２ｇの活性化した樹脂ＣＨ−セファロース４Ｂ（スウェーデン国ウップサラのファルマシア社製、カタログ番号１７−０４９０−０１）、これはペプチド及びプロテインとの直接結合用に予め活性化したアフィニティー クロマトグラフィー用のクロマトグラフィー支持体である、に添加した。この懸濁液を２４時間振盪し、反応混合物の一部分を種々異なる時間に採取して、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析することにより結合レベルをモニターした。
【００４０】
２４時間後、約９０％の当初ペプチドが樹脂に共有結合して生成した。この誘導体化した樹脂を５０ｍｌのｐＨ９．０の１M TRISを用いて洗浄し、次いでガラスカラム（１００×６．６ｍｍ内径）上に充填した。
本発明の他の化合物を用いて同様に実施して、次の表４に示す免疫グロブリン収率を得た。
【００４１】
【表４】

【００４２】
免疫グロブリンを生成する為に、カラムを２５ミリモルのｐＨ６．５のＢＩＳ−ＴＲＩＳ緩衝液（シグマ社製、カタログ番号Ｂ９７５４）を用いて、１ｍｌ／分の流量で平衡化し、一方溶離液を２８０ｎｍでモニターした。次いで、１ｍｌの粗兎血清（シグマ社製、カタログ番号Ｒ９１３３）をカラム上に負荷させ、カラム空隙容積に非保持物質を溶出した後、溶離液を０．１Ｍ酢酸に変更した。
【００４３】
かかる処理により脱着した物質を集合し、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動分析により分析した。
粗血清からの兎免疫グロブリンのアフィニティークロマトグラフィーによる精製を図１に示し、集合した諸部分の電気泳動分析を図２に示す。電気泳動分析から明らかに判るように、カラムは粗血清からの免疫グロブリン部分を保持することができ、一方、アルブミンは保持されず、カラム空隙容積に溶出された。また、図２は、異なる緩衝剤即ち（Ａ）ｐＨ５．７の０．１Ｍ酢酸アンモニウム、（Ｂ）ｐＨ７．０の０．１ M 燐酸ナトリウム又は（Ｃ）ｐＨ８．５の０．１Ｍ燐酸ナトリウムを用いて、アフィニティーカラムの平衡後に得た幾つかの兎免疫グロブリンの精製に相応する電気泳動分析をも示す。０．１Ｍ酢酸を用いる処理により脱着さた諸部分の電気泳動分析から明らかに判るように、３つの場合の何れにおいても免疫グロブリンが汚染物から最適に精製された。
【００４４】
さらに、カラムは（Ｅ）０．５ｍｌの血清からの免疫グロブリンの精製、（Ｆ）１ｍｌの血清からの免疫グロブリンの精製及び（Ｇ）１．５ｍｌの血清からの免疫グロブリンの精製を可能とする極めて優れた精製能力を示した。このカラム選択性は固定化したプロテインＡを用いるカラムの選択性よりも優れていた。実際に、同じ大きさを有する固定化したプロテインＡのカラム上での同じ血清の精製は、常に痕跡量のアルブミンを含有する精製諸部分を提供した。検査下の単量体性及び多量体性ペプチドの双方及びＬ又はＤ構造のアミノ酸を用いて調製したそれ等の同族体の精製能力は同様であり、使用したアフィニティークロマトグラフィー支持体の種類によっては左右されなかった。実際に、プロテイン−パック（米国ウオータース社製）、ユーペルギットＣ３０Ｎ（米国シグマ社製）及びアフィ−ゲル（米国ビオ−ラド社製）等のような他の支持体を用いた場合にも、同様な結果を得た。
【００４５】
マウス、ラット、山羊、羊、馬、ヒト及び牛の血清からのＩｇＭの単離並びに粗給源からの鶏のＩｇＹ、ヒトのＩｇＡ及びヒトのＩｇＭの単離にあたり、式（１）の固定化したペプチドを用いて調製したカラムを用いて同様な結果を得た。
【図面の簡単な説明】
【図１】式(H−Ｌ−Arg −Ｌ−Thr −Ｌ−Tyr-)₄−Lys₂−Lys −Gly −OHで表わされる化合物の固定化により製造したカラム上でアフィニティークロマトグラフィーを用いることにより、兎の粗血清から免疫グロブリンを精製することを示す図である。
【図２】式(H−Ｌ−Arg −Ｌ−Thr −Ｌ−Tyr-)₄−Lys₂−Lys −Gly −OHで表わされる化合物と種々な緩衝剤と種々な量の血清を用いることによる兎の血清の精製から誘導した画分のポリアクリルアミド ゲル上での電気泳動分析を示す図である。

Claims (23)

1. 次の一般式（１）
   (H₂N−X₁−Thr −X₂−CO)_n −R ．．．．（１）
   （式中のX₁とX₂は互いに異なる基であって、Ｌ又はＤ構造のアルギニン又は
   チロシンのアミノ酸残基を示し、トレオニン及びチロシンの水酸基とアルギニンのグアニジン部分とは水酸基とグアニジン部分とを夫々保護するペプチド化学により常用される化合物により保護されている場合もあり、Thr はＬ又はＤ構造を有するトレオニンのアミノ酸残基を示し、ｎは１、２、３又は４を示し、R はｎが２、３又は４の場合には二量体、三量体又は四量体を生成するのに適する基を示し、ｎが１の場合にはR はOH基、単独アミノ酸残基又はアミノ酸残基が７以下のペプチド鎖を示し、但し、 X ₁ がチロシンであり、 X ₂ がアルギニンであり、 n が１であり、 R が単独のアミノ酸残基である場合、 R はイソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン又はトリプトファンではなく、 X ₁ がアルギニンであり、 X ₂ がチロシンであり、ｎが１であり、 R がペプチド鎖である場合、 R は式 Gln-Lys-Ser-Thr-Glu-Ler で表されるペプチド鎖ではない）で表されることを特徴とする免疫グロプリンリガンド。
2. ｎが１である請求項１記載の免疫グロプリンリガンド。
3. ＲがOH基である請求項２記載の免疫グロプリンリガンド。
4. ｎが４である請求項１記載の免疫グロプリンリガンド。
5. Ｒが式 Lys−Lys(ε−Lys)−で表される分枝鎖状トリペプチドである請求項４記載の免疫グロプリンリガンド。
6. Ｒが式 Lys−Lys(ε−Lys)−Gly で表される分枝鎖状テトラペプチドである請求項４記載の免疫グロプリンリガンド。
7. 少なくとも１ケ以上のアミノ酸がＤ構造を有する請求項１、２、３、４、５、又は６記載の免疫グロプリンリガンド。
8. 免疫グロブリンのリガンドとして用いる為の請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の式（１）の免疫グロブリンリガンド。
9. （ｉ）少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンに対しそれ自体を非共有的に結合し得る化合物を、アフィニティークロマトグラフィーの支持体上に固定化する段階と、
   （ii）前述のアフィニティークロマトグラフィーの支持体をクロマトグラフィーカラム中に充填する段階と、
   （iii）免疫グロブリンと固定化した化合物との間の相互作用を促進し得る緩衝剤を用いて、前述のクロマトグラフィーカラムを平衡化する段階と、
   （iv）少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンを有する流体を前述のカラムに負荷させる段階と、
   （ｖ）免疫グロブリンと固定化した化合物との間の相互作用を妨げることなく不純物を溶離し得る少なくとも一種以上の液体を用いて前述のカラムを洗浄する段階と、
   （vi）カラム上に先に吸着した前述の免疫グロブリンを解離性溶離剤により溶離する段階とを有する免疫グロブリンの分離精製方法において、少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンに対しそれ自体を非共有的に結合し得る化合物が、請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の式（１）の化合物であることを特徴とする免疫グロブリンの分離精製方法。
10. ペプチド及びプロテインとの直接結合の為にエポキシド基を用いてアフィニティークロマトグラフィーの支持体を予め活性化する請求項９記載の方法。
11. アフィニティークロマトグラフィーの支持体が樹脂活性化したＣＨセファロース（登録商標）４Ｂである請求項１０記載の方法。
12. アフィニティークロマトグラフィーの支持体が樹脂プロテイン−パック（登録商標）である請求項９記載の方法。
13. 塩基性緩衝剤溶液の存在下で段階（ｉ）を行う請求項９記載の方法。
14. ｐＨが８．５〜９である請求項１３記載の方法。
15. 段階(iii) で用いる緩衝剤溶液が中性であって弱いイオン強度を有する請求項９記載の方法。
16. ｐＨが６．５〜７である請求項１５記載の方法。
17. 段階（ｖ）で用いる洗浄液が緩衝溶液である請求項９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６記載の方法。
18. ｐＨが６．５である請求項１７記載の方法。
19. 酸性又は塩基性溶液を用いて溶離段階（vi）を行う請求項９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８記載の方法。
20. ｐＨ２．５の酸性水性溶液、ｐＨ３のグリシンの０．１M水性溶液又はｐＨ９の重炭酸ナトリウム水性溶液を用いる請求項１９の方法。
21. 溶液相技術又は固体相技術により反応を行うことにより、請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の式（１）の免疫グロブリンリガンドを製造する方法。
22. 固体相内での製造を適当な自動合成機を用いて行う請求項２１の方法。
23. ＥＬＩＳＡ技術により免疫グロブリン又はその混合物を試験するにあたり、
    （ｉ）少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンに対しそれ自体を非共有的に結合し得る化合物を、ＥＬＩＳＡ決定用マイクロタイタープレート上に固定化する段階と、
    （ii）測定しようとする免疫グロブリンを前述のマイクロタイタープレート上でインキュベートする段階と、
    (iii)前述のマイクロタイタープレートを洗浄する段階と、
    （iv）かくて生成した固定化した錯化合物／免疫グロブリンを検査する段階と、を有する免疫グロブリン又はその混合物の試験方法において、
    少なくとも１ケ以上の免疫グロブリンに対しそれ自体を非共有的に結合し得る化合物が請求項１、２、３、４、５、６又は７記載の式（１）の化合物であることを特徴とする免疫グロブリン又はその混合物の試験方法。

Images