JP4104691B2 - フイブリノーゲン結合性ペプチド - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は一般的にはタンパク質−リガンド相互作用を同定することに関し、具体的にはフィブリノーゲンに結合しそしてフィブリノーゲンのアフィニティー精製法に使用することができるペプチドリガンドに関する。
【0002】
【従来の技術】
フィブリノーゲンは血餅の主要タンパク質、フィブリンの血漿前駆物質である。フィブリノーゲンはジスルフィドによって結合された3対のポリペプチド(Aα、Bβ、およびγ)を含む糖タンパク質である。AαおよびBβ鎖がトロンビンで分解されると、フィブリノーゲンはフィブリンに転化し、血液凝固が始まる。フィブリノーゲンは、通常はフィブリングルーまたはシーラントと呼ばれる止血製剤中での使用のために商業的に使用されてきた。
【0003】
フィブリノーゲン濃厚物の製造は、全血漿、寒冷沈降物、または組織グルー中での使用のためのCohnフラクションIから、沈殿法によって行われてきた。最も粗製の製剤では単に、自己血漿から通常に製造された寒冷沈降タンパク質を、フィブリンシーラントとしての使用のために直接に使用する(Kingdon等,1994)。大規模製造法は、示差溶解度をもたらすエタノール(Blomback and Blomback,1956)、硫酸アンモニウム(Takeda,1966)またはβ−アラニンおよび/またはグリシン(Jakobsen and Kierulf,1973)の使用に依存する。これらの濃厚物は、因子XIIIとフィブロネクチンを含む他の多種類の血漿タンパク質、並びにまたあまり望ましくないプラスミン、プラスミノーゲン、フィブリノーゲン分解産物(断片DおよびE)およびフィブリンプロトマーの混合物である。血液凝固できるフィブリノーゲンを得るためには、ε−アミノカプロン酸の添加によるプラスミンの阻害が通常必要である。
【0004】
クロマトグラフィー的単離法では、ゲル濾過またはイオン交換樹脂を使用して中間純度の濃厚物を製造する(Furlan、1984の総説)。限外濾過もまた一つの方法として特許請求された(Kopf and Morse,1993)。血漿からフィブリノーゲンを高純度増強するために、アフニティー法もまた導入された。フィブリノーゲンを精製するために、フィブリノーゲン分解産物およびフィブリンのプロトフィブリルもまた共精製されるが(Dempfle and Heene,1987b)、プロタミンが使用された(Dempfle and Heene,1987a)。固定化単量体フィブリンがフィブリノーゲンと結合して精製することが示された(Matthias等、1975)。抗生物質、リストセチン(Ristocetin)が固定化され、フィブリノーゲンを結合するのに使用された(Suzuki等、1980)。免疫アフィニティークロマトグラフィーが開発され、特に分析的応用に有用である(Merskey等、1980;McConnell and Anderson,1993)。
【0005】
ペプチドリガンドクロマトグラフィー Kuyas等(1990年)は、GPRPK−セファロース(配列番号:4)のカラム上で血漿からフィブリノーゲンを精製した。ペプチドGPRPは、トロンビンによる分解時に露呈されたフィブリノーゲンAα−鎖のカルボキシ側の相似体(GPRVVERHK(配列番号:5))である。この配列は、フィブリノーゲンのγ鎖上のカルボキシ末端配列による初期重合のための結合性領域である。(アミノ酸略語は該技術分野で通常使用される通りであり、Scholz等、1993年に記載されている。)
【0006】
【発明の構成】
本発明者等は今回、フィブリノーゲンに結合する能力を特徴とする一群のペプチドを発見した。これらのペプチドはPhe−Leu−Leu−ValおよびLeu−Leu−Val−Proよりなる群から選ばれた利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有する。本明細書中で使用する場合、利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインとは、周囲溶液中でフィブリノーゲンと結合するのに立体化学的に利用できるペプチド配列並びにpH、イオン強度および溶媒組成の制御された条件下で中位ないし強い結合活性でフィブリノーゲンと連結する配座を採るペプチド配列を意味する。結合活性は、上記に挙げられた配列に隣接するアミノ酸を変えることによって、そして/またはアミノ酸の末端欠失によって、増強または低下させることができる。結合活性はさらに、pH、イオン強度または溶媒組成の上記の条件を変えることによって、改変することができる。
【0007】
利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有するさらに好適なペプチドの配列はPhe−Leu−Leu−Val−Pro−Leu、Pro−Leu−Leu−Val−Pro−Leu、およびPhe−Ala−Leu−Val−Pro−Leu(それぞれ、配列番号:1、2、および3)であり、最も好適なペプチドの配列はPhe−Leu−Leu−Val−Pro−Leuである。これらのペプチドは、Joseph A.Buettnerの名称の米国特許出願番号第08/438,331号明細書(1995年5月10日出願)に記載のスクリーニング法を使用して単離され、そして同定された。本発明者等もまた、フィブリノーゲン含有溶液を、本明細書中に開示されたペプチドをその上に結合した基質上に通過させ、次いでフィブリノーゲンを溶出することを含んでなるこのと特徴とする、フィブリノーゲンを精製するアフィニティークロマトグラフィー法にペプチドを使用する方法を記載する。
【0008】
本明細書中に記載されたペプチドFLLVPL、PLLVPLおよびFALVPLをタンパク質配列データベースと比較したが、フィブリノーゲンに関連する血液凝固成分と相互作用することが知られているタンパク質との相同性を示さない。FLLVPLに対する完全整合物(exact matches)は、酵母(サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae))の仮定的膜タンパク質、リゾビウム・レグミノサルム(Rhizobium leguminosarum)の小節形成性タンパク質、およびウシのナトリウム依存性リン酸輸送体に対するインターロイキン−6受容体(マウスおよびヒト)である。PLLVPLに対する完全整合物は、クラミディア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)CMP−2−ケト−3−デオキシオクツロソン酸シンテターゼ(kdsB)およびCTPシンテターゼ(pyrG)遺伝子、大腸菌(Escherichia coli)およびサルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)のミスマッチ修復プロティンmutLタンパク質、ヒトアデノウイルス2後期L2muコアプロティン前駆体、スタフィロコッカス・アウレウム(Staphylococcus aureus)pI258の仮定的14Kタンパク質(merオペロン)、バチルス・サブチリス(Bacillus subtilis)の仮定的タンパク質、ヒトのミトコンドリア読み取り枠(ORF)タンパク質、ブラキダニオ・レリオ(Brachydanio rerio)(縞模様の魚)のPOU−c転写因子、およびシネコシスチス属(Synechocystissp.)のH+輸送性ATPシンターゼ(EC3.6.1.34)鎖aである。FALVPLに対する完全整合物は、ヒトMLL−AF4 der(11)融合タンパク質、ヒト140kdセリン/プロリンに富むタンパク質、AF−4mRNAによってコードされたヒトタンパク質、ミコバクテリウム属(Mycobacterium)のプロティンlmbE、およびミスカンタス・ストリークウイルス(Miscanthus streak virus)のVOタンパク質である。
【0009】
【発明の具体的な態様】
材料
フィブリノーゲンに対するポリクローンウサギ抗体は、American Diagnostical(Greenwich,CT)およEnzyme Research Labs(South Bend,IN)から購入した。第二抗体抱合体、ヤギ抗ウサギIgG−アルカリホスファターゼ、および色素基質NBT/BCIPとFast Red TRは、Pierce Chemical Co.(Rockford,IL)からのものであった。ヒトのフィブリノーゲンは、Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)およびChromogenix AB(Molndal,Sweden)から購入した。Fmocアミノ酸はNovobiochemからのものであった。他のすべての化学品は試薬等級またはそれ以上のものであった。
【0010】
一般的方法
ペプチドライブラリーのスクリーニングは、微孔質HPLC(MicromeBioresources,Auburn,CA)上の2.1mm×15cmカラム中で行った。ペプチドおよび6量体組合せライブラリーは、4,7,10−トリオキサ−1,13−トリデカンジアミン(Totda;Aldrich,St.Louis,MO)で修飾されたToyopearl AF Chelate 650M(Tosohaas,Montogomeryville,PA)上で、Buettner等(1996)に記載の標準Fmoc化学を使用して合成した。ペプチドはGilson AMS422を使用してロボット的に合成した。上記のスキームで達成されたペプチド密度は通常0.2〜0.5mモル/g樹脂の範囲内であった。
【0011】
アフィニティークロマトグラフィー方式でペプチドをスクリーニングする場合、立体障害のためにフィブリノーゲン結合性の容量が低くなる危険を少なくするために、いくらか低いペプチド密度がより望ましい。かかる望ましい密度は、アフィニティークロマトグラフィーの通常の技術で実施する場合、0.05〜0.2mモル/g樹脂(10〜40mg/ml樹脂)の範囲内である。Totdaリンカー上で合成されるペプチドの密度を調節するために、Fmoc−L−アラニン対t−Boc−L−アラニンの各種比率を含有する混合物をTotda−Toyopearlに結合させた。混合物は、等濃度のストックFmoc−L−アラニンの、t−Boc−L−アラニン中への系列希釈(1:0、1:5、1:10、1:25、および1:125)によって作成した。全アミノ酸濃度は、約2.5mモル/g樹脂(Totdaの5倍)に一定に保持した。当該技術分野で実施される標準Fmoc条件を使用して混合物を結合させた後、Fmoc保護基をアルカリによって解放したが、他方アルカリ耐性t−Bocは解放されなかった。この残留t−Boc誘導化L−アラニンは第一級アミンを欠き、さらなるペプチド合成に利用できなかった。次いで、ペプチドを樹脂上でFmoc誘導化アミノ酸を使用して合成し、次いで酸条件下(残留t−Bocも解放した)で脱保護した。樹脂のバッチ上のペプチドの密度は、標準方法による乾燥秤量試料の全アミノ酸分析によって決定した。最適ペプチド密度は、1:10のFmoc対t−Bocの混合物を用いて達成された。
【0012】
可溶性結合性リガンドとして可溶性の精製ペプチドが必要である場合、Rink樹脂(Novobiochem)を合成に使用した。ペプチドを切断し、脱保護し、逆相HPLCによって精製した。別法として、アフィニティークロマトグラフィーに必要である幾つかのペプチドは、脱保護し、N−末端Fmoc基の除去なしにRink樹脂から切断し、逆相HPLCによって精製し、A−Totda−Toyopearlに結合させた。ペプチドの純度は分析用逆相HPLCによって評価し、組成はFAB質量分析法によって確認した。
【0013】
分析方法
ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS−PAGE)は、8%ポリアクリルアミドゲル(Novex,San Diego,CA)中で、Laemmli(1970)の操作法に従って、レーン当たり4μgタンパク質を負荷して行なった。ゲルからタンパク質の移動は、未不使用膜結合部位を遮蔽するためにカゼイン(Pierce Chemical Co.)を使用するTowbin等(1979)の方法によって行った。結合抗体は、化学発光性基質CSPD(Tropix,Bedford,MA)を使用し、XARフィルム(Eastman Kodak,Rochester,NY)に露出することによって検出した。
【0014】
免疫比濁法は、Behringwerke AG(Marburg,DEU)から購入した検査キットを用いて、Behring比濁計、BNA型を使用して行った。
【0015】
等温滴定比色法は、精製された可溶性ペプチド(5mM)またはA−Totda−Togopearl上に直接に合成されたペプチド(1.4mM)のいずれかを使用して、精製フィブリノーゲン(50μM)を用いて、Tyler−Cross等(1993)の技術の改良法によって行った。測定はすべて、30℃で、30mMリン酸緩衝液、pH7.0中で、Omega滴定比色計(Microcal,Inc.,Northampton,MA)を用いて行った。
【0016】
フィブリノーゲンに対する結合性ペプチドの発見
米国特許出願番号第08/438,331号明細書(引用することによって本明細書中に取り込まれている)中で使用されたものと同様の分析法を使用して、フィブリノーゲンと結合するペプチドを推論した。この分析法は、ペプチドライブラリー免疫染色クロマトグラフィー分析法またはPELICAN法と呼称される。要するに、6量体組合せペプチドライブラリーを、Totdaによるアミノ化、次いで塩基易動性リンカーヒドロキシメチル安息香酸の添加、そして最終的にグリシン残基の添加によって逐次修飾された、約0.1mモル/g樹脂の最終置換密度のTosoHaasクロマトグラフィー樹脂、Toyopearl650M Chelate(G−HMBA−Totda−Toyopearl)上で直接にに合成した。ライブラリーは、20種の天然アミノ酸の中の18種(システインおよびメチオニンを除く)を用いて、F−moc化学を使用して合成した。アミノ末端をメチルスルホニルエチルカルボニル基で部分的に保護した。
【0017】
樹脂(0.5ml)への最初の接触物は、平衡緩衝液(20mM HEPES、pH6.8と0.1M NaClおよび0.1%v/vTween−20)、次いで洗浄緩衝液(1M NaClを含有する平衡緩衝液)からなった。次いで、樹脂を、検出系の各個成分と順次接触させた。これらの成分は、即ち、抗ヒトフィブリノーゲン(アフニティー精製されたIgGフラクション)、アルカリホスファターゼと複合化した第二抗体、およびBCIP/NBTブルー色素であった。すべてのタンパク質は平衡緩衝液中にあり、次いで洗浄緩衝液中にあった。
【0018】
さらに、樹脂を、上記およびBuettner等(1996)に記載のように、平衡緩衝液中の0.625μgのフィブリノーゲン(2nM)と接触させ、次いで染料としてファースト・レッド(Fast Red)を使用する検出系と接触させた。
【0019】
検出系と非特異的相互作用を示した青ビーズは、カラム全体に0.1%以下で均一に見出され;赤ビーズはカラム全体に0.01%以下で均一に見出された。各個ビーズを単離し、ペプチドを、メタノール中の20%トリエチルアミンを用いて2時間の音波処理によりビーズから切断した。切断されたペプチドを乾燥し、Edman分解法によって配列決定した。アミノ酸配列データを以下に示す(表1)。不明確なコールがあったサイクルについては、最高の応答をもつアミノ酸を第一行にリストし、それより低い収量をもつものをその後の行にリストした。
【0020】
【表1】
【0021】
結合性確認分析法は、Totda次いでアラニン残基で修飾された、0.2mモル/g樹脂の最終置換密度のToyopear l650M Chelate樹脂(A−Totda−Toyopearl)上に直接に合成された各個ペプチド配列を使用して、微孔質HPLC上のカラムクロマトグラフィー方式で行った。樹脂への接触物(図1および図2、それぞれPLLVLおよびFLLVPLの場合)として、A)平衡緩衝液(上記と同じ)、洗浄緩衝液(上記と同じ)、溶出緩衝液(2.5%酢酸)のみ;B)平衡緩衝液中のヒト血清アルブミン(hSA;0.5mg)、次いで洗浄および溶出緩衝液;C−E)平衡緩衝液中の精製フィブリノーゲンの段階的に増大する用量(250、500および1000μg)、次いで洗浄および溶出緩衝液)が挙げられる。終点は、フィブリノーゲン接触物中の酸溶出液の用量依存性増加であり、定量は280nmでの吸光度の積分によった(図2)。
【0022】
【表2】
【0023】
樹脂FLLVPL−A−Totda−Toyopearl、PLLVPL−A−Totda−Toyopearlに対するフィブリノーゲンの結合には用量依存性増加があり、FALVPL−A−Totda−Toyopearlに対する場合は程度が低かった。これらの樹脂を、平衡緩衝液中のフィブリノーゲン(100μg)およびhSA(0.5mg)との混合物と、0.1%(v/v)Tween−20、低い非特異性結合に使用されまたウイルス不活性化剤として使用される非イオン性界面活性剤の存在または不在下で接触させた。樹脂を洗浄緩衝液(Tween−20なし)および2%酢酸で洗浄した。酸溶出液のSDS−PAGEによる分析の結果(図3A、レーン4−5およびレーン7−8)は、PLLVPLおよびFLLVPL樹脂に結合したタンパク質の大部分は、精製フィブリノーゲン標準(レーン10)と共に移動する、フィブリノーゲンと同じ分子量(340,000)を持つものであることをで示した。このタンパク質は出発混合物(図3A、レーン3)から大きく濃縮(enrich)されていた。ヒトフィブリノーゲンに対する抗体を用いるウエスタンブロットの結果、このタンパク質の本性がフィブリノーゲンと確認された(図3B)。緩衝液系中のTween−20の存在は、酸溶出液中に回収されたタンパク質の量によって示されるように、フィブリノーゲンのいずれのペプチドへの結合にも影響しなかった。それ故、Tweenは、カラムを洗浄することによって、フィブリノーゲン溶液から除去した。
【0024】
【表3】
【0025】
溶液相結合性等温式は、精製された可溶性ペプチドおよび精製フィブリノーゲンについて、等温滴定熱量計を使用して行った(表3)。配列PLLVPLは、使用された条件下で、フィブリノーゲンに対し、FllVPLよりも弱い溶液結合性を示した。アミノ末端でPからFに変化すると、解離定数は150倍以上低下した。PLLVPLはフィブリノーゲン分子当たり約3〜4部位に結合した。これらの相互作用は大きい正のエントロピーを有し、それは、配座変化がペプチドまたはフィブリノーゲン中に起こったことを示すことができる。配列FLLVPLはフィブリノーゲン上の約1部位で結合し、この結合はまた非常に大きい正のエントロピーを有した。両ペプチドの結合反応は、正のエンタルピー(ΔH)によって示されるように、吸熱性であり、試験された条件下で熱力学的に有利であった(負のΔG)。異常に高いエントロピーは、配座変化がペプチドのフィブリノーゲンとの会合を推進することができることを示す。
【0026】
A−Totda−Toyopearl上で合成されたFLLVPLの見掛の解離定数は、可溶性ペプチドより100倍以上減少した。エンタルピーおよびエントロピーの大きさが増加したことは、可溶性ペプチドと比較して、フィブリノーゲンへの結合が同様の機構であることを示唆している。結合の遊離エネルギーは有利であった。
【0027】
【実施例】
実施例1
FLLVPLおよびPLLVPL樹脂の使用による血漿からのフィブリノーゲンの精製
ヒト血漿を、0.1%(v/v)Tween−20を含有する平衡緩衝液中で1:2に希釈した。洗浄および溶出条件は上記の通りであった。約1.0mlを、ペプチド樹脂PLLVPL−A−Totda−ToyopearlおよびFLLVPL−A−Totda−Toyopearl上に注入した(それぞれ、図4および図5)。酸処理を使用して、タンパク質をペプチド樹脂から解放した。新しく凍結および融解し、寒冷沈降物を遠心分離によって除去した全血漿を、SDS−PAGEによって分析した(図3A、レーン2)。血漿は、ゲルの頂部近辺にフィブリノーゲンのバンドを含有し、その本性はウエスタンブロット法によって確認された(図3B、レーン2)。酸溶出液は高度に精製されたフィブリノーゲンを含有した(図3Aおよび図3B、レーン6およびレーン9)。
【0028】
FLLVPL樹脂分離からの酸溶出液フラクションを、1M TrisHCl、pH8.0でpHを中性の調節した後、フィブリノーゲンおよび他の数種の血漿タンパク質について、免疫比濁分析法によって分析した(表4)。
【0029】
【表4】
【0030】
この分析法を使用することによって、酸溶出液中には、フィブリノーゲンおよび少量のIgM以外の血清タンパク質は全く検出されなかった。免疫反応性フィブリノーゲンの回収率が低いのは(58.8%)、低pHへの露呈による抗原性の減少を反映している。他のすべての試験血漿タンパク質は検出限界以下であった。
【0031】
実施例2
結合性配列のさらなる特性決定
N−アセチル化アミノ末端を有するおよび有しないペプチドPLLVPLおよびFLLVPLを、約0.2mモル/g樹脂の密度のAla−Totda−Toyopearl上に直接に合成した。これらの樹脂のフィブリノーゲンと結合する能力は上記の通りに決定した。フィブリノーゲンをPLLVPL−A−Totda−Toyopearlに結合させるためには、遮蔽されていない(遊離)アミノ末端が必要であった。FLLVPL−A−Totda−Toyopearlを使用する別の実験において同様の結果が得られた(表5)。
【0032】
【表5】
【0033】
結合に必要な最小配列を同定するために、PLLVPLおよびFLLVPLのカルボキシル−およびアミノ−末端からの切断物を、A−Totda−Toyopearl樹脂上に直接に合成した。表6は、クロマトグラフィー方式で段階的に増大する用量のフィブリノーゲンと接触させた樹脂からの溶出液の定量結果を示す。
【0034】
【表6】
【0035】
完全長のペプチド(例えば、6量体)は、1M NaClによって解放された量の増加がより少ないが比例的であったが、低pHで解放された量に反映されているように、3種類の注入量のすべて(250、500および1000μg)の場合にフィブリノーゲンに最も緊密に結合した。C−末端からの切断によって、1M NaClによって解放された量がより多いことによって示されるように、フィブリノーゲンへの結合の緊密性が低いペプチドが得られた。N−末端切断ペプチドの場合に同様の結果が観察された。これらの結果は、試験された条件下でのフィブリノーゲンへの最適の結合のためには、6種のアミノ酸の完全ペプチド配列が必要であることを示している。追加的には、ペプチドの長さの改変によって、低pHによるよりもさらに温和な溶出条件が可能になることができる。4個のアミノ酸の長さであるペプチド(4量体)は良好に結合し、5個のアミノ酸の長さであるペプチド(5量体)はさらに好適であり、6個のアミノ酸の長さであるペプチド(6量体)は最も好適である。7個(7量体)またはそれ以上のアミノ酸の長さであり、本明細書中に開示された配列を含有するペプチドもまた、結合性ドメインが上記のようにフィブリノーゲンによって結合されるのに利用しやすいまたは有効である場合、フィブリノーゲンと結合するのに適していることが予想される。
【0036】
実施例3
結合相互作用のさらなる特性決定
ペプチドFLLVPLを、0.2mモル/g樹脂の密度のA−Totda−Toyopearl上に直接に合成した。寸法1.0×6.4cm(約5mlカラム容量)のカラムを、10mM HEPESまたは10mM酢酸ナトリウム、pH6.8のいずれか、1.0mM EGTA、および0.1、0.2または1.0M NaClのいずれかで平衡させた。フィブリノーゲン(25mg;5.0ml)を、10mM酢酸ナトリウム、pH6.8、および0.1M NaClを含有する1mM EGTA中のカラムに適用した。これらの条件下では、適用された吸光度(280nm)の約5〜8%はカラムに結合しなかった。従って、結合はイオン強度の増加によっては影響されず、このことは、ペプチド−タンパク質相互作用での疎水性結合の顕著な役割を示唆している。
【0037】
フィブリノーゲン(25mg;5.0ml)を、10mM酢酸ナトリウム、pH6.8、および0.1M NaClを含有する1mM EGTA中のカラムに適用した。結合緩衝液中の非イオン性界面活性剤(5%Tween−20)で溶出した結果、適用されたタンパク質の40%が解放され、このことは、結合における疎水性相互作用の役割を示唆している。反対に、イオン性(2%コール酸ナトリウム)界面活性剤で溶出すると、14%だけが解放された。
【0038】
フィブリノーゲン(10mM酢酸ナトリウム、pH6.8、および0.1M NaClを含有する1mM EGTA中のカラムに適用された)の溶出は、親水性化合物、ポリエチレングリコール(10%)を使用することによっては全く観察されなかった。10mMホウ酸ナトリウムでpHを10に上昇させることによって、適用されたフィブリノーゲンの約8%のみが溶出されたに過ぎない。直線勾配でpHをさらに上昇させると(pH6.8から12.0に)、フィブリノーゲンの約25%が解放された。他方、6.8から4.0へのpH勾配を使用した結果は、pH4.2でフィブリノーゲンの約66%が解放された。
【0039】
FLLVPLのフィブリノーゲンへの結合機構に対する疎水性相互作用の貢献をさらに評価するために、フィブリノーゲン(25mg;5.0ml)を、疎水性結合に有利である高塩条件下でペプチドに適用し、そして低イオン強度下で解放させた。ペプチド樹脂を、10mM酢酸ナトリウム、1.0M NaCl、および1.0mM EGTA、pH6.8で平衡させた。同一緩衝液中のフィブリノーゲン溶液(5mg/ml)の5mlをカラムに適用し、2カラム容量の同一緩衝液で洗浄した。次いで、樹脂を、10カラム容量の10mM酢酸ナトリウム、pH4.0と接触させ、次いで2%酢酸(4カラム容量)と接触させた。溶出プロフィールを図6に示す。適用されたタンパク質の約7.2%(280nmでの吸光度による)はカラムと相互作用せず、流出および洗浄フラクション中に回収された。低イオン強度および低pH(4.0)では、タンパク質の約78。3%が解放された。しかし、10mM酢酸ナトリウム、pH4.0溶液が0.1MNaClを含有する第二実験においては、適用されたタンパク質の5%のみが溶出された。酸処理では、両実験で回収されたタンパク質の残部が解放された。pH4.0溶出液を、0.4Mリン酸ナトリウム、pH11のストック溶液でpHを中性化した後、α−トロンビンで処理すると、可視しうる血餅が形成した。中性化された酸溶出液中の全回収タンパク質の約88.9%はα−トロンビンで凝固可能であった。
【0040】
これらの結果は、フィブリノーゲンとFLLVPLとの相互作用が、タンパク質のN−末端の第一級アミンとのイオン性相互作用の外に、疎水性引力によって推進されることを示している。さらに、これらの結果は、アフィニティークロマトグラフィーで有用である、フィブリノーゲンのための結合および溶出戦略を示している。
【0041】
結論
本発明者等はフィブリノーゲンのアフィニティー精製のための新規のペプチドの使用を示した。これらの新規のペプチドは利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有し、ペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られ、そして精製された形態で容易に製造することができる。さらに、保存的置換、末端残基の欠失、および/または末端部分の添加によるペプチドの修飾が、結合の選択性を変えるための有用な技術であることが予想される。
【0042】
なお、本発明の主たる特徴および態様を以下に記載する。
【0043】
1.結合性ドメインがPhe−Leu−Leu−ValおよびLeu−Leu−Val−Proよりなる群から選ばれることを特徴とする、利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有するペプチドを含んでなる組成物。
【0044】
2.ペプチドが5量体(5−mer)である上記1に記載の組成物。
【0045】
3.ペプチドがPhe−Leu−Leu−Val−ProおよびLeu−Leu−Val−Pro−Leuよりなる群から選ばれる上記2に記載の組成物。
【0046】
4.ペプチドが6量体である上記1に記載の組成物。
【0047】
5.ペプチドがPhe−Leu−Leu−Val−Pro−LeuおよびPro−Leu−Leu−Val−Pro−Leuよりなる群から選ばれる上記4に記載の組成物。
【0048】
6.ペプチドが4量体、5量体、6量体、および7量体よりなる群から選ばれる上記1に記載の組成物。
【0049】
7.結合性ドメインがPhe−Leu−Leu−Val−LeuおよびPro−Leu−Leu−Val−Pro−Leu、およびPhe−Ala−Leu−Val−Pro−Leuよりなる群から選ばれる、利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有するペプチドを含んでなる組成物。
【0050】
8.基質が支持物質に結合したペプチドを含んでなり、ペプチドがPhe−Leu−Leu−ValおよびLeu−Leu−Val−Proよりなる群から選ばれた利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有することを特徴とする、フィブリノーゲンを基質に結合させるのに十分な条件下でフィブリノーゲン含有溶液を基質と接触させることを含んでなるフィブリノーゲンの精製方法。
【0051】
9.基質が支持物質に結合したペプチドを含んでなり、ペプチドがPhe−Leu−Leu−Val−Pro−Leu、Pro−Leu−Leu−Val−Pro−Leu、およびPhe−Ala−Leu−Val−Pro−Leuよりなる群から選ばれた利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有することを特徴とする、フィブリノーゲンを基質に結合させるのに十分な条件下でフィブリノーゲン含有溶液を基質と接触させることを含んでなるフィブリノーゲンの精製方法。
【0052】
10.Phe−Leu−Leu−Val−Pro−Leu、Pro−Leu−Leu−Val−Pro−Leu、およびPhe−Ala−Leu−Val−Pro−Leuよりなる群から選ばれるペプチド。
【0053】
11.Phe−Leu−Leu−Val−Pro、Phe−Leu−Leu−Val、およびLeu−Leu−Val−Pro−Leuよりなる群から選ばれるペプチド。
【0054】
【表7】
【0055】
【表8】
【0056】
【表9】
【0057】
【表10】
【0058】
【表11】
【図面の簡単な説明】
【図1】ペプチドPLLVPL−A−Totda−Toyopearl(配列番号:2)上でのクロマトグラフィー的分離の溶出プロフィール(280nmでの吸光度)を示す。A)緩衝液、タンパク質なし;B)0.5mg hSA;C)250μgフィブリノーゲン;D)500μgフィブリノーゲン;E)1000μgフィブリノーゲン。フィブリノーゲンは約17μl/分で10分間に適用し、次いでカラムを平衡緩衝液で865μl/分で4分間洗浄し、次いで1.0M NaClを含有する平衡緩衝液で5分間、3.0M NaClでさらに5分間、0.1Mでさらに5分間洗浄した。タンパク質は、2%酢酸を使用することによって、30〜35の間に溶出した。
【図2】ペプチドFLLVPL−A−Totda−Toyopearl(配列番号:1)上でのクロマトグラフィー的分離の溶出プロフィール(280nmでの吸光度)を示す。線の表示は図1と同一である。溶出条件は図1と同一である。
【図3】Aは血漿、フィブリノーゲンとhSAの混合物、およびクロマトグラフィー的分離からの酸溶出液のクーマシー染色SDS−PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド電気泳動)の結果を表す図面に代わる写真である。レーン1、分子量標準;レーン2、ヒト血漿;レーン3、フィブリノーゲン/hSA混合物;レーン4、PLLVPL−樹脂(配列番号2)に適用されたフィブリノーゲン/hSA混合物(Tweenなし)からの酸溶出液;レーン5、酸溶出液、レーン4と同一(Tweenあり);レーン6、ヒト血漿の酸溶出液;レーン7−9、FLLVPL−樹脂(配列番号:1)を使用するレーン4−6と同一;レーン10、フィブリノーゲン標準。BはAに示したものの重複ゲルのウエスタンブロット分析(すなわち、同上の電気泳動)の結果を表す図面に代わる写真である。
【図4】PLLVPL−A−Totda−Toyopearl(配列番号:2)に適用された全血漿の溶出プロフィール(280nmでの吸光度)を示す。溶出条件は図1と同一である。
【図5】FLLVPL−A−Totda−Toyopearl(配列番号:1)に適用された全血漿の溶出プロフィール(280nmでの吸光度)を示す。溶出条件は図1と同一である。
【図6】FLLVPL−A−Totda−Toyopearl(配列番号:1)に適用されたフィブリノーゲンの、中性pH(6.8)での高い塩濃度(1M NaCl)の条件下の溶出プロフィール、および低pH(4.0)での低いイオン強度(10mM酢酸ナトリウム)による溶出を示す。
Claims (3)
- ペプチドが4、5または6個のアミノ酸の長さであり、結合性ドメインがPhe−Leu−Leu−ValおよびLeu−Leu−Val−Pro−Leuよりなる群から選ばれることを特徴とする、利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有するペプチドを含んでなる組成物。
- 基質が支持物質に結合したペプチドを含んでなり、ペプチドが4、5または6個のアミノ酸の長さであり、ペプチドがPhe−Leu−Leu−ValおよびLeu−Leu−Val−Pro−Leuよりなる群から選ばれた利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有することを特徴とする、フィブリノーゲンを基質に結合させるのに十分な条件下でフィブリノーゲン含有溶液を基質と接触させることを含んでなるフィブリノーゲンの精製方法。
- Phe−Leu−Leu−Val−Pro−Leu、Pro−Leu−Leu−Val−Pro−Leu、およびPhe−Ala−Leu−Val−Pro−Leuよりなる群から選ばれるペプチド。
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