JPH09309899A - フイブリノーゲン結合性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 フィブリノーゲンの精製に用いることのでき
る手段を提供する。 【解決手段】 フィブリノーゲン結合性ドメインがＰｈ
ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＶａｌおよびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏよりなるペプチドを含有する組成物、なら
びにそれらの使用したアフィニティークロマトグラフィ
ーによるフィブリノーゲンの精製方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は一般的にはタンパク
質−リガンド相互作用を同定することに関し、具体的に
はフィブリノーゲンに結合しそしてフィブリノーゲンの
アフィニティー精製法に使用することができるペプチド
リガンドに関する。

【０００２】

【従来の技術】フィブリノーゲンは血餅の主要タンパク
質、フィブリンの血漿前駆物質である。フィブリノーゲ
ンはジスルフィドによって結合された３対のポリペプチ
ド（Ａα、Ｂβ、およびγ）を含む糖タンパク質であ
る。ＡαおよびＢβ鎖がトロンビンで分解されると、フ
ィブリノーゲンはフィブリンに転化し、血液凝固が始ま
る。フィブリノーゲンは、通常はフィブリングルーまた
はシーラントと呼ばれる止血製剤中での使用のために商
業的に使用されてきた。

【０００３】フィブリノーゲン濃厚物の製造は、全血
漿、寒冷沈降物、または組織グルー中での使用のための
ＣｏｈｎフラクションＩから、沈殿法によって行われて
きた。最も粗製の製剤では単に、自己血漿から通常に製
造された寒冷沈降タンパク質を、フィブリンシーラント
としての使用のために直接に使用する（Ｋｉｎｇｄｏｎ
等，１９９４）。大規模製造法は、示差溶解度をもたら
すエタノール（Ｂｌｏｍｂａｃｋ ａｎｄ Ｂｌｏｍｂ
ａｃｋ，１９５６）、硫酸アンモニウム（Ｔａｋｅｄ
ａ，１９６６）またはβ−アラニンおよび／またはグリ
シン（Ｊａｋｏｂｓｅｎ ａｎｄ Ｋｉｅｒｕｌｆ，１
９７３）の使用に依存する。これらの濃厚物は、因子Ｘ
ＩＩＩとフィブロネクチンを含む他の多種類の血漿タン
パク質、並びにまたあまり望ましくないプラスミン、プ
ラスミノーゲン、フィブリノーゲン分解産物（断片Ｄお
よびＥ）およびフィブリンプロトマーの混合物である。
血液凝固できるフィブリノーゲンを得るためには、ε−
アミノカプロン酸の添加によるプラスミンの阻害が通常
必要である。

【０００４】クロマトグラフィー的単離法では、ゲル濾
過またはイオン交換樹脂を使用して中間純度の濃厚物を
製造する（Ｆｕｒｌａｎ、１９８４の総説）。限外濾過
もまた一つの方法として特許請求された（Ｋｏｐｆ ａ
ｎｄ Ｍｏｒｓｅ，１９９３）。血漿からフィブリノー
ゲンを高純度増強するために、アフニティー法もまた導
入された。フィブリノーゲンを精製するために、フィブ
リノーゲン分解産物およびフィブリンのプロトフィブリ
ルもまた共精製されるが（Ｄｅｍｐｆｌｅ ａｎｄ Ｈ
ｅｅｎｅ，１９８７ｂ）、プロタミンが使用された（Ｄ
ｅｍｐｆｌｅａｎｄ Ｈｅｅｎｅ，１９８７ａ）。固定
化単量体フィブリンがフィブリノーゲンと結合して精製
することが示された（Ｍａｔｔｈｉａｓ等、１９７
５）。抗生物質、リストセチン（Ｒｉｓｔｏｃｅｔｉ
ｎ）が固定化され、フィブリノーゲンを結合するのに使
用された（Ｓｕｚｕｋｉ等、１９８０）。免疫アフィニ
ティークロマトグラフィーが開発され、特に分析的応用
に有用である（Ｍｅｒｓｋｅｙ等、１９８０；ＭｃＣｏ
ｎｎｅｌｌ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３）。

【０００５】ペプチドリガンドクロマトグラフィー Ｋ
ｕｙａｓ等（１９９０年）は、ＧＰＲＰＫ−セファロー
ス（配列番号：４）のカラム上で血漿からフィブリノー
ゲンを精製した。ペプチドＧＰＲＰは、トロンビンによ
る分解時に露呈されたフィブリノーゲンＡα−鎖のカル
ボキシ側の相似体（ＧＰＲＶＶＥＲＨＫ（配列番号：
５））である。この配列は、フィブリノーゲンのγ鎖上
のカルボキシ末端配列による初期重合のための結合性領
域である。（アミノ酸略語は該技術分野で通常使用され
る通りであり、Ｓｃｈｏｌｚ等、１９９３年に記載され
ている。）

【０００６】

【発明の構成】本発明者等は今回、フィブリノーゲンに
結合する能力を特徴とする一群のペプチドを発見した。
これらのペプチドはＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌお
よびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏよりなる群から選
ばれた利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有
する。本明細書中で使用する場合、利用可能なフィブリ
ノーゲン結合性ドメインとは、周囲溶液中でフィブリノ
ーゲンと結合するのに立体化学的に利用できるペプチド
配列並びにｐＨ、イオン強度および溶媒組成の制御され
た条件下で中位ないし強い結合活性でフィブリノーゲン
と連結する配座を採るペプチド配列を意味する。結合活
性は、上記に挙げられた配列に隣接するアミノ酸を変え
ることによって、そして／またはアミノ酸の末端欠失に
よって、増強または低下させることができる。結合活性
はさらに、ｐＨ、イオン強度または溶媒組成の上記の条
件を変えることによって、改変することができる。

【０００７】利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメイ
ンを有するさらに好適なペプチドの配列はＰｈｅ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、およびＰｈｅ−Ａ
ｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ（それぞれ、配
列番号：１、２、および３）であり、最も好適なペプチ
ドの配列はＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−
Ｌｅｕである。これらのペプチドは、Ｊｏｓｅｐｈ
Ａ．Ｂｕｅｔｔｎｅｒの名称の米国特許出願番号第０８
／４３８，３３１号明細書（１９９５年５月１０日出
願）に記載のスクリーニング法を使用して単離され、そ
して同定された。本発明者等もまた、フィブリノーゲン
含有溶液を、本明細書中に開示されたペプチドをその上
に結合した基質上に通過させ、次いでフィブリノーゲン
を溶出することを含んでなるこのと特徴とする、フィブ
リノーゲンを精製するアフィニティークロマトグラフィ
ー法にペプチドを使用する方法を記載する。

【０００８】本明細書中に記載されたペプチドＦＬＬＶ
ＰＬ、ＰＬＬＶＰＬおよびＦＡＬＶＰＬをタンパク質配
列データベースと比較したが、フィブリノーゲンに関連
する血液凝固成分と相互作用することが知られているタ
ンパク質との相同性を示さない。ＦＬＬＶＰＬに対する
完全整合物（ｅｘａｃｔ ｍａｔｃｈｅｓ）は、酵母
（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））の仮定的膜タンパク
質、リゾビウム・レグミノサルム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ
ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）の小節形成性タンパク
質、およびウシのナトリウム依存性リン酸輸送体に対す
るインターロイキン−６受容体（マウスおよびヒト）で
ある。ＰＬＬＶＰＬに対する完全整合物は、クラミディ
ア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏ
ｍａｔｉｓ）ＣＭＰ−２−ケト−３−デオキシオクツロ
ソン酸シンテターゼ（ｋｄｓＢ）およびＣＴＰシンテタ
ーゼ（ｐｙｒＧ）遺伝子、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａ ｃｏｌｉ）およびサルモネラ・チフィムリウム
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の
ミスマッチ修復プロティンｍｕｔＬタンパク質、ヒトア
デノウイルス２後期Ｌ２ｍｕコアプロティン前駆体、ス
タフィロコッカス・アウレウム（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）ｐＩ２５８の仮定的１４Ｋタ
ンパク質（ｍｅｒオペロン）、バチルス・サブチリス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の仮定的タン
パク質、ヒトのミトコンドリア読み取り枠（ＯＲＦ）タ
ンパク質、ブラキダニオ・レリオ（Ｂｒａｃｈｙｄａｎ
ｉｏ ｒｅｒｉｏ）（縞模様の魚）のＰＯＵ−ｃ転写因
子、およびシネコシスチス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔ
ｉｓｓｐ．）のＨ^＋輸送性ＡＴＰシンターゼ（ＥＣ３．
６．１．３４）鎖ａである。ＦＡＬＶＰＬに対する完全
整合物は、ヒトＭＬＬ−ＡＦ４ ｄｅｒ（１１）融合タ
ンパク質、ヒト１４０ｋｄセリン／プロリンに富むタン
パク質、ＡＦ−４ｍＲＮＡによってコードされたヒトタ
ンパク質、ミコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ）のプロティンｌｍｂＥ、およびミスカンタス・
ストリークウイルス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｓｔｒｅ
ａｋ ｖｉｒｕｓ）のＶＯタンパク質である。

【０００９】

【発明の具体的な態様】材料 フィブリノーゲンに対するポリクローンウサギ抗体は、
Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａｌ（Ｇｒｅ
ｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ）およＥｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｌａｂｓ（Ｓｏｕｔｈ Ｂｅｎｄ，ＩＮ）から購
入した。第二抗体抱合体、ヤギ抗ウサギＩｇＧ−アルカ
リホスファターゼ、および色素基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰと
Ｆａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌＣｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）からのもので
あった。ヒトのフィブリノーゲンは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およ
びＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ ＡＢ（Ｍｏｌｎｄａｌ，Ｓ
ｗｅｄｅｎ）から購入した。Ｆｍｏｃアミノ酸はＮｏｖ
ｏｂｉｏｃｈｅｍからのものであった。他のすべての化
学品は試薬等級またはそれ以上のものであった。

【００１０】一般的方法 ペプチドライブラリーのスクリーニングは、微孔質ＨＰ
ＬＣ（ＭｉｃｒｏｍｅＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ａｕ
ｂｕｒｎ，ＣＡ）上の２．１ｍｍ×１５ｃｍカラム中で
行った。ペプチドおよび６量体組合せライブラリーは、
４，７，１０−トリオキサ−１，１３−トリデカンジア
ミン（Ｔｏｔｄａ；Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉ
ｓ，ＭＯ）で修飾されたＴｏｙｏｐｅａｒｌ ＡＦ Ｃ
ｈｅｌａｔｅ ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈａａｓ，Ｍｏｎｔ
ｏｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）上で、Ｂｕｅｔｔｎ
ｅｒ等（１９９６）に記載の標準Ｆｍｏｃ化学を使用し
て合成した。ペプチドはＧｉｌｓｏｎ ＡＭＳ４２２を
使用してロボット的に合成した。上記のスキームで達成
されたペプチド密度は通常０．２〜０．５ｍモル／ｇ樹
脂の範囲内であった。

【００１１】アフィニティークロマトグラフィー方式で
ペプチドをスクリーニングする場合、立体障害のために
フィブリノーゲン結合性の容量が低くなる危険を少なく
するために、いくらか低いペプチド密度がより望まし
い。かかる望ましい密度は、アフィニティークロマトグ
ラフィーの通常の技術で実施する場合、０．０５〜０．
２ｍモル／ｇ樹脂（１０〜４０ｍｇ／ｍｌ樹脂）の範囲
内である。Ｔｏｔｄａリンカー上で合成されるペプチド
の密度を調節するために、Ｆｍｏｃ−Ｌ−アラニン対ｔ
−Ｂｏｃ−Ｌ−アラニンの各種比率を含有する混合物を
Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌに結合させた。混合物
は、等濃度のストックＦｍｏｃ−Ｌ−アラニンの、ｔ−
Ｂｏｃ−Ｌ−アラニン中への系列希釈（１：０、１：
５、１：１０、１：２５、および１：１２５）によって
作成した。全アミノ酸濃度は、約２．５ｍモル／ｇ樹脂
（Ｔｏｔｄａの５倍）に一定に保持した。当該技術分野
で実施される標準Ｆｍｏｃ条件を使用して混合物を結合
させた後、Ｆｍｏｃ保護基をアルカリによって解放した
が、他方アルカリ耐性ｔ−Ｂｏｃは解放されなかった。
この残留ｔ−Ｂｏｃ誘導化Ｌ−アラニンは第一級アミン
を欠き、さらなるペプチド合成に利用できなかった。次
いで、ペプチドを樹脂上でＦｍｏｃ誘導化アミノ酸を使
用して合成し、次いで酸条件下（残留ｔ−Ｂｏｃも解放
した）で脱保護した。樹脂のバッチ上のペプチドの密度
は、標準方法による乾燥秤量試料の全アミノ酸分析によ
って決定した。最適ペプチド密度は、１：１０のＦｍｏ
ｃ対ｔ−Ｂｏｃの混合物を用いて達成された。

【００１２】可溶性結合性リガンドとして可溶性の精製
ペプチドが必要である場合、Ｒｉｎｋ樹脂（Ｎｏｖｏｂ
ｉｏｃｈｅｍ）を合成に使用した。ペプチドを切断し、
脱保護し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。別法とし
て、アフィニティークロマトグラフィーに必要である幾
つかのペプチドは、脱保護し、Ｎ−末端Ｆｍｏｃ基の除
去なしにＲｉｎｋ樹脂から切断し、逆相ＨＰＬＣによっ
て精製し、Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌに結合
させた。ペプチドの純度は分析用逆相ＨＰＬＣによって
評価し、組成はＦＡＢ質量分析法によって確認した。

【００１３】分析方法 ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳
動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、８％ポリアクリルアミド
ゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中で、
Ｌａｅｍｍｌｉ（１９７０）の操作法に従って、レーン
当たり４μｇタンパク質を負荷して行なった。ゲルから
タンパク質の移動は、未不使用膜結合部位を遮蔽するた
めにカゼイン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．）を使用するＴｏｗｂｉｎ等（１９７９）の方法に
よって行った。結合抗体は、化学発光性基質ＣＳＰＤ
（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用し、Ｘ
ＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈ
ｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に露出することによって検出した。

【００１４】免疫比濁法は、Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ
ＡＧ（Ｍａｒｂｕｒｇ，ＤＥＵ）から購入した検査キ
ットを用いて、Ｂｅｈｒｉｎｇ比濁計、ＢＮＡ型を使用
して行った。

【００１５】等温滴定比色法は、精製された可溶性ペプ
チド（５ｍＭ）またはＡ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｇｏｐｅａ
ｒｌ上に直接に合成されたペプチド（１．４ｍＭ）のい
ずれかを使用して、精製フィブリノーゲン（５０μＭ）
を用いて、Ｔｙｌｅｒ−Ｃｒｏｓｓ等（１９９３）の技
術の改良法によって行った。測定はすべて、３０℃で、
３０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０中で、Ｏｍｅｇａ滴
定比色計（Ｍｉｃｒｏｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈａ
ｍｐｔｏｎ，ＭＡ）を用いて行った。

【００１６】フィブリノーゲンに対する結合性ペプチド
の発見 米国特許出願番号第０８／４３８，３３１号明細書（引
用することによって本明細書中に取り込まれている）中
で使用されたものと同様の分析法を使用して、フィブリ
ノーゲンと結合するペプチドを推論した。この分析法
は、ペプチドライブラリー免疫染色クロマトグラフィー
分析法またはＰＥＬＩＣＡＮ法と呼称される。要する
に、６量体組合せペプチドライブラリーを、Ｔｏｔｄａ
によるアミノ化、次いで塩基易動性リンカーヒドロキシ
メチル安息香酸の添加、そして最終的にグリシン残基の
添加によって逐次修飾された、約０．１ｍモル／ｇ樹脂
の最終置換密度のＴｏｓｏＨａａｓクロマトグラフィー
樹脂、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ６５０Ｍ Ｃｈｅｌａｔｅ
（Ｇ−ＨＭＢＡ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）上
で直接にに合成した。ライブラリーは、２０種の天然ア
ミノ酸の中の１８種（システインおよびメチオニンを除
く）を用いて、Ｆ−ｍｏｃ化学を使用して合成した。ア
ミノ末端をメチルスルホニルエチルカルボニル基で部分
的に保護した。

【００１７】樹脂（０．５ｍｌ）への最初の接触物は、
平衡緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８と０．
１Ｍ ＮａＣｌおよび０．１％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ−２
０）、次いで洗浄緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌを含有する平
衡緩衝液）からなった。次いで、樹脂を、検出系の各個
成分と順次接触させた。これらの成分は、即ち、抗ヒト
フィブリノーゲン（アフニティー精製されたＩｇＧフラ
クション）、アルカリホスファターゼと複合化した第二
抗体、およびＢＣＩＰ／ＮＢＴブルー色素であった。す
べてのタンパク質は平衡緩衝液中にあり、次いで洗浄緩
衝液中にあった。

【００１８】さらに、樹脂を、上記およびＢｕｅｔｔｎ
ｅｒ等（１９９６）に記載のように、平衡緩衝液中の
０．６２５μｇのフィブリノーゲン（２ｎＭ）と接触さ
せ、次いで染料としてファースト・レッド（Ｆａｓｔ
Ｒｅｄ）を使用する検出系と接触させた。

【００１９】検出系と非特異的相互作用を示した青ビー
ズは、カラム全体に０．１％以下で均一に見出され；赤
ビーズはカラム全体に０．０１％以下で均一に見出され
た。各個ビーズを単離し、ペプチドを、メタノール中の
２０％トリエチルアミンを用いて２時間の音波処理によ
りビーズから切断した。切断されたペプチドを乾燥し、
Ｅｄｍａｎ分解法によって配列決定した。アミノ酸配列
データを以下に示す（表１）。不明確なコールがあった
サイクルについては、最高の応答をもつアミノ酸を第一
行にリストし、それより低い収量をもつものをその後の
行にリストした。

【００２０】

【表１】

【００２１】結合性確認分析法は、Ｔｏｔｄａ次いでア
ラニン残基で修飾された、０．２ｍモル／ｇ樹脂の最終
置換密度のＴｏｙｏｐｅａｒ ｌ６５０Ｍ Ｃｈｅｌａ
ｔｅ樹脂（Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）上に
直接に合成された各個ペプチド配列を使用して、微孔質
ＨＰＬＣ上のカラムクロマトグラフィー方式で行った。
樹脂への接触物（図１および図２、それぞれＰＬＬＶＬ
およびＦＬＬＶＰＬの場合）として、Ａ）平衡緩衝液
（上記と同じ）、洗浄緩衝液（上記と同じ）、溶出緩衝
液（２．５％酢酸）のみ；Ｂ）平衡緩衝液中のヒト血清
アルブミン（ｈＳＡ；０．５ｍｇ）、次いで洗浄および
溶出緩衝液；Ｃ−Ｅ）平衡緩衝液中の精製フィブリノー
ゲンの段階的に増大する用量（２５０、５００および１
０００μｇ）、次いで洗浄および溶出緩衝液）が挙げら
れる。終点は、フィブリノーゲン接触物中の酸溶出液の
用量依存性増加であり、定量は２８０ｎｍでの吸光度の
積分によった（図２）。

【００２２】

【表２】

【００２３】樹脂ＦＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏ
ｙｏｐｅａｒｌ、ＰＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏ
ｙｏｐｅａｒｌに対するフィブリノーゲンの結合には用
量依存性増加があり、ＦＡＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌに対する場合は程度が低かった。こ
れらの樹脂を、平衡緩衝液中のフィブリノーゲン（１０
０μｇ）およびｈＳＡ（０．５ｍｇ）との混合物と、
０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、低い非特異性結
合に使用されまたウイルス不活性化剤として使用される
非イオン性界面活性剤の存在または不在下で接触させ
た。樹脂を洗浄緩衝液（Ｔｗｅｅｎ−２０なし）および
２％酢酸で洗浄した。酸溶出液のＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る分析の結果（図３Ａ、レーン４−５およびレーン７−
８）は、ＰＬＬＶＰＬおよびＦＬＬＶＰＬ樹脂に結合し
たタンパク質の大部分は、精製フィブリノーゲン標準
（レーン１０）と共に移動する、フィブリノーゲンと同
じ分子量（３４０，０００）を持つものであることをで
示した。このタンパク質は出発混合物（図３Ａ、レーン
３）から大きく濃縮（ｅｎｒｉｃｈ）されていた。ヒト
フィブリノーゲンに対する抗体を用いるウエスタンブロ
ットの結果、このタンパク質の本性がフィブリノーゲン
と確認された（図３Ｂ）。緩衝液系中のＴｗｅｅｎ−２
０の存在は、酸溶出液中に回収されたタンパク質の量に
よって示されるように、フィブリノーゲンのいずれのペ
プチドへの結合にも影響しなかった。それ故、Ｔｗｅｅ
ｎは、カラムを洗浄することによって、フィブリノーゲ
ン溶液から除去した。

【００２４】

【表３】

【００２５】溶液相結合性等温式は、精製された可溶性
ペプチドおよび精製フィブリノーゲンについて、等温滴
定熱量計を使用して行った（表３）。配列ＰＬＬＶＰＬ
は、使用された条件下で、フィブリノーゲンに対し、Ｆ
ｌｌＶＰＬよりも弱い溶液結合性を示した。アミノ末端
でＰからＦに変化すると、解離定数は１５０倍以上低下
した。ＰＬＬＶＰＬはフィブリノーゲン分子当たり約３
〜４部位に結合した。これらの相互作用は大きい正のエ
ントロピーを有し、それは、配座変化がペプチドまたは
フィブリノーゲン中に起こったことを示すことができ
る。配列ＦＬＬＶＰＬはフィブリノーゲン上の約１部位
で結合し、この結合はまた非常に大きい正のエントロピ
ーを有した。両ペプチドの結合反応は、正のエンタルピ
ー（ΔＨ）によって示されるように、吸熱性であり、試
験された条件下で熱力学的に有利であった（負のΔ
Ｇ）。異常に高いエントロピーは、配座変化がペプチド
のフィブリノーゲンとの会合を推進することができるこ
とを示す。

【００２６】Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ上で
合成されたＦＬＬＶＰＬの見掛の解離定数は、可溶性ペ
プチドより１００倍以上減少した。エンタルピーおよび
エントロピーの大きさが増加したことは、可溶性ペプチ
ドと比較して、フィブリノーゲンへの結合が同様の機構
であることを示唆している。結合の遊離エネルギーは有
利であった。

【００２７】

【実施例】

実施例１ＦＬＬＶＰＬおよびＰＬＬＶＰＬ樹脂の使用による血漿
からのフィブリノーゲンの精製 ヒト血漿を、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含
有する平衡緩衝液中で１：２に希釈した。洗浄および溶
出条件は上記の通りであった。約１．０ｍｌを、ペプチ
ド樹脂ＰＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａ
ｒｌおよびＦＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌ上に注入した（それぞれ、図４および図５）。
酸処理を使用して、タンパク質をペプチド樹脂から解放
した。新しく凍結および融解し、寒冷沈降物を遠心分離
によって除去した全血漿を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
分析した（図３Ａ、レーン２）。血漿は、ゲルの頂部近
辺にフィブリノーゲンのバンドを含有し、その本性はウ
エスタンブロット法によって確認された（図３Ｂ、レー
ン２）。酸溶出液は高度に精製されたフィブリノーゲン
を含有した（図３Ａおよび図３Ｂ、レーン６およびレー
ン９）。

【００２８】ＦＬＬＶＰＬ樹脂分離からの酸溶出液フラ
クションを、１Ｍ ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．０でｐＨ
を中性の調節した後、フィブリノーゲンおよび他の数種
の血漿タンパク質について、免疫比濁分析法によって分
析した（表４）。

【００２９】

【表４】

【００３０】この分析法を使用することによって、酸溶
出液中には、フィブリノーゲンおよび少量のＩｇＭ以外
の血清タンパク質は全く検出されなかった。免疫反応性
フィブリノーゲンの回収率が低いのは（５８．８％）、
低ｐＨへの露呈による抗原性の減少を反映している。他
のすべての試験血漿タンパク質は検出限界以下であっ
た。

【００３１】実施例２結合性配列のさらなる特性決定 Ｎ−アセチル化アミノ末端を有するおよび有しないペプ
チドＰＬＬＶＰＬおよびＦＬＬＶＰＬを、約０．２ｍモ
ル／ｇ樹脂の密度のＡｌａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌ上に直接に合成した。これらの樹脂のフィブリノ
ーゲンと結合する能力は上記の通りに決定した。フィブ
リノーゲンをＰＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏ
ｐｅａｒｌに結合させるためには、遮蔽されていない
（遊離）アミノ末端が必要であった。ＦＬＬＶＰＬ−Ａ
−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌを使用する別の実験
において同様の結果が得られた（表５）。

【００３２】

【表５】

【００３３】結合に必要な最小配列を同定するために、
ＰＬＬＶＰＬおよびＦＬＬＶＰＬのカルボキシル−およ
びアミノ−末端からの切断物を、Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏ
ｙｏｐｅａｒｌ樹脂上に直接に合成した。表６は、クロ
マトグラフィー方式で段階的に増大する用量のフィブリ
ノーゲンと接触させた樹脂からの溶出液の定量結果を示
す。

【００３４】

【表６】

【００３５】完全長のペプチド（例えば、６量体）は、
１Ｍ ＮａＣｌによって解放された量の増加がより少な
いが比例的であったが、低ｐＨで解放された量に反映さ
れているように、３種類の注入量のすべて（２５０、５
００および１０００μｇ）の場合にフィブリノーゲンに
最も緊密に結合した。Ｃ−末端からの切断によって、１
Ｍ ＮａＣｌによって解放された量がより多いことによ
って示されるように、フィブリノーゲンへの結合の緊密
性が低いペプチドが得られた。Ｎ−末端切断ペプチドの
場合に同様の結果が観察された。これらの結果は、試験
された条件下でのフィブリノーゲンへの最適の結合のた
めには、６種のアミノ酸の完全ペプチド配列が必要であ
ることを示している。追加的には、ペプチドの長さの改
変によって、低ｐＨによるよりもさらに温和な溶出条件
が可能になることができる。４個のアミノ酸の長さであ
るペプチド（４量体）は良好に結合し、５個のアミノ酸
の長さであるペプチド（５量体）はさらに好適であり、
６個のアミノ酸の長さであるペプチド（６量体）は最も
好適である。７個（７量体）またはそれ以上のアミノ酸
の長さであり、本明細書中に開示された配列を含有する
ペプチドもまた、結合性ドメインが上記のようにフィブ
リノーゲンによって結合されるのに利用しやすいまたは
有効である場合、フィブリノーゲンと結合するのに適し
ていることが予想される。

【００３６】実施例３結合相互作用のさらなる特性決定 ペプチドＦＬＬＶＰＬを、０．２ｍモル／ｇ樹脂の密度
のＡ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ上に直接に合成
した。寸法１．０×６．４ｃｍ（約５ｍｌカラム容量）
のカラムを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳまたは１０ｍＭ酢酸
ナトリウム、ｐＨ６．８のいずれか、１．０ｍＭ ＥＧ
ＴＡ、および０．１、０．２または１．０Ｍ ＮａＣｌ
のいずれかで平衡させた。フィブリノーゲン（２５ｍ
ｇ；５．０ｍｌ）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ
６．８、および０．１Ｍ ＮａＣｌを含有する１ｍＭ
ＥＧＴＡ中のカラムに適用した。これらの条件下では、
適用された吸光度（２８０ｎｍ）の約５〜８％はカラム
に結合しなかった。従って、結合はイオン強度の増加に
よっては影響されず、このことは、ペプチド−タンパク
質相互作用での疎水性結合の顕著な役割を示唆してい
る。

【００３７】フィブリノーゲン（２５ｍｇ；５．０ｍ
ｌ）を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．８、および
０．１Ｍ ＮａＣｌを含有する１ｍＭ ＥＧＴＡ中のカ
ラムに適用した。結合緩衝液中の非イオン性界面活性剤
（５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で溶出した結果、適用された
タンパク質の４０％が解放され、このことは、結合にお
ける疎水性相互作用の役割を示唆している。反対に、イ
オン性（２％コール酸ナトリウム）界面活性剤で溶出す
ると、１４％だけが解放された。

【００３８】フィブリノーゲン（１０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ６．８、および０．１ＭＮａＣｌを含有する１
ｍＭ ＥＧＴＡ中のカラムに適用された）の溶出は、親
水性化合物、ポリエチレングリコール（１０％）を使用
することによっては全く観察されなかった。１０ｍＭホ
ウ酸ナトリウムでｐＨを１０に上昇させることによっ
て、適用されたフィブリノーゲンの約８％のみが溶出さ
れたに過ぎない。直線勾配でｐＨをさらに上昇させると
（ｐＨ６．８から１２．０に）、フィブリノーゲンの約
２５％が解放された。他方、６．８から４．０へのｐＨ
勾配を使用した結果は、ｐＨ４．２でフィブリノーゲン
の約６６％が解放された。

【００３９】ＦＬＬＶＰＬのフィブリノーゲンへの結合
機構に対する疎水性相互作用の貢献をさらに評価するた
めに、フィブリノーゲン（２５ｍｇ；５．０ｍｌ）を、
疎水性結合に有利である高塩条件下でペプチドに適用
し、そして低イオン強度下で解放させた。ペプチド樹脂
を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１．０Ｍ ＮａＣｌ、お
よび１．０ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ６．８で平衡させた。
同一緩衝液中のフィブリノーゲン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）
の５ｍｌをカラムに適用し、２カラム容量の同一緩衝液
で洗浄した。次いで、樹脂を、１０カラム容量の１０ｍ
Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０と接触させ、次いで２％
酢酸（４カラム容量）と接触させた。溶出プロフィール
を図６に示す。適用されたタンパク質の約７．２％（２
８０ｎｍでの吸光度による）はカラムと相互作用せず、
流出および洗浄フラクション中に回収された。低イオン
強度および低ｐＨ（４．０）では、タンパク質の約７
８。３％が解放された。しかし、１０ｍＭ酢酸ナトリウ
ム、ｐＨ４．０溶液が０．１ＭＮａＣｌを含有する第二
実験においては、適用されたタンパク質の５％のみが溶
出された。酸処理では、両実験で回収されたタンパク質
の残部が解放された。ｐＨ４．０溶出液を、０．４Ｍリ
ン酸ナトリウム、ｐＨ１１のストック溶液でｐＨを中性
化した後、α−トロンビンで処理すると、可視しうる血
餅が形成した。中性化された酸溶出液中の全回収タンパ
ク質の約８８．９％はα−トロンビンで凝固可能であっ
た。

【００４０】これらの結果は、フィブリノーゲンとＦＬ
ＬＶＰＬとの相互作用が、タンパク質のＮ−末端の第一
級アミンとのイオン性相互作用の外に、疎水性引力によ
って推進されることを示している。さらに、これらの結
果は、アフィニティークロマトグラフィーで有用であ
る、フィブリノーゲンのための結合および溶出戦略を示
している。

【００４１】結論 本発明者等はフィブリノーゲンのアフィニティー精製の
ための新規のペプチドの使用を示した。これらの新規の
ペプチドは利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメイン
を有し、ペプチドライブラリーをスクリーニングするこ
とによって得られ、そして精製された形態で容易に製造
することができる。さらに、保存的置換、末端残基の欠
失、および／または末端部分の添加によるペプチドの修
飾が、結合の選択性を変えるための有用な技術であるこ
とが予想される。

【００４２】なお、本発明の主たる特徴および態様を以
下に記載する。

【００４３】１．結合性ドメインがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−ＶａｌおよびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏよ
りなる群から選ばれることを特徴とする、利用可能なフ
ィブリノーゲン結合性ドメインを有するペプチドを含ん
でなる組成物。

【００４４】２．ペプチドが５量体（５−ｍｅｒ）であ
る上記１に記載の組成物。

【００４５】３．ペプチドがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｖａｌ−ＰｒｏおよびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
−Ｌｅｕよりなる群から選ばれる上記２に記載の組成
物。

【００４６】４．ペプチドが６量体である上記１に記載
の組成物。

【００４７】５．ペプチドがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＬｅｕおよびＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれる上記
４に記載の組成物。

【００４８】６．ペプチドが４量体、５量体、６量体、
および７量体よりなる群から選ばれる上記１に記載の組
成物。

【００４９】７．結合性ドメインがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌ
ｅｕ−Ｖａｌ−ＬｅｕおよびＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、およびＰｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅ
ｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれる、
利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを有するペ
プチドを含んでなる組成物。

【００５０】８．基質が支持物質に結合したペプチドを
含んでなり、ペプチドがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ
ｌおよびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏよりなる群か
ら選ばれた利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメイン
を有することを特徴とする、フィブリノーゲンを基質に
結合させるのに十分な条件下でフィブリノーゲン含有溶
液を基質と接触させることを含んでなるフィブリノーゲ
ンの精製方法。

【００５１】９．基質が支持物質に結合したペプチドを
含んでなり、ペプチドがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａ
ｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、およびＰｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖ
ａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれた利用可能
なフィブリノーゲン結合性ドメインを有することを特徴
とする、フィブリノーゲンを基質に結合させるのに十分
な条件下でフィブリノーゲン含有溶液を基質と接触させ
ることを含んでなるフィブリノーゲンの精製方法。

【００５２】１０．Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐ
ｒｏ−Ｌｅｕ、およびＰｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれるペプチド。

【００５３】１１．Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−
Ｐｒｏ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ、およびＬｅ
ｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選
ばれるペプチド。

【００５４】

【表７】

【００５５】

【表８】

【００５６】

【表９】

【００５７】

【表１０】

【００５８】

【表１１】

【図面の簡単な説明】

【図１】ペプチドＰＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏ
ｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：２）上でのクロマトグラフ
ィー的分離の溶出プロフィール（２８０ｎｍでの吸光
度）を示す。Ａ）緩衝液、タンパク質なし；Ｂ）０．５
ｍｇ ｈＳＡ；Ｃ）２５０μｇフィブリノーゲン；Ｄ）
５００μｇフィブリノーゲン；Ｅ）１０００μｇフィブ
リノーゲン。フィブリノーゲンは約１７μｌ／分で１０
分間に適用し、次いでカラムを平衡緩衝液で８６５μｌ
／分で４分間洗浄し、次いで１．０Ｍ ＮａＣｌを含有
する平衡緩衝液で５分間、３．０Ｍ ＮａＣｌでさらに
５分間、０．１Ｍでさらに５分間洗浄した。タンパク質
は、２％酢酸を使用することによって、３０〜３５の間
に溶出した。

【図２】ペプチドＦＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏ
ｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：１）上でのクロマトグラフ
ィー的分離の溶出プロフィール（２８０ｎｍでの吸光
度）を示す。線の表示は図１と同一である。溶出条件は
図１と同一である。

【図３】Ａは血漿、フィブリノーゲンとｈＳＡの混合
物、およびクロマトグラフィー的分離からの酸溶出液の
クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミド電気泳動）の結果を表す図面
に代わる写真である。レーン１、分子量標準；レーン
２、ヒト血漿；レーン３、フィブリノーゲン／ｈＳＡ混
合物；レーン４、ＰＬＬＶＰＬ−樹脂（配列番号２）に
適用されたフィブリノーゲン／ｈＳＡ混合物（Ｔｗｅｅ
ｎなし）からの酸溶出液；レーン５、酸溶出液、レーン
４と同一（Ｔｗｅｅｎあり）；レーン６、ヒト血漿の酸
溶出液；レーン７−９、ＦＬＬＶＰＬ−樹脂（配列番
号：１）を使用するレーン４−６と同一；レーン１０、
フィブリノーゲン標準。ＢはＡに示したものの重複ゲル
のウエスタンブロット分析（すなわち、同上の電気泳
動）の結果を表す図面に代わる写真である。

【図４】ＰＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌ（配列番号：２）に適用された全血漿の溶出プロ
フィール（２８０ｎｍでの吸光度）を示す。溶出条件は
図１と同一である。

【図５】ＦＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌ（配列番号：１）に適用された全血漿の溶出プロ
フィール（２８０ｎｍでの吸光度）を示す。溶出条件は
図１と同一である。

【図６】ＦＬＬＶＰＬ−Ａ−Ｔｏｔｄａ−Ｔｏｙｏｐｅ
ａｒｌ（配列番号：１）に適用されたフィブリノーゲン
の、中性ｐＨ（６．８）での高い塩濃度（１Ｍ ＮａＣ
ｌ）の条件下の溶出プロフィール、および低ｐＨ（４．
０）での低いイオン強度（１０ｍＭ酢酸ナトリウム）に
よる溶出を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨージ・エイ・ボームバツク アメリカ合衆国ノースカロライナ州27545 ナイトデイル・ベデイングフイールドドラ イブ902 (72)発明者 デイビツド・ジエイ・ハモンド アメリカ合衆国ノースカロライナ州27614 ローリー・ベントリーフドライブ5312

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 結合性ドメインがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
   ｕ−ＶａｌおよびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏより
   なる群から選ばれることを特徴とする、利用可能なフィ
   ブリノーゲン結合性ドメインを有するペプチドを含んで
   なる組成物。
2. 【請求項２】 基質が支持物質に結合したペプチドを含
   んでなり、ペプチドがＰｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
   およびＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏよりなる群から
   選ばれた利用可能なフィブリノーゲン結合性ドメインを
   有することを特徴とする、フィブリノーゲンを基質に結
   合させるのに十分な条件下でフィブリノーゲン含有溶液
   を基質と接触させることを含んでなるフィブリノーゲン
   の精製方法。
3. 【請求項３】 Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒ
   ｏ−Ｌｅｕ、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ
   −Ｌｅｕ、およびＰｈｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐ
   ｒｏ−Ｌｅｕよりなる群から選ばれるペプチド。