JPH09124696A - フオンビルブランド因子に結合するペプチドリガンド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）の精製に
有効なペプチドリガンド及びそれを使用する精製法の提
供。 【解決手段】 リガンドは、ＲＬＨＳＦＹ，ＲＬＫＳＦ
Ｙ，ＲＬＮＳＦＹ，ＲＬＯＳＦＹ，ＲＦＲＳＦＹ，ＲＩ
ＲＳＦＹ，ＲＶＲＳＦＹ，ＲＹＲＳＦＹ，ＲＬＲＳＦ
Ｙ，ＨＬＲＳＦＹ，およびＫＬＲＳＦＹからなる群より
選ばれる。好適なペプチドリガンドは、配列ＲＶＲＳＦ
Ｙをもつ。基材にペプチドを結合させ、次いで、ｖＷＦ
がペプチドに選択的に結合するような条件下で、基材上
にｖＷＦを含む溶液を通過させ、そして次に、ｖＷＦを
溶出することを含む、ｖＷＦを精製するために開示ペプ
チドを使用する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、タンパク
質に結合するペプチドリガンド、そして具体的には、フ
ォンビルブランド因子のようなタンパク質のアフィニテ
ィー精製に使用されるクロマトグラフィー基材を改変す
るためのペプチドリガンドの使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】タンパク質フォンビルブランド因子（ｖ
ＷＦ）は、血友病および凝固に関連する疾患の治療にお
ける重要な補因子タンパク質である。正常な人間の血液
中では、ｖＷＦは、血液凝固カスケードに直接必要とさ
れる第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を安定化し、そして
輸送する（１）。ヒトのｖＷＦまたはＦＶＩＩＩのいず
れかの欠乏は、関連するタンパク質または両者の複合体
の濃縮液（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ）で処置できる恒
常性疾患をもたらす。これらの濃縮液は、プールされた
多数の献血者の血液から調製され、そして製造には高価
である。濃縮液は、必要とされる特定の因子に富んでい
るが、それは、なお他のタンパク質により汚染されてい
る。また、これらの濃縮液の起源によっては、ウイルス
汚染の危険性もある（２）。

【０００３】ｖＷＦの精製は、それが、分子量範囲０．
５〜１０ｘ１０⁶ダルトンをもつ多量体タンパク質であ
るが故に、ある種の挑戦を意味する（１）。これは、精
製法における選択的沈殿、サイズ排除、イオン交換、ま
たは免疫アフィニティークロマトグラフィー段階を含
む、このタンパク質に対する種々のアプローチの使用へ
と導いた。

【０００４】フォンビルブランド因子−第ＶＩＩＩ因子
複合体濃縮液 フォンビルブランド因子−第ＶＩＩＩ因子複合体（ｖＷ
Ｆ−ＦＶＩＩＩ複合体）濃縮液の調製は、古典的には、
血漿の低温沈殿物からの沈殿法によって行われてきた。
これらの濃縮液は、多くの他の血漿タンパク質、特にア
ルブミン中のｖＷＦ−ＦＶＩＩＩの混合液である。方法
は、異なる溶解度に依存する。共通の沈殿剤は、水酸化
バリウムまたは水酸化アルミニウムのような金属水酸化
物、ポリエチレングリコール、およびグリシンのような
アミノ酸である。そのような操作によって除去される関
連タンパク質は、β−グロブリンとフィブリノーゲンで
ある。

【０００５】最近の単離法は、イオン交換クロマトグラ
フィーを用いて、中間純度の濃縮液を調製する。第ＶＩ
ＩＩ因子は、通常は、このアプローチによってはｖＷＦ
から除去されない。アニオン交換樹脂は、血漿から直
接、ｖＷＦ−ＦＶＩＩＩを捕捉するために使用されてき
た（３−４）。アニオン交換クロマトグラフィーを用い
る低温沈殿物由来のｖＷＦ−ＦＶＩＩＩの精製は、既に
報告されている（５−６）。その他は、精製方法にアフ
ィニティークロマトグラフィー段階を組み入れた（７−
１０）。

【０００６】また、アフィニティー法は、レクチンのよ
うなリガンド（１１）と金属キレートの使用を含む、血
漿由来のｖＷＦ−ＦＶＩＩＩを高純度に濃厚化するため
に導入された。最近では、ヘパリンが、ｖＷＦ−ＦＶＩ
ＩＩ複合体濃縮液を作成するためのリガンドとして導入
された（１２−１３）。

【０００７】本開示にとって重要なことには、Hagen ら
は、血小板糖タンパク質１ｂのアミノ酸配列由来のペプ
チドを用いて、ｖＷＦ単独か、ｖＷＦ−ＦＶＩＩＩ複合
体かいずれかの精製を記述している（２）。彼らは、糖
タンパク質１ｂのアミノ酸１６５〜２６０、血小板表面
のｖＷＦ相互作用のためのインテグリン（ｉｎｔｅｇｒ
ｉｎ）レセプターに対応する少なくとも４個の連続する
アミノ酸のいずれかのペプチドを用いる精製を特許請求
している。

【０００８】ＦＶＩＩＩに対する抗体を用いる免疫アフ
ィニティークロマトグラフィーは、ＦＶＩＩＩの精製の
ために実施されたが、これらの調製物は、例えば、血漿
由来ＦＶＩＩＩｃ濃縮液Ｈｅｍｏｆｉｌ中に、ｖＷＦを
欠いている（１４）。

【０００９】フォンビルブランド因子濃縮液 また、ＦＶＩＩＩを除去されたｖＷＦ濃縮液のクロマト
グラフィーによる調製も報告されている。アニオン交換
クロマトグラフィーは、典型的には、ｖＷＦ−ＦＶＩＩ
Ｉ複合体を破壊するのに十分な濃度でカルシウムイオン
を含むことによって、ｖＷＦからＦＶＩＩＩを分離する
のに使用できる（１６−１９）。

【００１０】ｖＷＦに対する抗体を用いる免疫アフィニ
ティークロマトグラフィーが、高純度のｖＷＦ濃縮液を
作成するために述べられた（２０）。また、同様な抗体
が使用されて、高純度のＦＶＩＩＩ調製物（例えばＭｏ
ｎｏｃｌａｔｅ）が作成されるが、その方法では、ＦＶ
ＩＩＩが、カルシウムイオンの使用により、抗体に結合
したｖＷＦから遊離される。次いで、抗体吸着剤からｖ
ＷＦを溶出することができる。しかしながら、免疫アフ
ィニティークロマトグラフィーは、アフィニティー・リ
ガンドとしてモノクローナル抗体を使用する。現在、モ
ノクローナル抗体は、アフィニティー・リガンドとして
使用するには前以て巾広く精製されねばならない。それ
故、ＦＤＡ（食品医薬品局、Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕ
ｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）の許可を得る方法
は、長たらしいものとなり、そして精製タンパク質の品
質は、変わるかもしれない。その上、固定化された抗体
は、操作条件に特に敏感である。アフィニティー分離過
程および衛生操作に、しばしば使用される苛酷な溶出条
件は、時間とともに抗体活性を失わせる。

【００１１】ペプチドリガンド・クロマトグラフィー リガンドとしてペプチドを用いるペプチド・アフィニテ
ィークロマトグラフィーは、免疫アフィニティークロマ
トグラフィー以上の有利性を有する（３２）。１つの利
点は、ペプチドリガンドが、わずか数個のアミノ酸のみ
からなることであり、それは、大きなマウス抗体とは違
って、生成物中へ漏洩した場合にも、多分免疫反応を引
き起こさないであろう。また、ペプチドリガンドは、抗
体リガンドに比較してはるかに安定である。それらは、
ＧＭＰ（医薬品の製造および品質に関する基準、ｇｏｏ
ｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅ
ｓ）条件下で大量に、無菌的に製造できる。結合ペプチ
ドとタンパク質間の相互作用は、分離に際して穏やかな
溶出条件を生むように、合成法によって容易に改変でき
る（３２）。

【００１２】古典的なアフィニティー相互作用は、１な
いし数個の特異的な場所における親水性および疎水性相
互作用を伴う（２２）。アフィニティークロマトグラフ
ィーは、いわゆる高いまたは生物特異的（ｂｉｏｓｐｅ
ｃｉｆｉｃ）なアフィニティークロマトグラフィーと、
弱いまたは偽生物特異的（ｐｓｅｕｄｏｂｉｏｓｐｅｓ
ｉｆｉｃ）なアフィニティークロマトグラフィーとに分
けることができる。これらの用語は、リガンドの性質の
違いに依存する可逆的相互作用における違いを述べてい
る（２１）。生物特異的アフィニティーリガンドは、生
物学的活性な物質間、例えば抗体およびその抗原間の相
互作用に依存するが、これに対して、偽生物特異的リガ
ンドは、典型的には、色素および金属キレートのような
低分子である。生物特異的および偽生物特異的両分離に
おいて、多種類の相補的分子内結合を介する可逆的相互
作用の性質は、同じである。典型的には、生物特異的相
互作用は、高い結合定数をもち、そして特異性を増大す
るであろう。

【００１３】ペプチドは、生物特異的と偽生物特異的ア
フィニティー相互作用の両方に分類できる。例えば、ペ
プチド配列は、タンパク質リガンドの相互作用部位のサ
ブ配列であってもよい。これは、ｖＷＦに結合する、血
小板１ｂ由来のペプチドの場合である（２）。特異性は
高く、そしてタンパク質は、そのペプチドによって溶出
されるであろう。同様に、生物学的リガンドとのいかな
る明瞭な配列相同性もないペプチドも、例えば、ビオチ
ンを模倣し、ストレプトアビジンを結合する配列ＨＰＱ
のようにリゲート（ｌｉｇａｔｅ）と相互作用するかも
しれない（３２）。生物特異的および偽生物特異的機構
は、タンパク質のクロマトグラフィーによる精製のため
には有用である。

【００１４】Vijayalakshmi（２３）は、ヒスチジル−
セファロースを用いることによって、付着したｖＷＦを
もつ第ＶＩＩＩ因子の精製を例証した。吸着の条件は、
疎水的およびイオン的相互作用が、結合に重要であるこ
とを示唆した。例えば、吸着のｐＨは、低いイオン強度
における６．０（範囲５．８〜６．１）であった。ｖＷ
ＦのｐＩは、５．８であり、このｐＨでは、相互作用
は、単にイオン的だけでは働かないであろう。脱着は、
イオン的相互作用を妨げるのに有用な条件、０．１Ｍグ
リシン、０．３Ｍリジンおよび０．３ＭＣａＣｌ₂を用
いて実施された。また、著者は、ヒスチジン−セファロ
ース系が、結合するＩｇＧ、および内毒素を含む他の分
離に有用であることも例証した。

【００１５】ペプチドリガンドは、ファージペプチド・
ライブラリーをスクリーニングすることによって見出だ
すことができる（２４）。ファージペプチド・ライブラ
リーは、ファージ表面にランダムペプチドを発現するた
めに培養される細菌ファージ中へ、一定の長さのランダ
ム遺伝子の挿入によって創製される。次いで、各々が異
なるペプチドをもつ数百万個のファージ粒子が、ペトリ
皿上に固定された目的のタンパク質とともに培養され
る。目的のタンパク質に特異的に結合しないファージ粒
子は、洗浄除去される。特異的に保留されたファージ
は、遺伝子増幅のために、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細
胞に感染するのに使用される。増幅された遺伝子は、配
列決定され、そして特異的ペプチド配列が、演繹でき
る。

【００１６】

【発明の構成】本発明者らは、ここに、ｖＷＦに結合す
る広い範疇の偽生物特異的リガンドに入る１群のペプチ
ドアフィニティー・リガンドを記述する。この群は、次
のようなペプチドアフィニティー・リガンド：ＲＬＨＳ
ＦＹ，ＲＬＫＳＦＹ，ＲＬＮＳＦＹ，ＲＬＯＳＦＹ，Ｒ
ＦＲＳＦＹ，ＲＩＲＳＦＹ，ＲＶＲＳＦＹ，ＲＹＲＳＦ
Ｙ，ＲＬＲＳＦＹ，ＨＬＲＳＦＹ，およびＫＬＲＳＦＹ
を含む。好適なリガンドは、ＲＶＲＳＦＹである。さら
にまた、本発明者らは、基材に特定配列のペプチドアフ
ィニティーリガンドを結合した基材上に、タンパク質含
有溶液を通過させ、次いで、ｖＷＦを溶出することを含
む、ｖＷＦを精製する方法を記述する。

【００１７】［材料および方法］樹脂のアミノ化および固相ペプチド合成 TosoHaas(Montgomeryville, PA)製Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
（商標）６５０Ｍキレート樹脂が、ペプチドのアミノ化
と直接合成のために選ばれた。樹脂は、水、メタノール
およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，Burdick & Jack
son）を含む２５ｇ反応容器中で洗浄された。樹脂カル
ボン酸基の５倍モル過剰のエチレンジアミン（Aldrich,
Milwaukee, WI）を、ＤＭＦ中ややモル過剰のベンゾト
リアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリリジノ
ホスホニウム(ＰｙＢＯＰ, NovaBiochem, La Jolla, C
A）およびＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ，ＰｙＢＯＰ
の３倍モル過剰、 Aldrich）を用いて、６０分間、カル
ボン酸部分にカップリングさせた。このアミノ化された
樹脂を、ＤＭＦ、次にメタノールで洗浄し、次いで、真
空乾燥した。切断されないペプチド樹脂を作成するため
に、２個のβ−アラニン（Nova Biochem）スペーサー残
基を、標準的固相ペプチド合成カップリング法によって
カップリングした。

【００１８】ペプチドは、α−アミノ保護基としてＦＭ
ＯＣ（９−フルオレニルメトキシカルボニル）を利用す
るＧｉｌｓｏｎＡＭＳ４２２マルチプル・ペプチド・シ
ンセサイザー（Middleton, WI）における固相法によっ
て合成された。簡単には、各アミノ酸（５倍モル過剰；
ＤＭＦ中０．５Ｍ １ｍｌ）を、本発明者らにより改変
されたＴｏｓｏＨａａｓ樹脂（０．３ｇ，１２０μｍｏ
ｌｅ）またはＲｉｎｋアミド樹脂（Nova Biochem、０．
５ｇ，２００μ）とともに、ＰｙＢＯＰ（ＤＭＦ中０．
３Ｍ ０．５ｍｌ）およびＮＭＭ（ＤＭＦ中１．１９Ｍ
０．２５ｍｌ）を用いてイン・サイチューで活性化し
た。カップリングは、アルゴン通気撹拌により４５分間
進行させた。全ペプチドは、試薬Ｒ（９０％トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）、５％チオアニソール、３％エタンジ
チオール、２％アニソール ５ｍｌ、すべてAldrich
製）を用いて３．５時間切断および／または脱ブロック
された。ＴｏｓｏＨａａｓ樹脂−ペプチドを、合成容器
中で脱保護し、メタノールで徹底的に洗浄し、そして真
空乾燥した。Ｒｉｎｋ樹脂からのペプチド混合物を、樹
脂から直接、冷無水ジエチルエーテル（Aldrich）４０
ｍｌ中に中間多孔度の焼結ガラス漏斗を通して濾別し
た。濾過ケーキを、５０％アセトニトリル／水に溶解
し、そして風袋を計ったシンチレーションバイアル中で
凍結乾燥した。これらの沈殿した未精製ペプチドを、５
０％アセトニトリル／水中、２５〜５０ｍｇ／ｍｌで溶
解し、そして１ｍｌを、２２ｍｍｘ２５０ｍｍ（Ｃ１８
１５μ ３００Å、Vydac, Hesperia, CA）の逆相カ
ラムをもつ調製用ＨＰＬＣ（Gilson, Inc. Middleton,
WI）によって精製した。分析用ＨＰＬＣシステム、Ｕｌ
ｔｒａｆａｓｔ Ｍｉｃｒｏｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌ
ｙｚｅｒは、Microm BioReseaches, Inc.（Sacamento,
CA）から購入した。分子量およびペプチドの配列は、Ｊ
ＥＯＬ ＨＸ１１０ＨＦ装置において高速原子衝撃質量
分析を用いるＭＳ／ＭＳ測定法によって明らかにした。

【００１９】ペプチドの固定化およびアフィニティーカ
ラムの充填 精製したペプチドを、０．２Ｍ重炭酸ナトリウムおよび
０．５ＭＮａＣｌ中にｐＨ１０．３で溶解した。樹脂粉
末、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ（Toso
Haas，Montgomeryville,PA）を、樹脂０．５ｇ対ペプチ
ド溶液３．２ｍｌの比でペプチド溶液と直接混合した。
そのスラリーを、４０℃で２４時間撹拌し、次いで、溶
液を樹脂から分離した。固定化前後の溶液中のペプチド
濃度を、分析用Ｃ１８逆相クロマトグラフィーで測定し
た。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ粉末を、ペプチド溶液と混合し
た場合、希釈の影響はないので、混合後のペプチドピー
ク領域の減少は、固定化の結果であり、ペプチドカップ
リング効率の算定に使用した。

【００２０】ペプチドのカップリング後、ゲル上の反応
部位を、１ＭエタノールアミンとｐＨ１１で２４時間４
０℃で反応させることによってブロックした。ゲルを、
脱気したＰＢＳ（リン酸緩衝塩類水）および１Ｍ塩化ナ
トリウムを用いてｐＨ７．４で洗浄した。

【００２１】ゲルスラリー（脱気ＰＢＳおよび１ＭＮａ
Ｃｌバッファー２ｍｌと混合された湿潤ゲル１ｍｌ）
を、充填器具（PerSeptive Biosystems, Framingham, M
A）に移し、そしてＰＥＥＫカラム（０．７５ｃｍｘ５
ｃｍ, Altech, Deerfield, IL）中に、流速８ｍｌ／ｍ
ｉｎで充填した。圧力低下は、６０ｐｓｉ．であり、こ
れは、製造者によって示された最高圧力低下１２０ｐｓ
ｉ．内であった。カラムを、少なくとも４倍ベッド容量
の結合バッファー（１０ｍＭＨＥＰＥＳ，１００ｍＭＮ
ａＣｌ、５ｍＭ塩化カルシウムｐＨ７）および溶出バッ
ファー（２％酢酸）で洗浄し、次いで、結合バッファー
で平衡化した。

【００２２】溶媒および界面活性剤による処理 ＰＥＧ濾液と呼ばれる出発材料は、Bayer Corp.(Clayto
n, NC)においてヒト血漿低温沈殿物から処理された。こ
の材料は、ｖＷＦ、ＦＶＩＩＩ、多量のフィブリノーゲ
ン、フィブロネクチンおよびＩｇＭを含有した。ＰＥＧ
濾液を、１％ＴＮＢＰ（リン酸トリ−ｎ−ブチル）およ
び０．５％Ｔｗｅｅｎ２０（Aldrich）を用いて３０℃
で３時間処理した。処理後、混合液を、ペプチドアフィ
ニティーカラム上に直接注入した。

【００２３】ＥＬＩＳＡ タンパク質濃度は、Ａ₂₈₀吸光度で追跡した。サンプル
は、ｖＷＦ・ＥＬＩＳＡを用いて特定した。簡単には、
抗−ｖＷＦ抗体（Accurate Inc. NY）を、０．１Ｍ重炭
酸ナトリウムバッファーｐＨ９．６中に２００倍に希釈
した抗体溶液１００μｌを用いて、ミクロタイタープレ
ート（９６穴、Corning, NY 14831）の各ウェル上に一
夜コーティングした。次に、各ウェルを、ＰＢＳ中１％
ＢＳＡの３００μｌ溶液により室温で１時間ブロックし
た。そのプレートを、ＰＢＳで５回洗浄した。純粋なｖ
ＷＦと回収されたサンプルを、ＰＢＳ中ＢＳＡ１ｍｇ／
ｍｌを用いて、０．０２〜０．２μｇ／ｍｌの濃度範囲
に希釈した。各サンプル（１００μｌ）を、抗−ｖＷＦ
をコーティングしたウェルを用いて、室温で１時間イン
キュベートし、そしてプレートを、ＰＢＳプラス０．１
％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。セイヨウワサビ・ペ
ルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と共役した第２の抗−ｖＷＦ
抗体（DAKO, Glostrup, Denmark）を、１〜５００倍希
釈濃度で各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベー
トした。プレートを再び、ＰＢＳプラス０．１％Ｔｗｅ
ｅｎ２０で５回洗浄した。基質ＡＢＴＳ（２，２’−ア
ジノ−ビス−（３−エチルベンズ−チアゾリン−６−ス
ルホン酸）およびＨ₂Ｏ₂を、BioTek(Winooski, VT)製Ｂ
ｉｏ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ｒｅａｄｅｒを用いる４１０
ｎｍでの速度読み取りのために使用した。

【００２４】ゲル電気泳動 回収したサンプルの分子量および純度を、Ｐｈａｓｔｓ
ｙｓｔｅｍ（Pharmacia, Piscataway, NJ)を用いて、還
元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した。ｖＷＦ
の多量体を決定するためには、１．５％アガロースゲル
電気泳動を使用した。アガロースゲル電気泳動は、Ｂｉ
ｏＲａｄミニゲルシステムにおいて実施した。

【００２５】吸着等温線の測定 吸着等温線を、バッチ様式で測定した。シリコン処理し
たミクロ遠心管中で、湿潤ゲル０．１ｍｌを、１０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ塩化カルシウムおよび０．５Ｍ塩化
ナトリウムｐＨ７のｖＷＦ溶液、全量０．３ｍｌと混合
した。ミクロ遠心管を、２５℃で２０時間インキュベー
トし、次いで、ゲルを、ミクロ遠心によって溶液から分
離した。溶液中のｖＷＦの濃度を、ｖＷＦ１ｍｇ／ｍｌ
の吸光係数１．２を用いる２８０ｎｍにおける吸光度お
よびＥＬＩＳＡの両方によって測定した。

【００２６】材料 ヒト血漿から得られた高度に精製されたｖＷＦは、Baye
r Corp.(Berkley, CA)から入手した。ｖＷＦ、ＦＶＩＩ
Ｉおよびアルブミンを含むＫｏａｔｅ（商標）は、Baye
r Corp.(Clayton, NC)の製品であった。実験に使用した
他の試薬は、分析級またはより純度の高いものをSigma
から入手した。すべての水溶液は、Ｂａｒｎｓｔｅａｄ
ｎａｎｏｐｕｒｅ水精製システム(Dubuque, IA)によ
って精製された脱イオン水を用いて調製した。

【００２７】

【実施例】本発明の最良の実施様式を発見するために、
発明者らは、精製効率に及ぼすペプチド配列、ペプチド
密度、塩濃度、温度、溶媒疎水性および溶媒ｐＨの影響
を検討した。

【００２８】ｖＷＦに結合するペプチドの同定 ｖＷＦに結合するペプチドを、第ＶＩＩＩ因子を除去し
た精製ｖＷＦを用いて、ランダム６量体バクテリオファ
ージ・ディスプレイライブラリーをスクリーニングする
ことによって発見した。ｖＷＦ結合で選ばれたクローン
を、標準ＤＮＡ配列分析にかけて、対応するペプチド配
列を演繹した。対応する配列のペプチドを、化学的に合
成し、樹脂にカップリングさせ、そしてそれらのｖＷＦ
結合能についてスクリーニングした。ペプチドＲＬＲＳ
ＦＹ（配列番号：１３）を、選択操作により演繹し、ア
フィニティーリガンドとして利用するために試験した。
便宜上、アミノ酸は、Lehningerにおいて定められたそ
れらの慣用略号によって表される（３１）。

【００２９】固定化ペプチドＲＬＲＳＦＹを用いるｖＷ
Ｆ精製のためのアフィニティークロマトグラフィー ペプチドＲＬＲＳＦＹを、改変されたＴｏｙｏｐｅａｒ
ｌ樹脂（−（β−Ａｌａ）₂−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ）上
で直接合成し（２５）、そして樹脂を、１ｍｌカラム
（０．７ｘ２．５ｃｍ）中に充填した。Ｋｏａｔｅ（ｖ
ＷＦ、ＦＶＩＩＩおよびヒト・アルブミンを含むBayer
の製品）を、結合バッファー（１０ｍＭＨＥＰＥＳ，５
ｍＭ塩化カルシウムおよび０．１ＭＮａＣｌ、ｐＨ７）
において、流速２ｍｌ／ｍｉｎでそのカラムに適用し
た。結合バッファーで洗浄１分後、ＨＥＰＥＳバッファ
ー中０．１から１ＭまでのＮａＣｌ直線勾配液を、５分
間以上かけてカラムに適用した。高塩濃度による溶出
を、さらに１分間持続し、その後、２％酢酸を使用し
て、保持されたタンパク質を溶出した。クロマトグラム
を、図１に示す。Ｋｏａｔｅ０．１ｍｌをカラムに適用
した場合、そのタンパク質の約６０％は、ペプチド樹脂
に結合しないか、またはゆるく結合し、塩化ナトリウム
によって溶出した。残留物は、２％酢酸を用いて溶出さ
れた。ペプチドが樹脂に接着されてない対照実験（−
（β−Ａｌａ）₂−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌのみ）では、Ｋ
ｏａｔｅ０．１ｍｌ由来のほとんど全タンパク質が、ペ
プチド−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラムに用いられた同一条
件下で、カラムを通過した。また、このクロマトグラム
も図１に示す。

【００３０】図１のピークを回収し、ＥＬＩＳＡによっ
てｖＷＦを、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度を分
析した。ｖＷＦのほとんどは、ＲＬＲＳＦＹ−Ｔｏｙｏ
ｐｅａｒｌカラムによって保持され、そして１Ｍまでの
塩化ナトリウムによって溶出されなかった（表１）。大
体半分のｖＷＦを、酸ピークにおいて回収した。これに
比べて、総ｖＷＦの８３％を、（β−Ａｌａ）₂−Ｔｏ
ｙｏｐｅａｒｌカラムからの通過ピークに見出だした。

【００３１】また、表１は、２種のカラムから回収され
た総タンパク質（２８０ｎｍにおける吸光度で表され
る、Ａ₂₈₀）が同じであることを示す。適用されたｖＷ
Ｆの半分だけが、ペプチド−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム
から回収される。これは、酸が溶出の間にｖＷＦの一部
を変性することを示唆している。このことは、ＥＬＩＳ
ＡアッセイにおけるｖＷＦ標準品の直接酸処理と続く中
和によって確認される（データは示されない）。

【００３２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元的）によるカラム
画分の分析は、ペプチド−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌからの酸
溶出液における主要タンパク質が、サブユニット分子量
２２５ｋＤａをもつことを明らかにした。酸ピークで
は、ゲルは、また、６６ｋＤａの位置に少量のアルブミ
ンを示した（データは示されない）。本発明者らは、ペ
プチド−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂が、Ｋｏａｔｅ混合液
からｖＷＦを保持できるが、ペプチド配列における若干
の改変が選択性を増進できるであろうと結論した。その
ことが、次のような配列最適化の研究に導いた。

【００３３】

【表１】

【００３４】配列の最適化 ＲＬＲＳＦＹの初めの３つの位置における単一同類アミ
ノ酸置換体を、（β−Ａｌａ）₂−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
上で直接合成した。両アルギニン（Ｒ）に使用されるア
ミノ酸置換体は、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、グ
ルタミン（Ｑ）およびアスパラギン（Ｎ）であった。ロ
イシン（Ｌ）の置換体は、イソロイシン（Ｉ）、バリン
（Ｖ）、フェニルアラニン（Ｆ）およびチロシン（Ｙ）
を含む。これらの個々の置換体が、１２種の独特のペプ
チド配列を生んだ（配列番号：１〜１２）。樹脂を１ｍ
ｌガラスカラムに充填後、Ｋｏａｔｅ０．１ｍｌを、各
カラムに適用し、そして塩化ナトリウム勾配と２％酢酸
を用いて、図１におけると同様に溶出した。画分を回収
し、そしてＡ₂₈₀吸光度とＥＬＩＳＡについて分析し
た。結果を、表２に列挙する。Ｎ−末端におけるＲが、
ＮまたはＱで置換された場合、カラムに捕捉されたｖＷ
Ｆのパーセンテージは、有意に減少したことが、証明さ
れる。Ｎ−末端から３番目の位置におけるＲの置換体
は、Ｋｏａｔｅ由来のｖＷＦの捕捉に影響を与えなかっ
た。このことは、Ｎ−末端のＲが、Ｋｏａｔｅ由来のｖ
ＷＦの捕捉において、３番目の位置のＲよりも重要な役
割を演じることを示唆すると思われた。ＬがＶで置換さ
れた場合、最大のｖＷＦ結合が起きた。

【００３５】ＲＶＲＳＦＹ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌにおけ
るｖＷＦの精製の確認を、出発材料としてＰＥＧ濾液を
用いて実施した（図２）。０．１５ＭＮａＣｌ洗浄と、
さらに０．３５ＭＮａＣｌ洗浄を加えることにより、大
部分のアルブミンが除去された。結合したｖＷＦは、２
％酢酸を用いて溶出された。図２、列８に見られるよう
に、ｖＷＦは、ＲＶＲＳＦＹ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌへの
結合によって高度に精製された。

【００３６】

【表２】

【００３７】ＲＶＲＳＦＹ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌへのｖ
ＷＦの吸着等温線 Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ上で直接合成されたＲＶＲＳＦＹと
ｖＷＦの間の相互作用が、吸着等温線測定を通して研究
された。ｖＷＦは、広範囲の分子量からなるので、吸着
等温線から結合定数を得るために、複雑な理論的解析が
要求される。それに加えて、ｖＷＦの種々の多量体は、
さまざまな結合定数をもつであろう。解析を単純化する
ために、１０００ｋＤａ周辺の分子量をもつｖＷＦを、
Ｂｉｏ−ＧｅｌＡ−５Ｍゲル（BioRad）によるサイズ排
除クロマトグラフィーを用いて、Ｋｏａｔｅから分画
し、そして非還元アガロースゲル電気泳動によって解析
した。

【００３８】図３における吸着等温線は、一定濃度のｖ
ＷＦでは、ほとんどのｖＷＦが、ＲＶＲＳＦＹ−Ｔｏｙ
ｏｐｅａｒｌに吸着されることを示している。吸着等温
線は、ラングミュアの式を用いて適合され、会合定数
１．３１ｘ１０⁶（Ｍ^-1）を得た。また、曲線の適合
は、樹脂の最大容量が、ｖＷＦ１５ｍｇ／樹脂ｍｌ、ま
たはｖＷＦ６０ｍｇ／樹脂１ｇであることを示した。

【００３９】吸着等温線に及ぼすペプチド密度の影響 ペプチドＡｃ−ＲＶＲＳＦＹ−アミド（配列番号：１
４）を、化学的に合成し、Ｃ−末端リジンを介してＴｏ
ｙｏｐｅａｒｌ−Ｅｐｏｘｙ−６５０Ｍ樹脂に固定化し
た。Ｎ−末端のアセチル基は、ペプチドがＮ−末端アミ
ンで樹脂にカップリングするのを妨害した。樹脂におけ
るペプチドのカップリング効率とペプチド濃度を、逆相
ＨＰＬＣによって追跡した。カップリング効率は、ペプ
チド５〜６０ｍｇ／ｍｌに対応して９５〜７５％の範囲
であった。

【００４０】吸着等温線に及ぼすペプチド密度の影響
を、図４に示す。ペプチド密度の増加は、ｖＷＦの吸着
を増進する。最小ペプチド密度、ペプチドＡｃ−ＲＶＲ
ＳＦＹ３２ｍｇ／樹脂１ｍｌ（３２μｍｏｌ／ｍｌ）
が、ペプチドへのｖＷＦの吸着に必要である。ラングミ
ュアの式を、これらの等温線を適合させるために使用
し、曲線適合から得られた会合定数と最大容量を、表３
に列挙する。それらは、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ樹脂上に固
定化されたペプチド密度の増大に伴う会合定数と最大結
合性能の増大を示す。

【００４１】

【表３】

【００４２】固定化ペプチド樹脂を、Ｋｏａｔｅ由来の
ｖＷＦ分離用カラムに充填する場合、カラムによって捕
捉されるＫｏａｔｅ中のｖＷＦのパーセンテージは、ま
た、ペプチド密度に依存した。図５は、クロマトグラフ
ィー型式において、Ｋｏａｔｅ由来のｖＷＦ捕捉に及ぼ
すペプチド密度の影響を示す。ペプチド密度が、３２ｍ
ｇ／ｍｌ未満の場合には、ｖＷＦの捕捉は、ほとんどな
かった。ペプチド密度の増大とともに、ｖＷＦの捕捉
は、捕捉なしから、密度５４ｍｇ／ｍｌにおけるほとん
ど完全捕捉まで、遷移的に進んだ。この傾向は、吸着等
温線測定から得られたものと一致した。

【００４３】ペプチド−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカラム由来
の捕捉されたｖＷＦ溶出に及ぼす塩および温度の影響 一般に、高塩濃度による溶出は、酸溶出よりも高い生物
活性をもつタンパク質を回収できる。この理由により、
溶出についての塩濃度を、２ＭＮａＣｌまで増加させた
が、Ａｃ−ＲＶＲＳＦＹＫ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌによっ
てＫｏａｔｅから捕捉されたｖＷＦは、遊離されなかっ
た。ＣａＣｌ₂およびＭｇＣｌ₂のような二価塩を溶出に
使用した場合、ペプチドカラムによって捕捉されたｖＷ
Ｆのほとんどを遊離した。図６は、カルシウムおよびマ
グネシウム濃度への、保持ｖＷＦの溶出の依存性を示
す。カルシウムおよびマグネシウム濃度が、０．３Ｍよ
り高い場合には、捕捉ｖＷＦの約８０％を溶出できた。

【００４４】温度を上げると、カルシウムは、Ａｃ−Ｒ
ＶＲＳＦＹＫ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌを充填したカラムか
ら、捕捉ｖＷＦを溶出するのに一層効果的であった。例
えば、温度を、２２から２６および３０℃に上げた場
合、０．５Ｍ塩化カルシウム溶液によって溶出されるｖ
ＷＦのパーセンテージは、それぞれ８０％から８５およ
び８９％まで増大した。二価塩および温度上昇による捕
捉ｖＷＦの効率的溶出は、固定化ペプチドとｖＷＦの間
のイオン相互作用が、結合相互作用に重要な役割を演じ
ていることを示唆する。

【００４５】より高い温度が、ｖＷＦを損傷しないこと
を確かめ、そして塩化カルシウム溶出のｖＷＦ回収率を
試験するために、５４ｍｇ／ｍｌペプチドＡｃ−ＲＶＲ
ＳＦＹＫを含む０．４ｍｌカラムを用いて、Ｋｏａｔｅ
０．１ｍｌからｖＷＦを分離した。通過液、塩（１ＭＮ
ａＣｌ）、０．５ＭＣａＣｌ₂および２％酢酸溶出の画
分を回収し、各画分中のｖＷＦ活性を、ＥＬＩＳＡによ
って測定した。ＣａＣｌ₂画分は、総ｖＷＦの８２．５
％を含み、そしてすべての画分中に回収されたｖＷＦ
は、８７．８％であった。これに比べて、２％酢酸のみ
を溶出に使用した時は、総ｖＷＦの５５．９％が回収さ
れた（表２）。

【００４６】Ｋｏａｔｅ由来のｖＷＦの捕捉に及ぼす溶
液ｐＨの影響 リガンドとタンパク質間のイオン相互作用は、溶液ｐＨ
が、タンパク質の等電点以上（または以下）から以下
（または以上）まで変化する場合、通常は減少する。Ｔ
ｏｙｏｐｅａｒｌ上に固定されたＡｃ−ＲＶＲＳＦＹＫ
の場合には、リガンドは、ｐＨ１２以下のすべてのｐＨ
において正に帯電される。ｖＷＦの等電点５．８（２
７）以上の溶液ｐＨは、ｖＷＦが負に帯電されるので、
好ましい相互作用をもつことが期待される。図７に示す
ように、ｐＨ６〜７では、ｖＷＦの約９５％が、ペプチ
ドカラムによって捕捉された。しかしながら、溶液ｐＨ
が５および４．６の時でも、ｖＷＦの可成のパーセンテ
ージ（それぞれ、９１％および６５％）が、ペプチドに
よって捕捉された（図７）。これらの結果は、低ｐＨで
は、イオン相互作用が、ｖＷＦの捕捉に必要な唯一の力
ではないことを示唆している。

【００４７】［例］ヒト血漿の低温沈殿物ＰＥＧ濾液からｖＷＦの精製 ヒト血漿の低温沈殿物由来の粗ＰＥＧ濾液を使用して、
実際の分離を例証した。ＰＥＧ濾液を、ウイルス不活化
薬剤、１％ＴＮＢＰおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を用
いて、３０℃で３時間処理した。処理されたＰＥＧ濾液
を、カラム中に直接注入した。図８に示すように、５４
ｍｇ／ｍｌペプチドＡｃ−ＲＶＲＳＦＹＫ−Ｔｏｙｏｐ
ｅａｒｌを含むカラムを使用して、ＰＥＧ濾液中のｖＷ
Ｆを捕捉し、そしてカルシウム勾配５ｍＭ〜５００ｍＭ
を用いて溶離した。総ｖＷＦのほぼ７４％が、０．３５
ＭＣａＣｌ₂で溶出した（１０分における小ピーク）。

【００４８】［結論］本発明者らは、ｖＷＦ精製用のア
フィニティーリガンドとして使用するための、ペプチド
ライブラリーから選択されたペプチドを記述した。固定
化ペプチドに対するｖＷＦの会合定数の測定は、表面へ
のｖＷＦの接着が多量体的であることを明らかにする。
ペプチド密度の増大は、結合定数と最大容量を増大する
ことが注目された（図４、５）。そのような現象は、多
点相互作用の特徴であり、その理由は、リガンド密度の
増大が、固定化されたリガンドとタンパク質間の相互作
用の可能性を増大するからであろう（２９）。最終的
に、アフィニティークロマトグラフィーによる、ヒト血
漿の粗ＰＥＧ濾液由来のｖＷＦの精製が例証された。

【００４９】ペプチドＲＶＲＳＦＹ、およびまたＲＬＲ
ＳＦＹ、そして同様の配列をもつ他の低ペプチドは、ｖ
ＷＦに親和力をもつ広い範疇の偽生物特異的リガンドに
入る。この場合、相互作用は強いように思われ、そして
特異性は中間である。結合の機構は、混合様式、すなわ
ち、すべてのアフィニティー相互作用に基本的に必要な
種々の結合型の組み合わせであると思われる。Ｎ−末端
におけるアルギニンのグアニジニウム基を介するイオン
相互作用が重要であるが、反対に、Ｎ−末端の第１級ア
ミンは重要ではない。かくして、ペプチド中の脂肪族ま
たは芳香族アミノ酸に対する疎水性結合のような他の相
互作用が役割の一部を果たす。

【００５０】ｖＷＦを精製するために低ペプチドを使用
することは、Hagenらによって既に報告されている
（２）。Hagenらの方法は、血小板糖タンパク質１ｂの
配列に由来するペプチドを使用する。糖タンパク質１ｂ
の残基１６５〜２６０の分析では、本発明に開示された
ペプチドのいずれとも類似性がないことが示される。さ
らにまた、ペプチドに関して検索されたタンパク質デー
タベースでは、ただ３種のタンパク質のみが相同な配列
を示したが、そのいずれもｖＷＦや血小板糖タンパク質
１ｂとは関係がない。（相同な配列をもつタンパク質
は、ブドウの木のクロームモザイクウイルス由来ゲノム
・ポリタンパク質１、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇ
ｌｅｎａ ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来リボソームタンパク
質Ｌ５、および酵母中の硫酸塩輸送タンパク質と思われ
るＹＢＲ２９４ｗであった。） 結論として、本発明者らは、タンパク質のアフィニティ
ー精製のために、ペプチド・ライブラリーから得られた
新規なペプチドの使用を例証したが、この場合、ペプチ
ドは、アフィニティー・マトリックス上で直接合成され
るか、または固定化される。ペプチド配列の同類置換
は、選択性の改変には有用な技術である。結局、ペプチ
ド密度、溶液ｐＨ、および塩濃度は、ヒト血漿の低温沈
殿物における粗材料ＰＥＧ濾液由来のｖＷＦ分離を最適
化するように調節できる。

【００５１】上記実施例は、本発明を具体的に説明する
ことを意図し、そして種々の変法が、当業者には生じる
であろうと考えられる。したがって、本発明の範囲は、
以下の請求範囲によってのみ限定されることが意図され
る。

【００５２】

【表４】

【００５３】

【表５】

【００５４】

【表６】

【００５５】

【表７】

【００５６】

【表８】

【００５７】

【表９】

【００５８】

【表１０】

【００５９】

【表１１】

【００６０】

【表１２】

【図面の簡単な説明】

【図１】ペプチドＲＬＲＳＦＹ（配列番号：１３）をも
つ場合（ａ）およびもたない場合（ｂ）のカラムからの
Ｋｏａｔｅ（商標）第ＶＩＩＩ因子について、溶出プロ
フィルを示す。

【図２】ＲＶＲＳＦＹ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）樹
脂（配列番号：１１）カラムを用いるクロマトグラフィ
ーから収集された画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（電気泳動）
の結果を示す図面と代わる写真である。列１：ヒト血清
アルブミン標準品；列２：標準ｖＷＦ；列３：出発材料
（ＰＥＧ濾液）；列４：分子量標準品；列５：通過ピー
ク；列６：０．１５ＭＮａＣｌ溶出液ピーク；列７：
０．３５ＭＮａＣｌ溶出液ピーク；列８：２％酢酸溶出
液ピーク。

【図３】ＲＶＲＳＦＹ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（配列番
号：１１）上への吸着等温線を示す。

【図４】Ａｃ−ＲＶＲＳＦＹＫ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
（配列番号：１４）へのｖＷＦの吸着に及ぼすペプチド
密度の影響を示す。

【図５】Ｋｏａｔｅ由来のｖＷＦの分離に及ぼす（Ａｃ
−ＲＶＲＳＦＹＫ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：１
４）上の）ペプチド密度の影響を示す。

【図６】５５ｍｇ／ｍｌ Ａｃ−ＲＶＲＳＦＹＫ−Ｔｏ
ｙｏｐｅａｒｌ（配列番号：１４）を充填されたカラム
からの捕捉されたｖＷＦの溶出に及ぼす二価カチオン濃
度の影響を示す。

【図７】Ａｃ−ＲＶＲＳＦＹＫ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
（配列番号：１４）を用いるＫｏａｔｅ由来のｖＷＦの
捕捉に及ぼす溶液ｐＨの影響を示す。

【図８】Ａｃ−ＲＶＲＳＦＹＫ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
（配列番号：１４）を用いる、ヒト血漿の低温沈殿物に
おける粗材料ＰＥＧ濾液由来のｖＷＦの精製を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨージ・エイ・ボームバク アメリカ合衆国ノースカロライナ州27545 ナイトデイル・ベツデイングフイールドド ライブ902 (72)発明者 デイビツド・ジエイ・ハモンド アメリカ合衆国ノースカロライナ州27606 ローリー・ベントリーフドライブ5312

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＲＬＨＳＦＹ，ＲＬＫＳＦＹ，ＲＬＮＳ
   ＦＹ，ＲＬＯＳＦＹ，ＲＦＲＳＦＹ，ＲＩＲＳＦＹ，Ｒ
   ＶＲＳＦＹ，ＲＹＲＳＦＹ，ＲＬＲＳＦＹ，ＨＬＲＳＦ
   Ｙ，およびＫＬＲＳＦＹからなる群より選ばれる、６個
   の連続するアミノ酸残基の特定配列を含んでなる組成
   物。
2. 【請求項２】 ＲＬＨＳＦＹ，ＲＬＫＳＦＹ，ＲＬＮＳ
   ＦＹ，ＲＬＯＳＦＹ，ＲＦＲＳＦＹ，ＲＩＲＳＦＹ，Ｒ
   ＶＲＳＦＹ，ＲＹＲＳＦＹ，ＲＬＲＳＦＹ，ＨＬＲＳＦ
   Ｙ，およびＫＬＲＳＦＹからなる群より選ばれるアミノ
   酸配列を含む基材と、フォンビルブランド因子を含む溶
   液を、基材にフォンビルブランド因子を結合させるのに
   十分な条件下で接触させることを含んでなるフォンビル
   ブランド因子の精製方法。