JPH1075778A - プロトロンビンおよびトロンビンに結合するペプチド - Google Patents
プロトロンビンおよびトロンビンに結合するペプチドInfo
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- JPH1075778A JPH1075778A JP9181895A JP18189597A JPH1075778A JP H1075778 A JPH1075778 A JP H1075778A JP 9181895 A JP9181895 A JP 9181895A JP 18189597 A JP18189597 A JP 18189597A JP H1075778 A JPH1075778 A JP H1075778A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
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- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 トロンビンおよびプロトロンビンに特異的に
結合するペプチドリガンド及びトロンビンを精製するた
めにアフィニティークロマトグラフィー法に使用する方
法を開示する。 【解決手段】 ペプチドの配列としてGln-Leu-Trp-Gly-
Ser-His，Arg-Gln-Leu-Trp-Gly-Ser-His，His-Gln-Leu-
Trp-Gly-Ser-HisおよびTyr-Phe-Pro-Gly-Pro-Tyr-Leuの
配列を有するペプチド及びそのアフィニティークロマト
グラフィーへの使用が提供される。
結合するペプチドリガンド及びトロンビンを精製するた
めにアフィニティークロマトグラフィー法に使用する方
法を開示する。 【解決手段】 ペプチドの配列としてGln-Leu-Trp-Gly-
Ser-His，Arg-Gln-Leu-Trp-Gly-Ser-His，His-Gln-Leu-
Trp-Gly-Ser-HisおよびTyr-Phe-Pro-Gly-Pro-Tyr-Leuの
配列を有するペプチド及びそのアフィニティークロマト
グラフィーへの使用が提供される。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は、一般的にタンパク
質−リガンド相互作用の同定、そして具体的にはプロト
ロンビンおよびその活性化状態であるトロンビンに結合
し、かつこれらのタンパク質のアフィニティー精製法に
使用できるペプチドリガンドに関する。
質−リガンド相互作用の同定、そして具体的にはプロト
ロンビンおよびその活性化状態であるトロンビンに結合
し、かつこれらのタンパク質のアフィニティー精製法に
使用できるペプチドリガンドに関する。
【０００２】
【従来の技術】α-トロンビンは、血漿セリンプロテア
ーゼチモーゲンであるプロトロンビンの活性化状態であ
り、タンパク質中のArg−Gly結合に高い特異性を有す
る。α-トロンビンは、その内皮細胞レセプター、血漿
凝固調節プロテインＣ、凝固V、VIIIおよびXIII因子、
ならびに血液凝固の主要タンパク質であるフィブリノー
ゲンを含む多くの生理学的基質を有する。α-トロンビ
ンによるフィブリノーゲンのフィブリンへの開裂は、フ
ィブリンの血液凝固への重合を生じる。トロンビンは、
典型的にはフィブリングルーまたは封止材と呼ばれる止
血用の調製物において商業的に使用されている。
ーゼチモーゲンであるプロトロンビンの活性化状態であ
り、タンパク質中のArg−Gly結合に高い特異性を有す
る。α-トロンビンは、その内皮細胞レセプター、血漿
凝固調節プロテインＣ、凝固V、VIIIおよびXIII因子、
ならびに血液凝固の主要タンパク質であるフィブリノー
ゲンを含む多くの生理学的基質を有する。α-トロンビ
ンによるフィブリノーゲンのフィブリンへの開裂は、フ
ィブリンの血液凝固への重合を生じる。トロンビンは、
典型的にはフィブリングルーまたは封止材と呼ばれる止
血用の調製物において商業的に使用されている。
【０００３】ヒトの血漿からのトロンビンの精製は、コ
ーン画分IIIを出発材料として使用して、Fentonら(197
1)ならびにMillerおよびCopeland(1965)の研究から引用
されるようにFentonら(1977)に記載された。この方法は
アルカリ塩沈殿および陽イオン交換クロマトグラフィー
を含むが、高純度のα-トロンビンを生成した。
ーン画分IIIを出発材料として使用して、Fentonら(197
1)ならびにMillerおよびCopeland(1965)の研究から引用
されるようにFentonら(1977)に記載された。この方法は
アルカリ塩沈殿および陽イオン交換クロマトグラフィー
を含むが、高純度のα-トロンビンを生成した。
【０００４】またトロンビンは、プロトロンビン濃縮物
（プロトロンビン複合体濃縮物:prothrombin complex c
oncentrate:PTCとも言う）から調製することもでき、こ
れは典型的には全血漿を陰イオン交換樹脂へ吸着させ、
そして溶出させることにより調製される(Coanら、1981
に要約されている）。この画分を、プロトロンビン（II
因子）、VII、IXおよびX因子、プロテインＣならびにプ
ロテインＳを含む数種のビタミン−Ｋ依存性プロテアー
ゼのチモーゲン形に濃縮する。続く処理は典型的には、
陽イオン交換クロマトグラフィーが必要である（Walzお
よびSeegers、1974;Downingら、1975)。
（プロトロンビン複合体濃縮物:prothrombin complex c
oncentrate:PTCとも言う）から調製することもでき、こ
れは典型的には全血漿を陰イオン交換樹脂へ吸着させ、
そして溶出させることにより調製される(Coanら、1981
に要約されている）。この画分を、プロトロンビン（II
因子）、VII、IXおよびX因子、プロテインＣならびにプ
ロテインＳを含む数種のビタミン−Ｋ依存性プロテアー
ゼのチモーゲン形に濃縮する。続く処理は典型的には、
陽イオン交換クロマトグラフィーが必要である（Walzお
よびSeegers、1974;Downingら、1975)。
【０００５】アフィニティー法は、プロトロンビン濃縮
物から、または陽イオン交換クロマトグラフィーにより
調製された下流の中間体から、血漿α-トロンビンを高
純度濃縮するために導入された。トロンビンはアフィニ
ティー相互作用のために利用された構造的特徴、すなわ
ち触媒部位、陰イオン-結合部位(フィブリノーゲン-結
合エキソサイトIとしても知られている)、およびヘパリ
ン−結合部位（エキソサイトII）を有する。有用なリガ
ンドは、例えばクロロベンジルアミン（Thompson、197
6：ThompsonおよびDavie、1971)およびp-アミノベンザ
ミジン(Lorneら、1989：Khamlichiら、1990)のような合
成インヒビター、および触媒部位に結合するL-アルギニ
ルメチルエステル(Yuら、1986)のような基質類似体を含
む。ヘパリンおよび陽イオンクロマトグラフィー樹脂
は、ヘパリン−結合部位（エキソサイトII）に結合する
(Miller-Andersonら、1980：NgaiおよびChang、1991)。
物から、または陽イオン交換クロマトグラフィーにより
調製された下流の中間体から、血漿α-トロンビンを高
純度濃縮するために導入された。トロンビンはアフィニ
ティー相互作用のために利用された構造的特徴、すなわ
ち触媒部位、陰イオン-結合部位(フィブリノーゲン-結
合エキソサイトIとしても知られている)、およびヘパリ
ン−結合部位（エキソサイトII）を有する。有用なリガ
ンドは、例えばクロロベンジルアミン（Thompson、197
6：ThompsonおよびDavie、1971)およびp-アミノベンザ
ミジン(Lorneら、1989：Khamlichiら、1990)のような合
成インヒビター、および触媒部位に結合するL-アルギニ
ルメチルエステル(Yuら、1986)のような基質類似体を含
む。ヘパリンおよび陽イオンクロマトグラフィー樹脂
は、ヘパリン−結合部位（エキソサイトII）に結合する
(Miller-Andersonら、1980：NgaiおよびChang、1991)。
【０００６】ペプチドリガンドクロマトグラフィー トロンビンに相互作用し、そして／またはトロンビンに
より開裂されると知られているタンパク質の部位に由来
する多数のペプチド配列があるが、本発明者はプロトロ
ンビンまたはトロンビンのアフィニティー精製に関し
て、そのようなペプチドを利用する参考文献が無いこと
を知っている。Petersら(1993)は、セリンプロテアーゼ
サーミターゼの精製のために、セリンプロテアーゼイン
ヒビターと認識されているペプチジルメチルケトンを使
用することにより、修飾ペプチドリガンドの有用性を実
証した。
より開裂されると知られているタンパク質の部位に由来
する多数のペプチド配列があるが、本発明者はプロトロ
ンビンまたはトロンビンのアフィニティー精製に関し
て、そのようなペプチドを利用する参考文献が無いこと
を知っている。Petersら(1993)は、セリンプロテアーゼ
サーミターゼの精製のために、セリンプロテアーゼイン
ヒビターと認識されているペプチジルメチルケトンを使
用することにより、修飾ペプチドリガンドの有用性を実
証した。
【０００７】ヒルジン、浸出抗凝固タンパク質は、トロ
ンビンの陰イオン結合部位で相互作用する結合配列（約
55−65残基)を有する(Krstenanskyら、1987)。
ンビンの陰イオン結合部位で相互作用する結合配列（約
55−65残基)を有する(Krstenanskyら、1987)。
【０００８】トロンビンおよびＸａ因子への結合に関し
て、本発明で見いだされたペプチドＱＬＷＧＳＨ（配列
番号１）は、トロンビンの既知の機能に関するタンパク
質に明らかな配列相同性を持たない。例えば、データベ
ース中のタンパク質に対する相同性配列では、ＱＬＷＧ
ＳＨに対して同一のものは無いが、ハロバクテリウムハ
ロビウム（Halobacterium halobium)由来のスーパーオ
キシドジスムターゼ、大腸菌(E.Coli)由来のウラシル-D
NAグリコシラーゼ(EC3.2.2.-)およびソラナム チューベ
ロサム(Solanum tuberosum)(ジャガイモ)由来の4-アル
ファ-グルカノトランスフェラーゼ(EC2.4.1.25)と、６
つ連続残基の中に５つの同一性が明らかになった。
て、本発明で見いだされたペプチドＱＬＷＧＳＨ（配列
番号１）は、トロンビンの既知の機能に関するタンパク
質に明らかな配列相同性を持たない。例えば、データベ
ース中のタンパク質に対する相同性配列では、ＱＬＷＧ
ＳＨに対して同一のものは無いが、ハロバクテリウムハ
ロビウム（Halobacterium halobium)由来のスーパーオ
キシドジスムターゼ、大腸菌(E.Coli)由来のウラシル-D
NAグリコシラーゼ(EC3.2.2.-)およびソラナム チューベ
ロサム(Solanum tuberosum)(ジャガイモ)由来の4-アル
ファ-グルカノトランスフェラーゼ(EC2.4.1.25)と、６
つ連続残基の中に５つの同一性が明らかになった。
【０００９】付加されたアミノ−末端ヒスチジンを含む
ＱＬＷＧＳＨの変異体（ＨＱＬＷＧＳＨ、配列番号２
１）は、トロンビンの既知の機能に関与するタンパク質
と明らかな配列相同性を持たない。データベースの調査
では、ＨＱＬＷＧＳＨとの同一のものは導かれなかった
が、レイシュマニア ドノバニ(Leishmania donovani)由
来の多剤耐性Ｐ-グリコプロテインは、７つの中に５つ
の同一連続残基を有することが判明した。この調査では
また、すでに述べたＱＬＷＧＳＨの配列も明らかになっ
た。ＱＬＷＧＳＨ変異体と同一の配列に関するデータベ
ースの調査では、ＲＱＬＷＧＳＨ（配列番号２０）が同
じものを持たないことが明らかになった。７つの連続同
一アミノ酸の中の５つを持つ２つの配列が見いだされ
た：それはヒトアデノウイルス由来の初期Ｅ２Ａ ＤＮ
Ａ 結合タンパク質およびマウスポリオーマウイルス由
来の小Ｔ抗原である。
ＱＬＷＧＳＨの変異体（ＨＱＬＷＧＳＨ、配列番号２
１）は、トロンビンの既知の機能に関与するタンパク質
と明らかな配列相同性を持たない。データベースの調査
では、ＨＱＬＷＧＳＨとの同一のものは導かれなかった
が、レイシュマニア ドノバニ(Leishmania donovani)由
来の多剤耐性Ｐ-グリコプロテインは、７つの中に５つ
の同一連続残基を有することが判明した。この調査では
また、すでに述べたＱＬＷＧＳＨの配列も明らかになっ
た。ＱＬＷＧＳＨ変異体と同一の配列に関するデータベ
ースの調査では、ＲＱＬＷＧＳＨ（配列番号２０）が同
じものを持たないことが明らかになった。７つの連続同
一アミノ酸の中の５つを持つ２つの配列が見いだされ
た：それはヒトアデノウイルス由来の初期Ｅ２Ａ ＤＮ
Ａ 結合タンパク質およびマウスポリオーマウイルス由
来の小Ｔ抗原である。
【００１０】ペプチドＹＦＰＧＰＹＬ(配列番号１９）
に関する配列相同性の調査では、トロンビンの既知の機
能に関与するタンパク質と配列類似性が無いことが明ら
かとなった。７つの非連続的な同一残基の中の５つを持
つ３つのタンパク質が、データベース調査により見いだ
された：ムス ムスカラス(Mus musculus)由来のパラオ
キソナーゼ、ソルガム ビカラー（Sorghum bicolor)由
来の澱粉シンターゼ(EC2.4.1.11)およびコリストネウラ
フミフェローナ(Choristoneura fumiferona)由来の遺
伝子p74タンパク質である。
に関する配列相同性の調査では、トロンビンの既知の機
能に関与するタンパク質と配列類似性が無いことが明ら
かとなった。７つの非連続的な同一残基の中の５つを持
つ３つのタンパク質が、データベース調査により見いだ
された：ムス ムスカラス(Mus musculus)由来のパラオ
キソナーゼ、ソルガム ビカラー（Sorghum bicolor)由
来の澱粉シンターゼ(EC2.4.1.11)およびコリストネウラ
フミフェローナ(Choristoneura fumiferona)由来の遺
伝子p74タンパク質である。
【００１１】
【発明の構成】今回、出願人はプロトロンビンおよびト
ロンビンに結合する能力を特徴とするペプチドの一群を
見いだした。この群には以下のペプチドアフィニティー
リガンドを含む：ＱＬＷＧＳＨ、ＲＱＬＷＧＳＨ、ＨＱ
ＬＷＧＳＨおよびＹＦＰＧＰＹＬ（それぞれ配列番号
１、２０、２１、１９）。好適なリガンドはＱＬＷＧＳ
Ｈ（配列番号１）およびＹＦＰＧＰＹＬ（配列番号１
９）である。また出願人は、プロトロンビンおよびトロ
ンビンの精製法も記載し、この方法はタンパク質含有溶
液を、定めた配列のペプチドアフィニティーリガンドを
結合している基質上に通し、そして次にプロトロンビン
またはトロンビンを溶出することを含んで成る。
ロンビンに結合する能力を特徴とするペプチドの一群を
見いだした。この群には以下のペプチドアフィニティー
リガンドを含む：ＱＬＷＧＳＨ、ＲＱＬＷＧＳＨ、ＨＱ
ＬＷＧＳＨおよびＹＦＰＧＰＹＬ（それぞれ配列番号
１、２０、２１、１９）。好適なリガンドはＱＬＷＧＳ
Ｈ（配列番号１）およびＹＦＰＧＰＹＬ（配列番号１
９）である。また出願人は、プロトロンビンおよびトロ
ンビンの精製法も記載し、この方法はタンパク質含有溶
液を、定めた配列のペプチドアフィニティーリガンドを
結合している基質上に通し、そして次にプロトロンビン
またはトロンビンを溶出することを含んで成る。
【００１２】
【発明の態様】材料 トロンビンに対するモノクローナルマウス抗体
は、アメリカン ダイアグノスティカ（American Diagno
stica：グリーンウィッチ、コネチカット州）から購入
した。第二抗体結合体であるヤギ抗−マウスIgG-アルカ
リホスファターゼおよび色素基質NBT/BCIPおよびFast R
ed TRは、ピアス化学社（Pierce ChemicalCo.:ロックフ
ォード、イリノイ州）から購入した。ヒトのトロンビン
はエンザイム リサーチ ラボズ(Enzyme Research Lab
s：サウスベンド、イリノイ州）から購入した。Fmocア
ミノ酸は、ノボビオケム（Novobiochem：ラジョラ、カ
リフォルニア州）から購入した。他の全ての化学品は試
薬級以上であった。
は、アメリカン ダイアグノスティカ（American Diagno
stica：グリーンウィッチ、コネチカット州）から購入
した。第二抗体結合体であるヤギ抗−マウスIgG-アルカ
リホスファターゼおよび色素基質NBT/BCIPおよびFast R
ed TRは、ピアス化学社（Pierce ChemicalCo.:ロックフ
ォード、イリノイ州）から購入した。ヒトのトロンビン
はエンザイム リサーチ ラボズ(Enzyme Research Lab
s：サウスベンド、イリノイ州）から購入した。Fmocア
ミノ酸は、ノボビオケム（Novobiochem：ラジョラ、カ
リフォルニア州）から購入した。他の全ての化学品は試
薬級以上であった。
【００１３】一般的方法 PELICAＮ法を使用する組み合
わせペプチドライブラリーのスクリーニング(Buettner
ら、1996)は、2.1mm×15cmのカラム内でミクロボア(mic
robore)ＨＰＬＣ(ミクローム バイオリソースイズ：Mic
rome Bioresources、オバーン、カリフォルニア州)で行
った。ペプチドおよび６-merの組み合わせライブラリー
は、Buettnerら(1996)により記載されたように、標準的
なFmoc化学を使用して、4,7,10-トリオキサ-1,13-トリ
デカンジアミン(Totda:アルドリッチ;Aldritch、セント
ルイス、モンタナ州)で修飾したToyopearl AF Chelate
650M(トーソーハース:TosoHaas、モンゴメリービル、ペ
ンシルバニア州）で合成した。ペプチドはギルソン（Gi
lson)AMS 422を使用することにより、ロボットで合成し
た。上記の方法で達成されたペプチドの密度は、典型的
には0.2−0.5ミリモル／ｇ樹脂の範囲であった。
わせペプチドライブラリーのスクリーニング(Buettner
ら、1996)は、2.1mm×15cmのカラム内でミクロボア(mic
robore)ＨＰＬＣ(ミクローム バイオリソースイズ：Mic
rome Bioresources、オバーン、カリフォルニア州)で行
った。ペプチドおよび６-merの組み合わせライブラリー
は、Buettnerら(1996)により記載されたように、標準的
なFmoc化学を使用して、4,7,10-トリオキサ-1,13-トリ
デカンジアミン(Totda:アルドリッチ;Aldritch、セント
ルイス、モンタナ州)で修飾したToyopearl AF Chelate
650M(トーソーハース:TosoHaas、モンゴメリービル、ペ
ンシルバニア州）で合成した。ペプチドはギルソン（Gi
lson)AMS 422を使用することにより、ロボットで合成し
た。上記の方法で達成されたペプチドの密度は、典型的
には0.2−0.5ミリモル／ｇ樹脂の範囲であった。
【００１４】アフィニティークロマトグラフィー形式で
ペプチドをスクリーニングするためには、ペプチド−ペ
プチド相互作用および１つのペプチドにトロンビンが結
合する立体障害の危険性を減少させるために、低いペプ
チド密度が望ましい。これらは許容量および特異性の減
少を生じ得る。そのような望ましい密度は、アフィニテ
ィークロマトグラフィーの通常の技術で実施されている
ような0.05−0.2ミリモル／ｇ樹脂(10−40mg/ml樹脂)の
範囲となるだろう。Totdaリンカー上に合成されたペプ
チド密度を制御するために、Fmoc-L-アラニン対t-Boc-L
-アラニンの変動比率を含む混合物を、Totda-Toyopearl
にカップリングした。以下の混合物を作成した:100％ F
moc-L-アラニン；20％ Fmoc-L-アラニン／80％t-Boc-L-
アラニン；10％ Fmoc-L-アラニン／90％t-Boc-L-アラニ
ン；４％ Fmoc-L-アラニン／96％t-Boc-L-アラニン；お
よび１％Fmoc-L-アラニン／99％t-Boc-L-アラニン。全
アミノ酸濃度（［Fmoc-L-アラニン］に［t-Boc-L-アラ
ニン］を加える）は、約2.5ミリモル／ｇ樹脂(Totdaの
５倍)で一定に保たれた。当該技術分野で実施されてい
る標準的なFmoc条件を使用して、混合物をカップリング
した後、Fmoc保護基はアルカリにより離脱されるが、ア
ルカリ耐性t-Bocは離脱されなかった。残っているt-Boc
-誘導化L-アラニンは第一アミンを欠き、そしてさらな
るペプチド合成に利用できなかった。次にペプチドは、
Fmoc-誘導化-アミノ酸を使用して樹脂上に合成され、続
いて酸性条件下で脱保護することにより合成した（これ
は残存t-Bocも外した）。バッチ樹脂に関するペプチド
密度は、標準的な手法により乾燥、測定した全アミノ酸
分析により決定した。最適なペプチド密度は、10％Fmoc
-L-アラニン／90％t-Boc-L-アラニンの混合物を用いて
達成され、約0.1−0.2ミリモル／ｇ樹脂の密度を生じ
た。
ペプチドをスクリーニングするためには、ペプチド−ペ
プチド相互作用および１つのペプチドにトロンビンが結
合する立体障害の危険性を減少させるために、低いペプ
チド密度が望ましい。これらは許容量および特異性の減
少を生じ得る。そのような望ましい密度は、アフィニテ
ィークロマトグラフィーの通常の技術で実施されている
ような0.05−0.2ミリモル／ｇ樹脂(10−40mg/ml樹脂)の
範囲となるだろう。Totdaリンカー上に合成されたペプ
チド密度を制御するために、Fmoc-L-アラニン対t-Boc-L
-アラニンの変動比率を含む混合物を、Totda-Toyopearl
にカップリングした。以下の混合物を作成した:100％ F
moc-L-アラニン；20％ Fmoc-L-アラニン／80％t-Boc-L-
アラニン；10％ Fmoc-L-アラニン／90％t-Boc-L-アラニ
ン；４％ Fmoc-L-アラニン／96％t-Boc-L-アラニン；お
よび１％Fmoc-L-アラニン／99％t-Boc-L-アラニン。全
アミノ酸濃度（［Fmoc-L-アラニン］に［t-Boc-L-アラ
ニン］を加える）は、約2.5ミリモル／ｇ樹脂(Totdaの
５倍)で一定に保たれた。当該技術分野で実施されてい
る標準的なFmoc条件を使用して、混合物をカップリング
した後、Fmoc保護基はアルカリにより離脱されるが、ア
ルカリ耐性t-Bocは離脱されなかった。残っているt-Boc
-誘導化L-アラニンは第一アミンを欠き、そしてさらな
るペプチド合成に利用できなかった。次にペプチドは、
Fmoc-誘導化-アミノ酸を使用して樹脂上に合成され、続
いて酸性条件下で脱保護することにより合成した（これ
は残存t-Bocも外した）。バッチ樹脂に関するペプチド
密度は、標準的な手法により乾燥、測定した全アミノ酸
分析により決定した。最適なペプチド密度は、10％Fmoc
-L-アラニン／90％t-Boc-L-アラニンの混合物を用いて
達成され、約0.1−0.2ミリモル／ｇ樹脂の密度を生じ
た。
【００１５】Rink樹脂(ノボビオケム)は、可溶性の精製
ペプチドが可溶性の結合リガンドとして必要な時の合成
に使用した。ペプチドを開裂し、そして脱保護し、次に
調製用の逆相ＨＰＬＣにより精製した。あるいはアフィ
ニティークロマトグラフィーに必要なペプチドの中に
は、N-末端Fmoc基の除去無しで、脱保護そしてRink樹脂
から開裂され、逆相ＨＰＬＣにより精製され、そして適
当なアフィニティー樹脂にカップリングされたものもあ
る。可溶性ペプチドの純度は、分析用逆相ＨＰＬＣによ
り評価し、そして分子量はＦＡＢマススペクトロメトリ
ーで確認した。
ペプチドが可溶性の結合リガンドとして必要な時の合成
に使用した。ペプチドを開裂し、そして脱保護し、次に
調製用の逆相ＨＰＬＣにより精製した。あるいはアフィ
ニティークロマトグラフィーに必要なペプチドの中に
は、N-末端Fmoc基の除去無しで、脱保護そしてRink樹脂
から開裂され、逆相ＨＰＬＣにより精製され、そして適
当なアフィニティー樹脂にカップリングされたものもあ
る。可溶性ペプチドの純度は、分析用逆相ＨＰＬＣによ
り評価し、そして分子量はＦＡＢマススペクトロメトリ
ーで確認した。
【００１６】分析法 ドデシル硫酸ナトリウムポリアク
リルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を、８％または12％
ポリアクリルアミドゲル（ノベックス:Novex、サンディ
エゴ、カリフォルニア州）で、Laemmli(1970)の手法に
従い行った。ゲルからのタンパク質の転写はTowbinら(1
979)の方法により、未使用の膜結合部位をブロックする
ためにカゼイン(ピアスケミカル社)を使用して行った。
結合した抗体は化学発光物質ＣＳＰＤ（トロピックス：
Tropix、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を使用
し、そしてＸＡＲフィルム(イーストマンコダック:East
man Kodak、ロチェスター、ニューヨーク州）に暴露し
て検出した。
リルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を、８％または12％
ポリアクリルアミドゲル（ノベックス:Novex、サンディ
エゴ、カリフォルニア州）で、Laemmli(1970)の手法に
従い行った。ゲルからのタンパク質の転写はTowbinら(1
979)の方法により、未使用の膜結合部位をブロックする
ためにカゼイン(ピアスケミカル社)を使用して行った。
結合した抗体は化学発光物質ＣＳＰＤ（トロピックス：
Tropix、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を使用
し、そしてＸＡＲフィルム(イーストマンコダック:East
man Kodak、ロチェスター、ニューヨーク州）に暴露し
て検出した。
【００１７】免疫比濁法は、ベーリング（Behring)比濁
計、モデルＢＮＡを使用することにより、ベーリングベ
ルケ社（Behringwerke AG)(マールブルグ、独国）から
購入したアッセイキットを用いて行った。
計、モデルＢＮＡを使用することにより、ベーリングベ
ルケ社（Behringwerke AG)(マールブルグ、独国）から
購入したアッセイキットを用いて行った。
【００１８】トロンビン活性は、合成基質S-2238(H-D-P
he-Pip-Arg-p-ニトロアラニン・2HCl)(ファルマシア:Pha
rmacia、フランクリン、オハイオ州)を使用して測定し
た。
he-Pip-Arg-p-ニトロアラニン・2HCl)(ファルマシア:Pha
rmacia、フランクリン、オハイオ州)を使用して測定し
た。
【００１９】トロンビンへの結合ペプチドの発見 米国特許出願番号第08/438,331号明細書(引用により本
明細書に編入する)に使用されたものに類似するアッセ
イを、プロトロンビンおよびα-トロンビンの両方に結
合するペプチドを推定するために使用した。簡単に説明
すると、組み合わせペプチドライブラリーを、約0.4ミ
リモル／ｇ樹脂の最終ペプチド密度で、トーソーハース
クロマトグラフィー樹脂、Toyopearl AF Chelate 650M
(Buettnerにより修飾)上に直接合成した。ライブラリー
はFmoc-化学を使用して、20の天然アミノ酸の中の18個
を用いて合成した(システインおよびメチオニンは含ま
なかった)。
明細書に編入する)に使用されたものに類似するアッセ
イを、プロトロンビンおよびα-トロンビンの両方に結
合するペプチドを推定するために使用した。簡単に説明
すると、組み合わせペプチドライブラリーを、約0.4ミ
リモル／ｇ樹脂の最終ペプチド密度で、トーソーハース
クロマトグラフィー樹脂、Toyopearl AF Chelate 650M
(Buettnerにより修飾)上に直接合成した。ライブラリー
はFmoc-化学を使用して、20の天然アミノ酸の中の18個
を用いて合成した(システインおよびメチオニンは含ま
なかった)。
【００２０】ライブラリー(0.5ml)への最初の添加は、
平衡化緩衝液（10mM HEPES、pH6.8および0.1M NaCl、0.
1mM EGTAおよび0.1容量/容量％ Tween-20）、そして次
に洗浄緩衝液（1M NaClを含む平衡化緩衝液）であっ
た。これに続いて連続的に樹脂を検出系の個々の成分と
接触させた。これらの成分は、すなわちマウスで作成さ
れた抗−ヒトトロンビン抗体、次にアルカリホスファタ
ーゼと結合したヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体であり、そし
てBCIP/NBT発色系(青)を用いて染色した。第二の接触
は、平衡化緩衝液中の１μM α-トロンビン(全１ナノモ
ル)で開始し、続いて検出系、そしてFast Redによる染
色を上記に概説し、そしてBuettnerら(1996)に詳細にさ
らに記載されているように行った。
平衡化緩衝液（10mM HEPES、pH6.8および0.1M NaCl、0.
1mM EGTAおよび0.1容量/容量％ Tween-20）、そして次
に洗浄緩衝液（1M NaClを含む平衡化緩衝液）であっ
た。これに続いて連続的に樹脂を検出系の個々の成分と
接触させた。これらの成分は、すなわちマウスで作成さ
れた抗−ヒトトロンビン抗体、次にアルカリホスファタ
ーゼと結合したヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体であり、そし
てBCIP/NBT発色系(青)を用いて染色した。第二の接触
は、平衡化緩衝液中の１μM α-トロンビン(全１ナノモ
ル)で開始し、続いて検出系、そしてFast Redによる染
色を上記に概説し、そしてBuettnerら(1996)に詳細にさ
らに記載されているように行った。
【００２１】
【表１】
【００２２】検出系との非特異的相互作用を示すブルー
ビーズは、0.1％未満でカラム全体に均一に見いだされ
た：10個のビーズが赤く染まった。個々の赤いビーズを
手で単離し、そして不溶性の赤色色素を除去するために
20分間、メタノール中で超音波処理を行った。固定化し
たペプチドをエドマン分解によりシークエンシングし、
そしてそれを表１に与える。曖昧な信号があるサイクル
については、最高の応答を有するアミノ酸を第一ライン
に掲載し、そしてより低い応答のアミノ酸を続くライン
に掲載した。
ビーズは、0.1％未満でカラム全体に均一に見いだされ
た：10個のビーズが赤く染まった。個々の赤いビーズを
手で単離し、そして不溶性の赤色色素を除去するために
20分間、メタノール中で超音波処理を行った。固定化し
たペプチドをエドマン分解によりシークエンシングし、
そしてそれを表１に与える。曖昧な信号があるサイクル
については、最高の応答を有するアミノ酸を第一ライン
に掲載し、そしてより低い応答のアミノ酸を続くライン
に掲載した。
【００２３】確認の結合アッセイは、0.2ミリモル／ｇ
樹脂の最終置換密度で、Totdaに続いてアラニン残基を
用いて修飾したToyopearl 650 M Chelate樹脂（A-Totda
-Toyopearl)に、直接合成した個々のペプチド配列を使
用して、ミクロボアＨＰＬＣに関するカラムクロマトグ
ラフィーの形式で行った。これらの樹脂の接触には、
Ａ）平衡化緩衝液（上記のような）、洗浄緩衝液（上記
のような）、高塩濃度緩衝液（３M NaClを含有する平衡
化緩衝液）、そして溶出緩衝液（2.5％酢酸）のみ；
Ｂ）平衡化緩衝液中のヒト血清アルブミン（hSA；0.5m
g）、続いて洗浄、高塩濃度、そして溶出緩衝液、Ｃ−
Ｅ）平衡化緩衝液中に段階的な精製α-トロンビンの付
加量(50、100および200μg）、続いて洗浄、高塩濃度、
そして溶出緩衝液を含んだ。終点は、トロンビン接触物
中の酸溶出液中の添加量−依存的増加であり、そして定
量は280nm吸収の積算によった。すべてのペプチド樹脂
からの溶出液の積算を、表２に与える。
樹脂の最終置換密度で、Totdaに続いてアラニン残基を
用いて修飾したToyopearl 650 M Chelate樹脂（A-Totda
-Toyopearl)に、直接合成した個々のペプチド配列を使
用して、ミクロボアＨＰＬＣに関するカラムクロマトグ
ラフィーの形式で行った。これらの樹脂の接触には、
Ａ）平衡化緩衝液（上記のような）、洗浄緩衝液（上記
のような）、高塩濃度緩衝液（３M NaClを含有する平衡
化緩衝液）、そして溶出緩衝液（2.5％酢酸）のみ；
Ｂ）平衡化緩衝液中のヒト血清アルブミン（hSA；0.5m
g）、続いて洗浄、高塩濃度、そして溶出緩衝液、Ｃ−
Ｅ）平衡化緩衝液中に段階的な精製α-トロンビンの付
加量(50、100および200μg）、続いて洗浄、高塩濃度、
そして溶出緩衝液を含んだ。終点は、トロンビン接触物
中の酸溶出液中の添加量−依存的増加であり、そして定
量は280nm吸収の積算によった。すべてのペプチド樹脂
からの溶出液の積算を、表２に与える。
【００２４】PELICANスクリーニングからの陽性レッド
ビーズに由来する数種の配列が、添加量依存的な様式で
トロンビンに結合した(表２)。溶出は大部分、NaClでは
なく低ｐＨ処理を使用することにより行なわれ、結合の
相互作用がヒルジン-誘導化ペプチドよりも明らかに強
いことを示唆していた。トロンビンに結合したこれらの
ペプチドは、ＱＬＷＧＳＨ（ならびにＱの前にさらにＲ
またはＨが挿入された変異体）、ＰＦＰＹＧＷ（および
すべての変異体、ＶＦＰＹＧＷ、ＰＦＰＹＡＷ、ＶＦＰ
ＹＡＷ、ＰＦＰＹＶＷおよびＶＦＰＹＶＷ）、ＹＴＰＦ
ＡＶ（しかし第一位でＶまたはＬをＹへ置換する変異体
ではない）、ＬＦＡＰＴＬ（しかしＰＦＡＰＴＬではな
い）、ＳＶＲＰＦＬ、ＦＥＰＡＮＰ、ＧＦＲＫＧＰ（お
よびＧＦＲＮＧＰ）、ＥＲＰＹＫＧ（しかしＥＲＰＹＨ
Ｇではない）およびＹＦＰＧＰＹＬであった。ＰＦＰＹ
ＶＷを含有するペプチド樹脂はトロンビンに結合する
が、添加量依存的様式ではなかった（配列番号について
は表２を参照にされたい）。
ビーズに由来する数種の配列が、添加量依存的な様式で
トロンビンに結合した(表２)。溶出は大部分、NaClでは
なく低ｐＨ処理を使用することにより行なわれ、結合の
相互作用がヒルジン-誘導化ペプチドよりも明らかに強
いことを示唆していた。トロンビンに結合したこれらの
ペプチドは、ＱＬＷＧＳＨ（ならびにＱの前にさらにＲ
またはＨが挿入された変異体）、ＰＦＰＹＧＷ（および
すべての変異体、ＶＦＰＹＧＷ、ＰＦＰＹＡＷ、ＶＦＰ
ＹＡＷ、ＰＦＰＹＶＷおよびＶＦＰＹＶＷ）、ＹＴＰＦ
ＡＶ（しかし第一位でＶまたはＬをＹへ置換する変異体
ではない）、ＬＦＡＰＴＬ（しかしＰＦＡＰＴＬではな
い）、ＳＶＲＰＦＬ、ＦＥＰＡＮＰ、ＧＦＲＫＧＰ（お
よびＧＦＲＮＧＰ）、ＥＲＰＹＫＧ（しかしＥＲＰＹＨ
Ｇではない）およびＹＦＰＧＰＹＬであった。ＰＦＰＹ
ＶＷを含有するペプチド樹脂はトロンビンに結合する
が、添加量依存的様式ではなかった（配列番号について
は表２を参照にされたい）。
【００２５】
【表２】
【００２６】ペプチド樹脂ＱＬＷＧＳＨ（配列番号１）
を、さらなる実験に使用するために選択した。精製α-
トロンビン(50、100および200μg)の結合および溶出プ
ロフィールは、図１に表す。酸溶出液中に、添加量依存
的な増加があった（図１Ｃ、ＤおよびＥ）。画分は、発
色物質S2238を使用するトロンビン活性のアッセイのた
めに集められた。添加したα-トロンビンエステラーゼ
活性の約64−79％が、酸溶出液のpHを中性に調整した後
に回収された(表３)。より少ない活性量が非結合画分中
（示さず）および３M NaCl溶出液中に溶出した。アルギ
ニンおよびヒスチジンのアミノ末端への点付加で、結合
を強化できた（配列番号２０および２１）。
を、さらなる実験に使用するために選択した。精製α-
トロンビン(50、100および200μg)の結合および溶出プ
ロフィールは、図１に表す。酸溶出液中に、添加量依存
的な増加があった（図１Ｃ、ＤおよびＥ）。画分は、発
色物質S2238を使用するトロンビン活性のアッセイのた
めに集められた。添加したα-トロンビンエステラーゼ
活性の約64−79％が、酸溶出液のpHを中性に調整した後
に回収された(表３)。より少ない活性量が非結合画分中
（示さず）および３M NaCl溶出液中に溶出した。アルギ
ニンおよびヒスチジンのアミノ末端への点付加で、結合
を強化できた（配列番号２０および２１）。
【００２７】ペプチド樹脂ＹＦＰＧＰＹＬ（配列番号１
９）を、図５に示す精製α-トロンビンおよびｈＳＡ
（0.5容量／容量％）の混合物に関する結合および溶出
プロフィールに基づくさらなる実験のために選択した。
酸溶出液中に、添加量依存的な増加があった（図５Ｃ、
ＤおよびＥ）。
９）を、図５に示す精製α-トロンビンおよびｈＳＡ
（0.5容量／容量％）の混合物に関する結合および溶出
プロフィールに基づくさらなる実験のために選択した。
酸溶出液中に、添加量依存的な増加があった（図５Ｃ、
ＤおよびＥ）。
【００２８】
【表３】
【００２９】
実施例１ＱＬＷＧＳＨ樹脂(配列番号１)を使用することによる、
活性化プロトロンビン複合体（ＰＴＣ）溶出物からのα
-トロンビンの精製 ヒトのプール血漿を、標準的な製造技法によりＰＴＣ溶
出物に処理した。簡単に説明すると、DEAE-Sephadex樹
脂を寒冷沈殿の溶出後に加え、そしてゆるく結合したタ
ンパク質を低塩緩衝液を用いて洗い流した。高濃度のNa
Clは、プロトロンビンおよびビタミンK-依存的凝固プロ
テアーゼチモーゲン（VII、IX、X因子、プロテインＣお
よびプロテインＳ）を含むＰＴＣと呼ばれる画分を溶出
した。ＰＴＣ溶出物の試料を25（重量／重量）％のクエ
ン酸ナトリウムの存在下で４日間、室温で活性化した。
約1.0mlの活性化ＰＴＣ溶出物を、ペプチド樹脂ＱＬＷ
ＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlに注入した(図２のＡ)。カ
ラムは、1.0M NaClを含有する平衡化緩衝液（10mM HEPE
S、pH6.8、1.0mM EGTAおよび0.1（容量／容量）％Tween
-20)で洗浄し、そして次に3.0M NaClを含有する平衡化
緩衝液でさらに洗浄した。酸処理（2.5％酢酸）は、タ
ンパク質をペプチド樹脂から外すために使用した。
活性化プロトロンビン複合体（ＰＴＣ）溶出物からのα
-トロンビンの精製 ヒトのプール血漿を、標準的な製造技法によりＰＴＣ溶
出物に処理した。簡単に説明すると、DEAE-Sephadex樹
脂を寒冷沈殿の溶出後に加え、そしてゆるく結合したタ
ンパク質を低塩緩衝液を用いて洗い流した。高濃度のNa
Clは、プロトロンビンおよびビタミンK-依存的凝固プロ
テアーゼチモーゲン（VII、IX、X因子、プロテインＣお
よびプロテインＳ）を含むＰＴＣと呼ばれる画分を溶出
した。ＰＴＣ溶出物の試料を25（重量／重量）％のクエ
ン酸ナトリウムの存在下で４日間、室温で活性化した。
約1.0mlの活性化ＰＴＣ溶出物を、ペプチド樹脂ＱＬＷ
ＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlに注入した(図２のＡ)。カ
ラムは、1.0M NaClを含有する平衡化緩衝液（10mM HEPE
S、pH6.8、1.0mM EGTAおよび0.1（容量／容量）％Tween
-20)で洗浄し、そして次に3.0M NaClを含有する平衡化
緩衝液でさらに洗浄した。酸処理（2.5％酢酸）は、タ
ンパク質をペプチド樹脂から外すために使用した。
【００３０】ＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlは、活
性化ＰＴＣ溶出物からのタンパク質に結合した（図２の
Ａ）。少量のタンパク質が、樹脂に結合し、これはNaCl
または酸処理のいずれかにより放出された。SDS-PAGEお
よびウエスタンブロッティング（図３のＡおよびＢ）に
より、活性化ＰＴＣ溶出物はカラムを通過することによ
りトロンビンが減った（レーン５、非結合画分を参照に
されたい）。１M NaClおよび2.5％酢酸の両方が、高度
に濃縮されたトロンビンを含んでいた（図３のＡおよび
Ｂ、レーン６および７）。同量のトロンビンが３M NaCl
で溶出した(示さず)。約42,000の見かけ上の分子量を持
つ第二ポリペプチド(SDS-PAGEの移動度により決定する
ような)は、トロンビンと同時に溶出するが、トロンビ
ンに対する抗体とは反応しなかった。このポリペプチド
のＮ−末端配列分析は、識別しうる配列を生じなかっ
た。これはＱＬＷＧＳＨがトロンビンに結合し、そして
濃縮することを示唆している。
性化ＰＴＣ溶出物からのタンパク質に結合した（図２の
Ａ）。少量のタンパク質が、樹脂に結合し、これはNaCl
または酸処理のいずれかにより放出された。SDS-PAGEお
よびウエスタンブロッティング（図３のＡおよびＢ）に
より、活性化ＰＴＣ溶出物はカラムを通過することによ
りトロンビンが減った（レーン５、非結合画分を参照に
されたい）。１M NaClおよび2.5％酢酸の両方が、高度
に濃縮されたトロンビンを含んでいた（図３のＡおよび
Ｂ、レーン６および７）。同量のトロンビンが３M NaCl
で溶出した(示さず)。約42,000の見かけ上の分子量を持
つ第二ポリペプチド(SDS-PAGEの移動度により決定する
ような)は、トロンビンと同時に溶出するが、トロンビ
ンに対する抗体とは反応しなかった。このポリペプチド
のＮ−末端配列分析は、識別しうる配列を生じなかっ
た。これはＱＬＷＧＳＨがトロンビンに結合し、そして
濃縮することを示唆している。
【００３１】実施例２ＱＬＷＧＳＨ樹脂(配列番号１)を使用することによる、
プロトロンビン複合体（ＰＴＣ）溶出物からのプロトロ
ンビンの精製 ヒトのプール血漿を、実施例１に示したように標準的な
製造技法によりＰＴＣ溶出物を処理した。約1.0mlのＰ
ＴＣ溶出物をペプチド樹脂ＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyo
pearlに注入した(図２のＢ)。カラムは、1.0M NaClそし
て次に3.0M NaClをを含有する平衡化緩衝液で洗浄し
た。酸処理（2.5％酢酸）はタンパク質をペプチド樹脂
から離すために使用した。
プロトロンビン複合体（ＰＴＣ）溶出物からのプロトロ
ンビンの精製 ヒトのプール血漿を、実施例１に示したように標準的な
製造技法によりＰＴＣ溶出物を処理した。約1.0mlのＰ
ＴＣ溶出物をペプチド樹脂ＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyo
pearlに注入した(図２のＢ)。カラムは、1.0M NaClそし
て次に3.0M NaClをを含有する平衡化緩衝液で洗浄し
た。酸処理（2.5％酢酸）はタンパク質をペプチド樹脂
から離すために使用した。
【００３２】ＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlは、非
活性化ＰＴＣ溶出物からのタンパク質に結合した。全タ
ンパク質の大部分（Ａ280による)が、１M NaClにより放
出され（図２のＢ）、これはSDS-PAGEおよびウエスタン
ブロッティング分析により、プロトロンビンを濃縮した
（図４のＡおよびＢ）。少量のプロトロンビンが３MNaC
lにより放出された（図２のＢおよび図４Ａおよび
Ｂ）。酸溶出は少なくとも３つのポリペプチドを遊離
し、そのいずれもトロンビンに対する抗体とは反応しな
かった。これらの結果は、プロトロンビンがペプチドＱ
ＬＷＧＳＨに結合し、そして１M NaCl含有の溶出緩衝液
により、濃縮された純度でペプチドから外されることが
できることを実証した。
活性化ＰＴＣ溶出物からのタンパク質に結合した。全タ
ンパク質の大部分（Ａ280による)が、１M NaClにより放
出され（図２のＢ）、これはSDS-PAGEおよびウエスタン
ブロッティング分析により、プロトロンビンを濃縮した
（図４のＡおよびＢ）。少量のプロトロンビンが３MNaC
lにより放出された（図２のＢおよび図４Ａおよび
Ｂ）。酸溶出は少なくとも３つのポリペプチドを遊離
し、そのいずれもトロンビンに対する抗体とは反応しな
かった。これらの結果は、プロトロンビンがペプチドＱ
ＬＷＧＳＨに結合し、そして１M NaCl含有の溶出緩衝液
により、濃縮された純度でペプチドから外されることが
できることを実証した。
【００３３】実施例３ＹＦＰＧＰＹＬ樹脂(配列番号１９)を使用することによ
る、活性化プロトロンビン複合体（ＰＴＣ）溶出物から
のα-トロンビンの精製 ヒトのプール血漿を、実施例１に示すように標準的な製
造技法によりＰＴＣ溶出物を処理した。ＰＴＣ溶出物の
試料を50mM CaCl2の存在下で６日間、４℃で活性化し
た。300μgのα-トロンビンでスパイクした約１mlの活
性化ＰＴＣ溶出物を、ペプチド樹脂ＹＦＰＧＰＹＬ-Tot
da-Toyopearlに注入した(図６)。カラムは、Ａ280がベ
ースラインに戻るまで平衡化緩衝液（10mM HEPES、pH6.
5、10mM CaCl2、500mM NaCl、0.1（容量／容量）％PEG-
400)で洗浄した。次にペプチドに結合したα-トロンビ
ンを放出するために、このペプチドカラムを１mM クエ
ン酸ナトリウム、ｐＨ7.0で洗浄した。酸処理（２％酢
酸）は、カラムに未だに結合しているタンパク質を除去
するために、クリーニング工程として使用した。
る、活性化プロトロンビン複合体（ＰＴＣ）溶出物から
のα-トロンビンの精製 ヒトのプール血漿を、実施例１に示すように標準的な製
造技法によりＰＴＣ溶出物を処理した。ＰＴＣ溶出物の
試料を50mM CaCl2の存在下で６日間、４℃で活性化し
た。300μgのα-トロンビンでスパイクした約１mlの活
性化ＰＴＣ溶出物を、ペプチド樹脂ＹＦＰＧＰＹＬ-Tot
da-Toyopearlに注入した(図６)。カラムは、Ａ280がベ
ースラインに戻るまで平衡化緩衝液（10mM HEPES、pH6.
5、10mM CaCl2、500mM NaCl、0.1（容量／容量）％PEG-
400)で洗浄した。次にペプチドに結合したα-トロンビ
ンを放出するために、このペプチドカラムを１mM クエ
ン酸ナトリウム、ｐＨ7.0で洗浄した。酸処理（２％酢
酸）は、カラムに未だに結合しているタンパク質を除去
するために、クリーニング工程として使用した。
【００３４】ペプチドカラムＹＦＰＧＰＹＬ-Totda-Toy
opearlは、α-トロンビン-スパイク-ＰＴＣ溶出物から
のタンパク質を結合した。全タンパク質のほとんどが
(Ａ280による）カラムを素通りし、そしてより少量が、
１mM クエン酸ナトリウム、ｐＨ7.0により放出された
(図６)。１mM クエン酸ナトリウム、ｐＨ7.0により放出
されたタンパク質は、SDS-PAGEの定量的スキャンニング
分析により示されるように、少なくとも72％のトロンビ
ンであった（図７）。他の少ない混入物は分子量がより
高く、そしてトロンビンの分解生成物とは思われない。
酸処理で少量のトロンビンおよび高分子量タンパク質種
を除去した。これらの結果により、活性化セリンプロテ
アーゼトロンビンはＹＦＰＧＰＹＬに結合し、そしてペ
プチドから特別な様式で外し、濃縮できることが実証さ
れた。
opearlは、α-トロンビン-スパイク-ＰＴＣ溶出物から
のタンパク質を結合した。全タンパク質のほとんどが
(Ａ280による）カラムを素通りし、そしてより少量が、
１mM クエン酸ナトリウム、ｐＨ7.0により放出された
(図６)。１mM クエン酸ナトリウム、ｐＨ7.0により放出
されたタンパク質は、SDS-PAGEの定量的スキャンニング
分析により示されるように、少なくとも72％のトロンビ
ンであった（図７）。他の少ない混入物は分子量がより
高く、そしてトロンビンの分解生成物とは思われない。
酸処理で少量のトロンビンおよび高分子量タンパク質種
を除去した。これらの結果により、活性化セリンプロテ
アーゼトロンビンはＹＦＰＧＰＹＬに結合し、そしてペ
プチドから特別な様式で外し、濃縮できることが実証さ
れた。
【００３５】まとめ ＰＥＬＩＣＡＮ技法を使用して、α-トロンビンを用い
た組み合わせライブラリーをスクリーニングすることに
より、アフィニティークロマトグラフィーに有用な結合
ペプチドを見いだした。ペプチドリガンドＱＬＷＧＳＨ
（配列番号１）を含むアフィニティー樹脂は、タンパク
質の起源に依存してプロトロンビンまたはトロンビンの
いずれかに結合し、そして精製できる。ペプチドリガン
ドＹＦＰＧＰＹＬ（配列番号１９）を含むアフィニティ
ー樹脂は、活性化ＰＴＣ溶出物からのトロンビンを結合
し、そして精製した。
た組み合わせライブラリーをスクリーニングすることに
より、アフィニティークロマトグラフィーに有用な結合
ペプチドを見いだした。ペプチドリガンドＱＬＷＧＳＨ
（配列番号１）を含むアフィニティー樹脂は、タンパク
質の起源に依存してプロトロンビンまたはトロンビンの
いずれかに結合し、そして精製できる。ペプチドリガン
ドＹＦＰＧＰＹＬ（配列番号１９）を含むアフィニティ
ー樹脂は、活性化ＰＴＣ溶出物からのトロンビンを結合
し、そして精製した。
【００３６】さらに、これらタンパク質のＱＬＷＧＳＨ
樹脂への結合および保持は、ヒト血漿画分に混入の可能
性がある包膜化ウイルスを不活性化するために有用な非
-イオン性界面活性剤であるTween-20の存在下で起こっ
た。これはこの樹脂が調製中にプロ（トロンビン）から
ウイルス不活性化界面活性剤を除くためにも有用であ
り、あるいはさらに（プロ）トロンビンをアフィニティ
ー樹脂に結合させながら、ウイルスを不活性化するため
の界面活性剤を用いた（プロ）トロンビンの処理に有用
である。
樹脂への結合および保持は、ヒト血漿画分に混入の可能
性がある包膜化ウイルスを不活性化するために有用な非
-イオン性界面活性剤であるTween-20の存在下で起こっ
た。これはこの樹脂が調製中にプロ（トロンビン）から
ウイルス不活性化界面活性剤を除くためにも有用であ
り、あるいはさらに（プロ）トロンビンをアフィニティ
ー樹脂に結合させながら、ウイルスを不活性化するため
の界面活性剤を用いた（プロ）トロンビンの処理に有用
である。
【００３７】上記の実施例は本発明を説明することを意
図し、そして当業者は変更態様を作成するであろうと考
えられる。したがって本発明の範囲は上記の請求項によ
ってのみ限定されることを意図する。
図し、そして当業者は変更態様を作成するであろうと考
えられる。したがって本発明の範囲は上記の請求項によ
ってのみ限定されることを意図する。
【００３８】参考文献 Buettner,J.Aら、Int.J.Protein Pept.Res.47:70-83(19
96)。
96)。
【００３９】Coan,M.Hら、Ann.NY Acad.Sci.370:731-74
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【００５１】Thompson,A.R.Biochim.Biophys Acta 422:
200-209(1976)。
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【００５２】Thompson,A.R.およびE.W.Davie,Biochim.B
iophys.Acta 250:210-215(1971)。
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【００５３】Walz,D.A.およびW.H.Seegers,Biochem.Bio
phys.Res.Commun.60:717-722(1974)。Yu,X.J.ら、J.Chr
omatog.376:429-435(1986)。
phys.Res.Commun.60:717-722(1974)。Yu,X.J.ら、J.Chr
omatog.376:429-435(1986)。
【００５４】
出願人：バイエル コーポレーション 発明の名称：プロトロンビンおよびトロンビンに結合す
るペプチド 整理番号：９７０５０８２ 出願日：平成９年６月２４日 優先権番号：０８／６７２，８０５ 優先権日：平成８年６月２８日 配列の数：２１ 配列番号１： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号２： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号３： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号４： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号５： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号６： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号７： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号８： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号９： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１０： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１１： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１２： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１３： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１４： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１５： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１６： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１７： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１８： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１９： 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｌｅｕ １ ５ 配列番号２０： 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ １ ５ 配列番号２１： 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ １ ５
るペプチド 整理番号：９７０５０８２ 出願日：平成９年６月２４日 優先権番号：０８／６７２，８０５ 優先権日：平成８年６月２８日 配列の数：２１ 配列番号１： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号２： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号３： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号４： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号５： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号６： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号７： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号８： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号９： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１０： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１１： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１２： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１３： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１４： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１５： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１６： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１７： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１８： 配列の長さ：６ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列番号１９： 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｌｅｕ １ ５ 配列番号２０： 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ １ ５ 配列番号２１： 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ｈｉｓ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｈｉｓ １ ５
【図１】ペプチドＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlで
のクロマトグラフィー分離の溶出プロフィールを表す
（280nmでの吸収)。（配列番号１）Ａ）緩衝液、タンパ
ク質無し；Ｂ）0.5mg hSA；Ｃ）50μgトロンビン；Ｄ）
100μg トロンビン；Ｅ）200μg トロンビン。タンパク
質は約17μl/分で10分間添加し、そして次にカラムを平
衡化緩衝液で865μl／分にて、４分間洗浄した。これに
続いて1.0M NaClを含む平衡化緩衝液で５分間、3.0M Na
Clでさらに５分間、そして0.1M でさらに５分間洗浄し
た。タンパク質は２％酢酸を使用して30分から35分の間
に溶出した。
のクロマトグラフィー分離の溶出プロフィールを表す
（280nmでの吸収)。（配列番号１）Ａ）緩衝液、タンパ
ク質無し；Ｂ）0.5mg hSA；Ｃ）50μgトロンビン；Ｄ）
100μg トロンビン；Ｅ）200μg トロンビン。タンパク
質は約17μl/分で10分間添加し、そして次にカラムを平
衡化緩衝液で865μl／分にて、４分間洗浄した。これに
続いて1.0M NaClを含む平衡化緩衝液で５分間、3.0M Na
Clでさらに５分間、そして0.1M でさらに５分間洗浄し
た。タンパク質は２％酢酸を使用して30分から35分の間
に溶出した。
【図２】活性化および非活性化ＰＴＣ溶出物の、ペプチ
ドＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlでのクロマトグラ
フィー分離の溶出プロフィールを表す（280nmでの吸
収)。Ａ）活性化ＰＴＣ溶出物；Ｂ）非活性化ＰＴＣ溶
出物。操作条件は図１に記載の通り。
ドＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlでのクロマトグラ
フィー分離の溶出プロフィールを表す（280nmでの吸
収)。Ａ）活性化ＰＴＣ溶出物；Ｂ）非活性化ＰＴＣ溶
出物。操作条件は図１に記載の通り。
【図３】活性化ＰＴＣ溶出物を、ＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totd
a-Toyopearlでクロマトグラフィー分離した画分のSDS-P
AGE（８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の結果を
ウエスタンブロット分析した結果を示す図に代わる写真
である。パネルＡ：クーマシー−染色ゲル、パネルＢ：
α-トロンビンに対する抗体を使用したウエスタンブロ
ット。レーン１および９、分子量標準；レーン２、プロ
トロンビン標準；レーン３および８、α-トロンビン標
準；レーン４、活性化ＰＴＣ溶出物；レーン５、非結合
画分；レーン６、１M NaCl洗浄画分；レーン７、２％酢
酸溶出物。
a-Toyopearlでクロマトグラフィー分離した画分のSDS-P
AGE（８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の結果を
ウエスタンブロット分析した結果を示す図に代わる写真
である。パネルＡ：クーマシー−染色ゲル、パネルＢ：
α-トロンビンに対する抗体を使用したウエスタンブロ
ット。レーン１および９、分子量標準；レーン２、プロ
トロンビン標準；レーン３および８、α-トロンビン標
準；レーン４、活性化ＰＴＣ溶出物；レーン５、非結合
画分；レーン６、１M NaCl洗浄画分；レーン７、２％酢
酸溶出物。
【図４】ＱＬＷＧＳＨ-Ａ-Totda-Toyopearlでクロマト
グラフィー分離したＰＴＣ溶出物のSDS-PAGE（８％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動）の結果をウエスタンブロ
ット分析した結果を示す図に代わる写真である。パネル
Ａ：クーマシー−染色ゲル、パネルＢ：α-トロンビン
に対する抗体を使用したウエスタンブロット。レーン１
および１０、分子量標準；レーン２、プロトロンビン標
準；レーン３および９、α-トロンビン標準；レーン
４、ＰＴＣ溶出物；レーン５、非結合画分；レーン６、
１M NaCl洗浄画分；レーン７、３M NaCl洗浄画分；レー
ン８、２％酢酸溶出物。
グラフィー分離したＰＴＣ溶出物のSDS-PAGE（８％ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動）の結果をウエスタンブロ
ット分析した結果を示す図に代わる写真である。パネル
Ａ：クーマシー−染色ゲル、パネルＢ：α-トロンビン
に対する抗体を使用したウエスタンブロット。レーン１
および１０、分子量標準；レーン２、プロトロンビン標
準；レーン３および９、α-トロンビン標準；レーン
４、ＰＴＣ溶出物；レーン５、非結合画分；レーン６、
１M NaCl洗浄画分；レーン７、３M NaCl洗浄画分；レー
ン８、２％酢酸溶出物。
【図５】ペプチドＹＦＰＧＰＹＬ-Totda-Toyopearl（配
列番号１９）でクロマトグラフィー分離した溶出プロフ
ィールを表す（280nmでの吸収)。Ａ）緩衝液、タンパク
質無し；Ｂ）0.5mg hSA；Ｃ）0.5mg hSA＋50μgトロン
ビン；Ｄ）0.5mg hSA＋100μg トロンビン；Ｅ）0.5mg
hSA＋200μg トロンビン。操作条件は図１に記載の通
り。
列番号１９）でクロマトグラフィー分離した溶出プロフ
ィールを表す（280nmでの吸収)。Ａ）緩衝液、タンパク
質無し；Ｂ）0.5mg hSA；Ｃ）0.5mg hSA＋50μgトロン
ビン；Ｄ）0.5mg hSA＋100μg トロンビン；Ｅ）0.5mg
hSA＋200μg トロンビン。操作条件は図１に記載の通
り。
【図６】活性化ＰＴＣ溶出物をペプチドＹＦＰＧＰＹＬ
-Totda-Toyopearlでクロマトグラフィー分離した溶出プ
ロフィールを表す（280nmでの吸収)。平衡（10mM HEPES
pH6.5、10mM CaCl2、0.1（容量／容量）％ PGE-400、50
0mM NaCl)は、0.01mlから18.6ml；１mMクエン酸ナトリ
ウム pH7.0は18.6mlから34.1ml；２％酢酸は34.1mlから
43.4mlである。
-Totda-Toyopearlでクロマトグラフィー分離した溶出プ
ロフィールを表す（280nmでの吸収)。平衡（10mM HEPES
pH6.5、10mM CaCl2、0.1（容量／容量）％ PGE-400、50
0mM NaCl)は、0.01mlから18.6ml；１mMクエン酸ナトリ
ウム pH7.0は18.6mlから34.1ml；２％酢酸は34.1mlから
43.4mlである。
【図７】ＹＦＰＧＰＹＬ-Totda-Toyopearlでクロマトグ
ラフィー分離した活性化ＰＴＣ溶出物のクーマシー−染
色SDS-PAGE（12％ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の
結果を示す図に代わる写真である。レーン１、300μgα
-トロンビンでスパイクした、６日目のCaCl2-活性化Ｐ
ＴＣ溶出物。レーン２および８、分子量標準；レーン
３、プロトロンビン標準（ＭＷ〜71,600)；レーン４、
非結合画分；レーン５、１mM クエン酸ナトリウム pH7.
0画分；レーン６、２％酢酸画分；レーン７、α-トロン
ビン標準(ＭＷ〜37,000）。
ラフィー分離した活性化ＰＴＣ溶出物のクーマシー−染
色SDS-PAGE（12％ポリアクリルアミドゲル電気泳動）の
結果を示す図に代わる写真である。レーン１、300μgα
-トロンビンでスパイクした、６日目のCaCl2-活性化Ｐ
ＴＣ溶出物。レーン２および８、分子量標準；レーン
３、プロトロンビン標準（ＭＷ〜71,600)；レーン４、
非結合画分；レーン５、１mM クエン酸ナトリウム pH7.
0画分；レーン６、２％酢酸画分；レーン７、α-トロン
ビン標準(ＭＷ〜37,000）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨゼフ・エイ・ビユツトナー アメリカ合衆国ノースカロライナ州27614 ローリー・ダンレイスドライブ11416 (72)発明者 クリストフアー・エイ・ダツド アメリカ合衆国ノースカロライナ州27511 キヤリー・ハイデインガードライブ116 (72)発明者 デイビツド・ジエイ・ハモンド アメリカ合衆国ノースカロライナ州27606 ローリー・ベントリーフドライブ5312
Claims (2)
- 【請求項１】 Gln-Leu-Trp-Gly-Ser-His，Arg-Gln-Leu
-Trp-Gly-Ser-His，His-Gln-Leu-Trp-Gly-Ser-Hisおよ
びTyr-Phe-Pro-Gly-Pro-Tyr-Leuから成る群から選択さ
れる特定の配列を有するペプチドを含んで成る組成物。 - 【請求項２】 プロトロンビンおよびトロンビンから成
る群から選択されるタンパク質の精製法であって、タン
パク質が基質に結合するために十分な条件下でタンパク
質を含む水溶液を基質と接触させることを含んで成り、
基質が支持体マトリックスに結合する、Gln-Leu-Trp-Gl
y-Ser-His，Arg-Gln-Leu-Trp-Gly-Ser-His，His-Gln-Le
u-Trp-Gly-Ser-HisおよびTyr-Phe-Pro-Gly-Pro-Tyr-Leu
から成る群から選択される特定の配列のペプチドを含ん
で成る、上記精製法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/672805 | 1996-06-28 | ||
| US08/672,805 US5831003A (en) | 1996-06-28 | 1996-06-28 | Peptides which bind to prothrombin and thrombin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1075778A true JPH1075778A (ja) | 1998-03-24 |
| JP3978258B2 JP3978258B2 (ja) | 2007-09-19 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18189597A Expired - Fee Related JP3978258B2 (ja) | 1996-06-28 | 1997-06-24 | プロトロンビンおよびトロンビンに結合するペプチド |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0816377B1 (ja) |
| JP (1) | JP3978258B2 (ja) |
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| AU (1) | AU712575B2 (ja) |
| CA (1) | CA2206663A1 (ja) |
| DE (1) | DE69711765T2 (ja) |
| DK (1) | DK0816377T3 (ja) |
| ES (1) | ES2175218T3 (ja) |
| PT (1) | PT816377E (ja) |
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| WO2002048176A1 (en) | 2000-12-14 | 2002-06-20 | Bayer Corporation | Method of preparing alpha-1 proteinase inhibitor |
| GB0211849D0 (en) * | 2002-05-23 | 2002-07-03 | Mok Kenneth H | Improvments to retro-inverso isomers |
| FR2884418B1 (fr) * | 2005-04-15 | 2008-11-21 | Soc Extraction Principes Actif | Utilisation d'un peptide comme principe actif amincissant |
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- 1997-06-16 PT PT97109744T patent/PT816377E/pt unknown
- 1997-06-16 EP EP97109744A patent/EP0816377B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-16 AT AT97109744T patent/ATE215964T1/de active
- 1997-06-16 DK DK97109744T patent/DK0816377T3/da active
- 1997-06-16 DE DE69711765T patent/DE69711765T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-06-23 AU AU26220/97A patent/AU712575B2/en not_active Ceased
- 1997-06-24 JP JP18189597A patent/JP3978258B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1997-06-25 CA CA002206663A patent/CA2206663A1/en not_active Abandoned
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| AU2622097A (en) | 1998-01-15 |
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