JP2001506987A

JP2001506987A - フォンビルブラント因子誘導体及びタンパク質の単離法

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Publication number: JP2001506987A
Application number: JP52600398A
Authority: JP
Inventors: シュヴァルツ，ハンス−ペーター; トゥレツェック，ペーター; アイブル，ヨハン
Original assignee: Immuno AG
Current assignee: Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Priority date: 1996-12-13
Filing date: 1997-11-19
Publication date: 2001-05-29
Also published as: CZ211299A3; AT405740B; EP0954533A1; HUP9903789A2; HUP9903789A3; WO1998025969A1; ATA217896A

Abstract

(57)【要約】担体に固定化されたｒ−ｖＷＦからなるｖＷＦ誘導体、及びこのｖＷＦ誘導体を用いるｖＷＦと結合するタンパク質の単離法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】フォンビルブラント因子誘導体及びタンパク質の単離法本発明は、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）誘導体及びｖＷＦに結合するタンパク質の単離法に関する。フォンビルブラント因子は、約500〜20,000キロダルトンの大きさの一連のマルチマーとして血漿中を循環している糖タンパクである。ｖＷＦのマルチマー型は、ジスルフィド結合によって互いに結合した250kDのポリペチドサブユニットから成る。ｖＷＦは、損傷した血管壁の内皮下層への最初の血小板接着に関与し、ここで、大きいマルチマーのみが止血活性も示す。内皮細胞は大きい多量体形のｖＷＦを分泌し、低分子量形のｖＷＦ（低分子量ｖＷＦ、LMW）はタンパク質加水分解による開裂によって生成したものであると考えられている。この血漿タンパクの主要な供給源である血管内皮細胞内で、ｖＷＦは構成的又は刺激下の遊離によって形成されるが、より小さいタンパク質は巨核球によっても合成される。ｖＷＦの生合成は非常に複雑であり、かくして非常に異なった構造、役割及び性質の非常に多様な多くのｖＷＦ分子が存在することになる。結果として、ｖＷＦは種々の組織の様々なレセプターと結合することができ、中でも、糖タンパク質Ｉｂ、糖タンパク質複合体II/IIIa、因子VIII：C等のタンパク質との結合、栓球との結合、内皮下層細胞（subendothelium）との結合はｖＷＦの最も重要な生理学的活性である。ｖＷＦが血液凝固因子VIIIに結合すると、因子VIII複合体又は安定化されたタンパク質として因子VIII：Ｃを含有する因子VIII：Ｃ／ｖＷＦ複合体が形成される。必要なｖＷＦの欠乏は、ｖＷＦの安定化効果が喪失するので因子VIII：Ｃ血中濃度の低下をも招く。を含有するカラムを用いる組換え因子VIIIの精製は知られている(Woodetal.，Na ture 312(1984)，330-337)。しかしながら、固定化した血漿ｖＷＦの親和力が低いために、例えば、記載されたｖＷＦ−セファロースを用いて因子VIII／ｖＷＦ−複合体を含有する溶液から因子ＶＩＩＩを顕著な収率で回収することができないことが示された。そのうえ、血漿性出発物質が因子VIII：C/ｖＷＦ複合体を含有するので、このｖＷＦ−セフアロースは因子VIIIをも含有していた。しかしながら、医薬組成物の回収においては血漿性因子VIII：Cによる汚染は大きい問題である。組換えｖＷＦを用いる、マイクロタイタープレートのウエルに固定化した血漿ｖＷＦへの因子VIIIの結合に対する阻害を調べる結合研究において、溶液中の組換えｖＷＦを用いてその結合パートナーである因子VIII:Cに関してより親和性が低いことが示された(Leyte et al.，Biochem．J.，274(1991)，257-261)。この理由から、この材料（material）は因子VIIIの製造のための調製法に不適である。このように、本発明の目的は、タンパクを単離しようとする溶液中にｖＷＦが存在していても、ｖＷＦに結合するタンパク質を単離することができるクロマトグラフィー用材料を提供することにある。換言すると、本発明の目的はその結合パートナーとの結合に際して、ｖＷＦの親和性、とりわけ因子VIII/ｖＷＦ複合体中のｖＷＦの親和性よりも高い親和性を有する材料を提供することにある。本発明によれば、この目的は、粒子状担体又は担体ゲル(担体)、特にクロマトグラフィー用材料上に固定化されたｖＷＦから成るｖＷＦ誘導体により達成される。ここに、ｖＷＦは組換えｖＷＦ（ｒ−ｖＷＦ）であることを特徴とする。好ましくは、ｖＷＦ誘導体は血液凝固因子VIIIを伴わず、抗ｖＷＦ‐抗体が回避されるので、抗体のような異種物質を含まない。驚くべきことに、クロマトグラフィー用材料に結合していたにもかかわらず、ｒ−ｖＷＦは血漿性ｖＷＦと対照的にｖＷＦ結合タンパクに驚くほど高い親和性を有することが示された。しかも、血漿性ｖＷＦと対照的に、ｒ−ｖＷＦは血液凝固因子VIIIを含まず、特にｖＷＦ結合タンパクの単離工程で面倒になりうる血漿タンパクを伴っていない。本発明のｖＷＦ誘導体の特定の態様では、ｒ−ｖＷＦをクロマトグラフィー用材料に化学結合によって固定化する。この方法で本発明のｖＷＦ誘導体の高親和性を高い安定性で維持することが保証され、そのことで本発明の材料の適応性が大いに増大する。化学的固定化により、クロマトグラフィー用材料の安定化が達成される一方で、驚くべきことに、ｖＷＦの本来の構造は否定的な影響を受けなかった。同時に、ｖＷＦと固相との結合に与る対応する抗体の使用を省略できる。抗体を介する結合には不安定化及び"漏れ(leakage)"(即ちｖＷＦの結合パートナーの回収と同時に固定化ｖＷＦが溶出する)の増加という不都合が起こりうる。注意深くｒ−ｖＷＦフラクション（画分）を選択することによりｖＷＦ誘導体の親和性をさらに増大できる。驚いたことに、低い一次止血活性を示すｒ−ｖＷＦフラクション、とりわけ分子量が約１５０万Da、好ましくは１００万Daより小さいｒ−ｖＷＦフラクションから、因子VIIIに対する高い親和力を有する材料（物質）が調製できる。組換えフォンビルブラント因子を高純度にかつ無制限量、入手可能であることが、アフィニティークロマトグラフィー又は関連のアフィニティー法（これらでは、結合させるべき分子がリガンドとの特異的な相互作用により結合する）におけるリガンドとして本発明のｖＷＦ誘導体の広範な適用が可能になる。ｒ−ｖＷＦは、例えばCHOのような哺乳動物細胞で発現されたものが好ましい。そのようなｒｖＷＦは特許出願WO96/10584に記載されている。ｒ−ｖＷＦを例えばヘパリンアフィニティークロマトグラフィーによって精製する場合、フラクションはｖＷＦに関して比較的分子量が小さい（約百万Daまで）分子を含有している。これらのフラクションはそれ自身比較的低い一次止血活性を有するが、ｖＷＦと特異的な相互作用を行い得る結合タンパク、例えば因子VIII、と結合することは依然としてできる。これらのｒ−ｖＷＦ製造の２次フラクションはそれ自身高多量体物の大部分を含有する治療的に適用されるｖＷＦ濃縮物としては用いられないので、これらを、本発明に従って固定化し、その固定化したものをアフィニティーマトリックスの調製に使用することにより二次生産物を構成する。本発明に従い、クロマトグラフィー用材料として、アフィニティークロマトグラフィーのための優れた性質、即ち、高い流速に対応する僅かな逆圧、固定化すべきリガンドに対する高い結合能力、低い漏出挙動、及び殺菌の可能性（例えばソーダアルカリ液による）など、を有するゲルを用いることが好ましい。ｒ−ｖＷＦの固体マトリックスへのカップリングはアフィニティークロマトグラフィーで結合させるべきタンパクへの結合性が失われないように行う。驚いたことに、この目的のためには標準的な固定化法、例えばWoodward,"Immobilized Cells and Enzymes"，IRL.，Press，Oxford，Washington(1985)，pp．3-17に記載された方法を用いることができる。さらに、そのようなクロマトグラフィー用のゲルは良好な再使用(reutilization)特性と安定性を有するので、繰り返し使用したときにも単離すべき分子との結合能力が一定に維持される。このように、好ましいｖＷＦ誘導体はクロマトグラフィー材料として、有機ポリマー、とりわけ炭水化物を基礎とする有機ポリマーを含む。適当なゲルマトリ汚染、特にヒト病原性ウイルスによる汚染を回避するために、本発明のｖＷＦ誘導体を好ましくはウイルス不活化処理に供し、ｖＷＦと結合するタンパク質を単離する際に、クロマトグラフィー材料がウイルス汚染因子を含まないことを確実にする。ウイルス不活化処理は好ましくは誘導体化の前に、例えば界面活性剤、ポリエチレングリコール、カオトロピック物質による処理、熱処理、又は放射性処理によって、化学的及び／又は物理的手段で行うことが好ましい。しかしながら、同様に、完成した誘導体を好ましくは凍結乾燥形で、熱処理又は放射性処理などに供することが好ましい。好ましい実施態様では、本発明のｖＷＦ誘導体を保存安定な形、特に凍結乾燥品として、提供することにより、それらの貿易、販売及び保存を極めて容易にする。さらなる側面では本発明は容器とその中に本発明のｖＷＦ誘導体とを含有する装置に関し、該容器は液体が通過するのに適した注入のための入口と、出口とを有する。実際には、本発明の装置はカラム、特にアフィニティーカラム又はクロマトグラフィー用カラムとして設計し、所望により保存安定な形で、タンパクの単離の前に個々の使用者が単に材料を膨潤させることのみが必要となるよう、re ady-to-use製品とすることができる。本発明はまた、以下のステップにより特徴付けられるｖＷＦと結合するタンパク質を単離する方法に関する：・ｖＷＦと結合するタンパク質を含有するフラクションを得、・そのフラクションを本発明のｖＷＦ誘導体と接触させて該タンパク質をｖＷＦと結合させ、・結合しない成分を分離し、・タンパク質をｖＷＦ誘導体から溶離する。この方法は、バッチ法で行うか、カラムクロマトグラフィー的な方法で行っても良い。本発明の方法によって単離し得るタンパク質としては、第一に、生理学的なｖＷＦ結合タンパク質、即ち、糖タンパク質Ｉｂ、糖タンパク質IIb/IIIa複合体、コラーゲン、及び、とりわけ因子VIIIが考慮されるが、もちろん、これらタンパク質の組換え誘導体及び類似体、ｖＷＦ抗原、ｖＷＦ抗体、ｖＷＦマルチメラーゼ又はｖＷＦデポリメラーゼもそれぞれ考慮され、さらにはｖＷＦを基質として認識する酵素、さらにその他のｖＷＦに親和性の天然又は合成ペプチド類及びタンパク類も考慮される。その他、ｖＷＦ−結合性糖類、例えば、ヘパリンもこの方法で単離できる。本発明のｖＷＦ誘導体は親和性が高いので、単離すべきタンパク質を本発明のクロマトグラフィー材料に特異的に結合させ、それらを６０％以上の収率、好ましくは８０％以上、最も好ましくは定量的に回収し、それらをｖＷＦ誘導体から粗製(inpurified)の形で溶離することが可能であり、かくして、溶離後の濃縮手段なしに単に溶離するだけで単離されたタンパク質の濃縮物を調製することが可能になる。本発明の方法は、特に因子VIII活性を有する生物学的に活性なタンパク質、とりわけ血漿性又は組換え的な因子VIII及びその突然変異体又は類似体の回収に適する。たとえ因子VIII/ｖＷＦ複合体を含有する出発溶液を用いても本発明方法によって単離することができるだろう。タンパク質の溶離、特に因子VIIIタンパク質の回収のための溶離は、カルシウムイオン含有バッファーを用いて行うことが好ましい。その作業において特に重要なのは、因子VIII含有血漿フラクション、又は因子 VIIIを発現する細胞の細胞培養上清からの因子VIIIの単離である。血漿画分から因子VIIIを単離する場合にはｖＷＦが因子VIIIのキャリアタンパクとして機能するよう、即ち、因子VIIIがｖＷＦに結合して存在するよう、注意しなければならない。その外の方法としては、因子VIIIとｖＷＦとの分離は複合体法によってのみ行うことができる。この場合、例えば固定化した、因子VIII/ｖＷＦ複合体が結合する因子VIIIに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体に因子VI IIを結合させ、次いで、抗体と因子VIIIとの結合を妨げずに意図的にｖＷＦを溶離する。その後、因子VIIIをクロマトグラフィー用ゲルから溶離する。そのような方法は非常に複雑であるが、純度の高い因子VIII製品を得ることができる。因子VIIIに対する高い特異的な結合能力及び高い親和力を有する固定化ｒ−ｖＷＦの独創的な使用により、因子VIIIは固定化ｖＷＦに高い親和性で結合し血漿画分中に存在する因子VIIIとｖＷＦとの複合体を解離することができる。このような方法でｖＷＦを伴わない高純度の因子VIIIを血漿フラクションから単離することもできる。因子VIIIに加えて、ｖＷＦと親和性の他のタンパク質も固定化ｒ−ｖＷＦと結合させ複合体混合物から単離することができる。即ち、複合体混合物としては、例えば、因子VIIIハイブリッドタンパク、特に米国特許出願08/558,107に記載の因子VIII-ヘパリン−補酵素IIハイブリッドタンパク又はWO90/05530に記載の因子VIII−因子V-ハイブリッドタンパク、又はWO94/11503に記載のキメラヒト/ブタ因子VIII、FVIII突然変異体、例えば、AT 403 438に記載のArg²³⁰⁷→Gln 置換を有する因子VIII突然変異体(因子VIIIdB695-R2307Q)、これは一定の因子VI II:C-プロコアギュレート(procoagulatory)活性及びｖＷＦ結合活性を持ち減少されたインヒビター結合を示す、フォンビルブラント因子分解酵素、例えば、それぞれｖＷＦ特異的デポリメラーゼ又はｖＷＦマルチメラーゼ、又は栓球レセプター、例えばGPIIb/IIIa複合体又はGPIb/IX複合体、それらの純粋な製品は生物学的分析、診断又は治療において興味深い、などがある。現在、治療用タンパクの特異的な単離はイムノアフィニティークロマトグラフィー法で行われている。そのような方法では単離すべき分子を固定化したモノクローナル抗体（一般にネズミ細胞から単離）に結合させ、洗浄して不純物を除き、次いで溶離して高純度のものとする。モノクローナル抗体の使用には、それがネズミのタンパク質を製品に持ち込みうるという欠点があり、そのことは、結合させるべき分子を治療に適用する限りにおいて、例えばネズミタンパクに対する抗体の惹起のような副作用を起こしうる。固定化したヒト起源の特異的なリガンド又はヒトタンパクと同等の分子を用いることにより、そして異種の抗体を用いることを回避することにより、製品に存在し得る汚染がヒト起源であり上記の副作用、即ち異種抗体の生成が排除されるという限りにおいて、内在するアフィテニィーカラムの漏れによる汚染の問題が低下する。さらなる利点は、抗体でない高特異性のリガンドを用いることにより、抗体の場合には起こり得る非特異性の問題が排除される。さらに、本発明方法によるｖＷＦに対する生理学的な結合タンパクの回収には、ｖＷＦがその結合パートナーに対する安定化剤又はキャリアー機能を発揮するという利点がある。このように、単離及び精製の間にも、溶離（溶出）の間に起こり得る分解条件から回収されたタンパク質は保護される。このようにして得られた生成物は上記のように、その抗原性のみならず、それらの活性又は本質性(n ativity)に関しても高収率で回収される。本発明のｖＷＦ誘導体を用いて精製される、その他の特に好ましいタンパク質又はタンパク質複合体は、高分子形のｖＷＦを低分子変異体に分解するｖＷＦマルチメラーゼである(AT 404 359及びAT 404 554参照)。この場合、マルチメラーゼは固定化ｖＷＦに結合し、誘導体化のおかげで本発明の材料の分解は防止される。特に、ｖＷＦマルチメラーゼを単離する場合、金属イオンのためのキレート剤を含有するバッファー、特にEDTAを用いる溶離が特に効率的である。本発明のｖＷＦ誘導体はｖＷＦに対する抗体の、可能な体外イムノアドソープションにも適する。ｖＷＦに対する抗体の形成は病理学的条件を構成し、出血傾向が高い血液凝固欠損に至る自己免疫疾患、あるいはｖＷＦ含有製剤で治療された患者における副作用として現れる。機能的で阻害性の抗体が形成すると、置換療法が不可能になるか、凝固因子濃縮物の止血作用の持続のために劇的な用量の増加を招く。過去においてはそのような場合、循環中の凝固因子に対する機能的な抗体を血漿瀉血（プラスマフェレーゼ）又はＩｇＧに対するタンパク質、例えばプロテインＡ又はプロテインＧ、による体外免疫吸着によって除去していた。同様の方法がNilsson et al.(Thromb．Haemostas．70(1993)，56-59)にも因子VI IIに対する抗体の除去に関して記載されている。この場合、患者の血漿を固定化された組換えFVIIIを含有するカラムにポンプで送り出し、FVIII阻害性抗体を循環中から除去する。しかしながら、この方法で固定化されたリガンドはフォンビルブラント因子を含有していなかった。従って、ｖＷＦに対する抗体の体外イムノアドソープションは行うことができなかった。本発明の抗体回収方法のさらなる応用は診断目的のためのｖＷＦに対するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の分取製造にある。本発明のｖＷＦ誘導体からの抗体の溶離に用いるのに好ましい溶離バッファーには酸性ｐＨ、特にｐＨ２〜５の範囲のものが含まれる。本発明の本質的な利点の１つは、任意の出発物質からタンパク質を精製できるということである。特に好ましい出発フラクションは哺乳動物の体液又は細胞培養から導かれるフラクションである。クロマトグラフィー材料の独創的な親和性の故にｖＷＦ及び/又は因子VIII/ｖＷＦ−複合体を含有するフラクションも好ましい。本発明方法の好ましい実施態様における変種は、ｖＷＦを含有している装置を用いて行うことからなる。以下に実施例及び図面に従って本発明をさらに詳しく説明するが、それらは本発明を制限するものではない。第１図及び第２図は本発明のｖＷＦ誘導体を用いる組換え因子VIIIの精製を示す。実施例１：ＣＨＯ細胞由来の組換えフォンビルブラント因子の調製 FEBS.Lett.351(1994),345-348に記載のように、組換えフォンビルブラント因子を産生するＣＨＯ細胞クローンを調製する。ヒトフリンのｃＤＮＡをコードするベクターでのトランスフェクション（van den Ouweland et al.，Nucleic Aci ds Res．18(1990）,664)によって、ヒトフリンを同時発現するセルラインを作成した。この安定な細胞クローンを潅流反応物中の微担体（ミクロキャリアー） Animalcelltechnology．Oxford，London:Butterworth-Heinemann，(1994),267-2 69)。 Thromb．Haemost．73(1995)，1160に記載の２段階クロマトグラフ法によって精製を行った。塩溶液で溶離させたフラクションを回収し、Sephadex G25（Phar macia）でゲルろ過して、２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ７．５のバッファーに再緩衝化した。次いで、この調製物をAmicon YM30メンブレン（カットオフ：３０，０００Ｄ）で超濃縮し、タンパク質濃度を３ｍｇ／ｍＬとした。この調製物中のｖＷＦ濃度はｖＷＦ抗原６０Ｕ／タンパク質ｍｇになった。細胞培養の調製時および精製時に血清または血漿成分を回避したため、この調製物は因子ＶＩＩＩを全く含んでいなかった。実施例２：組換えフォンビルブラント因子の固定化実施例１に記載の組換えｖＷＦの調製物を２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ７．５のバッファーで希釈し、１．５ｍｇ／ｍＬとした。アフィニティークロマトグラフィーに適当なあらかじめ活性化したゲル（Actigel, ALD-Superflow,Sterogene）を、２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ７．５のバッファーで何度も洗浄しておいた。あらかじめ洗浄したゲル１容量を、固定化するタンパク質溶液１．１容量と混合し、次いで０．１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７．０中の０．１Ｍシアノホウ水素化物（ＮａＣｎＢＨ₃）溶液０．１５容量を混合した。ゲルを振とうしてこのバッファーに懸濁し、さらに振とう下、室温で１６時間インキュベートした。次いでこのゲルを焼結吸引フィルター上、２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌを含むｐＨ７．５のバッファー１０倍容量で洗浄し、２０ｍＭトリス塩酸、２ＭＮａＣｌを含むｐＨ７．５のバッファー５倍容量で洗浄した。次いでこれを、２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５のバッファー５容量で再び平衡化し、このゲルを、直径：ゲル床の高さの寸法が１：４であるクロマトグラフィーカラムに移した。ｖＷＦ溶液のインキュベート上清およびアフィニティーゲルの溶液ならびに焼結吸引フィルターで分離された洗浄溶液中のタンパク質濃度を決定することによって、カップリング率は用いたタンパク質の９０％以上と決定された。実施例３組換え因子ＶＩＩＩの精製組換え因子ＶＩＩＩ調製物（Recombinante^R,Baxter）をAqua.dest．１０ｍＬに再構成した。この溶液は、生理的ｐＨのヒスチジン塩バッファー中、ＦＶＩＩＩ５０ＩＵ／ｍＬ、ヒトアルブミン１２ｍｇ／ｍＬ、ポリエチレングリコール３３５０１．５ｍｇ／ｍＬおよび微量のｖＷＦを含むものであった。Sephadex G25（Pharmacia）でのゲルろ過によって、この溶液から低分子成分を分離し、２０ｍＭトリス塩酸を含むｐＨ７．５のバッファーに因子ＶＩＩＩ／ｖＷＦ／アルブミン混合物を移した。次いでこの溶液７ｍＬを流速０．５ｍＬ／分で実施例２のカラムにアプライした。次いで、同流速下、これを２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５のバッファー１０ｍＬで洗浄し、さらに２５０ｍＭ塩化カルシウムを含む同バッファーでｖＷＦ結合ＦＶＩＩＩフラクションを溶出させた。室温で行った全クロマトグラフィー工程間に、５００μＬのフラクションを収集し、カラムに通した後、２８０ｎＭで光学密度を決定した。次いで、色で見分けられる因子ＶＩＩＩ試験、Immunochrom ＦＶＩＩＩ：Ｃ（Immuno）によってフラクション中のＦＶＩＩＩ含量を決定した。この結果を図１に示す。フラクションの分析により、タンパク質の９０％以上がカラム流出液および洗浄溶液に含まれていたが、ほんの一部のＦＶＩＩＩ活性（５％より少ない）がこのタンパク質フラクションとともに溶出しただけであることが示される。塩化カルシウムを含む溶出液により、大部分のＦＶＩＩＩを高い純度でカラムから溶離することができた。因子ＶＩＩＩの回収率は９０％以上であった。実施例４：アフィニティーゲルの再使用性組換え因子ＶＩＩＩの最初のアフィニティークロマトグラフ精製が完了した後、カラム中のアフィニティーゲルを、２０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ７．５のバッファーで過剰に洗浄した。ＥＬＩＳＡ（Boehringer，Mannheim）により、洗浄溶液中のｖＷＦ抗原を測定した。ｖＷＦ：Ａｇを全く測定できず、これによりこのアフィニティーカラムの低い漏出性が示された。実施例３に記載のように、同一条件下、固定化組換えｖＷＦによる組換え因子ＶＩＩＩのアフィニティークロマトグラフ精製を繰り返した。この溶出図を図２に示す。タンパク質および活性溶出プロファイルはアッセイ関連偏差内で、最初のアフィニティークロマトグラフィーの実行に匹敵していた。これゆえ、アフィニティーゲルの再使用性は良好であるとすることができる。実施例５：抗フォンビルブラント因子抗体の固定化組換えフォンビルブラント因子に対する結合 Sephadex G25（Pharmacia）でのゲルろ過により、ＩｇＧ濃度が７ｍｇ／ｍＬであるｖＷＦに対するマウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ０３７６８／３，Ch emicon International,Inc.）を、２０ｍＭトリス塩酸、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５のバッファー中に再緩衝化した。同バッファーで希釈して、タンパク質濃度を０．５ｍｇ／ｍＬに調節した。実施例３の固定化組換えｖＷＦを含むカラムに、この溶液４ｍＬを流速０．５ｍＬ／分でポンプで注入し、２８０ｎｍで流出液の光学密度を測定した。次いで、これをトリス塩酸バッファー２０ｍＬで洗浄し、さらに５００ｍＭＮａＣｌを含むトリス塩酸バッファー１０ｍＬで洗浄した。記載の洗浄工程では、いかなる言及可能な量のタンパク質もアフィニティーカラムから溶出しなかった。次いでこれを、１００ｍＭグリシン塩酸、ｐＨ２．２のバッファーで溶出させた。ｐＨを変化させることによって、タンパク質をカラムから定量的に溶離させることができた。ＩｇＧ含量の決定により、用いたＩｇＧ２ｍｇのうち、グリシン溶出液中にＩｇＧ１．７５ｍｇが再び見られた。これは収率８８％に相当する。酸性バッファーを用いた溶出工程の後、さらなる再使用のため、２０ｍＭトリス塩酸バッファー、ｐＨ７．５でアフィニティーカラムを洗い流した。実施例６：フォンビルブラント因子分解酵素の精製 Furlanet.al.(Blood87(1996),4223-4234)に記載のヒト血漿由来のｖＷＦ開裂プロテアーゼを同上に記載の方法にしたがい、銅キレートアフィニティークロマトグラフィー、次いでブチルセファロース（Pharmaciａ)での疎水性相互作用クロマトグラフィーによってあらかじめ精製した。ブチルセファロースの溶出液を凍結乾燥し、濃縮後に蒸留水にとった。次いで、これをSephadexG25（Pharmacia ）によって２０ｍＭトリス塩酸、５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＢａＣｌ₂、５ｍＭＰＥＦＡブロック(Pentapharm)、ｐＨ７．５のバッファーに再緩衝化した。流速０．５ｍＬ／分の実施例２の固定化組換えｖＷＦを含むカラムにこの溶液３ｍＬをアプライした。次いで、プロテアーゼフラクションを再緩衝化した同バッファー１０ｍＬでこれを洗浄し、このカラムを２０ｍＭトリス塩酸、５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＰＥＦＡブロック（Pentapharm）を含むｐＨ７．５のバッファーさらに１０ｍＬで洗い流した。不安定であることが知られているｖＷＦ分解酵素を安定化するために、各フラクションのフラクションコレクターの試験管にウシ血清アルブミンの１％水溶液５０μＬを入れておいて、全クロマトグラフィー工程間に、各４５０μＬのフラクションを収集した。クロマトグラフ時に、２８０ｎｍのＵＶ吸収を測定し、以下のようにｖＷＦ分解酵素活性を測定した。実施例１の組換えｖＷＦ調製物を０．２％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミンを含む５ｍＭトリス塩酸、１．５Ｍ尿素のバッファーに再緩衝化し、０．４ｖＷＦＵ／ｍＬとした。１００μＬ量の試験フラクションをそれぞれ５０ｍＭＰＰＡＣＫ水溶液５μＬおよび２００ｍＭＢａＣｌ₂溶液１２．５μＬと混合し、３７℃で５分間インキュベートした。次いで、このように調製したサンプルを基質（ｖＷＦ）と１＋１混合し、MaruskyおよびSergeant（Anal.Biochem.105(1980),403）の方法にしたがい、５ｍＭトリス塩酸、１．５Ｍ尿素を含むｐＨ８．０のバッファーに対し、３７℃で１５時間、浮動透析膜（Millipore VSWP）で透析した。次いで、ｖＷＦのコラーゲン結合活性およびその抗原性を決定するＥＬＩＳＡにおいてｖＷＦ残留活性に関し、透析物を分析した。これが終了した後、２μｇ／ｍＬの濃度のヒト胎盤のペプシン消化ＩＩＩ型コラーゲン（Southern Biotechnology）の懸濁液１００μＬを、ポリスチレンのミクロタイタープレート（９６ウェル、Pierce Reactibind^TM／リンゴ酸無水物−活性化）の各ウェルに入れ、室温で１時間インキュベートした。次いで、これをブロックバッファー（SuperBlock^TM，Pierce）各１５０μＬで３０分間処理した。次いで、ｖＷＦ含有サンプルの種々の希釈物各１００μＬをアプライし（２５−２５０ｎｇｖＷＦ／ｍＬ)、ペルオキシダーゼ結合抗ｖＷＦ抗体（Dakopatts P226，１：１０００希釈）の溶液１００μＬとインキュベートした。次いで、基質１００μＬを加え(Single Component TMB Peroxidase EIA Sub strate，Bio-Rad)、１分後に０．１８ＭＨ₂ＳＯ₄で１＋１希釈して、色反応を停止させた。この後、ＥＬＩＳＡ読み取り装置で４５０ｎｍでの吸光度を読み取り、標準の希釈シリーズと比較してサンプル濃度を決定した。各インキュベート工程の後、バッファー（それぞれの次の工程に対応するバッファー）各１５０μＬで３回洗浄した。用いたバッファー系：バッファー１（コラーゲンコーティングおよび抗体希釈用）：８ｍＭリン酸ナトリウム、１３５ｍＭＮａＣｌ、２．６ｍＭＫＣｌ、ｐＨ７．３バッファー２（サンプル希釈用）：バッファー１＋０．０５％トウィーン２０および１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．３に対応コラーゲン結合活性の逆数がｖＷＦ分解酵素の酵素活性についての直接の測定値であると考える。フォンビルブラント因子カラムにアプライされた酵素量のうち、約５０％が流出液および洗浄溶液中に見られ、一方、ＥＤＴＡでの溶出によって約５０％の活性がカラムから溶離した。しかし、クロマトグラフ精製の流出液および洗浄フラクションには９５％以上のタンパク質が含まれていたため、出発物質と比べて、単離される酵素活性を５−１０倍豊富にし、精製することができた。実施例７：血漿性因子ＶＩＩＩの精製血漿性因子ＶＩＩＩ／フォンビルブラント因子濃縮物（IMMUNATE；Immuno）を蒸留水５ｍＬに再組成した。この溶液は、ｐＨ７．４のクエン酸−グリシン−リシンバッファ−中に因子ＶＩＩＩ２５ＩＵ／ｍＬおよびｖＷＦ１０Ｕ／ｍＬ (リストセチンコファクター法によって測定)を含んでいた。Sephadex G25でのゲルろ過によって、因子ＶＩＩＩ／フォンビルブラント因子複合体を、２ーｍＭトリス／塩酸を含むｐＨ７．５のバッファーに再緩衝化した。次いでこの溶液３ｍＬを実施例２のカラムに直接アプライした。流速は０．１ｍＬ／分であった。次いでこれをｐＨ７．５の２０ｍＭトリス／塩酸バッファー３０ｍＬで洗浄し、次いで２０ｍＭトリス／塩酸および２５０ｍＭＣａＣｌ₂を含むバッファーでこれを溶出させた。溶出時にフラクションを集め、光学密度を決定した。溶出バッファーのアプライ後すぐのフラクションでは、２８０ｎｍのＵＶ吸収の１０％増加が測定され、フォンビルブラント因子ＥＬＩＳＡ（Boehringer,Mannheim ）ではフォンビルブラント因子を含まない溶離タンパク質が測定され、最初の１０溶出フラクションでは、色で見分けられる因子ＶＩＩＩアッセイ、Immunochro m ＦＶＩＩＩ：Ｃ（Immuno）での測定により、約０．２Ｕ／ｍＬの因子ＶＩＩＩ含量が見られた。

Claims

【特許請求の範囲】１．粒子状担体又は担体ゲルに固定化された組換えフォンビルブラント因子（ｒ −ｖＷＦ）を含有するフォンビルブラント因子誘導体(ｖＷＦ誘導体)。２．粒子状担体又は担体ゲルがクロマトグラフィー用材料である請求項１記載のｖＷＦ誘導体。３．ｖＷＦ誘導体が血液凝周丙子VIIIを含有しないことを特徴とする請求項１又は２記載のｖＷＦ誘導体。４．ｒ−ｖＷＦが粒子状担体又は担体ゲルに化学的な結合を介して固定化されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のｖＷＦ誘導体。５．ｒ−WFが低い一次止血活性を有するｒ−ｖＷＦフラクション、特に低分子量ｒ−ｖＷＦフラクションから導かれることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のｖＷＦ誘導体。６．粒子状担体又は担体ゲルが有機ポリマー特に炭水化物を基礎とする有機ポリマーであることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のｖＷＦ誘導体。７．ｒ−ｖＷＦ又はその誘導体がそれぞれウイルス不活化されていることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のｖＷＦ誘導体。８．保存安定な形、特に凍結乾燥物質として存在することを特徴とする請求項１〜７いずれかに記載のｖＷＦ誘導体。９．液体が通過するのに適するよう設計された入口と出口とを有する容器及び該容器に含有される請求項１〜８のいずれかに記載のｖＷＦ誘導体とを含む装置。１０．容器がアフィニティーカラムとして設計されていることを特徴とする請求項９記載の装置。１１．以下のステップにより特徴付けられるｖＷＦと結合するタンパク質を単離する方法：・ｖＷＦと結合するタンパク質を含有するフラクションを得、・そのフラクションを請求項１〜８のいずれかに記載のｖＷＦ誘導体と接触させ、該タンパク質をｖＷＦと結合するようにし、・結合しない成分を分離し、・タンパク質をｖＷＦ誘導体から溶離する。１２．タンパク質がｖＷＦ誘導体から濃縮物の形で溶離されることを特徴とする請求項１１記載の方法。１３．因子VIII活性を有する生物学的に活性なタンパク質を含有するフラクションを得、このタンパク質を単離することを特徴とする請求項１１又は１２記載の方法。１４．カルシウムイオンを含有するバッファーによって溶離することを特徴とする請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。１５．ｖＷＦマルチメラーゼを含有するフラクションを得、該タンパク質を単離することを特徴とする請求項１１又は１２記載の方法。１６．金属イオンのためのキレート剤、特にＥＤＴＡを含有するバッファーを用いて溶離することを特徴とする請求項１１、１２又は１５のいずれかに記載の方法。１７．ｖＷＦに対する抗体を含有するフラクションを得、これらのタンパク質を単離することを特徴とする請求項１１又は１２記載の方法。１８．酸性ｐＨ、特にｐＨ２〜５の範囲のバッファーを用いて溶離することを特徴とする請求項１１、１２又は１７のいずれかに記載の方法。１９．哺乳動物の体液又は細胞培養から導かれたフラクションを得ることを特徴とする請求項１１〜１８のいずれかに記載の方法。２０．ｖＷＦ及び/又は因子VIII/ｖＷＦ複合体を含有するフラクションを得ることを特徴とする請求項１１〜１９のいずれかに記載の方法。２１．タンパク質を少なくとも収率８０％で回収することを特徴とする請求項１１〜２０のいずれかに記載の方法。２２．請求項９又は１０に記載の装置を用いて行うことを特徴とする請求項１１〜２１のいずれかに記載の方法。