AT405740B - Von willebrand-faktor-derivat sowie ein verfahren zur isolierung von proteinen - Google Patents

Description

AT 405 740 B

Die Erfindung betrifft ein von Willebrand-Faktor-Derivat sowie ein Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die an vWF binden.

Von Willebrand-Faktor (vWF) ist ein Glykoprotein, welches in Plasma in einer Reihe von Multimeren der Größe von etwa 500 bis 20 000 Kilodalton zirkuliert. Die multimeren Formen von vWF setzen sich aus 250 kD Polypeptid-Untereinheiten zusammen, welche über Disulfidbrücken aneinander gebunden sind. vWF spielt eine Rolle bei der Bindung von Blutplättchen an das Subendothelium einer beschädigten Gefäßwand, wobei nur die größten Multimere auch haemostatische Aktivität zeigen. Es wird angenommen, daß die Endothelzellen große polymere Formen von vWF sekretieren und daß diejenigen Formen von vWF, welche ein kleineres Molekulargewicht aufweisen (low molecular weight vWF, LMW), durch proteolytische Spaltungen entstanden sind. vWF wird in den vaskulären Endothelzellen, welche die Hauptquelle dieses Plasmaproteins darstellen, durch konstitutive oder stimulierte Freisetzung gebildet aber auch in einem geringen Anteil durch die Megakaryozyten synthetisiert. Die Biosynthese von vWF ist sehr komplex und resultiert daher in einer Vielzahl verschiedenster vWF-Moleküle mit unterschiedlichster Struktur, Aufgaben und Eigenschaften.

Dies fuhrt dazu, daß vWF an verschiedene Rezeptoren in unterschiedlichen Geweben binden kann, wobei die Bindung an Proteine, wie Glykoprotein Ib, den Glykoproteinkomplex ll/llla, Faktor VIII:C, an Thrombozyten, an das Subendothelium zu den wichtigsten physiologischen Aktivitäten des vWF zählt.

Bei der Bindung des vWF an den Blutgerinnungsfaktor VIII wird der Faktor Vlll-Komplex oder Faktor VIII:C/vWF-Komplex gebildet, welcher den Faktor VIII:C als stabilisiertes Protein enthält. Ein vWF-Mangel führt unweigerlich auch zu einer Reduktion der Faktor VIII:C-Konzentration im Blut, da der Stabilisierungsef-fekt des vWF ausbleibt.

Es ist bekannt, rekombinanten Faktor VIII durch eine Säule enthaltend plasmatischen von Willebrand-Faktor, gekoppelt an Sepharose® (vWF-Sepharose), zu reinigen (Wood et al., Nature 312 (1984), 330-337). Es zeigte sich jedoch, daß die Avidität eines immobilisierten plasmatischen vWF niedrig ist und daher beispielsweise die Gewinnung von Faktor VIII mit der beschriebenen vWF-Sepharose aus einer Losung, welche den Faktor VIII/vWF-Komplex enthält, in nennenswerten Ausbeuten nicht möglich ist.

Darüberhinaus enthielt diese vWF-Sepharose neben vWF noch Faktor VIII aufgrund des plasmatischen Ausgangsmaterials, welches den Faktor VIII:C/vWF-Komplex enthält. Bei der Gewinnung von pharmazeutischen Präparaten würde allerdings die Kontamination mit dem plasmatischen Faktor VIII:C ein großes Problem darstellen.

Bindungsstudien, bei welchen die Inhibierung der Bindung von Faktor VIII an in Mikrotiterplattennäpfchen immobilisiertem plasmatischen vWF durch rekombinanten vWF untersucht worden sind, zeigten darüberhinaus, daß rekombinanter vWF in Lösung eine noch schlechtere Avidität bezüglich des Bindungspartners Faktor Vlll:C erzielt werden konnte (Leyte et al., Biochem. J„ 274 (1991), 257-261). Daher ist dieses Material nicht zur präparativen Darstellung von Faktor VIII geeignet.

In BLOOD 88 (19) (1996), S. 3854-3861 (Tsuij et al.) wird die Wechselwirkung zwischen Glycoprotein Ib mit einem oberflächenimmobilisierten vWF untersucht. Zur Immobilisierung wird vWF an eine Polymethyl-methacrylat-Platte gebunden, wobei diese Bindung entweder direkt oder über einen anti-vWF-Antikörper erfolgt. Hierbei kommt aber ebenfalls nur ausschließlich plasmatischer vWF zur Anwendung (vgl. Wood et al. (1994)). Ein derartiges vWF-Derivat auf Basis von plasmatischem vWF ist aber ungeeignet zur Reinigung von Faktor VIII.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher das Zurverfügungstellen eines Chromatographiematerials, mit welchem Proteine, die an vWF binden, isoliert werden können, selbst wenn vWF in der Lösung, aus der die Proteine isoliert werden sollen, vorhanden ist. Anders formuliert, besteht die Aufgabe der vorliegenden Erfindung im Zurverfügungstellen eines Materials mit einer Avidität, die höher ist als die des vWF im Verbund mit seinen Bindungspartnern, insbesondere als die des vWF im Faktor VIII/vWF-Komplex.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein vWF-Derivat, bestehend aus vWF, immobilisiert an einen partikulären Träger oder ein Trägergel (Träger), insbesondere an ein Chromatographiematerial, welches sich dadurch auszeichnet, daß der vWF ein rekombinanter vWF (r-vWF) ist. Vorzugsweise ist das vWF-Derivat frei von Blutgerinnungsfaktor VIII, und aufgrund der Vermeidung von anti-vWF-Antikörpern, frei von xenogenem Material, wie Antikörpern. Überraschenderweise hat sich nämlich gezeigt, daß - im Gegensatz zu plasmatischem vWF - r-vWF eine überraschende hohe Avidität gegenüber vWF-bindenden Proteinen hat, trotzdem er an ein Chromatographiematerial gebunden worden ist.

Darüberhinaus ist ein r-vWF im Gegensatz zu plasmatischem vWF frei von Blutgerinnungsfaktor VIII, und insbesondere frei von plasmatischen Proteinen, welche bei einem Isolierungsverfahren für vWF-bindende Proteine störend wären. 2

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Bei einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen vWF-Derivates ist der r-vWF durch chemische Bindung an das Chromatographiematerial fixiert. Dadurch wird gewährleistet, daß die hohe Avidität des erfindungsgemäßen vWF-Derivates mit einer großen Stabilität erhalten bleibt, was die Einsatzfähigkeit des erfindungsgemäßen Materials enorm erhöht. Durch die chemische Fixierung wurde die Stabilisierung des Chromatographiematerials erreicht, und überraschenderweise jedoch die Nativität des vWF nicht beeinträchtigt. Gleichzeitig kann auf die Verwendung von entsprechenden Antikörpern verzichtet werden, die eine Bindung des vWF an eine feste Phase vermitteln. Eine Bindung über Antikörper hätte den Nachteil der Instabilität und ein vermehrtes "leakage", d.h. ein Herauslösen des immobilisierten vWF gleichzeitig mit der Gewinnung der Bindungspartner für vWF.

Die Avidität des vWF-Derivates kann durch gezielte Auswahl der r-vWF Fraktion weiter gesteigert werden. Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß gerade aus einer r-vWF-Fraktion mit einer geringen primären hämostatischen Aktivität, insbesondere aus einer niedermolekularen r-vWF-Fraktion mit einem Molekulargewicht unter ca. 1,5 Millionen Da, vorzugsweise unter 1 Million Da, ein Material mit hoher Avidität für Faktor VIII hergestellt werden kann.

Die Verfügbarkeit von rekombinantem von Willebrand-Faktor in hoher Reinheit und unbegrenzter Quantität ermöglicht den breiten Einsatz des erfindungsgemäßen vWF-Derivats als Ligand in der Affinitäts-Chromatographie oder verwandten Affinitätsmethoden, bei welchen ein zu bindendes Molekül durch spezifische Wechselwirkung mit dem Liganden verbunden wird. r-vWF wird vorzugsweise in Säugetierzellen, z.B. CHO-Zellen, exprimiert. Ein derartiger vWF ist in der W096/10584 A1 beschrieben. Bei der Reinigung von r-vWF über z.B. Heparin-Affinitätschromatographie fallen Fraktionen an, welche Moleküle mit für vWF verhältnismäßig niedrigem Molekulargewicht (bis ca. 1 Million Dalton) enthalten. Diese Fraktionen haben zwar an sich eine relativ geringe primäre hämostatische Aktivität, sie sind allerdings weiterhin in der Lage, Bindungsproteine, die mit vWF in spezifische Interaktionen treten, z.B. Faktor VIII, zu binden. Da für therapeutisch angewandte vWF-Konzentrate mit großem Anteil an Hochmultimeren diese Nebenfraktionen der r-vWF-Produktion nicht verwendet werden, stellen diese somit ein Nebenprodukt dar, welches erfindungagemäß für die Immobilisierung und nachfolgende Anwendung des Immobilisats für die Herstellung einer Affinitätsmatrix verwendet werden kann.

Als Chromatographiematerial wird erfindungsgemäß vorzugsweise ein Gel verwendet, welches gute affinitätschromatographische Eigenschaften bautet, d.h. geringen Rückdruck entsprechend hohen Flußraten, eine hohe Bindungskapazität für den zu imm&ilisierenden Liganden, ein geringes Ausbluteverhalten und die Möglichkeit zur Desinfektion mit z.B. Natrontauge, aufweist.

Die Kopplung des r-vWF an die feste Matrix wird so durchgeführt, daß die Bindungseigenschaften für die in der Affinitätschromatographie zu bindenden Proteine nicht verloren gehen. Dazu können überraschenderweise Standardimmobilisierungstechniken verwendet werden, wie beispielsweise in Woodward "Immobilized Cells and Enzymes", IRL. Press, Oxford, Washington (1985), beschrieben. Weiters besitzt ein solches chromatographisches Gel gute Wiedapperwendungseigenschaften und Stabilität, so daß auch bei wiederholtem Einsatz gleichbleibende Bindungskapazität für die zu isolierenden Moleküle besteht.

Ein bevorzugtes vWF-Derivat umfaßt datpr als Chromatographiematerial ein organisches Polymer, insbesondere ein organisches Polymer auf UpMenhydratbasis. Geeignete Gelmatrizes bzw. partikuläre Träger sind z.B. Anionenaustauscher auf Zellulosebasis (Sephacele®), Anionenaustauscher auf Basis von quervernetztem Dextran (Sephadexe®), Anionenaustauscher auf Agarosebasis (Sepharosen®), Anionenaustauscher auf Agarosebasis (Fast Flow®-Mediee, High Performance®-Medien, Sepharose Big Beads®; alle Fa. Pharmacia), sphärische Chromatographiegtie. hergestellt durch Copolymerisation von N-acryloyl-2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol und einen anionischen Acrylderivat (Tris-Acryl®-Gele), nicht kom-pressible Silica-Dextran-Matrizes, bei welchefhiperöses Silicagel in einer quervemetzten Dextranmatrix eingebettet ist (Spherodex®-Gele), Gele aus rigiden Polystyrolpartikeln, deren Poren mit einem Hydrogel gefüllt sind (Hyper-D®-Gele; alle Fa. Sepracotfe rigide macroporose hydrophile Oberflächengele (Macro-prep®-Gele; Fa. BioRad); aber auch synthetische Polymere, wie synthetische Anionenaustauscher (Toyope-arl®-Gele; Fa. Tosohaas); und Anionenaustaus&er auf Basis von Copolymeren bestehend aus Oligoethyl-englycol-dimethylacrylat, Glycidylmethacrylat und Pentaerythrit-Dimethylacrylat (Fractogele®; Fa. MERCK).

Um Kontaminationen, insbesondere mit human-pathogenen Viren, zu vermeiden, wird das erfindungsgemäße vWF-Derivat vorzugsweise einer Virusinektivierungsbehandlung unterzogen, so daß sichergestellt werden kann, daß das Chromatographiematerial bei der Isolierung von Proteinen, die an vWF binden, keinen Virus-Kontaminationsfaktor darstellt. Die Behandlung zur Inaktivierung von Viren wird vorzugsweise vor der Derivatisierung durch ein chemisches und/oder physikalisches Verfahren vorgenommen, beispielsweise durch eine Behandlung mit Tensiden, Polyethylenglykolen, Chaotropen, durch eine Hitzebehandlung oder eine Strahlenbehandlung. Gleichfalls kann aber auch das fertige Derivat, vorzugsweise in lyophilisierter Form, einer Behandlung, wie die der Hitzebehandlung oder Bestrahlung, unterworfen werden. 3

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In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße vWF-Derivat in lagerstabiler Form, insbesondere als Lyophilisat, zur Verfügung gestellt, wodurch bedeutende Erleichterungen beim Handel, Vertrieb und bei der Lagerung erzielt werden.

Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch eine Vorrichtung, umfassend einen Behälter und ein darin enthaltenes erfindungsgemäßes vWF-Derivat, wobei der Behälter eine Eingangsöffnung und eine Ausgangsöffnung aufweist, die geeignet zur Durchleitung von Flüssigkeiten ausgebildet ist. Praktischerweise ist die erfindungsgemäße Vorrichtung dabei als Säule, insbesondere als Affinitätssäure oder Chromatographiesäule, ausgebildet, welche erwünschtenfalls als gebrauchsfertiges Produkt in lagerstabiler Form zur Verfügung gestellt werden kann, so daß lediglich noch eine Quellung des Materials vom jeweiligen Benutzer vor der Proteinisolierung durchgeführt werden muß.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die an den vWF binden, welches durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: - Bereitstellen einer Fraktion, welche Proteine enthält, die an den vWF binden, - Kontaktieren der Fraktion mit einem erfindungsgemäßen vWF-Derivat, wobei die Proteine an das vWF-Derivat gebunden werden, - Abtrennen der nicht gebundenen Bestandteile und - Eluieren der Proteine vom vWF-Derivat.

Dieses Verfahren kann ansat2weise, also als "batch"-Verfahren durchgeführt werden oder aber als säulenchromatographisches Verfahren.

Als Proteine, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isoliert werden können, kommen vor allem die physiologischen Bindungsproteine von vWF in Betracht, also Glykoprotein Ib, der Glykoprotein llb/llla-Komplex, Collagen und insbesondere Faktor VIII, aber selbstverständlich auch rekombinante Derivate und Analoga dieser Proteine, vWF-Antigene, vWF-Antikörper, vWF-Multimerasen bzw. vWF-Depolymerasen und sogar Enzyme, die den vWF als Substrat erkennen, und andere natürliche oder synthetische Peptide und Proteine, welche eine Affinität zu vWF aufweisen. Außerdem können vWF-bindende Saccharide, wie z.B. Heparin, mit diesem Verfahren isoliert werden.

Auf Grund der hohen Avidität des erfindungsgemäßen vWF-Derivats ist es möglich, die zu isolierenden Proteine in Ausbeuten von mehr als 60 %, vorzugsweise mehr als 80 %, am meisten bevorzugt nahezu quantitativ, am erfindungsgemäßen Chromatographiematerial spezifisch zu binden und zu gewinnen und in gereinigter Form vom vWF-Derivat zu eluieren, womit die Herstellung von Konzentraten der isolierten Proteine durch einfache Elution ohne anschließenden Konzentrierungsschritt möglich ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Gewinnung von biologisch aktiven Proteinen mit Faktor Vlll-Aktivität, insbesondere von plasmatischem oder rekombinantem Faktor VIII und deren Mutanten bzw. Analoga. Dieser kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren selbst dann isoliert werden, wenn eine Ausgangslösung, welche den Faktor VIII/ vWF-Komplex beinhaltet, verwendet wird.

Das Eluieren der Proteine, insbesondere bei der Gewinnung von Faktor Vlll-Proteinen, wird vorzugsweise mit einem Kalziumionen enthaltenden Puffer durchgeführt.

Von besonderer Bedeutung ist dabei die Isolierung von Faktor Vlll aus Faktor Vlll-hältigen Plasmafraktionen oder aus Zellkulturüberständen von Zellen, welche Faktor VIII exprimieren. Bei der Isolierung von Faktor VIII aus Plasmafraktionen ist zu beachten, daß vWF als Trägerprotein des Faktor VIII fungiert, d.h. Faktor VIII an vWF gebunden vorkommt. Die Trennung von Faktor VIII und vWF ist sonst nur mit aufwendigen Methoden zu bewerkstelligen, z.B. durch Bindung von Faktor VIII an immobilisierte gegen Faktor VIII gerichtete mono- bzw. polyklonale Antikörper, an welche der Faktor VIII/vWF-Komplex bindet und anschließend vWF gezielt eluiert wird ohne, daß die Bindung des Antikörpers mit Faktor VIII gestört wird. In der Folge wird dann Faktor VIII vom chromatographischen Gel eluiert. Solche Verfahren sind äußerst aufwendig, führen aber zu hochreinen Faktor Vlll-Präparaten. Durch den erfindungsgemäßen Einsatz eines immobilisierten r-vWF mit einer hohen spezifischen Bindungskapazität und einer hohen Avidität für Faktor VIII, läßt sich der in Plasmafraktionen vorkommende Komplex aus Faktor VIII und vWF dissoziieren, wobei Faktor VIII an den immobilisierten vWF mit höherer Avidität bindet. Auf diesem Wege läßt sich auch aus Plasmafraktion ein hochreiner Faktor VIII isolieren, der frei von vWF ist.

Außer Faktor VIII lassen sich auch andere Proteine mit Affinität zu vWF an immobilisiertem r-vWF binden und aus komplexen Mischungen isolieren, nämlich z.B. Faktor Vlll-Hybridproteine, insbesondere Faktor Vlll-Heparin-Cofaktor Il-Hybridprotein oder Faktor Vlll-Faktor V-Hybridprotein gemäß der WO 90/05570 oder chimärer humaner/porciner Faktor VIII gemäß der WO 94/11503, FVIII-Mutanten, wie z.B. in der AT 403 438 B (factor VIII dB695-R2307Q), beschriebene Faktor Vlll-Mutante mit einer Arg2307—Gin-Substitution, die bei gleichbleibender Faktor VIII:C-procoagulatorischer Aktivität und vWF-Bindungsaktivität eine reduzierte Inhibitorbindung aufweist, von Willebrand Faktor-abbauende Enzyme, z.B. die vWF-spezifi-sche Depolymerase bzw. vWF-Multimerase oder Thrombozytenrezeptoren, wie GPIIb/llla oder GPIb/IX- 4

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Komplex, deren Reindarstellung von biochemisch-analytischem, diagnostischem oder therapeutischem Interesse ist.

Gegenwärtig wird die spezifische Isolierung von therapeutischen Proteinen mit der Methode der Immunaffinitätschromatographie durchgeführt. Hierbei wird an einen immobilisierten monoklonalen Antikör-5 per (welche in der Regel aus Mauszellen gewonnen werden) das zu isolierende Molekül gebunden und von Verunreinigungen freigewaschen und anschließend in hoher Reinheit eluiert. Der Nachteil der Verwendung von monoklonalen Antikörpern besteht darin, daß durch diese in die Präparation Mausproteine abgegeben werden können, die, sofern das zu bindende Molekül therapeutisch angewendet wird, zu Nebenwirkungen, wie z.B. zur Antikörperbildung gegen Mausprotein, führen. Durch die Verwendung eines immobilisierten io spezifischen Liganden humanen Ursprungs oder eines dem humanen Protein äquivalenten Moleküls und die Vermeidung von xenogenen Antikörpern wird das immanente Problem der Kontamination durch das Ausbluten von Affinitätssäulen dahingehend reduziert, daß die im Präparat mögliche Verunreinigung ebenso humanen Ursprungs ist und damit die genannte Nebenwirkung, nämlich die Bildung von heterologen Antikörpern, ausgeschlossen wird. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß durch die Verwendung eines 15 hochspezifischen Liganden, der kein Antikörper ist, Unspezifitäten, wie sie bei Antikörpern gelegentlich Vorkommen, ausgeschlossen werden.

Die Gewinnung der physiologischen Bindungsproteine für vWF gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren hat weiters den Vorteil, daß der vWF eine Stabilisator- bzw. Trägerfunktion für seine Bindungspartner ausübt. Die gewonnenen Proteine sind daher sogar während der Isolierung und Reinigung vor denaturieren-20 den Bedingungen, die eventuell während der Elution gewährt werden, geschützt. Die erhaltenen Produkte werden also nicht nur bezüglich ihrer Antigenität in der genannten hohen Ausbeute erhalten, sondern auch bezüglich ihrer Aktivität bzw. Nativität.

Ein weiteres, besonders bevorzugtes Protein bzw. Proteinkomplex, welcher mit dem erfindungsgemäßen vWF-Derivat aufgereinigt werden kann, ist die vWF-Multimerase, welche die hochmolekularen Formen 25 des vWF zu niedrigmolekularen Varianten abbaut (siehe AT 404 359 B und AT 404 554 B. Dabei kann die Multimerase an den immobilisierten vWF binden, die Derivatisierung verhindert jedoch den Abbau des erfindungsgemäßen Materials.

Insbesondere bei der Isolierung der vWF-Multimerase kann besonders effizient mit einem Puffer, welcher eine Chelatbildner für Metallionen, insbesondere EDTA, enthält, eluiert werden. 3o Das erfindungsgemäße vWF-Derivat eignet sich auch zur gegebenenfalls extracorporalen Immunadsorption von Antikörpern, die gegen vWF gerichtet'Sind. Die Bildung von Antikörpern gegen vWF stellt einen pathologischen Zustand dar, der als Autoimmtiherkrankung auftreten kann und zu einem Blutgerinnungsdefekt mit gesteigerter Blutungsneigung führt oder eis Nebenwirkung der Behandlung von Patienten mit vWF enthaltenden Präparaten auftreten kann. Die Bildung eines funktionell inhibitorischen Antikörpers macht eine 35 Substitutionstherapie unmöglich oder führt zu drastischen Dosissteigerungen, um den hämostatischen Effekt des Gerinnungsfaktorkonzentrates aufrecht erhalten zu können. In solchen Fällen wurde der zirkulierende funktionelle Antikörper gegen den Gerindungsfaktor in der Vergangenheit durch Plasmapherese oder durch extracorporale Immunadsorption an gegen IgG gerichtete Proteine, z.B. Protein A oder Protein G, entfernt. Ein ähnliches Verfahren ist zur Entfernung von gegen Faktor VIII gerichteten Antikörpern von 40 Nilsson und Berntorp bekannt. Hierbei wird das Plasma des Patienten über eine Säule mit immobilisiertem, rekombinantem FVIII gepumpt, um die FVIIMnhibitorischen Antikörper aus dem Blutkreislauf zu entfernen (Nilsson et al., Thromb. Haemostas. 70 (1993), 56-59). Der dort immobilisierte Ligand war jedoch frei an von Willebrand-Faktor. Entsprechend konnte keine extracorporale Immunadsorption von gegen vWF-gerichteten Antikörpern durchgeführt werden. 45 Eine weitere Anwendung des erfindungsgemäSen Verfahrens zur Gewinnung von Antikörpern liegt in der präparativen Gewinnung von polyklonalen oder monoklonalen anti-vWF-Antikörpern für diagnostische Zwecke.

Ein Elutionspuffer, welcher bevorzugt bei der Elution von Antikörper vom erfindungsgemäßen vWF-Derivat verwendet wird, weist einen sauren pH auf, insbesondere einen pH im Bereich von 2 bis 5. so Einer der wesentlichen Vorteile der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß die Aufreinigung der Proteine von jedem Ausgangsmaterial möglich ist Besonders bevorzugte Ausgangsfraktionen bilden dabei Fraktionen, die aus einer Körperflüssigkeit eines Säugers oder einer Zellkultur abgeleitet sind. Aufgrund der erfindungsgemäßen Avidität des Chromatographiemateriais sind auch Fraktionen bevorzugt, welche den vWF und/oder den Faktor VIII/vWF-Komplex enthalten. 55 Eine bevorzugte Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit dem darin enthaltenen vWF-Derivat durchgeführt wird.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und die Zeichnungsfiguren, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll, näher erläutert. 5

I

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Es zeigen: Fig. 1 und Fig. 2 die Reinigung von rekombinantem Faktor VIII mit dem erfindungsgemäßen vWF-Derivat. BEISPIEL 1:

Herstellung eines rekombinanten von Willebrand-Faktors aus CHO-Zellen.

Ein CHO-Zellklon, der rekombinanten von Willebrand-Faktor produziert, wird wie in FEBS.Lett. 351 (1994) , 345-348, beschrieben, hergestellt. Durch Transfektion mit einem für die cDNA humanen Furins kodierenden Vektor (van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res. 18 (1990), 664) wurde die Zellinie zur Co-Expression von humanem Furin gebracht. Derartige stabile Zellklone wurden im Großmaßstab in Perfusionsreaktoren auf Microcarriern fermentiert (Blüml et al., In: Spier RE, Griffith JB, Berthold W, eds. Animal cell technology. Oxford, London: Butterworth-Heinemann, (1994), 267-269).

Die Reinigung wurde durch ein 2-stufiges chromatographisches Verfahren gemäß Thromb.Haemost. 73 (1995) , 1160, durchgeführt. Die durch Elution mit Kochsalz desorbierte Fraktion wurde gewonnen und durch Gelfiltration über Sephadex G25 (Fa. Pharmacia) in einen Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7,5, umgepuffert. Anschließend wurde die Präparation durch Ultrakonzentration über eine Amicon YM30-Membran (cut-off: 30.000 D) auf eine Proteinkonzentration von 3 mg/ml aufkonzentriert. Die vWF-Konzentra-tion in dieser Präparation betrug 60 E vWF-Antigen/mg Protein. Diese Präparation enthielt keinen Faktor VIII aufgrund der Vermeidung von Serum oder Plasmabestandteilen bei der Herstellung in Zellkultur und bei der Reinigung. BEISPIEL 2:

Immobilisierung von rekombinantem von Willebrand-Faktor.

Die Präparation des rekombinanten vWF aus Beispiel 1 wurde mit einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7,5, auf 1,5 mg/ml verdünnt. Ein voraktiviertes, für die Affinitätschromatographie geeignetes Gel (Actigel®, ALD-Superflow, Fa. Sterogene) wurde mit einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7,5, exzessiv vorgewaschen. Ein Volumsteil des vorgewaschenen Gels wurde mit 1,1 Volumsteilen der zu immobilisierenden Proteinlösung versetzt und anschließend 0,15 Volumsteile einer Lösung von 0,1 M Cyanborhydrid (NaCNBHa) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0, zugesetzt. Das Gel wurde durch Schütteln in diesem Puffer suspendiert und unter weiterem Schütteln 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde das Gel auf einer Sinternutsche mit dem 10-fachen Volumen eines Puffers, enthaltend 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7,5, und mit dem 5-fachen Volumen eines Puffers, enthaltend 20 mM Tris-HCI, 2 M NaCI, pH 7,5, gewaschen. Dann wurde nochmals mit 5 Volumsteilen des Puffers, 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7,5, äquilibriert und das Gel in eine chromatographische Säule mit einer Dimension Durchmesser zu Gelbetthöhe von 1:4 übergeführt. Durch Bestimmung der Proteinkonzentration in den auf der Sinternutsche abgetrennten Lösungen des Inkubationsüberstandes der vWF-Lösung und des Affinitätsgeles sowie der Waschlösungen konnte eine Kopplungsrate von über 90 % des eingesetzten Proteins ermittelt werden. BEISPIEL 3:

Reinigung von rekombinantem Faktor VIII.

Ein rekombinantes Faktor Vlll-Präparat (Recombinate, Fa. Baxter) wurde mit 10 ml Aqua.dest. rekonstituiert. Diese Lösung enthielt 50 IE FVIII/ml, 12 mg Humanalbumin/ml, 1,5 mg Polyethylenglykol 3350/ml sowie Spuren von vWF in einem Histidin-Kochsalz-Puffer bei physiologischem pH-Wert. Durch Gelfiltration auf Sephadex G25 (Fa. Pharmacia) wurden die niedrigmolekularen Komponenten aus dieser Lösung abgetrennt und das Faktor VIII/vWF/Albumin-Gemisch in einen Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCI, pH 7,5, gebracht. 7 ml dieser Lösung wurden anschließend auf die Säule aus Beispiel 2 mit einer Flußrate von 0,5 ml/min aufgetragen. Danach wurde bei gleicher Flußrate mit 10 ml eines Puffers, 20 mM TrisHCI, pH 7,5, nachgewaschen und weiters die an vWF-gebundene FVIII-Fraktion mit 250 mM Calciumchlorid im selben Puffer eluiert. Während der gesamten, bei Raumtemperatur durchgeführten, Chromatographie wurden Fraktionen zu 500 ul gesammelt und nach dem Säulendurchlauf die optische Dichte bei 280 nm bestimmt. In den Fraktionen wurde in der Folge der FVIII-Gehalt mittels des chromogenen Faktor Vlll-Tests, Immunochrom FVIILC (Fa. Immuno), bestimmt. Das Resultat ist der Fig. 1 zu entnehmen. 6

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Die Analyse der Fraktionen zeigt, daß mehr als 90 % des Proteins im Säulendurchlauf und in der Waschlösung enthalten waren, während mit dieser Proteinfraktion nur ein geringer Teil der FVI11-Aktivität (unter 5 %) eluierte. Die Hauptmenge an FVIII konnte durch die Elution mit Calciumchlorid von der Säule in hoher Reinheit desorbiert werden. Die Gewinnung des Faktor VIII erfolgte mit einer Ausbeute von mehr als 90 %. BEISPIEL 4:

Wiederverwendbarkeit des Affinitätsgeles.

Nach Abschluß der ersten affinitätschromatographischen Reinigung von rekombinantem Faktor VIII wurde das Affinitätsgel in der Säule exzessiv mit einem Puffer, 20 mM Tris, pH 7,5, gewaschen. In der Waschlösung wurde vWF-Antigen mittels EUSA (Fa. Boehringer, Mannheim) bestimmt. Es konnte kein vWF:Ag gemessen werden, was ein Indikator für geringes Ausbluteverhalten der Affinitätssäule ist. Die affinitätschromatographische Reinigung von rekombinantem Faktor VIII an immobilisiertem rekombinanten vWF wurde wie in Beispiel 3 unter identen Bedingungen wiederholt. Das Elutionsdiagramm ist Fig. 2 zu entnehmen. Protein- und Aktivitätseiutionsprofi! waren innerhalb der Testabweichungen mit dem ersten affinitätschromatographischen Lauf vergleichbar. Es kann daher von einer guten Wiederverwendbarkeit des Affinitätsgeles ausgegangen werden. BEISPIEL 5 :

Bindung von anti-von Willebrand Faktor-Antikörpern an immobilisierten rekombinanten von Willebrand Faktor.

Ein gegen vWF gerichteter Maus-monoklonaler Antikörper (MAb 03768/3, Fa. Chemicon International, Inc.) mit einer IgG-Konzentration von 7 mg/ml wurde durch Gelfiltration über Sephadex G25 (Fa. Pharmacia) in einen Puffer, 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7,5, umgepuffert. Die Proteinkonzentration wurde durch Verdünnung mit demselben Puffer auf 0,5 mg/ml eingestellt. 4 ml dieser Lösung wurden mit einer Flußrate von 0,5 ml/min über die immobilisierten rekombinanten vWF aus Beispiel 3 enthaltende Säule gepumpt und im Durchlauf die optische Dichte bei 280 nm bestimmt. Anschließend wurde mit 20 ml des Tris-HCl-Puffers nachgewaschen und weiters mit 10 ml einet'Tris-HCl-Puffers, enthaltend 500 mM NaCI, gewaschen. Bei keinem der genannten Waschschritte konnten nennenswerte Proteinmengen von der Affinitätssäule eluiert werden. Nachfolgend wurde mit einem Puffer, 100 mM Glycin-Hydrochlorid, pH 2,2, eluiert. Durch pH-Wert-Änderung konnte Protein quantitativ von der Säule desorbiert werden. Die Bestimmung des IgG-Gehaltes ergab, daß von den eingesetzten 2 mg IgG 1,75 mg IgG im Glycin-Eluat wiedergefunden wurden. Dies entspricht einer Ausbeute von 80 %. Die Affinitätssäule wurde nach dem Elutionsschritt mit dem sauren Puffer zur weiteren Wiederverwendung mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, pH 7,5, gespült. BEISPIEL 6: *

Reinigung eines von Wiilebrand-Faktor-abbauenden Enzyms.

Die von Furlan et al. (Blood 87 (1996), 4223-4234 beschriebene vWF-spaltende Protease aus Humanplasma wurde nach der ebenda beschriebenli· Methode über Kupferchelat-Affinitätschromatographie und nachfolgende hydrophobe Interaktionschromatoqmphie an Butylsepharose (Fa. Pharmacia) vorgereinigt. Das Eluat aus Butylsepharose wurde gefriergetrodldlft und konzentriert in destilliertem Wasser aufgenommen. Anschließend wurde es über Sephadex G25 (Fte Pharmacia) gegen einen Puffer, 20 mM Tris-HCI, 50 mM NaCI, 10 mM BaCh, 5 mM PEFA-Block (Fa. Pentapharm) pH 7,5, umgepuffert. 3 ml dieser Lösung wurden über die Säule, enthaltend immobilisierten rekombinanten vWF aus Beispiel 2, mit einer Flußrate von 0,5 ml/min aufgetragen. Anschließend wurde mit 10 ml desselben Puffers, gegen den die Proteasefraktion umgepuffert worden war, nachgewaschen und die Säule mit weiteren 10 ml eines Puffers, enthaltend 20 mM Tris-HCI, 50 mM NaCI, 20 mM EDTA, 5 fflM PEFA-Block (Fa. Pentapharm) pH 7,5, gespült. Während der gesamten Chromatographie wurden Fraktionen zu je 450 ul gesammelt, wobei in den Röhrchen des Fraktionssammlers bei jeder Fraktion 50 ul ekler 1 %igen wäßrigen Lösung von bovinem Serumalbumin vorgelegt war, um das als labil bekannte vWF-ebbauende Enzym zu stabilisieren. Während der Chromatographie wurde die UV-Absorption bei 280 nm gemessen und die Aktivität des vWF-abbauenden Enzyms wie folgt bestimmt. Eine Präparation des rekombinanten vWF aus Beispiel 1 wurde in einem Puffer, 5 mM 7

Claims (17)

1. AT 405 740 B Tris-HCI, 1,5 M Harnstoff, enthaltend 0,2 % (G/V) bovines Serumalbumin, umgepuffert und auf 0,4 vWF E/ml gebracht. Aliquote der zu untersuchenden Fraktionen von 100 ul wurden mit je 5 ul einer 50 mM wäßrigen PPACK-Lösung und 12,5 ul einer 200 mM BaCb-Lösung versetzt und 5 min bei 37 "C inkubiert. Anschließend wurde die so vorbereitete Probe 1 + 1 mit dem Substrat (vWF) versetzt und 15 h bei 37” C auf einer schwimmenden Dialysemembrane (Millipore VSWP) nach der Methode von Marusky und Sergeant (Anal.Biochem. 105 (1980), 403) gegen einen Puffer, enthaltend 5 mM Tris-HCI, 1,5 M Harnstoff, pH 8,0, dialysiert. Anschließend wurde das Dialysat auf seine vWF-Restaktivität in einem ELISA, bei welchem die Collagenbindungsaktivität des vWF sowie dessen Antigenität bestimmt wird, analysiert. Dazu wurden in einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol (96 weil, Pierce Reactibind ™/Maleinsäureanhydrid aktiviert) pro Napf 100 ul Suspension von pepsinverdautem Typ-Ill-Collagen (Fa. Southern Biotechnology) aus humaner Plazenta in einer Konzentration von 2 ug/ml gegeben und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde 30 Minuten lang mit jeweils 150 ul Blockpuffer (SuperBlock™, Fa. Pierce) behandelt. Dann wurden jeweils 100 ul verschiedener Verdünnungen der vWF enthaltenden Probe aufgetragen (25-250 ng vWF/ml) und mit 100 ul einer Lösung eines Peroxidase-konjugierten anti-vWF-Antikörpers inkubiert (Dakopatts P226, Verdünnung 1:1000). Anschließend wurden 100 ul Substrat zugegeben (Single Component TMB Peroxidase EIA Substrate, Fa. Bio-Rad) und die Farbreaktion nach 1 min durch 1 + 1-Verdünnung mit 0,18 M H2SO* abgestoppt. Danach wurde die Extinktion bei 450 nm mit einem ELISA-Reader gemessen und die Probenkonzentration gegenüber einer Verdünnungsreihe eines Standards bestimmt. Nach jedem Inkubationsschritt wurde jeweils 3mal mit 150 ul Puffer (Puffer entsprechend der jeweils nächsten Stufe) gewaschen. Verwendetes Puffersystem: Puffer 1 (für die Collagenbeschichtung und Antikörperverdünnung): 8 mM Natriumphosphat, 135 mM NaCI, 2,6 mM KCl, pH 7,3 Puffer 2 (für Probenverdünnung): entspricht Puffer 1 + 0,05 % Tween 20 und 1 % Rinderserum-Albumin, pH 7,3 Der Reziprokwert der Collagenbindungsaktivität gilt als direktes Maß für die Enzymaktivität des vWF-abbauenden Enzyms. Von der auf die von Willebrand Faktor-Säule aufgetragenen Enzymmenge fanden sich ca. 50 % im Durchlauf und in den Waschlösungen, während ca. 50 % der Aktivität durch die Elution mit EDTA von der Säule desorbiert werden konnten. Da jedoch mehr als 95 % des Proteins im Durchlauf und den Waschfraktionen der chromatographischen Reinigung enthalten waren, konnte die zu isolierende Enzymaktivität um einen Faktor 5 - 10 im Verhältnis zum Ausgang angereichert und gereinigt werden. BEISPIEL 7: Reinigung von plasmatischem Faktor VIII Ein plasmatisches Faktor Vlll/von Willebrand-Faktor-Konzentrat (IMMUNATE; Fa. Immuno) wurde mit 5 ml destilliertem Wasser rekonstituiert. Diese Lösung enthielt 25 IE Faktor Vlll/ml und 10 E vWF/ml (gemessen mit der Ristocetin Cofaktor-Methode) in einem Citrat-Glycin-Lysin-Puffer, pH 7,4. Durch Gelfiltration auf Sephadex G25 wurde der Faktor Vlll/von Willebrand-Faktor-Komplex gegen einen Puffer, enthaltend 20 mM Tris/HCI, pH 7,5, umgepuffert. Anschließend wurden 3 ml dieser Lösung direkt auf die Säule aus Beispiel 2 aufgebracht. Die Flußrate betrug 0,1 ml/min. Danach wurde mit 30 ml eines 20 mM Tris/HCI-Puffer, pH 7,5, nachgewaschen und anschließend mit einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris/HCI und 250 mM CaCI2, eluiert. Bei der Elution wurden Fraktionen gesammelt und die optische Dichte bestimmt. In den Fraktionen unmittelbar nach Aufträgen des Elutionspuffers konnte eine Erhöhung der UV-Absorption von 280 nm um 10 % gemessen werden, wobei das desorbierte Protein frei von von Willebrand-Faktor, gemessen in einem von Willebrand-Faktor-ELISA (Boehringer Mannheim), war, während in den ersten zehn Eluatfraktionen ein Faktor Vlll-Gehalt von ca. 0,2 E/ml durch Bestimmung mit einem chromogenen Faktor Vlll-Test, Immunochrom FVIII.C (Fa. Immuno), festgestellt werden konnte. Patentansprüche 1. Von Willebrand Faktor-Derivat (vWF-Derivat), bestehend aus rekombinantem von Willebrand Faktor (r- vWF), immobilisiert an einen partikulären Träger oder ein Trägergel. 8 AT 405 740 B 2. vWF-Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der partikuläre Träger oder das Trägergel ein Chromatographiematerial ist. 3. vWF-Derivat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das vWF-Derivat frei von Blutgerinnungsfaktor VIII ist.
2. 4. VWF-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der r-vWF durch chemische Bindung an den partikulären Träger oder das Trägergel fixiert ist.
3. 5. VWF-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der r-vWF aus einer r-vWF-Fraktion mit einer geringen primären hämostatischen Aktivität, insbesondere einer niedermolekularen r-vWF-Fraktion, abgeleitet ist.
4. 6. VWF-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der partikuläre Träger oder das Trägergel ein organisches Polymer, insbesondere ein organisches Polymer auf Kohlenhydratbasis, ist.
5. 7. VWF-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der r-vWF bzw. das Derivat virusinaktiviert ist.
6. 8. VWF-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es in lagerstabiler Form, insbesondere als Lyophilisat, vorliegt.
7. 9. Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die an den vWF binden, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: - Bereitstellen einer Fraktion, welche Proteine enthält, die an den vWF binden, - Kontaktieren der Fraktion mit einem vWF-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Proteine an das vWF-Derivat gebunden werden, - Abtrennen der nicht gebundenen Bestandteile und - Eluieren der Proteine vom vWF-Derivat.
8. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine in konzentrierter Form vom vWF-Derivat eluiert werden.
9. 11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fraktion, welche ein biologisch aktives Protein mit Faktor Vlll-Aktivität enthält, bereitgestellt wird und dieses Protein isoliert wird.
10. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem Calcium-Ionen enthaltenden Puffer eluiert wird.
11. 13. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fraktion, welche eine vWF-Multimerase enthält, bereitgestellt wird und dieses Protein isoliert wird.
12. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9,10 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem Puffer, welcher einen Chelatbildner für Metallionen, insbesondere EDTA, enthält, eluiert wird.
13. 15. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fraktion, welche Antikörper gegen den vWF enthält, bereitgestellt wird und diese Proteine isoliert werden.
14. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 9,10 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß mit einem Puffer mit einem sauren pH, insbesondere im Bereich von pH 2 bis 5, eluiert wird.
15. 17. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fraktion, die aus einer Körperflüssigkeit eines Säugers oder einer Zellkultur abgeleitet ist, bereitgestellt wird.
16. 18. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß eine Fraktion, enthaltend vWF und/oder den Faktor Vill/vWF-Komplex, bereitgestellt wird. 9 AT 405 740 B
17. 19. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteine mit einer Ausbeute von mindestens 80 % gewonnen werden. Hiezu 2 Blatt Zeichnungen 10