DE69931645T2

DE69931645T2 - Reinigung von fibrinogen aus flüssigkeiten mittels ausfällung und hydrophobischer-interaktion-chromatographie

Info

Publication number: DE69931645T2
Application number: DE69931645T
Authority: DE
Inventors: Graham Mccreath; Michael Udell
Original assignee: Pharming Intellectual Property BV
Current assignee: Pharming Intellectual Property BV
Priority date: 1998-09-24
Filing date: 1999-09-24
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2019-09-25
Also published as: WO2000017239A8; US20020019025A1; AU6104799A; ATE328007T1; DK1115745T3; ES2267289T3; WO2000017239A1; EP1115745B1; PT1115745E; EP1115745A1; US7211650B2; DE69931645D1; US20070219352A1

Description

Die Beschreibung befasst sich allgemein mit der Reinigung von Fibrinogen aus Flüssigkeiten, insbesondere, jedoch nicht ausschließlich aus Milch und spezifisch mit der Reinigung von menschlichem Fibrinogen aus Milch von transgenen nicht-menschlichen Tieren.
Fibrinogen, welches das Hauptstrukturprotein im Blut und für die Bildung von Gerinnseln verantwortlich ist, liegt als Dimer aus drei Polypeptidketten vor; die Aα (66,5 kD), Bβ (52 kD) und γ (46,5 kD) sind über 29 Disulfidbindungen verbunden. Die Hinzufügung von Asparagin-gebundenen Kohlenhydraten zu den Bβ und γ Ketten führt zu einem Molekül mit einem Molekulargewicht von 340 kD. Fibrinogen hat eine trinodale Struktur, ein zentraler Knoten, der die E Domäne genannt wird, enthält die Aminotermini aller 6 Ketten einschließlich der Fibrinpeptide (Fp), während die beiden distalen, D Domänen genannten Knoten die Carboxitermini der Aα, Bβ und γ Ketten enthalten. Fibrinogen wird an den Aminoterminus der Aα und Bβ Ketten gespalten, wodurch Fibrinpeptide A und B (FpA & FpB) frei gesetzt werden und durch Thrombin in Fibrinmonomer umgewandelt wird, welches eine Serinprotease ist, die aus ihrer inaktiven Form durch Faktor Xa umgewandelt ist. Die resultierenden Fibrinmonomere lagern sich nicht-kovalent zu Protofibrille durch DE Kontakte an benachbarten Fibrinmolekülen zusammen. Dies führt zu einer halb-gestapelten Überlappungsweise des Ausbildens der Fibrinpolymerkette. Kontakte bilden sich auch in Längsrichtung zwischen benachbarten D Domänen (DD Kontakte) aus, die zu seitlicher Aggregation führen. Eine andere Serinprotease, Faktor XIII wird proteolytisch durch Thrombin in Gegenwart von Ca⁺⁺ in eine aktivierte Form gespalten. Dieser aktivierte Faktor XIII (Faktor XIIIa) katalysiert ein Vernetzen des polymerisierten Fibrins durch Ausbildung von Isopeptidbindungen zwischen Lysin- und Glutaminseitenketten. Die ersten auszubildenden Glutamyl-Lysyl-Bindungen befinden sich am C-Terminal der γ Ketten und bilden C-C Vernetzungen. Danach bilden sich mehrfache Vernetungen zwichen den Aα Ketten, wobei der Vorgang des Vernetzens dem Gerinnsel sowohl biologische Stabilität (Widerstand gegen Fibrinolyse) als auch mechanische Stabilität verleiht [Sibenlist und Mosesson, Progressive Cross-Linking of Fibrin γ chains Increases Resistance to Fibrinolysis, Journal of Biological Chemistry, 269:28414-28419, 1994].
Der Koagulationsvorgang kann in vitro leicht zu einem selbsterhaltenden Klebersystem durch Anwendung von Fibrinogen und Faktor XIII als eine Komponente und Thrombin und Ca⁺⁺ als zweite Komponente, die den Polymerisationsprozess katalysiert, konstituiert werden. Diese Klebersysteme, die im Stand der Technik als „Fibrin-Dichtmittel" oder „Fibringewebskleber" bekannt sind, haben bei chirurgischen Verfahren und als Abgabeeinrichtungen für eine Reihe von pharmazeutisch aktiven Substanzen vielfach Anwendung gefunden [Sierra, Fibrin Sealant Adhesive Systems: A Review of Their Chemistry, material Properties and Clinical Applications, Journal of Biomaterials Applications, 7:309-352, 1993].
Es wurde geschätzt, dass der jährliche klinische US Bedarf an Fibrin-Dichtmittel weit über den 300kg/Jahr liegt, die unter Verwendung der von Plasmafraktionierern verwendeten herkömmlichen Kryopräzipitationsverfahren erhalten werden können. Alternative Quelle für Fibrinogen, welches die bei weitem größte Komponente der Fibrin-Dichtmittel ist, wurden deshalb erforscht, wobei die rekombinanten Quellen favorisiert wurden [Butler et al., Current Progress in the Production of Recombinant Human Fibrinogen in the Milk of Transgenic animals, Thrombosis and Haemostasis, 78:537-542, 1997]. Es wurde gezeigt, dass Säugetiere in der Lage sind, transgenes humanes Fibrinogen mit Konzentrationen von bis zu 5,0g/l in ihrer Milch zu produzieren, was dies zu einem kommerziell brauchbaren Verfahren zur Erzeugung von humanem Fibrinogen machte [Prunkard et al., High-level expression of recombinant human Fibrinogen in the milk of transgenic mice, Nature Biotechnology, 14:867-871, 1996; Cottingham et al., Human fibrinogen from the milk of transgenic sheep. In: Tissue Sealants: Current Practice, Further Uses. Cambridge Institute, Newton Upper Falls, MA, March 30 April 2 1996 (abstract)].
Es wurden Unterschiede zwischen rekombinantem humanem Fibrinogen und Fibrinogen identifiziert, das aus menschlichem Plasma gereinigt wurde. Fibrinogen, das aus menschlichem Plasma gereinigt wurde, hat zwei alternativ gespleißte Gamma-Ketten (γ und γ'). Im Gegensatz dazu wies das rekombinante humane Fibrinogen nur dir Hauptform γ auf. Weiters differierte die Glycosylierung der Beta und gamma Ketten (es gibt keine N-gebundene Glycosylierung der alpha Kette) des rekombinanten humanen Fibrinogens etwas von der des von Plasma stammenden Fibrinogens, aber ist ähnlich der Glycosylierung die bei anderen in der Milch von tansgenen Tieren exprimierten Proteinen gefunden wurde. Zusätzlich ist das Ser3 der alpha Kette von rekombinantem humanem Fibrinogen höher phosphoryliert als das Ser3 der alpha Kette des Plasma hergeleiteten Fibrinogens, wenngleich die Differenz in der Phosphorylierung nicht zu funktionellen Differenzen führt. Es gibt auch erkennbare Differenzen in der Homogenität, die durch die C-terminale Proteolyse einer Zahl von hoch Protease sensiblen Stellen an der alpha Kette verarscht sind. Differenzen ähnlicher Größenordnung wurde auch zwischen Plasma abgeleiteten Fibrinogen unterschiedlicher Quellen gefunden.
Von Milch ist allgemein bekannt, dass sie eine Zahl von Serinproteasen enthält; von diesen ist die alkalische Protease Plasmin, die zusammen mit ihrem inaktiven Zymogen Plasminogen in der Milch vorkommt, die bekannteste zur proteolytischen Aktivität beitragende Protease. Die Plasmin(ogen)konzentration ändert sich zusammen mit dem Gesundheitszustand des Tieres, z.B. zeigen mastitische Tiere erhöhte proteolytische Aktivität. Ebenso ist die Lactationsphase auf die proteolytische Aktivität von Einfluß, d.h. eine späte Lactation ist mit höheren Konzentrationen von Plasmin verbunden [Politis und Ng Kwai Hang, Environmental Factors Affecting Plasmin Activity in Milk, Journal of Dairy Science, 72:1713-1718, 1989]. In Milch ist Plasminogen) vorwiegend mit den Kaseinmicellen verbunden, obwohl es auch in geringerem Ausmaß in Molke gefunden werden kann. [Politis et al., Distrubution of Plasminogen and Plasmin in Fractions of Bovine Milk, Journal of dairy Science, 75:1402-1410, 1992].
Plasmin ist die Serinprotease, die vorwiegend für die Auflösung von Fibringerinneln in vivo verantwortlich und dessen Anwesenheit für die Hämostase wesentlich ist. Es ist sehr wahrscheinlich, dass jedes Fibrinogenabbauprodukt in der Milch das Ergebnis der Wirkung von Milchproteasen ist. Daher kann die Gegenwart von Plasmin oder anderen Proteasen in Milch schädlich für die Qualität von Fibrinogen sein, das durch das laktierende transgene Tier erzeugt wird, soferne nicht Schritte gesetzt werden, um deren Wirkung zu verringern. Von gleicher Wichtigkeit ist die Entfernung von jeglichen Fibrinogenabbauprodukten, die das Ergebnis der Wirkung von Plasmin oder anderen Milchproteasen sind. Die Verwendung von Proteaseinhibitorern zur Minimierung von Proteolyse ist im Stand der Technik gut bekannt und erfordert üblicherweise das Zusetzen eines Cocktails von Inhibitoren unterschiedlicher Spezifität. Mit transgenen Tieren wurde die Möglichkeit der proteolytischen Schädigung bei rekombinanten Proteinen erkannt und es wurden bereits Vorschläge gemacht um den Abbau zu begrenzen (Wilkins und Velander, Isolation of Recombinant Proteins from Milk, Journal of Cellular Biochemistry, 49:33-338, 1992; Velander et al. PCT WO 95/22249). Allerdings sind zunehmend wirksame Verfahren derzeit ein Bedürfnis.
Bei der Reinigung von Proteinen aus Milch ist ein Erfordernis, das gewünschte Protein von den verunreinigenden Kaseinmicellen zu trennen. Für die Isolation von transgenen Proteinen, wie AAT, ist der erste Schritt das Ausfällen mit PEG oder einem anderen Mittel, wie Ammoniumsulfat. Die fällt AAT nicht aus, jedoch fällt Kasein aus und es ist daher ein guter Weg, Kasein von AAT zu entfernen. Wenn allerding diese Lehre auf transgenes Fibrinogen in Milch angewendet wird, hat sich gezeigt, dass nicht nur das Kasein ausfällt, sondern auch das Fibrinogen mitausgefällt wird. Dies ist klarerweise kein passender Schritt zur Entfernung von Kasein von Fibrinogen. Weiters war das Fibrinogen im Kasein/Fibrinogen-Niederschlag instabil und wurde sehr rasch proteolytisch beschädigt, u.zw. möglicherweise infolge des gemeinsamen Ausfallens mit Proteaseenzymen. Das Problem lag damit darin, wie Kasein von fibrinogenartigen Proteinen in einer Milchprobe oder einer Fraktion davon getrennt werden kann. Die Trennung von Plasminogen) von Kaseinmicellen kann durch Inkubieren mit Wirkstoffen, wie 6-Aminohexansäure (e-Aminocapronsäure, eACA). Allerdings erhöhte 6-Aminohexansäure die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin, was die Proteolyse von jedem dafür anfälligen gewünschten Protein beschleunigen kann. Weiters hilft die Trennung von Plasmin (oder Plasminogen) von den Kaseinmicellen nicht bei der Trennung der Kaseinmicellen von fibrinogenartigen Proteinen.
Demgemäß verbleibt das Bedürfnis, die gewünschten Proteine von den Kaseinmicellen zu trennen, ohne die Proteolyse des gewünschten Proteins zu beschleunigen.
Menschliches Plasmafibrinogen tritt gemäß SDS-PAGE und anderer Verfahren zur Separation von Proteinen auf Grund ihrer Größe heterogen auf. Eine Fraktion höheren Molekulargewichts (HMW Fibrinogen, Fibrinogen 1 oder F1) mit einem Molekulargewicht von 340.000 Dalton trägt zu etwa 50-70% der gesamten Fibrinogenantigene bei. Fibrinogen niedrigen Molekulargewichts (LMW Fibrinogen, Fibrinogen 2 oder F2) mit einem Molekulargewicht von etwa 300.000 Dalton trägt zu etwa 20-40% bei. Der restliche Anteil, als Fibrinogen mit niedrigem Molekulargewicht' bezeichnet (LMW' Fibrinogen, Fibrinogen 3, F3 oder Fragment X) hat ein Molekulargewicht von etwa 280.000 Dalton. Es wurde gezeigt, dass die Hauptunterschiede bei diesen Fibrinogenmolekülen von einer proteolytischen Schädigung der Carboxyterminusregion der Aα Ketten (Aα C-terminale Region) stammen, was zu unterschiedlichen Längen des Aα Ketten-C-Terminus führt. Für Fibrinogen, das aus Kryopräzipitaten durch Anwendung von Fällungstechniken hergestellt wurde, wurde gezeigt, dass es teilweise verdaute Aα Ketten besitzt [Stroetmann, U.S. Patent 4,427,650]. Obwohl ursprünglich gedacht wurde, dass Plasmin oder plasminartige Enzyme für den Abbau von F1 Fibrinogen zu F2 und F3 Subfamilien verantwortlich sind [Lipinska et al., Fibrinogen Heterogeneity in Human Plasma: Electrophoretic demonstration and Characterization of two major fibrinogen components, Journal of Laboratory & Clinical Chemistry, 84:509-516, 1974], ist erkennbar, dass Plasmin selbst möglicherweise nicht für die direkte Proteolyse von F1 zu F2 Fibrinogen verantwortlich ist [Dempfle et al., Fibrinogen Heterogeneity in Homozygous Plasminogen Deficiency Type 1: Further evidence that plasmin is not involved in Formation of LMW and LMW'-Fibrinogen, Thrombosis and Haemostatis, 77:879-883, 1997]. Es wurde vorgeschlagen, dass F2 Fibrinogen eigentlich eine Gruppe von Abbauprodukten sind, die durch verschiedene Enzyme, einschließlich Matrixmetalloproteasen erzeugt werden [Nakashima et al., Human Fibrinogen Heterogeneity: the COOH-terminal residues of defective Aα chains of fibrinogen II, Blood Coagulation and Fibrinolysis, 3:361-370, 1992]. Von rekombinantem Fibrinogen, das in CHO-Zellen exprimiert wurde, wurde gezeigt, dass es heterogen ist und F1 Fibrinogen und kleinere F2-artige Subfraktion, der die C-terminale Region der Aα Kette fehlt enthält, und dass das rekombinante Fibrinogen ebenfalls für Proteolyse anfällig ist [Gorkun et al., The conversion of fibrinogen to fibrin: Recombinant fibrinogen typifies plasma fibrinogen, Blood 89:4407-4414]. In ähnlicher Weise wurde gezeigt, dass rekombinantes humanes in Hefe erzeugtes Fibrinogen F2-ähnliche Fraktionen besitzt, die teilweise abgebaute Aα Ketten aufweisen [Roy et al., Secretion of Biologically Active Fibrinogen by Yeast, Journal of Biological Chemistry, 270:23761-23767, 1995], wobei gezeigt wurde, dass die Aα Kettenschädigung für eine Reihe von Expressionwirten erwartet werden kann. Ebenso wie die bedeutenderen F2 und F3 Fragmente gibt es eine Reihe kleinerer aus Fibrinogen entstandener Fragmente, sogenannte Fibrinogenabbauprodukte (FDPs). F3 wird oft als FDP bezeichnet. Diese FDPs (Fragment Y, D und E) sind gut charakterisiert und können in geringen Mengen in menschlichem Plasma gefunden werden.
Unterschiede in dem Maß der Gerinnselbildung, der Struktur des endgültigen Gerinnsels und den mechanischen Eigenschaften dieses endgültigen Gerinnsels wurden von verschiedenen Forschern für jede der Hauptfibrinogenfragmente beobachtet. Auch die Gegenwart von FDPs und deren Einfluss auf den Gerinnselbildungsprozess wurde erforscht. Gorkan et al., [Role of the aC domains of fibrin in clot formation, Biochemistry 33:6986-6997, 1994] stellten fest, dass Fibrinogen F1 zu 95% klumpbar und Fibrinogen F2 zu 92% klumpbar ist. Während die gesamte Klumpbarkeit zwischen diesen beiden Fraktionen ähnlich erscheint, wurde ein deutlicher Unterschied in der Gerinnungszeit, d.h. Beginn der sichtbaren Gerinnselbildung als Folge der Thrombinwirkung, bei F2 Fibrinogen beobachtet, welches eine höhere Verzögerungszeit vor der Gerinnselbildung zeigt. Dies wurde auch früher beobachtet (z.B. Holm et al., 1985 Purification and Characterization of 3 Fibrinogens with different molecular weights obtained from Normal Human Plasma, Thrombosis & Haemostasis, 37:165-176), wobei für F1 Fibrinogen eine Gerinnungszeit von 14 sec. im Vergleich zu 20 sec. für F2 und 25 sec. für F3 beobachtet wurden. Belege deuten darauf hin, dass das Ausmaß an Proteolyse des Aα C-Terminus die Fibrinpolymerisation beeinflusst. Die 3-dimensionale Struktur des Gerinnsels wird auch durch den Grad des Abbaues der aC Regionen des Fibrinogens beeinflusst. Aus F2 und F3 Fibrinogen gebildete Gerinnsel zeigen einen niedrigeren Grad an Protofibrillenverzweigung mit erhöhter Pororsität. Es wurde postuliert, dass teilweise abgebaute Fibrinogene anfälliger sind für seitliche Aneinanderlagerung von Protofibrillen. Dies führt zur Ausbildung dickerer Fasern was zu gröberen Gerinnseln führt, wie dies durch Lichtstreuexperimente beobachtet wurde. Weitere Belege für die Wichtigkeit des Aα Ketten-C-Terminus für die Gerinnselbildung kommt aus der Tatsache, dass Gerinnsel, die aus Fibrinogen Milano III, einer natürlich vorkommenden Variante mit gestutzter Aα Kette, gebildet sind, einen geringeren Grad an Protofibrillenverzeigung zeigten [Furlan et al., Binding of calcium ions and their effect on clotting of Fibrinogen Milano II, a variant with truncated Aα chains, Blood Coagulation and Fibrinolysis, 7:331-335, 1995]. Unterschiedliche mechanische Eigenschaften von Gerinnseln, die mit unterschiedlichen Fibrinogenarten gebildet sind, wurden auch beobachtet, wobei Gerinnsel, die von F2 und F3 gebildet wurden, weniger widerstandsfähig gegen mechanische Störungen erscheinen. Thromboelastographie (TEG) machte deutlich, dass aus F1 hergestellte Gerinnsel mehr elastisch sind als Gerinnsel, die aus F2 Fibrinogen hergestellt sind [Hasegawa und Sasaki, Location of the binding site „b" for lateral polymerisation of fibrin, Thrombosis Research, 57:183-195, 1990]. Elastizität ist eine bevorzugte Eigenschaft für Fibrin-Dichtmittel, deren Verwendung die Anwendung in der Gelenks oder Sehnen Chirurgie einschließt.
Die C-terminale Region der Aα-Kette dient auch anderen Zwecken, die sich von der Gerinnselbildung unterscheiden. Sie enthalten Vernetzungsstellen für die Transglutaminase, Faktor XIIIa, wo FXIIIa die Bildung von Isopeptid-Bindungen zwischen benachbarten Fibrinogen Molekülen katalysiert, wodurch Stärke und Stabilität den Gerinnseln verliehen wird. Die Vernetzung erhöht auch die Widerstandsfähigkeit der Gerinnsel gegenüber Proteolyse und ist für die Lokalisierung anderer in den Gerinnungsprozess involvierter Moleküle an der Oberfläche der Gerinnsel verantwortlich, vor allem von a2-Antiplasmin, welches kovalent in die Aα-Ketten durch Faktor XIIIa vernetzt wird, und weiters die Stabilität des Gerinnsels gegen proteolytischen Abbau verstärkt [Rudchenko et al., Comparative, Structural and Funktional Features of the Human aC domain and the Isolated aC Fragement, Journal of Biological Chemistry, 271:2523-2530, 1996]. Fibronectin, Thrombospondin und von Willibrands Faktor sind ebenso in dieser Region vernetzt. Die aC Regionen sind auch wesentlich für die Verstärkung der Aktivierung von Plasminogen durch tPA an der Gerinnseloberfläche und führt dadurch zur einer wirkungsvollen Fibrinolyse [Matsuka et al., Factor XIIIa catalysed crosslinking of Recombinant aC Fragments of Human Fibrinogen, Biochemistry, 35:5810-5816, 1996]. Es wurde auch postuliert, dass der Aα C Terminus von Fibrinogen spezielle Erkennungsstellen für Plättchenrezeptoren enthalten, welche in den Resten Aα572 bis Aα574 lokalisiert sind [Hawiger, Adhesive ends of fibrinogen and its adhesive peptides: The end of a saga, Seminars in Haemotology, 32:99-109, 1995]. Plättchenaggregation ist für Hämostase wesentlich und deshalb kann erwartet werden, dass Fibrinogen-Moleküle, die abgebaute Aα-Ketten enthalten, weniger imstande sind, Plättchen zu aggregieren.
Die Wichtigkeit der Aα C-terminalen Regionen auf die Fibrinogen-Eigenschaften haben die Entwicklung von Techniken inspiriert, durch welche Fibrinogen-Moleküle, die unterschiedliche Grade der Aα-Ketten Proteolyse aufweisen, für eine Studie separiert werden können. Es wurden verschiedene Verfahren der Separation der Hauptfibrinogen-Subfamilien und FDPs beschrieben. Zum Beispiel wurden Ausfällungstechniken verwendet, um F1 und F2 von gereinigten Fibrinogen zu trennen [Sasaki und Kito, Simplified determination of fibrinogen subfractions by glycine precipitation, Thrombosis and Haemostasis 42:440-443, 1979]. Holm et al., haben ein Verfahren zur Trennung von gereinigten Plasma-Fibrinogen in F1, F2 und F3 Subfamilien, durch Verwendung einer Reihe von Ausfüllungen mit Ammonsulfat beschrieben. F3, Fragmente Y, D und E wurden aufgrund ihrer Größe getrennt unter Verwendung einer Größenausschlusschromatographie [Morder und Raphael Shulman, High molecular weight derivatives of human fibrinogen produced by plasmin, Journal of Biological Chemistry, 244:2120-2124, 1969]. Diese Autoren haben auch gezeigt, dass F3 Fibrinogen und FDPs Y, D und E tatsächlich antikoagulierende Aktivität besitzen und der Gerinnselbildung hinderlich sind; ein unerwünschtes Merkmal eines Moleküls, das zur Herstellung eines chirurgischen Klebers verwendet wird. Hauptaufinerksamkeit wurde den Endabbauprodukten D und E zugewandt, welche unter Verwendung einer Anion Austauschchromatographie getrennt wurden [Kemp et al., Plasmic degradation of fibrinogen: the preparation of a low molecular weight derivative of fragment D, Thrombosis und Haemostasis, 3:553-564, 1973], Kationenaustauschchromatographie [Rutjven Vermeer et al., A novel method for the purification of rat and human fibrinogen) degradation products, Hoppe-Seyler's Z. Physiological Chemistry, 360:633-637] Lysin-Sepharose-Chromatographie [Rupp et al., Fractionation of plasmic fibrinogen digest on Lysine agarose. Isolation of two fragments D, fragment E and simultaneous removal of plasmin, Thrombosis Research, 27:117-121, 1982] und Zinkchelat-Affinitätschromatographie [Structural features of fibrinogen associated with binding to chelated zinc, Scully and Kakkar, Biochim et. Biophys. Acta., 700:130-133, 1982]. In keinem der oben genannten Verfahren wurde eine gleichzeitige Trennung von Fibrinogen in die Subfraktionen F1, F2 und F3 und FDPs Y, D und E unter Verwendung einer einzigen Technologie beschrieben.
Wie oben bereits einführend angegeben, ist Plasmin die Serinprotease, die hauptsächlich für die Auflösung von Fibringerinnsel in vivo verantwortlich ist und deren Gegenwart für Hämostase wesentlich ist. Allerdings, wie bereits vorstehend erörtert, ist es sehr wahrscheinlich, dass jedes Fibrinogen-Abbauprodukt in Milch ein Produkt der Wirkung von Milchproteasen ist, während die Teilnahme von Plasmin am α-Ketten Abbau von F1 zu F2 und F3 noch in Diskussion steht. Deshalb kann die Gegenwart von Plasmin und anderen Proteasen in Milch der Qualität von Fibrin schädlich sein, die durch das laktierende transgene Tier gebildet ist, wenn nicht Schritte gesetzt werden, um deren Effekt zu minimieren. Von gleicher Wichtigkeit ist die Entfernung von jeglichen Fibrinogen Abbauprodukten, die von der Wirkung von Plasmin oder anderen Milchproteasen herrühren. Die Verwendung von Proteasen Inhibitoren zur Minimierung der Proteolyse ist im Stand der Technik gut bekannt und üblicherweise involviert dies den Zusatz eines Cocktails von Inhibitoren unterschiedlicher Spezifität.
Aus der vorstehenden Diskussion ist klar, dass der Einbau von Fibrinogen Abbauprodukten (F3 Fibrinogen, Fragmenten Y, D und E) und sogar F2 Fibrinogen in Zubereitungen, deren Endzweck entweder als Hämostase oder Abdichtwirkstoff ist, nicht wünschenswert ist. Techniken, die in die Reinigung von Fibrinogen aus Milch von transgenen Tieren einbezogen werden können, und welche Fibrinogen Abbauprodukte reduzieren und ermöglichen, dass Fibrinogen mit einer definierten Aα-Kette Integrität für verschiedenste Anwendungen hergestellt werden können, würden von erheblichen Nutzen sein.
Die Erfindung stellt ein leistungsfähiges und wirkungsvolles Verfahren zur Verfügung durch welches ein Protein, das in der Milch von transgenen Tieren gebildet wird, gewonnen und gereinigt wird.
Die Patentanmeldung beschreibt Techniken, durch welche Teilreinigungen von Fibrinogen ausgeführt werden können. Es werden Ausfällungstechniken verwendet, welche chemische Wirkstoffe einschließen, die in der Lage sind, die Interaktionen zwischen Protease-Enzymen und Kasein zu unterbrechen. Unter Verwendung dieser Techniken ist es möglich, Fibrinogen-Produkte von der zerstörenden Protease-Aktivität in den frühen Stufen des Verfahrens zu trennen und darauffolgend die Protease-Aktivität zu entfernen. Ausfällen wird in einer solchen Weise ausgeführt, dass die Gewinnung von im wesentlichen gereinigtem (bis zu 85 %) Produkt mit sehr geringer verbleibender Protease-Aktivität zu erreichen. Die Abwesenheit von Protease-Enzymen macht das Fibrinogen stabiler während der weiteren Behandlung, was eine Verbesserung der Produktausbeute und den Verzicht auf die Notwendigkeit für aufwändige Kühlausrüstungen oder toxische Protease-Inhiboren, die dann entfernt werden müssen, ergibt.
Die Patentanmeldung beschreibt chromatographische Techniken zur Reinigung von Proteinen, insbesondere von Fibrinogen aus Milch, und zur Entfernung von Fibrinogen Abbauprodukten (Fragmente X, Y, D, E und C-terminale A-Ketten Fragmente). Durch die Verwendung dieser Techniken ist es möglich, Fibrinogen bis zu letztlich 99 %-iger Reinheit zu reinigen. Die Verwendung dieser Techniken erlaubt es auch, Fibrinogen-Moleküle in einem Produkt im Hinblick auf die Unversehrtheit der A-Kette auszuwählen. So wurde es möglich, ein Fibrinogen Produkt auszuwählen, welches zu einem 100 %-igen F1 Fibrinogen aus einem 80 % F1 Fibrinogen oder jeglicher niedriger Konzentration von F1 zusammenzustellen. Da F1 Fibrinogen überlegende funktionelle Charakteristika im Hinblick auf die Gerinnselelastizität, die Starrheit und Stabilität, die Möglichkeit zu bestimmen und damit den F1-Gehalt auszuwählen, ermöglicht dies eine Reihe von Fibrinogen Produkten für verschiedene Zwecke herzustellen. Die Entfernung der Abbauprodukte ermöglicht auch ein überlegenes Fibrinogen-Dichtmittel in gesteuerter und reproduzierbare Weise zu erzielen.
Entsprechend einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für eine Teil-Reinigung des gewünschten Proteins aus Milch vorgesehen, wobei das Verfahren die Übertragung von Protease-Enzym welches in der Milch vorhanden ist, in die Molkephase mit der Entfernung oder der Abtrennung, des gewünschten Proteins in eine andere Phase der Milch aufweist.
Die gewünschten Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung sind alle jene, die in Milch hergestellt werden können, einschließlich natürlich hergestellte Milchproteine und transgene Proteine. Bevorzugte Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung sind solche, die fibrinogenartige Merkmale besitzen, welche zur gleichzeitigen Ausfällung mit Kasein in der Gegenwart von PEG oder Ammoniumsulfat führen. Zu solchen Proteinen zählen ohne darauf beschränkt zu sein; Fibrinogen, Kollagen, Fibronektin, Faktor VIII und Alpha-2-Makroglobulin.
Die vorliegende Erfindung steht vorzugsweise in Verbindung mit der Isolierung von transgenen Proteinen aus Milch, das sind Proteine, die als Ergebnis einer transgenen Behandlung eines Tieres erzeugt werden. Dies erlaubt dem entsprechend die Isolation von Proteinen wie Fibrinogen, Kollagen, Fibronektin, Faktor VIII und Alpha-2-Makroglobulin aus tierischer Milch, die üblicherweise solche Proteine nicht enthält. Die gegenwärtige Erfindung ist für die Herstellung und Isolation von verschiedenen Proteinen per se nützlich oder von Proteinen, welche in einer Weise verändert wurden, um eine transgene Expression zu ermöglichen, wie z.B. durch Fusion an andere Proteine.
Im vorliegenden Text bedeutet der Begriff „Teilreinigung", die Reinigung auf ein Niveau von etwa 50 % frei von anderen Verunreinigungen, bevorzugt 60, 70, 80, 90 % frei von anderen Verunreinigungen. Bevorzugt liegt die Wiedergewinnungsrate in einem Bereich zwischen 50 % bis etwa 80 % mehr bevorzugt im Bereich zwischen 65 % bis 85 %.
Die vorliegende Erfindung steht auch mit der Isolation von Fibrinogen in Verbindung insbesondere von transgenem Fibrinogen aus Milch, d.h. Fibrinogen, das als Ergebnis einer transgenen Behandlung eines Tieres erzeugt wurde. Dies erlaubt dementsprechend die Isolation von Fibrinogenen aus tierischer Milch, welche Milch normalerweise solche Proteine nicht enthält. Die vorliegende Erfindung ist nützlich für die Herstellung und Isolation von Fibrinogen Protein als solchem, oder Fibrinogen, das in irgendeiner Weise verändert wurde, um die transgene Expression zu ermöglichen, wie durch Fusion an ein anderes Protein.
Wenn das gewünschte Protein Fibrinogen ist, kann an das Verfahren für die Teilreinigung desselben gegebenenfalls ein Verfahren anschließen, welches folgende Schritte aufweist:

(a) Kontaktieren des teil-gereinigten Fibrinogens mit einem hydrophoben Wechselwirkungschromatographie-Harz unter Bedingungen, bei welchen das Fibrinogen an das Harz bindet; und
(b) Entfernung des gebundenen Proteins mittels Elution.

Bevorzugt liegt das teilgereinigte-Fibrinogen, gegebenenfalls durch die zuvor beschriebenen Schritte a) und b) weiter gereinigt, in flüssiger Form vor, und zwar entweder als direktes Ergebnis des ersten Teiles des Verfahrens oder anderweitig.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Fibrinogen" auf das Hauptstruktur-Protein, das für die Bildung von Gerinnsel verantwortlich ist und enthält sowohl die gesamte Glycoproteinform des Fibrinogens als auch andere zugehörige Fibrinogen-Spezien, einschließlich gekürztes Fibrinogen, Aminosäuresequenz-Varianten (Muteine oder polymorphe Varianten) von Fibrinogen, eine Fibrinogen-Spezies, welche zusätzliche Reste aufweist und jede natürlich vorkommende Variante davon. Die gleichen Variationen, die in Bezug auf Fibrinogen beschrieben sind, sind auch auf die anderen fibrinogenartigen Proteine anzuwenden, welche aus Milch entsprechend der vorliegenden Erfindung isoliert werden können.
Wie hier verwendet, ist unter „Milch" die Flüssigkeit zu verstehen, die von den Brustdrüsen von Tieren abgesondert wird. Milch entsprechend der vorliegenden Erfindung schließt Vollmilch, entrahmte Milch, Milchfraktionen und Kolostral Milch. Es schließt auch ein Milch abgeleitetes Fluid ein, wo das gewünschte Protein insbesondere Fibrinogen, das ursprünglich in der Milch produziert wurde, enthalten ist.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Teilreinigung des gewünschten Proteins durch Übertragung von in der Milch gegenwertigen Protease-Enzymen weg von der Phase in welcher das gewünschte Protein erhalten wird. Das Protease-Enzym wird in die Molkephase übertragen (Molkephase ist jene Phase/Portion/Fraktion von Milch, welche vorwiegend nicht-Kasein Proteine enthält), mit der Entfernung oder Teilung des gewünschten Proteins in eine andere Phase der Milch. Die Entfernung oder Teilung des gewünschten Proteins kann gleichzeitig mit der Übertragung der Protease-Enzyme in die Molkephase erfolgen. Alternativ dazu ist es möglich, einen zwei-stufigen Prozess auszuführen, bei welchen das Protease-Enzym zuerst unter Bedingungen in die Molke übergeführt werden, welche protelytische Schädigungen des gewünschten Proteins verlangsamen, welcher Schritt durch die Entfernung oder Abtrennung des gewünschten Proteins gefolgt wird. Solche Bedingungen können durch die Verwendung von Protease-Inhibitoren oder niedriger Temperatur geschaffen werden. Die Übertragung der Protease-Enzyme in die Molkephase bezieht sich hauptsächlich auf die Übertragung von Plasmin und/oder Plasminogen. Andere Milchproteasen, wie beispielsweise Serin-Proteasen (alkalisch oder sauer) können ebenfalls übertragen werden.
Das gewünschte Protein wird aus der Milch durch Verwendung von Ausfällungstechniken, wie sie im Stand der Technik gut bekannt sind, gewonnen, wie beispielsweise durch die Verwendung von protein-ausfällenden Wirkstoffen einschließlich, aber nicht ausschließlich, PEG, Natriumsulfat, Ammoniumsulfat, Glycin oder Temperatur. Die Ausfällung wird bevorzugt mit generell niedrigen Konzentrationen des chemischen Ausfällungswirkstoffes ausgeführt (z.B. 5-20 Gew.-/Vol.-% Natrium und Ammoniumsulfat, 5-20 Gew.-/Vol.-% Glycin oder β-Alanin; 2-15 % PEG) ausgeführt, zumal dieses die co-Ausfällung von Molkeproteinen reduziert.
Die Übertragung des Protease-Enzyms in die Molkephase der Milch wird bevorzugt in Gegenwart von Lysin oder Lysin-Analoga wie e-Amincapronsäure oder anderer basischer Aminosäuren wie Asparagin oder Histidin ausgeführt. Die Konzentration von Lysin oder einem Lysin-Analoga entsprechend der vorliegenden Erfindung hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, wie beispielsweise der Milchart aus welcher das gewünschte Protein zu reinigen ist, die Menge des gewünschten, vorhandenen Proteins und Art der Entfernung oder Abtrennung des gewünschten Proteins aus der Molkephase der Milch. Die Konzentrationen betragen üblicherweise zwischen 1mM-2M, bevorzugt 10-200mM.
Das Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung wird am meisten bevorzugt, wenigstens einmal bis etwa viermal wiederholt. Die Wiederholung kann die Reinheit des gewünschten Produktes insbesondere im Hinblick auf die verunreinigenden Mizellen stark erhöhen.
Das Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung steigert die Stabilität des teilgereinigten gewünschten Proteins in Bezug auf Proteolyse, insbesondere wenn das gewünschte Protein ein transgenes Protein ist.
In einem fakultativen zweiten Schritt des ersten Aspekts der Erfindung wird, wenn das gewünschte Protein Fibrinogen ist, wird ein hydrophobes Wechselwirkungschromatographie-Harz für Interaktion verwendet.
Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC) Harze sind im Stand der Technik bekannt und umfassen Harze wie Butyl-Sepharose^TM (Amersham Pharmacia Biotechnology), Phenyl-Sepharose (niedrig und hoch substituiert), Octyl-Sepharose und Alkyl-Sepharose (alle Amersham Pharmacia Biotechnolgy; andere Quellen von HICs schließen Biosepra, Frankreich E. Merck, Deutschland; BioRad USA ein).
Die Bedingungen unter welchen das Fibrinogen mit dem hydrophoben Wechselwirkungschromatographie-Harz in Kontakt gebracht wird, um Fibrinogen die Bindung an das Harz zu ermöglichen, schließen die Gegenwart von jedem „strukturformenden" Salz (Lösung) ein, wie z.B. Ammoniumsulfat, Natriumsulfat, und andere Salze wie sie beschrieben sind in: Melander und Horuath, Salt Effects on Hydrophobic Interactions in Precipitation and Chromatography: An Interpretation of the Lyotropic Series, Archives of Biochemistry and Biophysics, 183:200-215, 1977 and Srinivason and Ruckenstein, Role of Physical Forces in Hydrophobic Interaction Chromatography, Separation and Purification Methods, 9:267-370, 1980. Die Entfernung des gebundenen Proteins wird mittels Standard-Elutionstechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, vorgenommen. Ein solche Elution kann durch Verringern der Konzentration des strukturbildenden Salzes ausgeführt werden, wie z.B. durch abnehmende Ammoniumsulfat Konzentration in dem Elutions-Puffer. Die Elution kann durch eine Gradientenelution oder bevorzugter durch eine Serie von Schritten erfolgen, um das Fibrinogen, das aus der Säule in Form ihrer Sub-Fraktions Verhältnisse und damit ihrer Aα-Ketten Integrität eluiert wird, voraus zu bestimmen und somit zu definieren.
Der fakultative Verfahrensschritt des ersten Aspekts der Erfindung umfasst einen Schritt des Waschens des Harzes zwischen Schritt (a) und (b), um ungebundene Komponenten zu entfernen. Das Waschen des Harzes wird üblicherweise mit einem Waschpuffer ausgeführt, welcher die gleiche Salzkonzentration aufweist, die für die Beladung verwendet wurde. Eine höhere Konzentration an Salz im Waschpuffer ist möglich aber nicht bevorzugt.
Wenn der fakultative zweite Verfahrensschritt des ersten Aspekts der Erfindung verwendet wird, wird somit eines der folgenden erzielt:

(a) Ansteigen der Reinheit des Fibrinogen
(b) Auflösen des Fibrinogens in seine Fraktionen
(c) Ermöglichen der Isolation von Fibrinogen Aα-Kette mit höherer Unversehrtheit.

Da die gegenwärtige Erfindung vom Vorteil einer genetischen Manipulation von Tieren zur Erzeugung eines Proteins aus transgenen Quellen („transgenes Fibrinogen") Gebrauch macht, kann die Quelle des Fibrinogens sorgfältig ausgewählt sein. Bevorzugt ist das Fibrinogen von Menschen, von Rindern oder vom Schaf abgeleitet (d.h., es entspricht im Wesentlichen einem Fibrinogen von Menschen, Rind oder Schaf). Für medizinische Zwecke ist es bevorzugt, für den vorgesehenen Patienten native Proteine zu verwenden. Deshalb ist menschliches transgenes Fibrinogen bevorzugt. Wo das Fibrinogen rekombinant kodiert ist, so dass das Fibrinogen einer Spezies, die von der Spezies in welches es exprimiert ist, verschieden ist, kann das Glykosylierungsmuster unterschiedlich zum Glykosylierungsmuster des natürlich auftretenden Fibrinogens sein. Ein transgenes Tier, das in der biologischen Taxonometrie der Quelle des transgenen Fibrinogens ähnlicher ist, kann daher bevorzugt sein.
Natürlich kann jedes Tier, das Milch produziert, und Tiere die genetisch verändert werden können, um transgenes Fibrinogen in ihrer Milch zu bilden, bevorzugt sein. Diesbezüglich zählen zu Tieren, die laktieren und passende Milch produzieren, Schaf, Kuh, Ziege, Kaninchen, Wasserbüffel, Schweine oder Pferde. Transgene Tiere für die Produktion von transgenem Protein gemäß der vorliegenden Erfindung schließen transgene Menschen nicht ein.
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein Verfahren für die Teilreinigung eines gewünschten Proteins aus Milch vor, wobei das Verfahren die Ausfällung des gewünschten Proteins in der Gegenwart von Lysin oder einem Lysin-Analogon vorsieht. Wenn das gewünschte Protein Fibrinogen ist, schließt an das Verfahren gegebenenfalls ein Verfahrensschritt an welcher umfasst:

(a) Kontaktieren des teilgereinigten Fibrinogens mit einem hydrophoben Wechselwirkungschromatographie Harz unter Bedingungen in welchen das Fibrinogen an das Harz bindet; und
(b) Entfernen des gebundenen Proteins mittels Elution.

Ein verwandter zweiter Aspekt der Erfindung sieht die Verwendung von Lysin oder einem Lysin-Analogon bei der Reinigung eines gewünschten Proteins aus Milch (vorzugsweise transgenes Protein) vor. Die Verwendung von Lysin oder Lysin-Analogon in diesem Aspekt der Erfindung wird bevorzugt in Verbindung mit der Ausfällung des gewünschten Proteins ausgeführt.
Die Beschreibung und die Details im Hinblick auf den ersten Aspekt der Erfindung treffen auch auf den zweiten Aspekt zu.
Die vorliegende Erfindung sieht auch ein nützliches Verfahren vor, bei welchem Fibrinogen aus einem Fluid gewonnen wird.
Ein dritter Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein Verfahren zur Gewinnung von Fibrinogen aus einem Fluid vor, wobei das Verfahren aufweist:

(a) Kontaktieren des Fluids mit einen hydrophoben Wechselwirkungschromatographie-Harz unter Bedingungen, bei welchen Fibrinogen an das Harz bindet; und
(b) Entfernen des gebundenen Proteins mittels Elution.

Das Fibrinogen enthaltende Fluid kann jegliches sein. Insbesondere ist es eines oder mehrere von tierischen Körperflüssigkeiten wie Milch, Blutplasma oder Urin. D.h, dass insbesondere das Fibrinogen enthaltende Fluid ein Fluid ist, das eine Körperflüssigkeit eines Tieres (eine solche wie oben beschrieben ist) oder aus dieser abgeleitet ist und/oder ein Fluid welches verwendet wurde, um das Fibrinogen zu solvatisieren, beispielsweise im Anschluss an einen vorhergehenden Verfahrensschritt wie die Teilreinigung durch Ausfällung.
Jegliche Körperflüssigkeit kann gemäß einigen der Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bevorzugte Körperflüssigkeiten betreffen Milch, Blutplasma oder Urin. Natürlich, kann die natürliche Produktion von Fibrinogen in einigen Körperflüssigkeiten wie z.B. Plasma eine tierische Körperflüssigkeit vorsehen, aus welcher natürlich auftretendes Fibrinogen isoliert werden kann. Die vorliegende Erfindung ist bevorzugt natürlich in Bezug auf die Isolation von transgenen Fibrinogen als Resultat einer transgenen Behandlung eines Tieres zu sehen. Dies erlaubt dementsprechend die Isolation von Fibrinogen aus tierischen Körperflüssigkeiten, die nicht natürlicherweise Fibrinogen enthalten, wie Milch und Urin. Die vorliegende Erfindung ist für die Produktion von Fibrinogen als solches oder von Fibrinogen nützlich, welches auf gewisse Weise verändert wurde, um die transgene Expression zu erleichtern, wie z.B. durch Fusion an andere Proteine.
Der Begriff „Blutplasma" umfasst Vollblutplasma und jede Fraktion davon. Der Begriff „Urin" betrifft ebenfalls den gesamten Urin oder Fraktionen davon insbesondere konzentrierten Urin.
Bevorzugter Weise ist das Fluid Milch oder ein Milch abgeleitetes Produkt. In solchen Situationen (wenn das Fluid Milch oder von der Milch abgeleitetet ist) kann dem Verfahren gemäß dem dritten Aspekt der Erfindung gegebenenfalls ein Verfahrensschritt vorangehen, welcher die Teilreinigung von Fibrinogen aus Milch umfasst, wobei das Verfahren den Transfer von Protease-Enzym, welches in der Milch vorhanden ist, in die Molkephase mit der Entfernung oder Abtrennung des Fibrinogens in eine andere Phase der Milch aufweist.
Der gegebenenfalls vorhergehende Verfahrensschritt reinigt das Fibrinogen aus der Milch zumindest teilweise, was eine bessere Reinigung und/oder Abtrennung von Fibrinogen mittels des HIC Verfahrensschrittes ermöglicht.
Natürlicherweise kann jedes Tier, das eine Körperflüssigkeit produziert, die entsprechend dem dritten Aspekt der Erfindung verwendet werden, kann ins Auge gefasst werden. Bevorzugt werden Tiere, welche genetisch verändert werden können, um transgenes Fibrinogen in ihrer Milch zu bilden. Diesbezüglich zählen zu den Tieren die laktieren und passende Milch produzieren Schafe, Ziegen, Kühe, Kamele, Kaninchen, Wasserbüffel, Schweine oder Pferde. Diese Tiere sind auch nützlich für die Herstellung von anderen Körperflüssigkeiten gemäß der Erfindung. Transgene Tiere zur Produktion von transgenen Protein gemäß der vorliegenden Erfindung schließen transgene Menschen nicht ein.
Um ein maximales Ergebnis aus dem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung zu erreichen, kann es bevorzugt sein, das Fibrinogen aus der Tierkörperflüssigkeit zumindest teilweise zu reinigen. Eine solche Reinigung wird von der Körperflüssigkeit, aus welcher das Fibrinogen abgeleitet wird und der Art der vorhandenen potentiellen Verunreinigungen abhängen. Das Fibrinogen wird bevorzugt auf ein Niveau von 20 bis 40 % gereinigt bevor es dem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung unterzogen wird. Jedes Vorreinigungsverfahren kann verwendet werden, z.B. jene, die aus dem Stand der Technik bekannt sind z.B. Ausfällung von Fibrinogen wie es in PCT WO 95/22249 beschrieben ist. Die Tatsache, dass Fibrinogen bereits teilgereinigt sein kann, bevor der erste Aspekt der Erfindung angewendet wird, führt nicht von der Tatsache weg, dass Fibrinogen schon ursprünglich in Körperflüssigkeiten eines Tieres erzeugt wurde.
Alle Beschreibungen und Details im Bezug auf die Merkmale des ersten und zweiten Aspekts der Erfindung treffen auch auf den dritten Aspekt zu. Die Details für den fakultativen HIC Schritt im ersten und zweiten Aspekt treffen auf den HIC Schritt im dritten Aspekt zu.
In Übereinstimmung mit dem dritten Aspekt der Erfindung sieht ein verwandter dritter Aspekt die Verwendung von HIC in einem oder in mehreren der folgenden vor:

(a) Erhöhung der Reinigung von Fibrinogen,
(b) Auflösen von Fibrinogen in seine Fraktionen
(c) Auswählen von Fibrinogen mit hoher Integrität von Aα-Ketten des Fibrinogens in einer Flüssigkeit, vorzugsweise in einer Körperflüssigkeit eines Tieres.

Die Verwendung von HIC in dem sechsten Aspekt der Erfindung liegt bevorzugt in Verbindung mit einer Salzlösung, wie sie gemäß dem ersten Aspekt der Erfindung beschrieben ist, vor. Zugehörige bevorzugte Merkmale von Aspekt eins und zwei treffen auch auf den Aspekt drei zu. Die Verwendung von HIC in allen zugehörigen Aspekten der Erfindung schließt ein chargenweises Format oder ein Säulenformat ein. Im chargenweisen Format wird die Flüssigkeit mit dem HIC Harz in einem gut gerührten Tank in Verbindung gebracht. Die Trennung des HIC Harzes von der Flüssigkeit kann dann durch Sedimentation oder Zentrifugation unterstützt erleichtert werden. Im Säulenformat, welches bevorzugt ist, wird die Flüssigkeit durch eine Säule gepumpt, in welche HIC Harz bereits eingefügt ist. Säulenformate werden bevorzugt, da sie zu einer größeren Absorbtionseffizienz führen. Das Säulenformat wird dabei entweder als „Füllkörper"- oder „Festbett"-Format angesehen. Weiters können auch „expandiertes Bett" oder „fluidisiertes Bett" Kontaktoren angewendet werden.
Ein vierter Aspekt der Erfindung sieht ein Verfahren zur Gewinnung von Fibrinogen aus einem Fluid vor, wobei das Verfahren aufweist:

(a) Kontaktieren des Fluids mit einem hydrophoben Wechselwirkungschromatographie Harz unter Bedingungen, bei welchen Fibrinogen an das Harz bindet; und
(b) Entfernen des gebundenen Proteins mittels Elution.

Wenn das Fluid Milch oder ein von Milch abgeleitetes (bevorzugt) Fluid ist, dann wird dem Verfahren gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung gegebenenfalls ein Verfahrensschritt vorangesetzt, welcher die Teilreinigung von Fibrinogen aus Milch aufweist, wobei das Verfahren die Ausfällung des gewünschten Proteins in der Gegenwart von Lysin oder einem Lysin Analogon enthält.
Alle Beschreibungen und Details der Merkmale der Aspekte 1 bis 3 sind auch auf den vierten Aspekt anzuwenden.
Die Milch aus welcher Fibrinogen teilzureinigen ist, wird bevorzugt aus Tieren abgeleitet, die in Farmen gehalten werden können, um genügende Mengen an Milch zu erzeugen, aus welcher das pharmazeutische Protein zu gewinnen ist, und schließen Schafe, Kühe, Ziegen, Kaninchen, Kamele, Wasserbüffel, Schweine oder Pferde ein. Solche Tiere können natürlich transgenisch modifizierte Tiere sein. Bevorzugt, jedoch nicht ausschließlich, ist das transgene Protein von Rindern oder Menschen abgeleitet. Von Menschen abgeleitete Proteine sind solche, die, wenn sie aus Milch eines transgenen Tieres für pharmazeutische Zwecke isoliert und gereinigt sind, weniger wahrscheinlich sind, unerwünschte immunologische Reaktionen auszulösen, wenn sie an einem Menschen, der aus medizinischen Gründen Bedarf daran hat, verabreicht werden. Die vorliegende Erfindung bezieht sich nicht auf transgenmodifizierte Menschen.
Das Plasminogen-Aktivierungssystem in Milch war für eine Anzahl von Jahren im Brennpunkt des Interesses. Es ist allgemein anerkannt, dass Milch die primären Enzyme enthält, die für Fibrinolyse in vivo verantwortlich sind, z.B. Plasminogen-Aktivator (sowohl Gewebstyp, tPA als auch Urokinase Typ, uPA], Plasminogen und Plasmin. Die Wirkung der Proteolyse wurde oft während der Lagerung von Milch oder Milchprodukten beobachtet, wo es schien, dass Kasein jenes Milchprotein ist, das am meisten für Abbau empfänglich ist. Es war bald gezeigt, dass in Milch Plasminogen-Aktivatoren, Plasminogen und Plasmin hauptsächlich mit dem Kasein-Micellen in Verbindung standen und nicht in der Molke-(oder Serum) Phase derselben. Der Mechanismus durch welchen die Moleküle mit Kasein in Verbindung stehen, konnte nicht kategorisch bestimmt werden, aber es ist wahrscheinlich, dass im Hinblick darauf, dass diese Moleküle Kringle-Domänen (strukturierte Polypeptidketten mit einer Affinität für basische Aminosäuren) enthalten, diese Proteine möglicherweise die Interaktion mit Kasein vermitteln. Heegaard et al., 1997 [Plasminogen Aktivation System in Human Milk, Journal of Paediatric Gastroenterology and Nutrition, 25:159-166] zeigten, dass Kasein, das an Sepharose immobilisiert, ist in der Lage ist, tPA zu binden und wenn Kasein gegenwärtig ist, wird die tPA katalysierte Umwandlung von Plasminogen in Plasmin beschleunigt. Dies scheint darauf hinzuweisen, dass das Nebeneinanderliegen von Kasein, Plasminogen und tPA zu einer verstärkten Plasminogen-Aktivierung führt. Der Mechanismus der verstärkten Aktivierung ist nicht klar, aber kann auf Plasminogen zurückzuführen sein, das bei der Bindung an Kasein eine Konformationsänderung erfährt, was zu einem Molekül führt, welches mit tPA leichter aktiviert wird [Markus et al., Casein, A Powerful Enhancer of the rate of Plasminogen Activation, Fibrinolysis 7:229-236]. Es ist daraus ersichtlich, dass ein Wirkstoff (wie Lysin oder Lysin Analogon), der in genügender Konzentration Milch zugesetzt wird, tPA und Plasminogen) von Kasein trennen und dieselben in die Molkephase überführen wird.
Die Folge davon ist, das aktives Plasmin und Plasminogen in der gleichen Phase wie das transgene Protein vorhanden sind. Im Falle von Fibrinogen, wie oben diskutiert, führt dies dazu, dass Proteolyse, insbesondere der Aα-Kette auftreten wird. Es ist im Stand der Technik bekannt, dass eACA relativ unwirksam beim Inhibieren der primären Fibrinolyse ist, d.h. die Fragment X (F3) Bildung aus Fibrinogen oder Fibrin, und es wurde vorausgesetzt, dass der ursprüngliche Abbau von Fibrin unabhängig von der nicht-kovalenten Plasmin-Fibrin-Interaktion auftreten kann (welche durch Binden der Kringle-Domänen am Plasminogen an basische Aminosäuren in der Fibrinogen Aα-Kette vermittelt wird), im Gegensatz zu späteren Schritten, die zur Bildung von Fragmenten Y, D und E führen. Tatsächlich wurde gezeigt, [Francis et al., Structural and Chromatographic Heterogeneity of Normal Plasma Fibrinogen associated with the Presence of three γ-chain types with Distinct Molecular Weights, Biochimica et Biophysica Acta, 744:155-164] das Aα-Ketten Proteolyse bei kommerziellen Fibrinogen Präparaten während der chromatographischen Trennung in Fibrinogen Sub-Familien fortschreitet, selbst unter Einbeziehung von 20 mM e-Aminokapronsäure und Aprotinin (einem potenten Protease Inhibitor) bei 10 Kallikrein Einheiten/ml. Es ist daher ersichtlich, dass der Zusatz von e-Aminokapronsäure während der Reinigung von menschlichem Fibrinogen aus Milch keinen Vorteil sondern negative Effekte aufweist.
Paradoxerweise haben wir gefunden, dass e-Aminokapronsäure eine wirksame Hilfe bei der Verhinderung des Abbaus von Fibrinogen während der Reinigung aus Milch ist, wenn es während der Phase eingeschlossen wird, welche das Fibrinogen aufteilt, wie beispielsweise dem Ausfällungsstadium. Die Ähnlichkeit zwischen Fibrinogen und Kasein in Bezug auf Anfälligkeit für Ausfällung; eine Technik, die der Reinigung von Fibrinogen aus Plasma und Kryopräzipitaten [z.B. Schwarz et al., US Patente 4,362,567; 4,377,572 & 4,414,976], und bei der Separation von Kasein aus Milch [Swaisgood, Developments in dairy Chemistry – 1: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY, 1982] weit verbreitet ist, führt zu der Co-Ausfällung von zumindest einem Teil der Kasein-Fraktion, wenn Fibrinogen aus Milch unter Verwendung von Ausfällungsmitteln, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, ausgefällt wird (z.B. aber nicht ausschließlich Zink, Kupfer, Natrium und Ammoniumsalze, Aminosäure (z.B. Glyzin, β-Alanin), Alkohol (z.B. Ethanol) und Polymere (z.B. Polyethylenglycol, Dextran oder Hydroxyethyl Stärken)). Selbst bei Hinzufügung dieser Ausfällungsmittel bei relativ geringen Konzentrationen (z.B. 5-20 Gew.-/Vol.-% Natrium- und Ammoniumsulfat, 5-20 Gew.-/Vol.-% Glyzin oder β-Alanin; 2-15 %PEG) die ausreichend sind, um Fibrinogen oder eine Hauptfraktion desselben auszufällen, führt auch zur Co-Ausfällung einer Fraktion der Kaseinphase einschließlich einiger Molkeproteine. Dies kann vermindert werden, wenn die Ausfällung mehr als einmal vorgenommen wird. Die Einbeziehung von e-Aminokapronsäure oder einem ähnlichen Analogon von Lysin während des Ausfällungsstadiums (bei einer Konzentration von 10-200mM) resultiert in der Dissoziation von Kringle-enthaltenden Proteinen aus Kasein und Fibrinogen und hält diese in der Lösungsphase während Fibrinogen ausgefällt wird. Das Verfahren des Schützens des Fibrinogens ist daher ein Exklusionsverfahren. Das ausgefällte Fibrinogen kann dann in einem geeigneten Puffer rekonstituiert werden und ist nicht nur deutlich weniger anfällig für Proteolyse sondern auch deutlich reiner. Eine solche Technik würde gleich gut wirken, wenn Temperaturen als Ausfällverfahren eingesetzt wird. Der zusätzliche Vorteil dieser Erfindung ist, dass die e-Aminokapronsäure das Fibrinogen nicht nur vor proteolytischem Schaden schützt, sondern es verunreinigt auch das ausgefällte Fibrinogen nicht, da es in der Lösungsphase zurückbleibt.
Ein fünfter Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein transgenes Fibrinogen vor, welches zumindest teilweise gereinigt ist und eine verbesserte Stabilität insbesondere im Bezug auf Proteolyse aufweist. Alle bevorzugten Merkmale des ersten bis vierten Aspekts der Erfindung sich auch auf den fünften anzuwenden, selbst wenn das transgene Protein des fünften Aspekts nicht unbedingt nach dem Verfahren des ersten bis vierten Aspekts hergestellt sein muss.
Alle einzelnen Verfahrensschritte, die in den Aspekten eins bis vier beschrieben sind, sind gedacht, die Stabilität des Fibrinogens gegenüber Proteolyse zu erhöhen.
Ein sechster Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht Fibrinogen, Fibrinogen 1 (F1), Fibrinogen 2 (F2) oder eine Kombination davon vor, welche eine hohe Unversehrtheit der Aα-Ketten aufweisen.
Der siebte Aspekt der Erfindung sieht Fibrinogen, Fibrinogen 1 (F1), Fibrinogen 2 (F2) oder eine Kombination davon vor, welches mittels eines Verfahrens nach einem der Aspekte eins bis vier der Erfindung erhalten wird.
Das Fibrinogen, Fibrinogen 1 und Fibrinogen 2 sind aufgrund der HIC Schritte gewinnbar (welche hohe Aα-Ketten enthalten).
Das Fibrinogen 1 und/oder Fibrinogen 2, gemäß dem sechsten und siebten Aspekt der Erfindung sind insbesondere für die Verwendung in Fibrinogen-Klebern oder Dichtmittel bevorzugt, wie hier vorstehend oder hier nachstehend beschrieben ist.
Der fünfte, sechste und siebte Aspekt der Erfindung erzeugt vorzugsweise Fibrinogen, welches im Wesentlichen frei von viralen Verunreinigungen ist. Solches Fibrinogen kann leichter aus Nicht-Blutprodukten hergestellt werden, wie jenes aus Milch oder Urin.
Ein achter Aspekt der Erfindung sieht ein gereinigtes Fibrinogen vor, welches gemäß einem der Aspekte eins bis vier der Erfindung wie weiter oben beschrieben erhalten werden kann. Allen Beschreibungen und Details der Aspekte eins bis sieben sind auch auf den achten Aspekt anwendbar.
Das Fibrinogen gemäß der Erfindung kann in jedem passenden oder zweckmäßigen Stadium vorliegen, wie z.B. in einem lyophilisierten oder gelösten Zustand.
Ein neunter Aspekt der Erfindung sieht einen Fibrin-Kleber oder Dichtstoff vor, welcher Fibrinogen gemäß dem fünften bis achten Aspekt der Erfindung enthält. Der Fibrin-Kleber oder Dichtstoff gemäß dem neunten Aspekt der Erfindung ist in jeder Beziehung mit Ausnahme des vorliegend verwendeten Fibrinogens bekannt und Standard im Stand der Technik [Sierra, Fibrin Sealant Adhesive Systems: A Review of Their Chemistry, Material Properties and Clinical Applications, Journal of Biomaterials Applications, 7:309-352, 1993, Martinowitz and Spotnitz, Fibrin Tissue Adhesives, Thrombosis and Haemostasis, 78:661-666, 1997; Radosevich et al., Fibrin Sealant: Scientific Rationale, Production Methods, Properties and Current Clincial Use, Vox Sanguinis, 72:133-143, 1997].
Wie hierin verwendet, beschreibt der Begriff „Fibrin-Kleber" oder „Fibrin-Dichtmittel" eine Substanz, die Fibrinogen enthält, welche in der Lage ist, einen bioabbaubaren Klebstoff oder ein Dichtmittel durch die Bildung eines polymerisierten Fibrins zu bilden. Solche Kleber-Dichtmittelsysteme werden alternativ auch „Fibringewebekleber" oder „Fibringewebeleime" bezeichnet. Der Klebstoff oder das Dichtmittel kann inter alia als ein hämostatisches Mittel, eine Barriere für Flüssigkeiten, eine Raum ausfüllende Matrix oder ein Wirkstoff abgebendes Mittel sein. Spezielle Anwendung kann in der Neurochirurgie, in der Augenheilkunde, in der Orthopädie oder in der Kardiotorax-Chirurgie, Hauttransplantation und verschiedenen anderen Formen der Chirurgie gefunden werden.
Anders als das Fibrinogen kann der Fibrin-Kleber oder Dichtstoff Substanzen enthalten, welche die Ausbildung des Fibrin-Klebers/Dichtstoffes fördern, wie z.B. Thrombin, Ca⁺⁺ (z.B. CaCl₂) und Faktor XIII (und/oder Faktor XIIIa [in diesem Text beziehen sich alle Hinweise auf Faktor XIII auch auf Faktor XIIIa und umgekehrt]). Während es anerkannt ist, dass Thrombin das bevorzugte Enzym sein würde, welches in irgendein System einzubauen ist durch welches die Formation von Fibringerinnsel gewünscht wird, ist zu erkennen, dass es auch andere Enzyme gibt, die in der Lage sind Fibrinogen proteolytisch zu spalten, was zur Ausbildung von Fibringerinnsel führt. Ein Beispiel dafür könnte das Schlangengiftenzym Batroxobin [Weisel and Cederhol-Williams, Fibrinogen and Fibrin: Characterization, Processing and Applications, Handbook of Biodegradable Polymers (Series: Drug targeting and Delivery) 7:347-365, 1997]. Andere Komponenten wie Albumin, Fibronectin, Lösungsvermittler, Massebildner und/oder geeignete Träger oder Verdünnungsmittel können ebenfalls miteingeschlossen sein, wenn das gewünscht ist.
Ein Vorteil von Fibrin-Dichtmittel als bioabbaubares Polymer ist, dass natürliche Mechanismen in dem Körper vorliegen, um die Gerinnsel wirksam zu entfernen und so kann der Fibrin-Dichtstoff ein temporärer Pfropfen für Hämostase und Wundheilung sein. Verschiedene proteolytische Enzyme und Zellen können Fibrin in Abhängigkeit von den Umständen lösen, aber der am meisten spezifische Mechanismus bezieht das Fibrinolyse-System ein. Die Auflösung von Fibringerinnsel unter physiologischen Bedingungen involviert die Bindung von zirkulierendem Plasminogen an Fibrin und die Aktivierung von Plasminogen zur aktiven Protease, Plasmin, durch Plasminogen Aktivatoren, welche auch an Fibrin gebunden sein können. Plasmin trennt Fibrin an speziellen Stellen auf.
Abhängig von der Situation kann es vorteilhaft sein, den natürlichen Abbauprozess von Fibrin ablaufen zu lassen nachdem ein Fibrin-Kleber oder Dichtstoff auf die Stelle aufgebracht wurde. Tatsächlich kann dieser Abbau gefördert werden z.B. durch die Einbeziehung von Plasminogen. Alternativ dazu kann es in manchen Situationen von Vorteil sein, den Prozess durch Einbeziehen antifibrinolytischer Verbindungen zu verlangsamen, welche z.B. die Umwandlung von Plasminogen in Plasmin blockieren oder direkt an der aktiven Stelle des Plasmins binden und die Fibrinolyse zu hemmen. Solche antifibrinolytische Mittel umfassen a₂-Makroglobulin, welches ein primärer physiologischer Inhibitor von Plasmin ist, Aprotinin; a₂-Antiplasmin; und e-Aminokapronsäure.
Das Fibrin/Dichtstoff kann zwei Komponenten aufweisen, von denen die eine Komponente Fibrinogen und Faktor XIII (und/oder Faktor XIIIa) und die andere Komponente Thrombin und Ca⁺⁺ enthält. Andere Substanzen können, wie oben beschrieben, in einer oder beiden Komponenten, wenn gewünscht, enthalten sein.
Ein zehnter Aspekt der Erfindung sieht einen Satz für einen Fibrin-Kleber oder Dichtstoff vor, welcher Fibrinogen gemäß einem der Aspekte vier bis acht der Erfindung enthält und Instruktionen für die Anwendungen oder kann Fibrinogen gemäß einem der Aspekte vier bis acht der Erfindung aufweisen in Kombination mit (aber nicht unbedingt vermischt mit) einem oder mehreren von: Faktor XIII, Faktor XIIIa, Thrombin oder Ca⁺⁺. Weiters kann der Satz zwei Komponenten aufweisen: Fibrinogen mit (aber nicht unbedingt vermischt mit) Faktor XIII (und oder Faktor XIIIa) und Thrombin (aber nicht unbedingt vermischt mit) Ca⁺⁺.
Die Komponenten von irgendeinem Fibrin Dichtstoff gemäß der vorliegenden Erfindung einschließlich der Satzformen, können separat, gemeinsam oder aufeinander folgend verwendet werden.
Alle relevanten Beschreibungen und Details in Bezug auf den ersten bis neunten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auch auf den zehnten Aspekt anzuwenden.
Ein elfter Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein Verfahren zur Herstellung eines Fibrin-Klebers oder Dichtmittels gemäß dem neunten Aspekt der Erfindung vor, welches das Beimengen von Fibrinogen mit Thrombin oder irgendeinem anderen Enzym aufweist, welches in der Lage ist, das Fibrinogen proteolytisch zu modifizieren von und nicht die Bildung von Gerinnseln hervorruft. Faktor XIII (und/oder Faktor XIIIa) und Ca²⁺ kann auch mit Fibrinogen und Thrombin (oder einem passenden Enzym) in diesem Aspekt der Erfindung vermischt sein.
Das Verfahren des Mischens von Fibrinogen und Thrombin kann Aufspritzen oder Aufsprühen der Komponenten auf die zu heilende Stelle gleichzeitig oder hintereinander umfassen und zwar mit einer Spritze oder mit einem ähnlichen Gerät. Das Mischen kann aus zwei Spritzen, die entlang ihrer Zylinder und ihrer Presskolben aneinander gehalten werden, wobei die beiden Komponenten entweder nach dem Austritt aus den Nadeln oder in der Büchse knapp vor dem Austritt vermischt werden. Andere Geräte können verwendet werden, um ein Aerosol zu bilden oder in verschiedenen Mustern zu sprühen je nach der Anwendung.
Obwohl verschiedene Derivate von Fibrinogen bei klinischen Anwendungen bereits einige Zeit verwendet werden, sind verschiedene Sicherheitsauflagen bei der klinischen Verwendung von Fibrinogen involviert, welche virale Verunreinigungen betreffen, insbesondere bei Produkten, die Fibrinogen oder Komponenten enthalten, die aus menschlichem Blut insbesondere vereinigtem (gepooltem) menschlichen Blut hergestellt sind. Obwohl aufgrund der Angst vor Übertragung von pathogenen Viren Verbesserungen bei der viralen Reinigung von Blut dahingehend gemacht wurden, dass das Risiko einer Krankheitsübertragung weitgehend reduziert wurde, ist das Risiko noch nicht gänzlich ausgeschaltet. Die vorliegende Erfindung, die sich auf Fibrinogen, das aus Milch oder Urin hergestellt wurde, bezieht, kann völlig frei von solchen Bedenken sein.
Ein zwölfter Aspekt der Erfindung sieht Fibrinogen gemäß dem vierten und achten Aspekt der Erfindung vor für die Verwendung in der Medizin. Bevorzugt wird Fibrinogen in der Humanmedizin verwendet, jedoch kann sie auch in der Veterinärmedizin, wie z.B. für Pferde, Schweine, Schafe, Kühe, Rind, Kaninchen, Mäuse und Ratten sowie auch für Haustiere wie Hunde und Katzen verwendet werden.
Während die Hauptverwendung von Fibrinogen für die Herstellung von Kleber oder Dichtmittel gedacht ist, wie das vorstehend beschrieben ist, kann Fibrinogen auch andere Anwendungen auf dem Gebiet der Medizin z.B. als Überzug für Polymerartikel dienen wie dies im US-Patent Nr. 5,272,074 geoffenbart ist. Eine spezielle Anwendung von lyophilisiertem Fibrinogen der vorliegenden Erfindung ist innerhalb oder als Teil von Gaze oder Bandage zu sehen (bevorzugt aus Polymilchsäure-Verbindungen verwendet in chirurgischen Nähten). Solche Wundabeckungen können auch unter Beischließen von Komponenten, die für die Bildung von Gerinnseln (wie oben beschrieben) geliefert werden, gegebenenfalls in Form einer Packung oder einer Satzform, die für die direkte Anwendung auf die Haut oder auf ein inneres Organ gedacht ist. Alle Details und Merkmale der vorher diskutierten Aspekte sind auch auf den zwölften Aspekt anzuwenden.
Ein dreizehnter Aspekt der Erfindung sieht einen Fibrin-Kleber oder Dichtstoff gemäß dem neunten Aspekt der Erfindung für die Verwendung in der Medizin vor.
Die Verwendung in der Medizin kann jede der hier beschriebenen sein. Alle Details und Merkmale der Aspekte eins bis elf sind auch auf den dreizehnten Aspekt anzuwenden.
Ein vierzehnter Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein chirurgisches Verfahren oder eine Therapie vor, welche das Plazieren von Fibrinogen gemäß dem vierten bis achten Aspekt der Erfindung auf oder in ein Tier oder einen Körperteil eines Tieres vor. Das in Frage stehende Tier ist bevorzugt ein solches das Bedarf danach hat. Bevorzugt ist das Tier ein Mensch. Das Fibrinogen kann mit einem oder mehreren von Thrombin, Faktor XIII, Faktor XIIIa oder Ca²⁺ gemischt werden und zwar entweder getrennt, sequenziell oder gleichzeitig mit dem Fibrinogen. Das Fibrinogen kann demgemäß in Form eines Dichtmittels gemäß dem neunten Aspekt der Erfindung vorliegen. Das Fibrinogen kann durch Aufspritzen unter Verwendung einer Spritze oder einem ähnlichen Gerät aufgebracht werden. Es kann sehr präzise in einem begrenzten Bereich oder breit über einem großen Bereich auf jedes Gewebe aufgebracht sein. Alle Details und bevorzugte Merkmale der Aspekte eins bis dreizehn sind auch auf den vierzehnten Aspekt anzuwenden.
Ein fünfzehnter Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht die Verwendung von Fibrinogen gemäß dem vierten bis achten Aspekt der Erfindung bei der Herstellung eines Fibrin-Klebers oder Dichtmittels vor.
In dieser Erfindung wird die Reinigung von Fibrinogen erreicht bzw. ist ein bevorzugter Schritt in der Verwendung von der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie (HIC), die in einer Weise ausgeführt wird, die nicht nur die Trennung von Milchproteinen, welche zu einem im Wesentlichen reinen Produkt führt, sondern auch die gleichzeitige Fraktionierung von Fibrinogen in F1, F2 und Abbauprodukte ermöglicht. Im Allgemeinen wird Fibrinogen, vorzugsweise durch Ausfällung teilgereinigt, mit einem HIC Harz in Kontakt gebracht (zum Beispiel Butyl Sepharose^TM) und zwar unter Bedingungen, unter welchen Fibrinogen zurückgehalten wird (z.B. 0,2-0,8M vorzugsweise 0,3 bis 0,6M Ammonsulfat). Das Harz wird dann gewaschen und zwar entweder in chargenweise Arbeit durch Zentrifugierung oder durch Einschluss in eine Chromatographie-Säule. Die Elution des gebundenen Materials wird durch abnehmende Salzkonzentration ermöglicht (z.B. Ammoniumsulfat in abnehmenden Konzentrationen 0,5 bis 0M) in der mobilen Phase, so dass die Auflösung von Fibrinogen von nicht Fibrinogenen Komponenten erreicht wird. Durch sorgfältige Auswahl der Salzkonzentrationen wird das Fibrinogen nicht nur von der Mehrheit der Milchkomponenten getrennt sondern es kann auch in Sub-Familien fraktioniert werden. Die Eluierung kann entweder ausgeführt werden unter Verwendung von abnehmenden Gradienten, wobei das Gefälle des Gradienten die Auflösung bestimmt oder mehr ansprechend durch die Verwendung einer Serie von abnehmenden Schritten von Konzentration. Die Verwendung von HIC ermöglicht, dass das Fibrinogen Produkt in Bezug auf seine AαC-terminale Region definiert werden kann.
Das Plasminogenaktivierungssystem in Milch war für viele Jahre der Brennpunkt des Interesses. Es wurde allgemein anerkannt, dass Milch die primären Enzyme enthält, die für Fibrinolyse in vivo verantwortlich sind, z.B. Plasminogen Aktivatior (sowohl Gewebstyp, tPA als auch Urokinase Typ, uPA), Plasminogen und Plasmin. Die Wirkung der Proteolyse wird oft während der Lagerung von Milch oder Milchprodukten beobachtet, worin Kasein von den Milchproteinen am meisten für den Abbau empfänglich ist. Es war bald gezeigt, dass in Milch, die Plasminogen Aktivatoren, Plasminogen und Plasmin im Wesentlichen mit dem Kasein assoziiert sind und nicht mit der Molke (Serum) Phase. Der Mechanismus durch welchen diese Moleküle mit dem Kasein verbunden sind, konnte noch nicht kategorisch bestimmt werden, aber es ist wahrscheinlich, dass deshalb, weil diese Moleküle Kringle-Domänen (strukturierte Polypeptidketten mit einer Affinität für basische Aminosäuren) enthalten, diese Domänen möglicherweise diese Interaktion mit dem Kasein vermitteln.
Es wurde erkannt, dass die Proteolyse vom menschlichen Protein innerhalb der Brustdüse oder dem Euter eines laktierenden transgenen Tieres auftreten kann. Die Inkubationszeit des transgenen Proteins in der Brustdrüse oder dem Euter kann in der Zeit zwischen dem Melken des Tieres angenähert sein. Deshalb ist es nahe liegend, dass eine Erhöhung der Frequenz des Melkens diese Zeitperiode minimiert. Allerdings bedeutet der Anstieg der Frequenz des Melkens auf über drei oder vier Melkvorgänge pro Tag nicht nur eine Diskontinuität für das Tier sondern bedingt auch eine Kostenerhöhung für die Molkereikosten. Es wird daher akzeptiert, dass ein Maß an Abbau des menschlichen Fibrinogens auftreten wird. Wie im Stand der Technik bereits diskutiert, beeinträchtigt die Gegenwart von Fibrinogen Abbauprodukten in Fibrin Gewebskleber den Nutzen des Produktes und deshalb muss jegliches Abbauprodukt entfernt werden. Die Erfindung offenbart, wie die Erfinder einen sehr wirksamen Weg entdeckt haben, dies zu erreichen, welcher erlaubt, das Verhältnis von F1 und F2 Fibrinogen im Endprodukt auszuwählen und zu bestimmen.
Die Techniken für die Separation von Plasma Fibrinogen in seine verschiedene Sub-Fraktionen wie es im Stand der Technik beschrieben ist, fällt grundsätzlich in zwei Kategorien. Solche die auf unterschiedliche Löslichkeit der Sub-Fraktionen in hohen Salzkonzentrationen beruhen (z.B. Ammoniumsulfat und Glyzin), welche häufig als selektive Ausfällungstechniken beschrieben sind [Holm et al., Purification and Characterisation of 3 Fibrinogens with different molecular weights obtained form normal human plasma, Thrombosis Research, 37:165-176, 1985], und jene, die von dem Vorteil Gebrauch machen, dass Abbauprodukte eine unterschiedliche Molekulargröße haben und damit unter Verwendung von Größenausschlusschromatographie getrennt werden können.
Die zwei Kategorien der Techniken die vorne beschrieben wurden sind sehr unterschiedlich in ihrer Fähigkeit und Einfachheit der Verwendung, bei industriell anwendbaren Maßstäben zur Subfraktionierung von Fibrinogen. Während Ausfällungstechniken relativ einfach auszuführen und zu skalieren sind, erlaubt die inhärente Art der Separation nicht, extrem hohe Auflösungsgrade zu erzielen, die erforderlich wären, um sicher zu stellen, dass das hergestellte Fibrinogen genau im Hinblick auf das Verhältnis von F1:F2 und damit Aα-Ketten Integrität definiert werden kann. Tatsächlich richten Verfechter dieser Technik im Labormaßstab oft Verunreinigungen der Subfraktionen untereinander [Lipinska et al., Fibrinogen Heterogeneity in Human Plasma: Electrophoretic demonstration and characterization of two major fibrinogen componets, Journal of Laboratory & Clinical Chemistry, 84:509-516, 1974] und auch von niedrigen Ausbeuten.
Im Gegensatz zu Techniken, die auf unterschiedlicher Löslichkeit beruhen, kann Größenausschlusschromatographie zu sehr guten Auflösungen von Fibrinogensubfraktionen mit hoher Ausbeute führen. Der Hauptnachteil von dieser Technik ist der Aufwand und der Maßstab. Obwohl F1 und F2 Fibrinogen und F2 und F3 um einige 35-40Kdal differieren, ist die Größe des Moleküls selbst (340kDal) nahe am Limit des Fraktionierungsbereichs der meisten Größenausschlussmatrizen. Dies führt zu mageren Auflösungen wenn nicht teure Harze verwendet werden. Eine weitere Grenze ist der Maßstab, da SEC (Größenausschlusschromatographie) nicht eine Chromatographietechnik ist, die im technischen Maßstab favorisiert wird, wenn feine Separationen auszuführen sind. Ebenso ist SEC üblicherweise eine teure Technik, da nur ein kleiner Abschnitt des Säulenvolumens des Materials beladen werden kann, während die Auflösung aufrecht erhalten wird.
Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie (HIC) ist eine Separationstechnik, die das Binden von Proteinen an leicht hydrophobe Harzen in der Gegenwart von niedrigen Salz Konzentrationen ausnutzt, die hydrophobe Flecken auf der Oberfläche des Proteins exponieren. In Gegenwart von diesen so genannten „strukturbildenden" Salzen kann eine selektive Interaktion zwischen verschiedenen Proteinen und der Matrix ausgelöst werden. Die Technik ist meistens verwendet worden, um zwischen verschiedenen Proteinen in einer heterogenen Mischung zu unterscheiden. Die Erfinder haben entdeckt, dass nicht nur HIC eine sehr gute Fraktionierungstechnik zur Gewinnung von Fibrinogen aus teilweise gereinigten Extrakten ist, sondern sie ist auch überraschender Weise eine kraftvolle Technik für die Auflösung von Fibrinogensubfraktionen, das sind F1, F2 und F3 (Fragment X), Fragment Y und Fragmente D & E.
Transgenes humanes Fibrinogen wird verwendet, welches aus Milch teilweise gereinigt wurde ist an HIC Harz gebunden (z.B. aber nicht ausschließlich Butyl Sepharose 4FF. Amersham Pharmacia Biotechnology) in der Gegenwart von Ammoniumsulfat oder einem anderen „strukturbildenden" Salz mit einer Konzentration, welche dem Fibrinogen ermöglicht zu binden z.B. im Bereich 0,2-1,0M (bevorzugter 0,3-0,6M). Durch Abnahme der Konzentration von Ammoniumsulfat im Spülungspuffer, wird das gebundene Material aus der Säule eluiert, um die Milchkomponenten (0,485-0,37M Ammoniumsulfat), F1 Fibrinogen (0,37-0,2M Ammoniumsulfat), F2 Fibrinogen (0,2-0,14M Ammoniumsulfat) und F3 Fibrinogen und Abbauprodukte (0,10-0,0M Ammoniumsulfat) zu eluieren. Der Bereich der Konzentrationen von Ammoniumsulfat über welchen die gebundenen Komponenten eluiert werden wird bestimmt, zum Teil durch die Betriebsbedingungen und die Fachleute auf dem Gebiet würden in der Lage sein, um entweder die Temperatur oder das pH oder beide so einzustellen um die Konzentrationen von Ammoniumsulfat zu verändern, über welche die Fraktionen eluieren. Unter Verwendung dieser Techniken ist es möglich, mittels einer Gradientenelution oder mehr bevorzugt durch eine Serie von Schritten vorherzubestimmen, um damit das Fibrinogen zu definieren, das aus der Säule bezüglich seines F1:F2 Verhältnisses und damit der Aα-Ketten Integrität eluiert wird.
Dieser Text bezieht sich auf die angeschlossenen Figuren in welchem:
1 ein SDS-PAGE von teilgereinigten Fibrinogen aus Beispiel A ist, in Abwesenheit oder in Gegenwart von eACA.
2 ein Chromatogramm ist, welches die verschiedenen Fraktionen zeigt, das von der HIC Säule aus Beispiel 1 erzielt wird. Das Chromatogramm wurde unter Verwendung von UV bei 280 mM generiert.
3 eine Fibrinogenelution von transgenen menschlichen Fibrinogen aus einer HIC (Butyl-Sepharose 4FF) Säule in Beispiel 1 ist.
4 ein SDS-PAGE von einer Fibrinogenelution von transgenen menschlichen Fibrinogen aus einer HIC (Butyl-Sepharose 4FF) Säule gemäß Beispiel 2 ist.
5 ein Chromatogramm ist, welches die verschiedenen Fraktionen die von der HIC Säule in Beispiel 2 gebildet werden, darstellt.
Das Chromatogramm wird unter Verwendung von UV generiert.
6, 7, 8 und 9 RP-HPLC Chromatogramme für Fibrinogen und Fibrinogenfraktionen sind, die von der HIC Säule unter Verwendung von Bedingungen wie sie in den Beispielen 1 und 2 ausgeführt sind, eluiert sind. Die Chromotogramme wurden unter Verwendung von Wellenlängen von 214nm generiert.
Die folgenden nicht limitierenden Beispiele helfen die Erfindung zu erläutern.
Beispiel A
Milch eines transgenen Mutterschafes wurde aus einem gefrorenen Zustand in einem Wasserbad bei 37°C aufgetaut und dann durch Niedriggeschwindigkeitzentrifugation (2000rpm) für 10 Minuten entfettet. Die entfettete Milch wurde dann in 2 × 40 ml Fraktionen aufgeteilt und wie folgt weiter verarbeitet. Zu einer Fraktion wurden 40ml 27,6 Gew./Vol.- % Ammoniumsulfat in 25mM Citrat, 100mM eACA, pH 8,0 zugesetzt. Das Röhrchen wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und nachfolgend in einer Beckman Zentrifuge J2-21 (10°C) bei hoher Geschwindigkeit zentrifugiert. Der übergebildete Überstand wurde entfernt und das Pellet wurde in 25mM Citrat, pH 8,0 aufgelöst. Sobald es bis zu 40ml aufgelöst war, wurde die Ausfällung und Wiederauflösung wie oben stehend wiederholt. Ein letzter Ausfällungs- und Wiederlösungsschritt wurde dann ausgeführt, und zwar im Wesentlichen wie oben beschrieben jedoch mit der Ausnahme, das eACA von der Salzlösung ausgelassen wurde. Das gleiche Verfahren wie oben wurde dann mit der zweiten 40ml Aliquot von entrahmter Milch ausgeführt mit Ausnahme dass eACA nicht verwendet wurde.
Die Natriumdodecylsulphat-Polyacrylamid Gelelectrophorese (SDS-PAGE, 8-16%, Novex) wie sie in 1 gezeigt ist, veranschaulicht die Stabilität des teilgereinigten Fibrinogens. Bahn 1 repräsentiert das teilgereinigte Fibrinogen in Gegenwart von eACA und gelagert bei 4°C über Nacht. Es kann gesehen werden, dass das Fibrinogen vorwiegend F1:F2 ist. Das Abbauprodukt, Fragment X (F3) ist auch als rascher migrierende Bande unter den F1:F2 Banden gegenwärtig. Bahn 2 repräsentiert das Material das bei 4°C gelagert und gereinigt wurde wie in Bahn 1 mit Ausnahme das eACA während des Ausfällungsstadiums abwesend war. Aus Bahn 1 und Bahn 2 ist ersichtlich, dass selbst während der Lagerung bei 4°C einiges F1 Fibrinogen proteolytisch gespalten wurde. Bahn 3 veranschaulicht das gleiche Material wie in Bahn 1 mit der Ausnahme, dass die Lagerung 18°C über Nacht erfolgte. Es ist ersichtlich dass dieses Material mehr stabil erschien als jenes in Bahn 2 und tatsächlich ist dieses Material sehr ähnlich jenem das in Bahn 1 gezeigt ist. Bahn 4 zeigt das gereinigte Material, das in Abwesenheit von eACA über Nacht bei 18°C gelagert wurde. Es ist ersichtlich, dass dieses Material ernsthaft beschädigt ist und es nahezu an F1 Fibrinogen mangelt. Dieses Beispiel dient darzustellen, dass Fibrinogen, das aus Milch durch Ausfällung teilgereinigt ist, gegenüber Milchprotease-Aktionen unstabil ist. Diese Protease-Aktion kann durch Inkubation bei 4°C abgeschwächt werden, jedoch wird sie beseitigt, wenn die Ausfällung in Gegenwart von eACA erfolgt ist, welche verhindert, dass das aufgefällte Fibrinogen durch Milchprotease kontaminiert ist.
Beispiel 1
Transgenes Fibrinogen wurde in ähnlicher Weise wie es im Beispiel A beschrieben wurde aus Milch eines transgenen Mutterschafes durch Ausfällung mit Ammoniumsulfat teilgereinigt. 2ml wurden zu 0,485M Ammoniumsulfat durch Hinzufügen von 1,45M Ammoniumsulfat in 5mM Citrat, pH 7,5 (1ml) hergestellt. Nach dem Mischen wurde die Lösung auf eine HiTrap Butyl-Sepharose 4FF Säule gepumpt (die vorher mit 0,485M Ammoniumsulfat im 0,25mM Citratpuffer, pH 7,5 äquilibriert wurde) mit 0,1ml/Minute gepumpt. Die Säule wurde mit 2 Säulenvolumina von 0,485M Ammoniumsulfat in 5mM Citrat, pH 7,5 gewaschen wonach die Eluierung in drei Stufen ausgeführt wurde, 1) 0,40M Ammoniumsulfat in 5mM Citrat, pH 8,0, 2) 0,15M Ammoniumsulfat in 5mM Citratpuffer,. pH 8,0, 3) 5mM Citrat, pH 8,0. Das Chromatogramm das nachstehend als 2 wiedergegeben ist, zeigt, dass vier Hauptspitzen von diesem Experiment erhalten wurden. Der erste Peak repräsentiert Material, das unter diesen Adsorptionsbedingungen nicht an die Säule bindet und ist hauptsächlich Schafmilchprotein. Der zweite Peak repräsentiert Material, das an die Säule gebunden hat und mit 0,40M Ammoniumsulfat eluiert wurde. Der dritte Peak repräsentiert Fibrinogen und Fraktionen die mitgenommen wurden und diese sind auf dem SDS-PAGE gemäß 3 gezeigt. Die klare Unterscheidung zwischen F1 (Fibrinogen mit hohem Molekulargewicht) und F2 (Fibrinogen mit niedrigem Molekulargewicht) und die Auflösung auf der Chromatographie kann klar erkannt werden (Bahnen 1-5). Bahn 6 repräsentiert den zusammengefassten Peak während die Bahnen 7 und 8 Peak 4 des Chromatogramms wiedergeben, welche als F3 (Fragment X) Fibrinogen erkannt werden. Daraus ist es evident, dass durch Änderung der für die Elution verwendeten Ammoniumsulfat-Konzentration es möglich ist, das eluierte Fibrinogen im Hinblick auf seine Aα-Ketten Integrität zu definieren.
Beispiel 2
In einem anderen Beispiel, welches das Potential dieser Technik zur Maßstabvergrößerung illustriert, wird eine zu Beispiel 1 äquivalente Prozedur im Maßstab um einen Faktor 400 vergrößert. So wurden 0,9g (790ml) vom transgenen humanen Fibrinogen durch Ausfällung in Gegenwart von 50mM e-Aminokapronäure teilgereinigt. Es wurde dann zu 0,5M Ammoniumsulfat durch Hinzufügung von 790ml von 1 M Ammoniumsulfat in 5mM Citratpuffer, pH 7,5 gebracht. Das Material wurde auf eine Säule 5cm × 21cm (400ml) von Butyl-Sepharose 4FF mit einer Flussrate von 20ml/min. aufgetragen. Nach der Beladung wurde die Säule mit 400ml von 0,5M Ammoniumsulfat in 5mM Citratpuffer, pH 7,5 gewaschen. Das gebundene Material wurde aus der Säule durch Spülen mit drei Puffern eluiert. 1) 0,4M Ammoniumsulfat in 5mM Citrat, pH 7,5, 800ml, 2) 0,15M Ammoniumsulfat in 5mM Citratpuffer, pH 7,5, 800ml, und 3) 5mM Citrat, pH 7,5, 800ml.
SDS-PAGE und Chromatogramm sind in den 4 bzw. 5 gezeigt, die die Resultate dieses Experiments darstellen. Wie von der SDS-PAGE ersichtlich ist, wurde F1:F2 Fibrinogen aus der Säule bei 0,15mM Ammoniumsulfat (Bahnen 3-4, 4) eluiert, während F3 Fibrinogen unter Verwendung einer schrittweisen Änderung auf 5mM Citrat, pH 7,5 eluiert wurde, welches kein Ammoniumsulfat (Bahn 8, 4) enthielt. Die reduzierende SDS-PAGE ist ein herkömmlicher Weg zur Bestimmung der Aα-Ketten Integrität, da ein Wegfall der Aα C-terminalen Regionen in einer Abnahme des Aα-Ketten Molekulargewichtes resultiert. Diese Abnahme ist bereits qualitativ belegt. In 4 zeigt Bahn 6 ein reduziertes F1:F2 Fibrinogen mit 10mM Dithiotheritol als Reduktionsmittel. Wenn dies mit F3 Fibrinogen (Bahn 8) verglichen wird, ist der Verlust der Aα-Kette klar zu sehen.
Quantitative Informationen über die Aα-Ketten Integrität kann durch Verwendung von Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) an reduzierten Fibrinogen gemäß Raut et al., erhalten werden [Ultra-rapid preparation of milligram quantities of the purified polypeptide chains of human fibrinogen, Journal of Chromatography B, 660:390-394, 1994] welche die Integration von Peak-Flächen ermöglicht. 6 zeigt ein RP-HPLC Chromatogramm von gereinigtem F1 Fibrinogen; die drei Fibrinogen-Ketten eluieren von der Säule in der Folge Aα, Bβ bzw. γ; wie ersichtlich ist, gibt es für jede Kette einen einzigen Peak. Integrieren der Aα-Kette führt zu einer Peak-Fläche, welche als Standard verwendet wird, gegen den Fibrinogen mit abgebauter Aα-Kette normalisiert werden kann. In 7 ist ein RP-HPLC Chromatogramm für F2 Fibrinogen gezeigt, welches unter identischen Konditionen wie jenes gemäß 6 laufen gelassen wurde, worauf ersichtlich ist, dass der Aα Peak in zwei Peaks aufgeteilt wurde, wobei der erste die intakte Aα-Kette betrifft und der letztere Peak die Aα-Kette mit proteolytisch abgespaltenen C-Terminus wiedergibt. Es kann unter Verwendung der Online-Integration berechnet werden, dass die Aα-Kette zu 73% intakt existiert, die verbleibenden 27% sind abgebaute Aα-Ketten. In 8 ist ein RP-HPLC Chromatogramm für F3 Fibrinogen gezeigt. In diesem Chromatogramm ist ersichtlich, dass die Menge von abgebauten Aα die Menge von nicht-abgebauter Aα-Kette im Wesentlichen ausgleicht, was durch den stark reduzierten nicht abgebauten Aα-Ketten Peak gezeigt ist. Es kann berechnet werden, dass die abgebaute Aα-Kette 62% der gesamten vorliegenden Aα-Kette entspricht.
Es ist daraus evident, dass die Verwendung der RP-HPLC Technik als ein analytisches Werkzeug im Anschluss an die hydrophobe Wechselwirkungschromotographie Bedingungen für die hydrophobe Wechselwirkungschromotographie erlaubt, ausgewählt zu werden, um Fibrinogen mit einer bestimmten Aα-Ketten Integrität zu erzeugen. Ein Beispiel davon ist in 9 wiedergegeben, das die Elution aus der Butyl-Sepharose 4FF Säule zeigt, bei welcher die Konditionen gemäß Beispiel 2 angewandt sind. Aus dem Chromatogramm der 9 ist ersichtlich, dass hauptsächlich F1 Fibrinogen ausgewählt ist, da die Aα-Kette zu 87% unversehrt ist.

Claims

Verfahren zur Teilreinigung von Fibrinogen aus Milch, wobei das Verfahren die Überführung von Protease Enzym, welches in der Milch vorhanden ist, in die Molkephase mit der Entfernung oder Abtrennung des Fibrinogens in eine andere Phase der Milch aufweist.
Verfahren zur Teilreinigung von Fibrinogen, wobei das Verfahren die Ausfällung des gewünschten Proteins in der Gegenwart von Lysin oder einem Lysin-Analogon aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Verfahren gegebenenfalls durch einen Verfahrensschritt gefolgt wird, der aufweist: (a) das in Kontakt bringen des teilgereinigten Fibrinogens mit einem hydrophoben Wechselwirkungschromatographieharz unter Bedingungen bei welchen das Fibrinogen an das Harz bindet; und (b) das Entfernen des gebundenen Proteins mittels Elution.
Verfahren zum Gewinnen von Fibrinogen aus Milch, wobei das Verfahren aufweist: (a) das in Kontakt bringen der Milch mit einem hydrophoben Wechselwirkungs-Chromatographieharz unter Bedingungen bei welchen das Fibrinogen an das Harz bindet; und (b) das Entfernen des gebundenen Proteins mittels Elution.
Verfahren zum Gewinnen von Fibrinogen aus Milch, wobei das Verfahren aufweist: (a) das Überführen von Protease Enzym, welches in der Milch vorhanden ist, in die Molkephase mit der Entfernung oder Abtrennung des Fibrinogens in eine andere Phase der Milch; (b) das in Kontakt bringen der Milch mit einem hydrophoben Wechselwirkungs-Chromatographieharz unter Bedingungen bei welchen das Fibrinogen an das Harz bindet; und (c) Entfernen des gebundenen Proteins mittels Elution.
Verfahren zum Gewinnen von Fibrinogen aus Milch, wobei das Verfahren aufweist: (a) das Ausfällen des Fibrinogens in der Gegenwart von Lysin oder einem Lysin-Analogon; (b) das in Kontakt bringen der Flüssigkeit mit einem hydrophoben Wechselwirkungs-Chromatographieharz unter Bedingungen bei welchen das Fibrinogen an des Harz bindet; und (c) das Entfernen des gebundenen Proteins mittels Elution.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 5, wobei das Protease Enzym Plasmin und/oder Plasminogen ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 5 oder 7, wobei die Entfernung oder Abtrennung des gewünschten Proteins durch Ausfällung erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 5 oder 7, wobei die Überführung des Protease Enzyms in die Molkephase in der Gegenwart von Lysin oder einem Lysin-Analogon erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei Milch Vollmilch, Magermilch oder eine Milchfraktion ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Milch von einem Schaf, einer Kuh, einer Ziege, einem Kaninchen, einem Kamel, einem Wasserbüffel, einem Schwein oder einem Pferd stammt.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Fibrinogen von Rindern oder Menschen stammt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, oder 7 bis 12 (wenn abhängig von den Ansprüchen 1 bis 3), wobei das teilgereinigte Protein durch Wiederholen des ersten Schrittes jedes Reinigungsverfahrens weiters gereinigt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6 oder 10 bis 13 (wenn abhängig von den Ansprüchen 3 bis 6), welches die Isolation von Fibrinogen mit einem vorbestimmten F1 zu F2 Fragment Verhältnis ermöglicht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6 oder 10 bis 13 (wenn abhängig von den Ansprüchen 3 bis 6), welches die Isolation von Fibrinogen mit einer vorgewählten A-Ketten Integrität ermöglicht.
Transgenes Fibrinogen, welches ein vorbestimmtes F1 Fragment zu F2 Fragment Verhältnis aufweist, ist aus Milch erhältlich, ist zumindest teilweise gereinigt, hat eine verbesserte Stabilität (insbesondere in Bezug auf Proteolysis) und/oder eine erhöhte Integrität der Fibrinogen Alpha Kette.
Transgenes Fibrinogen, welches ein vorbestimmtes F1 Fragment zu F2 Fragment Verhältnis aufweist, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15.
Transgenes Fibrinogen, welches eine vorgewählte A Ketten Integrität hat.
Transgenes Fibrinogen nach Anspruch 17, wobei das Fibrinogen zumindest 80 % F1 Fibrinogen aufweist.
Transgenes Fibrinogen nach den Ansprüchen 15 bis 19, welches im Wesentlichen frei von viralen Kontaminationen ist.
Transgenes Fibrinogen nach einem der Ansprüche 15 bis 20, welches Fibrinogen 1, Fibrinogen 2 oder eine Kombination davon aufweist.
Fibrin-Klebstoff oder Dichtungsmittel, welches Fibrinogen nach einem der Ansprüche 15 bis 21 enthält.
Fibrin-Klebstoff oder Dichtungsmittel nach Anspruch 22, welches Thrombin, Ca⁺⁺ und Faktor XIII enthält.
Satz für einen Fibrin-Klebstoff oder Dichtungsmittel, welcher Fibrinogen nach einem der Ansprüche 15 bis 23 zusammen mit Faktor XIII und/oder Faktor XIIIa als eine Komponente und Thrombin und Ca⁺⁺ als eine zweite Komponente aufweist.
Verfahren zum Herstellen eines Fibrin-Klebstoffs oder Dichtungsmittels nach Anspruch 22 oder Anspruch 23, welches das Vermischen von Fibrinogen mit Thrombin aufweist.
Fibrinogen nach einem der Ansprüche 15 bis 21 für die Verwendung in der Medizin.
Fibrin-Klebstoff oder Dichtungsmittel, oder Satz nach einem der Ansprüche 21 bis 24 für die Verwendung in der Medizin.
Verwendung von Fibrinogen nach einem der Ansprüche 15 bis 21 in der Herstellung eines Fibrin-Klebstoffes oder Dichtungsmittels.