FR3032621A1 - Colle biologique et son utilisation comme medicament - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à une colle biologique à base de fibrinogène, d'au moins un facteur de coagulation activé parmi le FXa, le FIXa ou le FXIa, et d'une source d'ions calcium.

Description

1 Colle biologique et son utilisation comme médicament La présente invention se rapporte à une colle biologique à base de fibrinogène et d'au moins un facteur de coagulation activé choisi parmi le FXa, le FIXa et le FXIa, et d'une source d'ions calcium. On entend par « colle biologique » un composant capable de réunir des éléments tissulaires (peau, os, organes divers) et en même temps d'assurer une hémostase des tissus lésés, pouvant ainsi renforcer ou compléter une réunion de ces tissus par une ou des sutures. Un tel composant permet également de favoriser la réparation/cicatrisation en offrant notamment la possibilité d'une diffusion lente de composés actifs. La coagulation sanguine est réalisée selon des étapes en cascade impliquant différentes proenzymes et procofacteurs présents dans le sang qui sont convertis, par l'intermédiaire d'enzymes protéolytiques, en leur forme activée. Cette succession d'étapes ou cascade de la coagulation est effectuée selon deux systèmes de la coagulation, appelés voie extrinsèque de la coagulation et voie intrinsèque de la coagulation, conduisant à la transformation de la prothrombine en thrombine. La voie extrinsèque implique l'intervention du facteur X (FX) présent dans le sang. Toutefois, celui-ci requiert une activation du FX (par le facteur Vila (FV11a)) pour initier cette cascade de coagulation. Le facteur Vila présente une faible activité enzymatique jusqu'à ce qu'il se complexe au facteur tissulaire de nature phospholipidique libéré après lésion tissulaire. Le facteur Vila ainsi complexé transforme le FX en facteur X activé (FXa) en présence d'ions calcium. Le facteur Xa à son tour transforme la prothrombine en thrombine, en présence d'ions calcium, laquelle active le facteur V (facteur Va). La thrombine active également le facteur XIII en facteur Xllla. La thrombine, en présence de calcium agit sur le fibrinogène en le transformant en fibrine. La présence de facteur Xllla permet la formation d'un caillot de fibrine à réseau maillé solide et adhérent qui est progressivement et lentement résorbé avec l'installation du tissu cicatriciel de consolidation, à laquelle le réseau sert de trame. La voie intrinsèque de la coagulation implique également le FXa. Cette voie comprend une cascade de réactions aboutissant à l'activation de la thrombine par l'intermédiaire du facteur XII (FXII). Celui-ci active le facteur XI (facteur Xla - FXIa) qui active le facteur IX (facteur IXa - FIXa) en présence de facteur tissulaire phospholipidique (FT). Le facteur IXa participe à l'activation du facteur X en facteur Xa en présence de facteur Villa, de facteur tissulaire et d'ions calcium. Ceci conduit ensuite à la transformation de la prothrombine en thrombine 3032621 2 Il apparait donc que le facteur X joue un rôle prépondérant dans les mécanismes de la coagulation intrinsèque, aboutissant à la formation de caillot sanguin. Cependant, dans le cas de lésions tissulaires hémorragiques engendrées par les plaies, blessures ou interventions chirurgicales externes, la réparation tissulaire par suture 5 est une nécessité pour notamment favoriser l'arrêt de l'hémorragie par formation du caillot de fibrine, selon les mécanismes explicités précédemment. Il peut s'avérer nécessaire de favoriser, notamment dans le cas de chirurgies lourdes, l'hémostase de tissus lésés. Hormis l'hémostase de tissus lésés, il convient également d'accélérer, renforcer, voire compléter le processus naturel de cicatrisation tissulaire, suturé ou non, liée à la 10 réunion des tissus pour éviter leur déhiscence. Ceci est notamment possible par l'application locale de colle biologique. Les colles biologiques sont constituées d'un mélange de facteurs circulants de la coagulation sanguine, notamment de protéines le fibrinogène et le facteur XIII. Elles requièrent en outre un apport de thrombine exogène, enzyme nécessaire pour transformer le fibrinogène en fibrine insoluble, réticulable par le 15 facteur XIII. Des composants additionnels sont nécessaires pour effectuer la coagulation du fibrinogène, notamment l'ion calcium, et éventuellement de l'aprotinine, ajoutée pour ses propriétés anti-f ibrinolytiques. Les colles biologiques peuvent également servir à fixer des biomatériaux de nature diverse (collagène, alginates et acide polylactique) à des tissus biologiques pour renforcer 20 leurs propriétés mécaniques en attendant une consolidation par la repousse naturelle des cellules de l'organisme, par exemple dans le cas des peaux artificielles. Les colles biologiques peuvent également servir de réservoir pour distribuer dans le temps, lors de leur résorption, différents composés actifs tels que des antibiotiques, des facteurs de croissance ou de stimulation cellulaire.

25 Les colles biologiques disponibles dans le commerce se présentent en réalité sous forme de kits comprenant au moins les quatre composants cités ci-dessus sous forme sèche dans lequel les protéines activables par la thrombine, le fibrinogène et le facteur XIII, doivent être isolés de la thrombine, car leur association engendre une prise en fibrine en un temps très bref, de l'ordre de quelques secondes après reconstitution dans un 30 liquide et mélange. C'est la raison pour laquelle les kits de colle biologique sont au moins bi-composants, c'est-à-dire comprenant, d'une part, un lot à base de fibrinogène et de facteur XIII et, d'autre part, un lot à base de thrombine. La colle biologique remplit les fonctions indiquées ci-dessus par reconstitution et mélange des deux lots, par exemple avec des seringues et aiguilles, puis application sur le tissu à suturer ou bien par 35 vaporisation sur la plaie.

3032621 3 Cependant, de telles reconstitutions et mélanges sont relativement complexes et source d'erreurs possibles, notamment en cas d'urgence, étant donné que dès la mise en contact du fibrinogène et de la thrombine sous forme liquide, en présence des autres composants, il se forme presque instantanément de la fibrine. Le mélange fibrinogène- 5 thrombine ne peut donc se faire que juste avant l'application sur la plaie ou zone opératoire ou directement sur la plaie. De plus, lorsqu'un dispositif unique de distribution de colle biologique est utilisé, il existe un risque réel d'une prise en fibrine dans le dispositif même, ce qui peut conduire à un colmatage du système de distribution et d'application. Par ailleurs lorsque le produit n'est pas stable, il peut être difficile de prévoir 10 le volume requis avant le début de l'intervention. La reconstitution en urgence de produit lyophilisé s'accompagne d'un temps d'attente de stabilisation du produit qui peut être handicapant pour le bon déroulement d'une opération chirurgicale. Les inconvénients cités ci-dessus posent donc des problèmes en particulier dans le cadre d'interventions chirurgicales et/ou de situations d'urgence, où souvent la rapidité 15 du geste opératoire est une nécessité. Il est observé que de tels inconvénients sont susceptibles d'engendrer une réunion inhomogène des tissus par formation d'amas de fibrine avant adhésion tissulaire, pouvant en outre être accentués par la rétraction du caillot, conduisant au final à une cicatrice irrégulière, propice à une déhiscence et à des saignements secondaires post-opératoires.

20 Pour remédier à ces inconvénients, la Demanderesse a précédemment mis au point une colle biologique répondant à plusieurs objectifs conjoints. Le premier objectif était de fournir une colle biologique comprenant des facteurs de la coagulation, exempte de thrombine, sans risque d'une formation de fibrine avant l'application sur un tissu biologique et capable d'être stockée sous la forme d'un soluté homogène au moins le 25 temps de l'intervention chirurgicale. Le deuxième objectif était de fournir une colle présentant également des capacités accrues, d'une part, d'hémostase de tissus lésés et, d'autre part, de réunion de tissus conduisant à une cicatrisation améliorée. La demande W02007080276 a ainsi décrit une colle biologique monocomposée liquide à usage thérapeutique, exempte de thrombine, et comprenant du fibrinogène, du 30 facteur Vila, et une source d'ions calcium. La Demanderesse a développé une formulation améliorée de la colle biologique décrite dans la demande W02007080276 en substituant le FVIIa par au moins un facteur de coagulation activé choisi parmi le FXa, le FIXa et le FXIa. Cette formulation permet d'améliorer la vitesse de coagulation sans impacter la taille et la dureté du caillot.

35 Enfin, la Demanderesse a montré qu'une concentration optimale en facteur de coagulation activé, FXa, FIXa ou FXIa, est réduite par rapport à la concentration optimale 3032621 4 de la colle biologique antérieure contenant du FVIIa. Ainsi une concentration inférieure à 1,5 pg/m1 est suffisante pour que la colle biologique présente des propriétés d'hémostase améliorées.

5 Colle biologique L'invention concerne donc une colle biologique liquide, à usage thérapeutique, exempte de thrombine, comprenant du fibrinogène, au moins un facteur de coagulation activé sélectionné dans le groupe constitué du facteur Xa, du facteur IXa et du facteur Xla et une source d'ions calcium.

10 La colle biologique se présente sous la forme d'une composition pharmaceutique, c'est-à-dire une formulation « monocomposée » dans laquelle les au moins trois composants d'intérêt constitutifs de la colle forment une composition liquide unique, par opposition aux colles bi-composants de l'art antérieur. Dans le cadre de l'invention, tout fibrinogène (Fbg) et facteur de coagulation activé 15 parmi le FXa, le FIXa ou le FXIa de l'art antérieur, de préférence recombinant, conviennent pour réaliser la colle, à condition toutefois qu'ils soient compatibles avec les ions calcium de la colle sous forme liquide ainsi obtenue, c'est-à-dire que leur mise en contact n'engendre pas la coagulation du fibrinogène en fibrine, notamment pendant au moins 24 heures avant utilisation. Les ingrédients actifs, doivent donc être dépourvus de 20 thrombine (Fila) résiduelle mais aussi de facteurs de la coagulation tels que, en présence d'ions calcium, la cascade de la coagulation intrinsèque ou extrinsèque ne soit déclenchée. Les termes « fibrinogène » et « facteur de coagulation » comprennent en outre les variations alléliques naturelles de ces protéines qui peuvent exister, et toute forme ou 25 degré de glycosylation ou autre modification post-traductionnelle. Ces termes incluent aussi les formes mutées de ces protéines qui présentent la même ou une activité biologique supérieure par rapport à l'activité de la forme sauvage, ces mutants incluant notamment les polypeptides différant de la protéine sauvage par insertion, délétion, ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés. On peut citer, à titre d'exemple, des 30 protéines sauvages ayant pour séquences les séquences ayant comme numéro d'accession GenBank CCA61112.1 (version du 23 mars 2011) pour le facteur IX, AAH46125.1, (version du 23 septembre 2014) pour le facteur X, ou encore AA122864.1, (version du 23 septembre 2014) pour le facteur Xl. Ainsi, dans le cadre de l'invention tout fibrinogène et facteur de coagulation activé 35 parmi le FXa, le FIXa ou le FXIa peuvent être alternativement sauvage ou muté.

3032621 5 A titre d'exemple, une teneur maximale acceptable en Fll dans le fibrinogène est d'environ 0,1 Ul/g de fibrinogène. De préférence, le fibrinogène et le facteur de coagulation activé de la colle ne proviennent pas d'un plasma préactivé.

5 Le fibrinogène, de préférence viralement sécurisé, peut être préparé par toute technique partielle ou complète de fractionnement plasmatique connue dans l'art antérieur. Il peut s'agir du procédé décrit dans EP 0 305 243 ou encore celui mis au point par la Demanderesse dans la demande de brevet FR 05 06640 selon lequel on peut obtenir un concentré de fibrinogène. On peut également mettre en oeuvre du fibrinogène 10 recombinant produit en lignée cellulaire ou par le biais d'animaux transgéniques, notamment dans leur lait. Il peut s'agir du fibrinogène transgénique produit et purifié selon le procédé décrit dans la demande de brevet W095/23868, W000/17234, W000/17239 ou W02009/134130, 15 La préparation des facteurs de coagulation activés FXa, FIXa et FXIa notamment sous la forme de concentré, de préférence viralement sécurisé, est également connue. On peut à titre d'exemple citer le brevet US2005209149 concernant le facteur IXa, le brevet W02008145989 concernant le facteur Xa et le brevet US5252217 concernant le facteur Xl. On peut également utiliser du facteur FXa, du FIXa ou du FXIa sauvage ou 20 muté, recombinant ou transgénique. Selon un mode de réalisation, la colle de l'invention comprend en outre du facteur XIII. Un apport exogène de facteur XIII favorise la réticulation du réseau de fibrine et, par conséquent, son pouvoir coagulant et cicatrisant. De préférence, la colle biologique comprend du FXIII lorsque le fibrinogène est recombinant.

25 Le facteur XIII, de préférence viralement sécurisé, peut être isolé à partir du plasma par toute méthode développée dans l'art antérieur et il pourra avantageusement constituer la protéine accompagnante du fibrinogène lors du fractionnement du plasma. On préfère, dans ce cas, mettre en oeuvre le procédé décrit dans la demande de brevet FR 05 06640. On peut également mettre en oeuvre du facteur XIII recombinant produit en 30 lignée cellulaire (mammifère ou de levure) ou par le biais d'animaux transgéniques, notamment dans leur lait. Ce principe actif doit toutefois répondre aux mêmes critères de pureté, énoncés plus haut, relatifs à la présence notamment de certains autres facteurs plasmatiques. Selon un autre mode de réalisation, la colle de l'invention comprend en outre au 35 moins un agent gélifiant. L'ajout de gélifiant permet de favoriser le contact de la colle à la plaie et de réduire ou éliminer les risques de dispersion de la colle biologique en dehors 3032621 6 de la zone de traitement en cas de saignements importants. La Demanderesse a également montré que la présence de gélifiant ne modifie pas la stabilité et l'effet coagulant de la colle biologique à température ambiante, par rapport à une formulation dépourvue d'agent gélifiant.

5 Dans ce mode de réalisation, l'agent gélifiant est de préférence un gélifiant pharmaceutiquement acceptable. Dans le cadre de la présente invention, un agent gélifiant fait référence à un agent gélifiant et/ou épaississant. Le ou les agent(s) gélifiant(s), peuve(nt) être de l'albumine, du chitosan, des carraghénanes, de l'iohexol, des alginates, de l'acide polyacrylique, du dextrane, des 10 poloxamères, du collagène, de la gélatine, du polyéthylène glycol, des acides polycarboxyliques, des polymères cellulosiques, de la polyvinylpyrrolidone, de la polyvinylpyrrolidone réticulée, des hydrogels, des polyanhydrides, des polyamides, des alcools polyvinyliques, des monomères vinyliques, des éthers vinyliques, des composés aromatiques polyvinyliques, des oxydes de polyéthylène, des glycosaminoglycanes, des 15 polysaccharides, des copolymères éthylène-acétate de vinyle, des polyesters, des polyacrylamides, des polyéthers, du polyether sulfone, du polycarbonate, des polyalkylènes, des polyalkylènes halogènes, des polyuréthanes, des polyorthoesters, des protéines, des polypeptides, des silicones, des polymères de siloxane, de l'acide polylactique, de l'acide polyglycolique, du polycaprolactone, du polyhydroxybutyrate 20 valerate et des mélanges et copolymères de ceux-ci, cette liste n'étant pas limitative. De préférence le ou les agent(s) gélifiants sont des dérivés d'un ou de plusieurs composé(s) d'origine naturel, animal ou végétal, comme la cellulose. II(s) peuve(nt) avantageusement être composé(s) d'hydroxypropylcellulose. L'agent gélifiant est de préférence une hydroxypropylcellulose de poids 25 moléculaire supérieur à 60 kDa, avantageusement de 500 à 2000 kDa, plus avantageusement de 500 à 1000 kDa. A titre d'exemple, le gélifiant utilisé peut être le Klucel MF (Ashland) de grade pharmaceutique. Selon un autre mode de réalisation, la colle biologique ne contient pas d'autre facteur de coagulation que le fibrinogène et un facteur de coagulation activé (choisi parmi 30 le FXa, le FIXa et le FXIa). Une telle colle présente l'avantage de ne nécessiter que deux facteurs de coagulation, ce qui limite notamment les coûts de préparation à l'échelle industrielle de la colle grâce à la présence d'un nombre minimal mais efficace de composants actifs. Selon un autre mode de réalisation, la colle biologique selon l'invention contient, 35 en plus du fibrinogène, plus d'un facteur de coagulation activé choisi parmi le FXa, le FIXa et le FXIa, soit deux ou trois de ces facteurs de coagulation activés.

3032621 7 Les sources d'ions calcium représentent des composants hydrosolubles, compatibles avec un usage clinique. De préférence, ces composants sont des sels inorganiques, tels que le chlorure de calcium (CaCl2) ou le gluconate de calcium. Les composants constitutifs de la colle sont présents en des quantités efficaces 5 permettant à la colle de répondre aux objectifs thérapeutiques recherchés. Ainsi, la colle biologique comprend avantageusement une teneur en fibrinogène de 0,1 mg à 100 mg par ml de colle biologique, en particulier de 0,1 à 60 mg/ml, et de façon plus préférée de 0,2 à 40 mg/ml, de 0,5 à 30 mg/ml, de 1 à 20 mg/ml, ou encore 3 à 10 mg/ml. De préférence, la teneur en fibrinogène est supérieure ou égale à 1 mg par ml de 10 colle biologique, de préférence égale à 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 mg par ml de colle biologique. La colle biologique comprend un facteur de coagulation activé parmi le FXa, le FIXa et le FXIa dont la teneur est de 0,01 à 5 pg par ml de colle biologique, de façon plus préférée de 0,10 à 4 pg/m1 de facteur activé, de 0,25 à 2 pg/m1 de facteur activé, de 0,25 15 à 1,5 pg/m1 de facteur activé. Si plusieurs facteurs de coagulation activés parmi FXa, FIXa et FXIa sont présents dans la colle biologique, alors la teneur de chacun des facteurs de coagulation activés est comprise entre 0,01 à 5 pg par ml de colle biologique, de façon plus préférée de 0,5 à 2 pg/ml.

20 Le cas échéant, le facteur XIII est présent à raison de 1 Ul/ml à 100 Ul/ml, de préférence de 3 Ul/ml à 20 Ul/ml. La colle biologique comprend de 1 !moles à 30 !moles de la source d'ions calcium par ml de colle biologique, de façon plus préférée de 4 à 20 pmole/m1 de la source d'ions calcium.

25 De préférence l'ajout d'agent gélifiant confère à la colle biologique une viscosité supérieure à 1 mPa.s. La viscosité de la colle biologique est par exemple de 1 à 50 mPa.s, ou encore de 5 à 50 mPa.s, notamment 5 à 20 mPa.s. Dans le contexte de l'invention, la viscosité de la colle biologique est mesurée par viscosimétrie avec un viscosimètre Kinematica Expert L. La solution de colle biologique 30 contenant du fibrinogène à 20 mg/ml a une viscosité de 5,4 mPa.s. Cette viscosité peut être augmentée par la présence d'au moins un agent gélifiant, dont la teneur est de 0,01% à 10 % en poids /volume (1% correspondant à 1g/100 ml) de façon plus préférée de 0,1% à 5 %, ou encore de 0,5 à 2%. Par exemple, l'ajout de gélifiant Klucell MF (Ashland) à 1% permet d'augmenter 35 par un facteur 3 la viscosité de la solution de colle biologique contenant du fibrinogène à 20 mg/ml pour atteindre 16,8 mPa.s.

3032621 8 Selon un mode de réalisation de l'invention, un mélange de plusieurs gélifiants peut être utilisé. Les concentrations et activités sont par millilitre de solution liquide finale de colle biologique.

5 Une telle solution peut notamment être obtenue par reconstitution des composants lyophilisés. Comme indiqué ci-dessus, ces facteurs présents de préférence à de telles concentrations assurent les fonctionnalités recherchées pour la présente colle biologique.

10 La colle biologique liquide selon l'invention est stable car ses composants peuvent être en présence en milieu liquide en vue d'une utilisation fonctionnelle de celle-ci, et ce même au moins pendant 24 heures précédant cette utilisation, sans risque d'un déclenchement prématuré du processus de la coagulation. Cette stabilité de la colle est vérifiée, dans la mesure où l'on n'observe pas de fibrinoformation pendant 24 heures 15 d'incubation à température ambiante. La colle biologique de l'invention remplit sa fonction réparatrice de tissus une fois appliquée au niveau de la plaie ou du tissu cruenté, car la thrombine est formée in situ par contact de la colle biologique sur la plaie ou sur le tissu cruenté. En effet, cette formation de thrombine in situ est assurée par le facteur de 20 coagulation activé choisit parmi le FXa, le FIXa ou le FXIa qui est donc mis en contact avec tous les composants plasmatiques autorisant le déclenchement et le déroulement de la voie extrinsèque ou intrinsèque de la coagulation. Lorsque la colle biologique contient du FIXa ou le FXIa, celui-ci enclenche la voie intrinsèque de la coagulation en présence d'ions calcium et transforme le facteur X présent dans le plasma en facteur X activé, 25 lequel transforme la prothrombine en thrombine, enzyme responsable de la formation du caillot en générant la fibrine en présence de fibrinogène. Lorsque la colle biologique contient du FXa, celui-ci transforme la prothrombine du patient en thrombine, en présence d'ions calcium, enclenchant la formation du caillot. Il se produit alors une fibrinoformation et, par conséquent, le pouvoir adhésif de la colle biologique obtenue s'en trouve renforcé, 30 car la fibrine se forme alors directement au niveau de la plaie ou du tissu à réparer par chirurgie, où le facteur de coagulation activé et les composants cellulaires phospholipidiques sont exposés. Bien que le fibrinogène et les ions calcium soient déjà présents naturellement dans le sang, leur apport permet de renforcer et d'accélérer davantage encore le processus de réunion tissulaire et d'hémostase par la colle 35 biologique de l'invention. Ceci constitue un avantage décisif de la présente colle.

3032621 9 La colle biologique de l'invention présente de nombreux autres avantages. Sa mise à disposition évite les inconvénients de manipulation et préparation des colles biologiques de l'art antérieur, notamment dans le cas de situations d'urgences, ce qui améliore ses aptitudes de collage tissulaire, en termes de déhiscence et d'absence de 5 saignements secondaires au niveau de la cicatrice en formation. Typiquement, le processus de réunion peut être efficacement réalisé en moins de trois minutes, par exemple en 90 s. A titre d'exemple, la colle de l'invention évite la formation de « paquets » ou amas de fibrine visibles au niveau d'une plaie qui s'expliquerait par une prise inhomogène de la 10 colle, probablement à cause de la fibrine formée avant adhésion. La cicatrice formée présentant en outre un trait net, par rapport à un collage à durée égale obtenu en utilisant, par exemple, une colle biologique bi-composant à base d'une part, d'un mélange de fibrinogène et contenant du facteur XIII, et, d'autre part, d'un mélange de thrombine calcique, pour lequel on n'observe pas les effets ci-dessus.

15 Elle est simple à préparer et est d'une stabilité accrue dans le temps, dans la mesure où l'on n'observe pas de fibrinoformation pendant 24 heures d'incubation à 25°C. A titre d'exemple, elle est stable sous forme liquide pendant au moins 24 heures à température ambiante, en particulier pendant au moins 2, 4 ou 6 jours.

20 Comme indiqué ci-dessus, la colle biologique de l'invention est prête à l'emploi et comprend un mélange homogène de tous les composants sous forme liquide. Elle peut également se présenter sous la forme congelée, ce qui la rend apte à un stockage prolongé sous cette forme au moins pendant 2 ans sans risque d'une fibrinoformation, qui serait observée, le cas échéant, après décongélation. Il suffit d'une simple remise à 25 température ambiante pour que la colle puisse être utilisée. L'invention concerne également une colle biologique à usage thérapeutique, exempte de thrombine, à base de fibrinogène, comprenant au moins un facteur de coagulation activé sélectionné dans le groupe constitué de FXa, FIXa et FXIa, et une 30 source d'ions calcium se présentant sous la forme lyophilisée, apte à un stockage prolongé. Elle peut être obtenue par la mise en oeuvre de techniques de lyophilisation connues de la colle sous forme liquide comprenant avantageusement, à cet effet, une formulation stabilisante de lyophilisation pharmaceutiquement acceptable. La mise à disposition d'une telle présentation de la colle présente l'avantage décisif de ne nécessiter 35 qu'une simple reconstitution du lyophilisat comprenant les facteurs de coagulation, la source d'ions calcium et éventuellement le(s) gélifiant(s) dans un solvant ou milieu aqueux 3032621 10 biologiquement compatible pour obtenir la colle liquide stable, cette préparation étant effectuée à l'avance en prévision de l'utilisation. De plus, une telle colle lyophilisée est très facilement stockable à température ambiante pendant au moins 2 ans sans risque d'une fibrinoformation, qui serait observée, le cas échéant, après reconstitution. Elle est 5 aisément transportable jusqu'à un site où un patient requiert un usage de cette colle. Kit L'invention concerne également un kit pour la préparation de la colle biologique selon l'invention comprenant des moyens de conditionnement comprenant un lot de 10 fibrinogène lyophilisé, un lot de facteur de coagulation activé lyophilisé sélectionné dans le groupe constitué du FXa, du FIXa et du FXIa, un lot de source d'ions calcium sous la forme de poudre et un solvant aqueux. Un tel kit comprenant notamment trois lots différents, individuels, sous forme sèche, chacun comprenant l'un, particulier, des composants constitutifs de la colle de 15 l'invention, constitue en fait un produit intermédiaire dont il sera ensuite facile de réunir et de dissoudre les lots dans un solvant ou milieu aqueux biologiquement compatible, tel que l'eau purifiée pour injection (PPI), pour l'obtention de la colle biologique liquide stable de l'invention, concentrée au besoin, qui peut ensuite être congelée. L'avantage de mettre à disposition un tel kit est la possibilité d'un stockage prolongé des trois lots de 20 composants différents au moins pendant 2 ans à température ambiante, sans l'observation d'une fibrinoformation après reconstitution, et l'obtention de la colle biologique liquide et stable par simple dissolution. Selon un mode de réalisation de l'invention, le dit kit comprend en outre un lot d'au moins un gélifiant sous forme sèche.

25 Les moyens de conditionnement constituent en fait des moyens permettant de stocker en particulier les composants de la colle, de préparer et de distribuer la colle avant utilisation. Ils comprennent en outre avantageusement au moins un récipient pour au moins trois des composants différents de la colle, dont, de préférence, au moins un pour chaque composant. Chaque récipient est destiné à recevoir l'un des composants qui 30 est ensuite dissous dans le solvant aqueux. Les récipients peuvent être des flacons en divers matériaux de type verre et polymères biologiquement compatibles. De préférence, les moyens de conditionnement peuvent être avantageusement un récipient unique contenant au moins les trois composants. Un tel conditionnement présente l'avantage qu'une simple dissolution de l'ensemble fournit directement la colle 35 liquide prête à l'emploi.

3032621 11 Avantageusement, le kit comprend également un dispositif de distribution de la colle liquide une fois préparée par dissolution des lots ci-dessus avec le solvant aqueux. Un tel dispositif représente par exemple une seringue de volume approprié en fonction de la dose de colle à délivrer comportant une aiguille permettant de déposer le produit, ou 5 bien un vaporisateur qui permet de distribuer un faible volume de produit sur une grande surface, ou bien un pinceau qui permet d'étaler un faible volume de colle. De préférence, le kit ci-dessus comporte un lot multi-composant de mélange des lots desdits facteurs lyophilisés (c'est-à-dire le fibrinogène, les facteurs de coagulation activés et éventuellement le facteur XIII) et un lot de source d'ions calcium sous la forme 10 de poudre. Ce kit comprend donc, d'une part, un lot de mélange lyophilisé des facteurs de coagulation de l'invention, et, d'autre part, un lot de la source d'ions calcium sous forme de poudre, susceptible d'être également sous la forme d'un lyophilisat, qu'il suffira simplement de réunir et de mélanger avec un milieu aqueux, tel que l'eau PPI, avant utilisation. Avantageusement, le kit peut comprendre un lot de mélange lyophilisé des 15 facteurs de coagulation, et, d'autre part, un lot de la source d'ions calcium sous forme de solution aqueuse. De préférence, le kit de l'invention est caractérisé par le fait que chaque lot de facteur de coagulation, ou le lot multi-composant du mélange desdits lots des facteurs lyophilisés comprend des constituants d'une formulation stabilisante de lyophilisation 20 pharmaceutiquement acceptable. Il en est de même de la colle biologique lyophilisée. En effet, les différents lyophilisats des facteurs de coagulation sont obtenus par lyophilisation des concentrés ou solutions liquides des facteurs ou de chacun de ces facteurs, selon des techniques classiquement mises en oeuvre, comprenant avantageusement, à cet effet, une formulation stabilisante de lyophilisation.

25 La formulation stabilisante peut également, en tant que de besoin, comprendre des adjuvants stabilisants connus dans la technique. Par conséquent, l'invention concerne également un kit selon l'invention pour son utilisation à la préparation d'une colle biologique, par reconstitution des lots dudit kit dans un solvant aqueux biologiquement compatible suivie, le cas échéant, d'une congélation.

30 Applications thérapeutiques L'invention concerne également une colle biologique telle que décrite plus haut pour son utilisation comme médicament. Dans le cas où la colle est stockée sous la forme congelée, il suffira, 35 préalablement à l'utilisation, de dégeler celle-ci.

3032621 12 Dans le cas d'une colle lyophilisée seule ou au contact d'un tissu, la reconstitution dans un solvant aqueux biologiquement compatible permet de l'utiliser pour les effets recherchés. Dans le cas d'une formulation liquide ou d'un tissu imbibé, la colle sera prête à 5 l'emploi. La colle biologique de l'invention est donc utilisée pour stimuler le retour à l'hémostase et/ou favoriser l'adhésion et/ou la cicatrisation de tissus biologiques, tels que la peau ou tout organe susceptible d'interventions chirurgicales (rate, foie, poumons intestins etc.), qui, comme explicité précédemment, peuvent représenter les tissus 10 cruentés ou les plaies hémorragiques, dont le saignement peut même être très faible dans la mesure où tous les facteurs nécessaires à la cascade de la coagulation sont présents. La colle de l'invention peut être utilisée, en présence de plasma, pour la préparation d'un médicament, ce dernier étant avantageusement destiné à traiter les 15 tissus lésés, par exemple pour réunir ces tissus, choisis dans le groupe constitué par le cartilage, le collagène, l'os et la poudre d'os. De plus, en présence de plasma, elle est également utilisée pour la préparation d'un médicament destiné à réunir les biomatériaux choisis dans le groupe constitué par les alginates ou l'acide polylactique. La présence de plasma peut par conséquent être 20 utile dans certains cas pour l'apport exogène des facteurs plasmatiques afin d'initier la cascade de la coagulation, et, de préférence, est du plasma compatible ou autologue. Cet apport pourra notamment être effectué dans le cadre d'interventions chirurgicales classiques, en stomatologie ou odontologie. Le tissu biologique peut également provenir de cellules-souches mises en culture 25 et différenciées. Bien que la colle de l'invention soit un médicament, en particulier un pansement à application locale, c'est-à-dire à usage externe sur une plaie ou autre comme décrit plus haut, il n'est pas exclu que le médicament puisse également être une gélule adaptée, gastrorésistante ou non, dans laquelle la colle biologique est sous forme sèche, et ingérée 30 pour le traitement d'un saignement digestif. La colle permet d'apporter une hémostase à travers un système endoscopique utilisé en microchirurgie (prélèvements, biopsies, excision de polypes etc.). La fluidité de la présente colle, rend possible son utilisation à travers d'une aiguille fine, typiquement de diamètre inférieur à 1 mm, en particulier inférieur à 0,5 mm, pour une 35 application en chirurgie sous microscope, par exemple ophtalmique.

3032621 13 Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois en limiter la portée. FIGURES Les figures 1-4 montrent la représentation graphique du thromboélastogramme 5 obtenu pour chacune des colles testées, permettant de comparer l'utilisation du FVIIa et du FXa. Les temps total de coagulation (CT+CFT, figure 1), la fermeté maximale du caillot (MCF, figure 2), l'amplitude de formation du caillot (figure 3) et le ratio d'efficacité : rapport de la fermeté maximale sur le temps total de formation du caillot MCF/(CT+CFT) (figure 4) sont présentés.

10 Les figures 5-7 montrent la représentation graphique du thromboélastogramme obtenu pour chacune des colles testées, permettant de comparer l'utilisation du FVIIa et du FIXa. Les temps total de coagulation (CT+CFT, figure 5), la fermeté maximale du caillot (MCF, figure 6) et le ratio d'efficacité MCF/(CT+CFT) (figure 7) sont présentés. Les figures 8-11 montrent la représentation graphique du thromboélastogramme 15 obtenu pour chacune des colles testées, permettant de comparer l'utilisation du FVIIa et du FXIa. Les temps total de coagulation (CT+CFT, figure 8), la fermeté maximale du caillot (MCF, figure 9), l'amplitude de formation du caillot (figure 10) et le ratio d'efficacité MCF/(CT+CFT) (figure 11) sont présentés. Les figures 12-14 montrent la stabilité des solutions de colle biologique contenant 20 les FIXa, FXa et FXIa au cours du temps. La figure 12 montre les temps de coagulation totaux (CT+CFT) obtenus pour les trois mélanges. La figure 13 montre la fermeté maximale des caillots (MCF) des trois mélanges au cours du temps. La figure 14 montre le ratio d'efficacité des trois mélanges (MCF/CT+CFT) au cours du temps. Les figures 15 à 20 présentent la comparaison des solutions de colle avec ou sans 25 gélifiant en indiquant les temps de coagulation totaux (figures 15, 17 et 19) et les le ratio d'efficacité (figures 16, 18 et 20). Les figures 15 et 16 concernent la colle avec FIXa, les figures 17 et 18 la colle avec FXa et les figures 19 et 20 la colle contenant du FXIa. Les figures 21 et 22 comparent les temps totaux de coagulation et le ratio d'efficacité des différents facteurs de coagulation utilisés à leur optimum de concentration 30 dans des colles avec ou sans gélifiant. EXEMPLES Exemple 1 : Evaluation d'une colle biologique à base de facteur X activé 3032621 14 Six colles sont préparées suivant les concentrations décrites dans le tableau 1. Les colles sont testées dans des milieux comprenant du plasma (Unicalibrator, STAGO), du Facteur Tissulaire (FT) et des Phospholipides (« PL », PPP Reagent Low STAGO). Le Facteur Tissulaire et les Phospholipides sont repris par 0,6 ml de CaCl2 à 60 5 mM. Ces composés vont servir d'inducteurs in vitro à la prise de la colle. Lors de l'application in vivo chez le patient, ces composés seront présents dans les traces de sang et de plasma issues de la plaie et les tissus sous-endothéliaux. Le fibrinogène est pré-dilué à 22,2 mg/ml dans un tampon Hepes 25mM, NaCI 175 mM à pH 7,4. Le facteur Vila est pré-dilué à 132 pg/m1 ou le FXa (HTI) est pré-dilué 10 respectivement à 32,85-24,6-16,4 et 8,21 pg/ml, chacun dans un tampon Hepes 25mM, NaCI 175 mM à pH 7,4. Les réactifs sont mélangés entre eux et la mesure de formation du caillot est réalisée par l'automate ROTEM. Les concentrations finales de chacun des réactifs sont indiquées dans le tableau 1. L'évolution de chaque échantillon est suivie par thromboélastographie. Chaque 15 condition est réalisée en duplicate et l'expérience est répétée deux fois. Les figures 1 à 4 sont représentatives des résultats obtenus. Tableau 1 : Condition 1 Condition 2 Condition 3 FT 0,5 pM FT 0,5 pM FT 0,5 pM PL 21..1M PL 21..1M PL 21..1M Ca 2+ 3 mM Ca 2+ 3 mM Ca 2+ 3 mM Fibrinogène 20 mg/ml Fibrinogène 20 mg/ml Fibrinogène 20 mg/ml FVIIa 4 pg/mI FXa 1 pg/mI FXa 0,75 pg/mI Plasma 5% Plasma 5% Plasma 5% Condition 4 Condition 5 Condition 6 FT 0,5 pM FT 0,5 pM FT 0,5 pM PL 21..1M PL 21..1M PL 21..1M Ca 2+ 3 mM Ca 2+ 3 mM Ca 2+ 3 mM Fibrinogène 20 mg/ml Fibrinogène 20 mg/ml Fibrinogène 20 mg/ml FXa 0,5 pg/mI FXa 0,25 pg/mI FXa 0 pg/mI Plasma 5% Plasma 5% Plasma 5% 20 L'analyse des données ROTEM a permis de déterminer pour chaque condition le temps de coagulation (CF), le temps de formation du caillot (CFT), deux paramètres cinétiques qui caractérisent la rapidité de coagulation de la solution. Pour plus de simplicité, la valeur correspondant à la somme de ces deux paramètres (CT+CFT) est 3032621 15 présentée, correspondant au temps total de formation du caillot. Les résultats de ce dernier paramètre sont présentés figure 1. En contrôle négatif, la gélification sera observée en présence des inducteurs de la coagulation mais sans facteurs de coagulation. En contrôle positif, la gélification sera observée en présence des inducteurs 5 de la coagulation (0,5 pM de facteur tissulaire, 4 pM de phospholipides, 5% de plasma humain et 5 pM de CaCl2 dans une petite cupule de ROTEM (500 pl) et de facteur Vila (3 à 5 pg/ml). Le temps total de formation du caillot est diminué en présence de FXa par rapport à une gélification sans facteurs de coagulation (0 pg/ml FXa). La présence de FXa est plus efficace que celle du FVIIa puisque le temps total est raccourci (414 s contre 10 environ 183 s. en moyenne pour toutes les doses de FXa). Il n'y a pas de différence significative entre les temps obtenus pour les différentes doses de FXa. La fermeté maximale du caillot au bout d'une heure a ensuite été évaluée dans les mêmes conditions (figure 2). Toutes les mixtures permettent d'atteindre une fermeté à environ 89 mm au bout d'une heure. La mesure cinétique de cette fermeté montre que toutes les colles se 15 comportent de manière similaire avec un avantage pour les concentrations de FXa les plus faibles (0,25 et 0,5 pg/ml) (figure 3). Le rapport de la fermeté maximale sur le temps total de formation du caillot (MCF/CT+CFT) permet d'identifier les mixtures les plus efficaces. En effet, plus ce rapport est élevé plus un caillot solide se forme en un temps court. Les valeurs de ce rapport sont présentées dans la figure 4. Elles varient de 0,16 +/- 20 0,02 mm/sec pour un contrôle sans facteur de coagulation à 0,66 +/- 0,11 mm/sec pour un gel de fibrine formé en présence de 0,75 pg/ml de FXa. Ces résultats montrent que la présence de FXa permet de former de manière efficace un gel de fibrine à partir d'une solution de fibrinogène en présence d'inducteurs de la coagulation avec un optimum de concentration de FXa à 0,75 pg/ml.

25 Exemple 2 : Evaluation d'une colle biologique à base de facteur IX activé Des colles biologiques sont préparées comme décrit dans l'exemple 1 mais en substituant le FXa par du facteur IX activé (FIXa) à différentes concentrations. Les concentrations en facteur IX activé testées sont comprises entre 0,5 pg/ml et 2 pg/ml. Les 30 inducteurs et les contrôles positif et négatif sont aussi identiques. Les temps totaux de formation du caillot sont présentés en figure 5. La présence de FIXa sauf à la concentration de 0,75 pg/ml raccourcit les temps de formation du caillot par rapport au FVIIa ou au contrôle négatif. La concentration de 1,5 pg/ml FIXa est la plus efficace. La fermeté maximale du caillot est retrouvée autour de 86 mm comme en présence de FXa 35 ou FVIIa sans différence significative entre les différentes concentrations de FIXa (figure 3032621 16 6). Le rapport de la fermeté maximale sur le temps total de formation du caillot a été calculé et confirme que la concentration à 1,5 pg/mIde FIXa est la plus efficace (figure 7). Ces résultats montrent que la présence de FIXa permet de former de manière efficace un gel de fibrine à partir d'une solution de fibrinogène en présence d'inducteurs 5 de la coagulation avec un optimum de concentration de FIXa à 1,5 pg/ml. Exemple 3 : Evaluation d'une colle biologique à base de facteur XI activé Des colles biologiques sont préparées comme décrit dans l'exemple 1 mais en substituant le FXa par du facteur XI activé (FXIa) à différentes concentrations. Les 10 concentrations en facteur XI activé testées sont comprises entre 0,25 pg/m1 et 4 pg/ml. Les inducteurs et les contrôles positif et négatif sont aussi identiques à ceux de l'exemple 1. Les temps totaux de formation du caillot sont présentés en figure 8. Le temps total de formation du caillot est identique pour des concentrations de FXIa supérieures à 0,5 pg/ml. La présence de FXIa (au-dessus de 0,5 pg/m1) diminue le temps de formation du 15 gel puisque sans FXIa, le temps de formation du gel est de 554 s, alors qu'en sa présence il est en moyenne de 313 s. La fermeté maximale des caillots a été mesurée (figure 9). Elle augmente avec la concentration de FXIa pour atteindre un optimum à 92 mm en présence de 1 pg/m1 de FXIa. La fermeté diminue un peu dans les plus fortes concentrations de FXIa. La cinétique de l'augmentation de la fermeté montre que la 20 concentration de FXIa à 1 pg/m1 est la plus efficace suivie par 0,75 et 1,5 pg/m1 (figure 10). La concentration à 0,25 pg/m1 est la moins efficace des doses. Le rapport de la fermeté maximale sur le temps total de formation du caillot confirme ces résultats et identifie la dose de 1 pg/mIde FXIa comme l'optimum de concentration (figure 11). Ces résultats montrent que la présence de FXIa permet de former de manière 25 efficace un gel de fibrine à partir d'une solution de fibrinogène en présence d'inducteurs de la coagulation avec un optimum de concentration de FXIa à 1,0 pg/ml. Exemple 4: Evaluation de la stabilité des colles biologiques utilisant le facteur Xa, le facteur IXa ou le facteur Xla 30 Trois colles biologiques distinctes ont été réalisées en utilisant les concentrations optimales de facteurs de coagulation activés qui ont été mises en évidence: soit 0,75 pg/m1 FXa, 1 pg/m1 FXIa et 1,5 pg/m1 FIXa. Le mélange fibrinogène (à 20 mg/ml)/facteur de coagulation a été incubé de 0 à 10 jours à température ambiante (25°C). Puis le pouvoir gélifiant de ce mélange a été évalué en ajoutant les inducteurs (plasma ; 35 phospholipides, facteur tissulaire et calcium) comme décrit dans l'exemple 1.

3032621 17 La mesure du temps total de formation du caillot n'a été possible que sur deux jours pour le mélange FXa/fibrinogène car ce mélange a ensuite polymérisé et ne pouvait plus réagir au-delà de cette date (figure 12). Les mélanges contenant du FIXa et du FXIa sont restés actifs pendant 10 jours mais une augmentation progressive du temps de 5 coagulation a été détectée (figure 12). Ce phénomène corrèle avec une diminution modérée mais continue de la fermeté du caillot (figure 13). A noter que ce paramètre n'a pas pu être obtenu sur plus de deux jours pour le FXa à cause de la polymérisation du réactif précité. Le rapport de la fermeté maximale sur le temps total de formation du caillot illustre ces résultats puisqu'il diminue de manière constante au cours du temps 10 pour les trois produits (figure 14). Les mélanges à base de facteurs de coagulation FIXa, FXa et FXIa et de fibrinogène conservent leur propriété au moins 24h ce qui permet leur utilisation sur la journée dans le cadre d'une opération chirurgicale.

15 Exemple 5 : Gélification des solutions de colle biologique à base de FIXa, FXa ou FXIa L'effet d'un agent gélifiant dérivé de cellulose (Klucell MF 1%) a été évalué sur l'efficacité in vitro des colles à base de FIXa, FXa et FXIa. Comme précédemment les paramètres cinétiques et qualitatifs de la gélification des colles biologiques ont été 20 mesurés par le biais d'une analyse thromboélastrométrique (ROTEM) en présence de 20 mg/mi de fibrinogène et des inducteurs décrits (facteur tissulaire 0,5 pM, phospholipides 2 ptM et de plasma 5%). Le temps total de formation du gel (CT+CFT) ainsi que le ratio d'efficacité (MCF/ CT+CFT) sont présentés dans les figures 15 à 20. La présence de FIXa en concentration variable (0,5 à 2 pg/m1) dans une solution 25 de fibrinogène en présence de calcium permet de raccourcir le temps de coagulation total de 549 s à 220 à 258 s (figure 15). En présence de Klucell MF 1% ces temps varient de 217s à 343 s sans que ces variations ne soient significativement différentes. Le ratio d'efficacité de la coagulation sans gélifiant est trouvée de 0,34 à 0,40 mm/s et de 0,18 à 0,37 mm/s avec gélifiant sans différence significative (figure 16).

30 La présence de FXa en concentration variable (0,25 à 1 pg/m1) dans une solution de fibrinogène en présence de calcium permet de raccourcir le temps de coagulation total de 564 s (témoin sans facteur de coagulation) de 132 à 337 s (figure 17). En présence de Klucell MF 1% ces temps varient de 127 à 219 s sans que ces variations ne soient significativement différentes. Le ratio d'efficacité de la coagulation sans gélifiant est 35 trouvée de 0,5 à 0,69 mm/s et de 0,63 à 0,74 mm/s avec gélifiant sans différence significative due à la présence du gélifiant (figure 18).

3032621 18 La présence de FXIa en concentration variable (0,25 à 4 pg/m1) dans une solution de fibrinogène (20 mg/ml) en présence de calcium permet de raccourcir le temps de coagulation total de 402 s (témoin sans facteur de coagulation) à 214 à 450 s (figure 19). Dans cette expérience, les doses de FXIa de 0,25 et 0,5 pg/m1 ne sont pas suffisantes 5 pour raccourcir les temps de coagulation par rapport au témoin. En présence de Klucell MF 1%, ces temps varient de 229 à 334 s. Pour les faibles doses de FXIa (0,25 et 0,5 pg/m1), la présence de gélifiant semble diminuer les temps de coagulation. Pour les autres doses, la présence de gélifiant ne modifie pas les paramètres de gélification. Bien que cela n'a pas été observé en particulier pour les deux autres facteurs de 10 coagulation testés (FIXa et FXa), Le temps total de coagulation est fonction de la concentration de FXIa supplémenté ; plus la dose de FXIa ajoutée est forte plus le temps de coagulation est raccourci. Le ratio d'efficacité de la coagulation, c'est-à-dire le rapport de la fermeté maximale sur le temps total de formation du caillot, augmente logiquement en fonction de 15 la concentration de FXIa. Sans gélifiant il est trouvée de 0,25 à 0,41 mm/s et de 0,24 à 0,37 mm/s avec gélifiant sans différence significative due à la présence de gélifiant (figure 20). Exemple 6: Comparaison de l'efficacité des différents facteurs de coagulation 20 utilisés à leur optimum Les données obtenues ont permis la fixation de l'optimum d'action du FIXa à 0,75 pg/ml, du FXa à 1 pg/m1 et du FXIa à 1,5 pg/ml. Les temps de coagulation total et le ratio d'efficacité des différents facteurs de coagulation à ces trois concentrations ont été placés pour comparaison cotes à cotes sur un graphique (respectivement figures 21 et 22). Les 25 FIXa et FXIa ont des valeurs quasiment identiques alors que le FXa est le plus efficace des facteurs puisqu'il diminue significativement le temps de coagulation et augmente en proportion l'efficacité de la réaction. Ces figures confirment aussi que l'ajout de gélifiant Klucell MF à 1 % n'affecte pas les paramètres mesurés tout en accroissant la gélification de la solution. 30

Claims (20)

1. REVENDICATIONS1.- Colle biologique liquide, à usage thérapeutique, exempte de thrombine, comprenant du fibrinogène, au moins un facteur de coagulation activé sélectionné dans le groupe constitué du facteur Xa, du facteur IXa et du facteur Xla, et d'une source d'ions calcium.
2. 2.- Colle biologique selon la revendication 1, comprenant une teneur en fibrinogène de 0,1 mg à 100 mg par ml de colle biologique.
3. 3.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 2, comprenant une teneur en ledit au moins un facteur de coagulation activé de 0,01 pg à 5 pg par ml de colle biologique.
4. 4.- Colle biologique selon la revendication 3, dans laquelle ledit au moins un facteur de coagulation activé et/ou le fibrinogène sont recombinants.
5. 5.- Colle biologique selon la revendication 3, dans laquelle ledit au moins un facteur de coagulation activé et/ou le fibrinogène sont mutés.
6. 6.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 5, comprenant de 1 !moles à 30 !moles de la source d'ions calcium par ml de colle biologique.
7. 7.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle ledit au moins un facteur de coagulation activé est le facteur Xa.
8. 8.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 7, comprenant en outre du facteur XIII.
9. 9.- Colle biologique selon la revendication 8 dans laquelle le facteur XIII est présent à raison de 1 UI à 100 UI par millilitre de solution finale de colle biologique.
10. 10.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 9, comprenant en outre au moins un agent gélifiant. 3032621 20
11. 11.- Colle biologique selon la revendication 10, dans laquelle le ou les agent(s) gélifiant(s) sont pharmaceutiquement acceptable(s).
12. 12.- Colle biologique selon l'une des revendications 10 à 11, dans laquelle l'ajout 5 d'agent gélifiant confère à la colle une viscosité supérieure à 1 mPa.s.
13. 13.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 12 se présentant sous forme congelée. 10
14. 14.- Colle biologique, l'une des revendications 1 à 12, se présentant sous forme lyophilisée.
15. 15.- Colle biologique selon la revendication 14, comprenant des constituants d'une formulation stabilisante de lyophilisation pharmaceutiquement acceptable. 15
16. 16.- Kit pour la préparation de la colle biologique selon l'une des revendications 1 à 12, comprenant des moyens de conditionnement comprenant un lot de fibrinogène lyophilisé, un lot de facteur de coagulation activé lyophilisé sélectionné dans le groupe constitué du facteur Xa, du facteur IXa et du facteur Xla, et un lot de source d'ions 20 calcium sous la forme de poudre et un solvant aqueux.
17. 17.- Kit selon la revendication 16, comprenant également un dispositif de distribution de la colle une fois préparée par dissolution desdits lots avec le solvant aqueux.
18. 18.- Kit selon l'une des revendications 16 à 17, pour son utilisation à la préparation d'une colle biologique telle que définie selon l'une des revendications 1 à 15 par reconstitution des lots dudit kit dans un solvant aqueux biologiquement compatible suivie, le cas échéant, d'une congélation.
19. 19.- Colle biologique telle que définie selon l'une des revendications 1 à 15 pour son utilisation comme médicament.
20. 20.- Colle biologique selon l'une des revendications 1 à 15, pour son utilisation 35 pour stimuler le retour à l'hémostase et/ou favoriser l'adhésion et/ou la cicatrisation de tissus biologique. 25 30