DE69231791T2 - Verbesserter Gewebekleber, zubereitet aus Kryopräzipitat - Google Patents

Description

• Diese Erfindung bezieht sich auf einen zweikomponentigen Gewebekleber mit zwei getrennten Komponenten A und B, ein Verfahren zur Herstellung des Gewebeklebers, die Verwendung einer großen Menge Aprotinin sowie die Verwendung eines proteolytischen Enzyms aus einem Schlangengift zur Herstellung eines Gewebeklebers.
• Die Verbesserung der lokalen Hämostase an der Stelle einer Operationswunde durch Auftragung von Plasmaproteinen ist ein wohlbekanntes Konzept. So werden Fibrinpflaster für die Hämostase in der Gehirnchirurgie verwendet. Blutplasma und Thrombin wurden verwendet, um einen Fibrinfilm über der Operationswunde zu erzeugen. In den letzten 20 Jahren gab es viele Veröffentlichungen, die Anwendungen von "Fibrinleim" oder "Fibrinkleber" oder "Fibrin-Dichtungsmittel" für die meisten chirurgischen Disziplinen beschrieben. In den letzten 10 Jahren wurden kommerzielle Präparate des "Klebers" in Europa verbreitet verwendet. Der "Kleber" besteht aus zwei Komponenten, während ein Gemisch dieser Komponenten ein Gerinnsel erzeugt. Die erste Komponente ist ein Fibrinogenkonzentrat. Dieses Konzentrat enthält auch Fibronectin und Faktor XIII, die für die Stabilisierung und Festigkeit des Gerinnsels wichtig sind. Die zweite Komponente ist Thrombin, ein aktives Enzym, das Fibrinogen, die letzte Komponente des normalen Gerinnungssystems, in ein Fibringerinnsel umwandelt. Dieser Vorgang umgeht die meisten Schritte der normalen Gerinnung und ahmt seine letzte Phase nach. Einige Hersteller fügen Plasminogen hinzu, ein Enzym, das nach einiger Zeit die Auflösung des Gerinnsels induziert, während andere Aprotinin, das ein Inhibitor von Proteasen ist, hinzufügen, um die Auflösung des Gerinnsels zu verhindern.
• Diese Produkte liefern zwar bei Patienten befriedigende Ergebnisse, wenn auch mit leichten Blutungsstörungen, doch Patienten, die unter schweren Blutungsstörungen, wie Hämophilie A oder B, leiden, haben immer noch ein sehr hohes Risiko der postoperativen Blutung. Zuweilen kommt im Durchschnitt nach Tagen zu verspäteten Blutungskomplikationen aufgrund der Operation. Außerdem können Patienten, die mit Antikoagulationsfaktoren behandelt werden, nicht mit dem Gewebekleber des Standes der Technik behandelt werden. Ein weiterer schwerer Nachteil der kommerziellen Konzentrate sind die hohen Produktionskosten.
• WO-A-86/01814 offenbart ein Verfahren zur Herstellung einer kryopräzipitierten Suspension, die Fibrinogen und Faktor VIII enthält und als Vorstufe für die Herstellung eines Fibrinklebers geeignet ist, wobei das Verfahren folgendes umfasst: (a) das Einfrieren von frischem gefrorenem Plasma von einem einzelnen Spender, wie einem Menschen oder Tier, der bzw. das auf blutübertragbare Krankheiten durchmustert wurde, bei etwa -80ºC während wenigstens etwa sechs Stunden; (b) Erhöhung der Temperatur des gefrorenen Plasmas, z. B. auf zwischen etwa 0ºC und Raumtemperatur unter Bildung eines Überstands und einer kryopräzipitierten Suspension, die Fibrinogen und Faktor VIII enthält; und (c) Gewinnen der kryopräzipitierten Suspension. Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines für chirurgische Maßnahmen geeigneten Fibrinklebers offenbart, welches folgendes umfasst: (a) Herstellen einer kryopräzipitierten Suspension, wie es oben beschrieben ist; (b) Aufbringen eines definierten Volumens der Suspension auf eine gewünschte Stelle; und (c) Aufbringen einer Zusammensetzung, die eine ausreichende Menge Thrombin enthält, auf die Stelle, so dass eine Umwandlung des Fibrinogens in der Suspension in den Fibrinkleber bewirkt wird, welcher sich dann verfestigt.
• EP-A-0 341 007 offenbart einen chirurgischen Kleber, der in einer wässrigen Zusammensetzung Eigenplasma des Patienten, Collagen, Thrombin und gegebenenfalls ein antifibrinolytisches Mittel umfasst. Der Patientenkleber wird ohne Verwendung irgendwelcher zugesetzter Reagentien für die Konzentration oder Isolation des Fibrinogens aus dem Plasma des Patienten gebildet. Zweckmäßigerweise wird der Kleber als zweikomponentige Zusammensetzung zubereitet, die unmittelbar vor der Verwendung zusammengemischt wird.
• EP-A-0 253 198 offenbart einen einkomponentigen Gewebekleber, der eine wässrige Lösung mit Fibrinogen, Faktor VIII, einem Thrombin-Inhibitor, Prothrombinfaktoren, Calciumionen und gegebenenfalls einem Plasmin-Inhibitor aufweist. Der Gewebekleber kann aus einer lyophilisierten Probe rekonstituiert werden, indem man Wasser hinzufügt. Der Gewebekleber kann alle aktive Substanzen in einer pasteurisierten Form enthalten, um die Übertragung von Hepatitis und HTLV III zu vermeiden.
• WO-A-91/01762 offenbart ein Verfahren zum Pasteurisieren eines Gemischs von Proteinen, das hauptsächlich Fibrinogen enthält, durch Erhitzen des Gemischs unter Bedingungen, die eine Pasteurisierung gewährleisten, wobei das Gemisch in Gegenwart von Monosaccharid und eines alkoholischen Zuckers pasteurisiert wird. Dieser Gewebekleber kann ausgehend von Kryopräzipitat hergestellt werden. Es wird ein Konzentrationsschritt nach der Pasteurisierung beschrieben.
• EP-A-0 305 243 offenbart einen Gewebekleber, der eine Komponente A, die Fibrinogen, Fibronectin, Faktor VIII und 10 000 kIE/ml Aprotinin enthält, und eine Komponente B, die aus Thrombin besteht, umfasst.
• Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Gewebekleber bereitzustellen, der auch für Patienten mit schweren Blutgerinnungsstörungen, wie Hämophilie A oder B, geeignet ist. Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, einen Gewebekleber bereitzustellen, der auch für Patienten verwendet werden kann, die bereits Antikörper gegen Rinderthrombin entwickelt haben, welches der aktive Faktor der Komponente B ist. Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Gewebekleber für Patienten bereitzustellen, die mit Antikoagulationsfaktoren, wie Heparin, behandelt werden. Wegen der Gefahr der Übertragung von Viruskrankheiten mit den Komponenten des Gewebeklebers muss gewährleistet sein, dass die Fraktionen des Gewebeklebers virusinaktiviert sind.
• Der zweikomponentige Gewebekleber mit zwei getrennten Komponenten A und B gemäß der Erfindung umfasst eine Komponente A, die ein Kryopräzipitat aus Vollblut und eine Menge eines Protease-Inhibitors, die 3000 bis 5000 kIE/ml Aprotinin entspricht, umfasst, wobei die Komponente A erhältlich ist durch
• - Auftauen einer Kryopaste;
• - Auflösen in einem Puffer mit pH 7,0 bis 7,2;
• - Vorerhitzen auf 30 bis 35ºC;
• - Einstellen des pH-Werts auf 7,0 bis 7,2;
• - Hinzufügen von Aluminiumhydroxid unter Rühren;
• - Zentrifugieren und Verwerfen des Präzipitats;
• - Hinzufügen von CaCl&sub2;;
• - Virusinaktivierung;
• - Konzentrieren durch Ultrafiltration auf eine Proteinkonzentration von 60 bis 100 mg/ml;
• - Hinzufügen einer Menge eines Protease-Inhibitors, die 3000 bis 5000 kIE/ml Aprotinin entspricht;
• sowie eine Komponente B, die ein proteolytisches Enzym umfasst, das in Komponente A vorhandenes Fibrinogen spezifisch zu spalten und die Bildung eines Fibrinpolymers zu bewirken vermag.
• Für die Herstellung des Fibrinklebers der Erfindung kann kommerziell erhältliches Kryopräzipitat verwendet werden. Gemäß der Erfindung muss es um einen Faktor zwischen 2 und 5, vorzugsweise um einen Faktor 3, konzentriert werden.
• Durch Zugabe eines Protease-Inhibitors in ausreichender Konzentration, die einer Menge von 3000 bis 5000 kIE/ml Aprotinin entspricht, zu dem Kryopräzipitat wird der Gewebekleber der Erfindung für die Verwendung bei Patienten mit schweren Blutungsstörungen geeignet. Der bevorzugte Protease-Inhibitor ist Aprotinin, das unter dem Warenzeichen Trasylol® oder Antagosan® kommerziell erhältlich ist.
• Das Kryopräzipitat kann von dem Patienten selbst erhalten werden, indem er vor der Operation eine Eigenblutspende abgibt. Durch diesen Ansatz wird die Gefahr einer Übertragung von Virusinfektionen durch Blutderivate verhindert. Um ein richtiges kommerzielles Produkt zu erhalten, muss das Kryopräzipitat virusinaktiviert werden. Ein Verfahren zur Virusinaktivierung ist in PCT/EP 91/00503 beschrieben. Das Grundprinzip ist die Behandlung des Kryopräzipitats mit speziellen Detergentien und die spätere Entfernung des Detergens aus dem Kryopräzipitat.
• Die zweite Komponente, Komponente B, des Gewebeklebers der vorliegenden Erfindung wird durch eine Lösung eines proteolytischen Enzyms hergestellt, das Fibrinogen spezifisch zu spalten vermag. Gewöhnlich wird Thrombin verwendet, das aus Plasma von Menschen oder Säugern, wie Rindern, isoliert wurde. Das Thrombin kann in lyophilisierter Form geliefert werden. Die Rekonstitution des Thrombins erfolgt mit einer 40 mM Lösung von Calciumchlorid. Die bevorzugte Konzentration des Thrombins beträgt 50 bis 200 E/ml.
• Zur Herstellung eines schnellen Fibrinklebers wird eine Thrombinlösung von ungefähr 100 E/ml Calciumchlorid hergestellt. Zur Herstellung eines langsamen Klebers, zum Beispiel beim Füllen von Hohlräumen, z. B. beim Ziehen von Zähnen oder Verschließen des Hohlraums von einer transphenoidierten Hypophysektomie, wird das Thrombin mit einer geeigneten Calciumchloridlösung weiter auf eine Konzentration von 25 E/ml verdünnt.
• Eine weitere Ausführungsform des verbesserten Gewebeklebers der Erfindung umfasst als Komponente B ein aus einem Schlangengift isoliertes proteolytisches Enzym. Diese Ausführungsform ist vorteilhaft, da auch Patienten, die Antikörper gegen Thrombin entwickelt haben, behandelt werden können. Überdies können mit Heparin vorbehandelte Patienten mit dem Gewebekleber gemäß der Erfindung behandelt werden, da Heparin die Reaktion des Schlangengiftenzyms nicht beeinflusst. In einer sehr bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Schlangengiftenzym Batroxobin verwendet, das aus der südamerikanischen Grubenotter Bothrops moojeni isoliert werden kann. Vorzugsweise enthält Komponente B 0,5 bis 10 E/ml des entsprechenden proteolytischen Enzyms aus Schlangengift.
• Chemisch ist Batroxobin ein einzelkettiges Glycopeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 36 000. Defibrase® bewirkt eine Spaltung einer α-16-Arg/17-Gly- Bindung in Fibrinogen, was die Freisetzung von Fibrinopeptid A und die Bildung von monomerem Fibrin I bewirkt.
• Wenn Aprotinin in den Mengen der Erfindung verwendet wird, können auch die Gewebekleber, die gereinigtes Fibrinogen, Fibronectin und Faktor VIII umfassen, als Komponente A verwendet werden. Die Gefahr einer Nachblutung ist dann dramatisch reduziert.
• Wenn proteolytische Proteasen aus Schlangengift für die Herstellung von Komponente B verwendet werden, können auch "herkömmliche Komponenten A mit Fibrinogen, Fibronectin und Faktor VIII verwendet werden. Die Verwendung großer Mengen Aprotinin gemäß der Erfindung ist bevorzugt. Eine sehr bevorzugte Ausführungsform ist die Kombination der von Kryopräzipitat abgeleiteten Komponente A der Erfindung mit oder ohne große Mengen Aprotinin und der Komponente B der Erfindung, die das aus Schlangengift isolierte proteolytische Enzym aufweist.
• Das Verfahren zur Herstellung des Gewebeklebers der Erfindung umfasst die Schritte des Herstellens von Komponente A, das die folgenden Schritte umfasst:
• - Herstellen einer Kryolösung aus konzentriertem Kryopräzipitat,
• - eine Virusinaktivierung,
• - Entfernen von Viruciden,
• - Hinzufügen des Protease-Inhibitors, und
• - Herstellen einer geeigneten Proteaselösung einer Protease als Komponente B. Eine Kryopaste wird über Nacht bei 4 bis 10ºC vorgetaut. Die Kryopaste wird in einem Puffer gelöst, der Natriumchlorid, Trinatriumcitrat und Glycin enthält und einen pH-Wert von 7,0 bis 7,2 aufweist, und dann auf 30 bis 35ºC erhitzt. Die Kryopaste sollte sich leicht auflösen lassen, sonst ist sie für die Herstellung nicht geeignet. Die Auflösung kann beschleunigt werden, indem man die Kryopaste nach dem Auftauen in kleine Stücke schneidet. Nach dem Abkühlen der Lösung auf fast Raumtemperatur und Einstellen des pH-Werts auf einen Wert von 7,0 bis 7,2 wird unter Rühren Aluminiumhydroxid hinzugefügt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und verworfen. Gegebenenfalls wird ein Filtrationsschritt durchgeführt. Dann wird Calciumchlorid bis zu der gewünschten Endkonzentration an Calciumchlorid hinzugefügt.
• Zur Virusinaktivierung wird die Lösung bis auf 30ºC erhitzt. Dann werden die Detergentien hinzugefügt. Nach einigem Rühren wird die Lösung in einen virusfreien Behälter übergeführt und mehrere Stunden lang ohne Rühren bei geringfügig erhöhten Temperaturen belassen.
• Die Virucide werden entfernt, indem man eine Menge Ricinusöl hinzufügt und mehrere Minuten lang sachte rührt. Wenn sich die Öl- und die Wasserphase getrennt haben, wird die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt. Die wässrige Schicht wird in einen virussicheren Behälter abgezogen, und die Ölschicht wird verworfen. Die wässrige Schicht wird durch Filtration geklärt. Es muss überprüft werden, dass der pH-Wert 7,0 bis 7,2 beträgt. Dann wird die Proteinlösung bei Raumtemperatur durch eine Umkehrphasensäule gepumpt. Nach dem Messen des Proteingehalts (im Bereich von 10 bis 60 mg/ml wird das Eluat durch Ultrafiltration auf einen Proteingehalt von 60 bis 100 mg/ml konzentriert und gegen einen Puffer dialysiert, der mit dem oben genannten Puffer identisch ist, aber zusätzlich eine relativ hohe Konzentration an Calciumchlorid aufweist. Dann wird der Protease- Inhibitor hinzugefügt. Eine Sterilfiltration wird durchgeführt, und die Probe wird in geeignete Behälter gefüllt und tiefgefroren.
• Komponente B ist vorzugsweise eine gefriergetrocknete Protease. Besonders bevorzugt ist lyophilisiertes Thrombin oder eine lyophilisierte Fraktion von der südamerikanischen Grubenotter Bothrops moojeni. Das proteolytische Enzym ist unter dem Handelsnamen Reptilase bekannt, und es handelt sich um das Enzym Batroxobin.
• Die proteolytischen Enzyme werden in einem Calciumchloridpuffer gelöst.
• Die Auftragung der beiden Komponenten A und B erfolgt unter Verwendung einer Doppelspritzentechnik, zum Beispiel durch ein Kunststoffverbindungsstück. Beim Mischen der beiden Komponenten entsteht ein Gerinnsel. Die Auftragung kann durch eine Kanüle erfolgen, oder die Komponenten können aus einem Katheter mit drei Lumen gesprüht werden. Jede der beiden Komponenten wird in ein getrenntes Lumen eingespritzt, und eine Luftdruckquelle im Bereich von einigen bar (Atmosphären) wird mit dem dritten Lumen verbunden, um das Gemisch aufzusprühen.
• Der Gewebekleber der Erfindung ist vorteilhaft, da er bei Patienten mit schweren Blutgerinnungsstörungen verwendet werden kann und noch billiger ist als die bekannten Gewebekleber. Patienten mit schwerer Hämophilie können anschließend zum Beispiel mit einer Erfolgsquote von über 80% Zähne gezogen werden, ohne dass man präventive Infusionen von Faktor-VIII-Konzentraten verwendet. Das bedeutet, dass nur etwa ein Fünftel der Patienten Infusionen aufgrund von Blutungen, die nach der Extraktion auftreten, benötigt. Außerdem können auch mit Heparin vorbehandelte Patienten mit dem Gewebekleber der Erfindung behandelt werden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass Menschen, die Antikörper gegen Thrombin, die zweite Komponente des Gewebeklebers, entwickelt haben, mit einem Gewebekleber gemäß der Erfindung behandelt werden können, bei dem Thrombin durch eine Protease aus Schlangengift ersetzt ist, insbesondere durch Defibraseº, bei der es sich um die Serin-Protease Batroxobin handelt, die aus dem Gift der südamerikanischen Grubenotter Bothrops moojeni isoliert wird.
• Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele offenbart.
• Human-Fibrinogen (Qualität L) wurde von Kabi (Stockholm) erhalten, Rinder- Thrombin von Merz-Dade. Das chromogene Substrat N-α-Benzoyl-DL-arginin-pnitroanilid (BAPNA) und analysenreine Reagentien wurden von Sigma (St. Louis, MO) erhalten. Reagentien und Salze wurden mit 0,015 M Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,4, verdünnt. Fibrinogen wurde in Tris-Puffer dialysiert, wobei die Konzentration aus der Abs&sub2;&sub8;&sub0; unter Verwendung eines Umrechnungsfaktors von E1%280 = 15 bestimmt wurde.
• Rinder-Thrombin wurde aus kommerziellen Quellen erhalten (Merz-Dade oder Parke Davis), wobei die Aktivitätseinstufung durch den Hersteller verwendet wurde. Reptilase®, ein Schlangengift, das nur FPA freisetzt, wurde von Pentapharm (Basel) erhalten. Die proteolytische Aktivität von Reptilase® wurde auf die von Thrombin normalisiert, indem man ihre Geschwindigkeiten der Proteolyse eines unspezifischen chromogenen Substrats SAPNA (0,25 mM) bei 37ºC in Tris/Kochsalzlösung, pH 8,0, die 15 Minuten lang bei 405 nm überwacht wurde, miteinander verglich.
• Auf der Basis ihrer esterolytischen Aktivität wurde die Aktivitätseinheit der Reptilase auf die von Thrombin normalisiert.
• Gewebekleber wurde im wesentlichen nach dem Doppelspritzenverfahren erzeugt, wobei sich reines oder kryopräzipitathaltiges Fibrinogen als Substrat in einer Spritze und Reptilase (20 E/ml) oder Thrombin mit CaCl&sub2; (20 mM) in der anderen befand.
• Die Gerinnungszeit (CT) wurde mit einem Research Model 300-R ACL Coagulation Analyzer (IL, Milan) bestimmt. Die Viskoelastizität (TEG) wurde bei 37ºC mit einem 3-Kanal-Heiliger-Thromboelastograph bestimmt. Die Rissfestigkeit (BS) von Klebern (in g) wurde bestimmt, indem man die Kleberkomponenten zwischen zwei Stück grobgewebter synthetischer Faser (0,5 · 1 cm) miteinander mischte, die Bildung von Gel völlig eingewebt zwischen den beiden Stücken groben Tuches erlaubte, und nach 2 Stunden bei 24ºC wurde die Gesamtheit von Tuch-Kleber- Tuch unter Verwendung eines Accuforce Cadet Tensionometer (AMATEK, Mansfield & Greene, USA) auseinandergezogen.
• Steriles Kryopräzipitat (Kryo) wurde aus gefrorenem (-30ºC) Humanplasma hergestellt, das bei 4ºC aufgetaut wurde, und das überstehende Plasma wurde entnommen. Fünf solche Einheiten wurden gepoolt, und Protein- und Fibrinogenkonzentration wurden vor und nach dem Verklumpen des Kryopräzipitats (1 : 5 verdünnt) mit 2 E/ml Thrombin nach dem Biuret-Verfahren bestimmt. Faktor XIII wurde bestimmt, indem man nach der Aktivierung der Proben mit 4 E/ml Rinder- Thrombin, 10 min. 22ºC, den Einbau von [³H]-Putrescin in dimethyliertes Casein maß.
• Ein bemerkenswertes Merkmal der CT-Fibrinogen-Kurve besteht darin, dass sie für eine feste Menge an Thrombin oder Reptilase (d. h. 1 E/ml, Fig. 1A) zweiphasig ist und ein Minimum im Bereich von 1-8 mM Fibrinogen erreicht. Dies unterscheidet sich ein wenig von der maximalen Trübung (nach 10 min), die ihr Maximum im Bereich von 20 bis 40 mM Fibrinogen erreicht. Ein umgekehrtes Experiment zeigt die Abhängigkeit der CT von der Menge an Thrombin bzw. Reptilase. Diese Kurve zeigt eine fast lineare inverse Abhängigkeit der Gelierungsgeschwindigkeit bei niedrigen Enzymmengen (weniger als 2 E/ml), die bei größeren Mengen ein Plateau erreicht.
• Die Entwicklung der Viskoelastizität von reinem Fibrin ist etwas langsamer als die seiner Trübung. Ca(II) ist ein wichtiger Cofaktor bei der Gelverstärkung durch Faktor-XIIIa-induzierte kovalente Verschränkung von Proteinketten. Diese Gelvernetzung ist eine wichtige Quelle für mechanische Festigkeit des Gels, die nach 20 min ein Plateau erreicht.
• Eine Anmerkung über die Fähigkeit von Reptilase zur Induktion der Faktor-XIIIa- Aktivität erscheint angebracht.
• Proteinmengen von gepooftem Kryopräzipitat:
• Gepooltes Kryo, hergestellt aus 5 Einheiten, ergab die folgenden Mittelwerte:
• Protein: 75 mg/ml
• Fibrinogen: 36 mg/ml
• Faktor XIII: 4,10 E/ml
• Gerinnungsgeschwindigkeiten:
• Die Gerinnungszeit (CT) von Kryo hängt linear von der Thrombin- bzw. Reptilasemenge ab. Oberhalb von 3 E/ml haben wachsende Enzymmengen jedoch nur eine geringe Auswirkung auf die CT. Für eine feste Enzymmenge ergibt eine Verdünnungsreihe von Kryo eine zweiphasige CT-Kurve, die zu der im reinen Fibrinsystem beobachteten Fibrinogenabhängigkeit äquivalent ist.
Viskoelastizität (TEG) und Reißfestigkeit (BS) von Kryoklebern
• Die Entwicklung der Viskoelastizität von Kryoklebern wurde sowohl mit Thrombin als auch mit Reptilase untersucht. Dieser Parameter braucht viel länger als die Trübung, um sich zu entwickeln. Kryokleber, die mit einem Überschuß an CaCl&sub2; und entweder Thrombin oder Reptilase hergestellt wurden, erreichen jedoch in ungefähr demselben zeitlichen Rahmen äquivalente TEG-Werte. Nach dem anfänglichen Einsetzen der Gelierung unterstützt die Faktor-XIIIa-induzierte Vernetzung anscheinend die Gelfaserstruktur, so dass die TEG-Werte für beide Kleber innerhalb 1 Stunde konvergieren. Ähnlich verhält es sich mit dem endgültigen BS beider Kryokleber, die mit einem Überschuß an CaCl&sub2; gebildet wurden. Beide Kryokleber reißen bei 50 bis 60 g. Diese Experimente weisen darauf hin, dass die Gelfasern innerhalb des Klebers durch Faktor-XIIIa-induzierte kovalente Vernetzung verstärkt werden.
Herstellung einer Kryolösung
• Kommerzielle Kryopaste wird über Nacht bei 4 bis 10ºC vorgetaut. Ein Kilo Kryo wird in zwei Litern Puffer A (120 mM NaCl, 10 mM Trinatriumcitrat, 120 mM Glycin und pH 7,0 bis 7,2) gelöst und auf 30 bis 35ºC vorerhitzt. Die Kryopaste sollte sich leicht auflösen, sonst ist sie für die Herstellung nicht geeignet. Um die Auflösung zu beschleunigen, schneide man die Kryopaste nach dem Auftauen in kleine Stücke.
• Dann wird die Lösung auf 20 bis 22ºC abgekühlt, und der pH-Wert wird überprüft. Gegebenenfalls muss er auf pH 7,0 bis 7,2 eingestellt werden, indem man verdünnte Natronlauge oder Salzsäure hinzufügt. 100 ml Aluminiumhydroxid werden hinzugefügt, und es wird noch 30 Minuten Lang gerührt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert und verworfen. Der Überstand wird mit Hilfe eines 1-um-Filters filtriert. 0,1 M CaCl&sub2; wird hinzugefügt, um eine Endkonzentration an Ca2+ von 1 mM/l zu erhalten. Wiederum muss der pH-Wert überprüft werden.
Virusinaktivierung
• Die Lösung wird auf 30ºC erhitzt. 1% (w/v) TNBP und 1% (w/v) Triton · 100 werden hinzugefügt. Das Gemisch wird 1/2 Stunde lang sachte gerührt. Dann wird die Lösung in einen virusfreien Behälter übergeführt und 3 l/2 Stunden lang ohne Rühren auf 30ºC belassen.
Entfernung von Viruciden
• 150 ml Ricinusöl werden zu dem Gemisch gegeben, das wie oben beschrieben hergestellt wurde, und es wird 30 Minuten lang sachte gerührt. Während man auf die Trennung von Öl und Wasser wartet (30 bis 45 Minuten), wird die Lösung auf 20ºC abgekühlt. Die wässrige Schicht wird in einen virussicheren Behälter abgezogen, während die Ölschicht verworfen wird. Die wässrige Schicht wird durch Filtration über eine 1 um/0,45 um-Filterkaskade geklärt. Dann wird die Proteinlösung bei Raumtemperatur mit einer Geschwindigkeit von 3 I/h durch eine Umkehrphasensäule (C-18-Säule) gepumpt. Der Durchsatz wird durch UV überwacht und aufgefangen, bis die Extinktion auf 50% zurückgekehrt ist. Die Fraktion enthält nach einer Messung in einem Proteinassay ungefähr 40 mg/ml.
• Das Eluat wird durch Ultrafiltration und Dialyse gegen eine ausreichende Menge eines Puffers B (dieselben Bestandteile wie Puffer A, aber zusätzlich 1 mM Calciumchlorid) auf einen Proteingehalt von 70 bis 80 mg/ml konzentriert. Dann werden 4 Mio. kIE Aprotinin pro Liter Lösung hinzugefügt. Danach erfolgt eine Sterilfiltration unter Verwendung einer 0,45 um/0,2 um-Kaskade. Dann wird die Lösung in Kunststoffbeutel gefüllt und tiefgefroren, gegebenenfalls lyophilisiert.
Herstellung einer Thrombinlösung
• Lyophilisiertes Thrombin wird in einer Lösung von 40 mM/I Calciumchlorid gelöst. Die Menge des Thrombins in dem Kleber beträgt 100 E/ml. Für einen schnell festwerdenden Kleber, zum Beispiel zum Sprühen des Klebers auf den Bereich der Wunde, wird eine Thrombinlösung von 100 E/ml in Calciumchlorid ausreichend sein. Für einen langsamen Kleber, zum Beispiel zum Füllen von Hohlräumen beim Ziehen eines Zahns oder Verschließen des Hohlraums von einer transphenoidierten Hypophysektomie, wird das Thrombin durch Zugabe großer Mengen CaCl&sub2; weiter auf eine Endkonzentration von 2-3 E/ml verdünnt. Die Thrombinlösung wird durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, virusinaktiviert.
• Die Herstellung von Reptilase ist der von Thrombin ähnlich. Die Menge an Reptilase beträgt jedoch ungefähr 2 E/ml.
Klinischer Fallbericht
• Der Patient im Alter von 21, MY (ein 21 Jahre alter männlicher Patient), litt unter schwerer Blutungsneigung aufgrund eines erworbenen Inhibitors gegen Thrombin. Keine Hintergrundkrankheit (d. h. ein Tumor oder eine Autoimmunkrankheit) konnte dieses Problem erklären. Ein Labortest, der von zwei Drittlabors bestätigt wurde, zeigte an, dass MY große Mengen an Anti-Thrombin-IgG-Antikörper aufwies. Im letzten Jahr litt er unter wiederholten Nierenkolikanfällen aufgrund eines großen Steines in seinem linken Nierenbecken. Eine elektive Lithotripsie durch Ultraschall wurde geplant. Auf der Grundlage der Technik, dass IgG an Protein-A-Affinitätssäulen bindet, wurde der Patient auf immunosuppressive Therapie, kombiniert mit extracorporaler Immunadsorption, gesetzt. Nach 8 Behandlungen, bei denen 601 Plasma des Patienten durch Leiten über die Protein-A-Säule verarbeitet wurden, nahm der Inhibitortiter um 98% ab. Dies wurde bestimmt, indem man die Thrombinzeit (TT) von normalem gepooltem Plasma mit prä- und postaffinitätsgereinigtem MJ-Plasma maß. Dennoch wurden der TT- sowie PT- und APTT-Wert verlängert. Zu diesem Zeitpunkt bewegte sich der Nierenstein zum Harnleiter, was eine vollständige Blockierung der Niere und eine damit einhergehende Hydronephrose bewirkte. Der Patient erhielt noch 10 Immunadsorptionsbehandlungen (ungefähr 80 Liter Plasma) und anschließend eine intensive Plasmapherese (ungefähr 50 Liter) und eine hochdosierte Immunglobulininfusion (2 g/kg). Zu diesem Zeitpunkt nahm der Thrombin-Inhibitor-Spiegel auf 0,5% ab. PTT sank auf 1,2 m (47") [im Vergleich zu 2,2-2,3 m (85-90") vor der Behandlung], und der TT betrug 0,9 m (35") [im Vergleich zu 2,3 m (90") vor der Behandlung und 0,7 m (27") normale Kontrolle]. Es wurde beschlossen, den Stein operativ zu entfernen, wobei man biologischen Kleber (Kryo-Kleber) verwenden wollte, der aus Kryopräzipitat und großen Mengen (200 E/ml) Thrombin hergestellt wurde. Mit dieser Mischung gelierte das Kryo unmittelbar nach dem Aufsprühen. Bei dem Patienten erfolgte jedoch keine Gelierung, und eine lokale Hämostase wurde durch Nähen erreicht. Am Ende der Operation sah die Wunde "trocken" aus. Dennoch blutete der Patient sechs Stunden später aus chirurgischen Drains. Eine Immunadsorption von 10 Liter Plasma wurde durchgeführt, aber ohne Auswirkung auf die Blutung, die tatsächlich noch zunahm.
• Der Patient wurde erneut operiert, um die Quelle der Blutung zu finden. Es wurde jedoch keine operative Blutung gefunden. Es wurde eine diffuse Blutung aus den gesamten Wundflächen beobachtet. Dieses Mal wurde eine Mischung aus Kryo und Reptilase (2 E/ml; Defibrase) auf die Wunde gesprüht. Das Spray klumpte sofort zusammen, die Wundoberfläche erschien trübe, und die Blutung hörte auf. Der Patient erhielt noch 5 Tage lang weiterhin täglich eine Immunadsorptionstherapie, ohne dass es zu einer Blutung kam. Dies belegt den Vorteil der Verwendung einer Schlangen-Protease als Komponente B des Gewebeklebers der Erfindung

Claims (13)

1. Zweikomponentiger Gewebekleber mit zwei getrennten Komponenten A und B, umfassend eine Komponente A, die ein Kryopräzipitat aus Vollblut und eine Menge eines Protease-Inhibitors, die 3000 bis 5000 kIE/ml Aprotinin entspricht, umfasst, wobei die Komponente A erhältlich ist durch

- Auftauen einer Kryopaste;

- Auflösen in einem Puffer mit pH 7,0 bis 7,2;

- Vorerhitzen auf 30 bis 35ºC;

- Einstellen des pH-Werts auf 7,0 bis 7,2;

- Hinzufügen von Aluminiumhydroxid unter Rühren;

- Zentrifugieren und Verwerfen des Präzipitats;

- Hinzufügen von CaCl&sub2;;

- Virusinaktivierung;

- Konzentrieren durch Ultrafiltration auf eine Proteinkonzentration von 60 bis 100 mg/ml;

- Hinzufügen einer Menge eines Protease-Inhibitors, die 3000 bis 5000 kIE/ml Aprotinin entspricht;

sowie eine Komponente B, die ein proteolytisches Enzym umfasst, das in Komponente A vorhandenes Fibrinogen spezifisch zu spalten und die Bildung eines Fibrinpolymers zu bewirken vermag.

2. Gewebekleber gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Protease-Inhibitor um Aprotinin in Mengen von 3000 bis 5000 kIE/ml handelt.

3. Gewebekleber gemäß einem der Ansprüche 1 und/oder 2, wobei es sich bei dem proteolytischen Enzym um von Säugern oder vom Menschen stammendes Thrombin handelt.

4. Gewebekleber gemäß Anspruch 1, umfassend eine Komponente A, die ein konzentriertes Kryopräzipitat aus Vollblut umfasst; und

eine Komponente B, die ein aus Schlangengift erhältliches proteolytisches Enzym umfasst, wobei das Enzym in Komponente A vorhandenes Fibrinogen spezifisch zu spalten und die Bildung eines Fibrinpolymers zu bewirken vermag.

5. Gewebekleber gemäß Anspruch 4, wobei es sich bei dem Schlangengiftenzym um Batroxobin handelt, das aus dem Gift der südamerikanischen Grubenotter Bothrops moojeni isoliert wurde.

6. Gewebekleber gemäß Anspruch 4 oder 5, der eine große Menge eines Protease-Inhibitors, vorzugsweise Aprotinin, die 3000 bis 5000 kIE/ml Aprotinin entspricht, enthält.

7. Gewebekleber gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Kryopräzipitat virusinaktiviert ist.

8. Verfahren zur Herstellung eines Gewebeklebers gemäß den Ansprüchen 1 bis 7 mit den folgenden Schritten:

- Auftauen einer Kryopaste;

- Auflösen in einem Puffer mit pH 7,0 bis 7,2;

- Vorerhitzen auf 30 bis 35ºC;

- Einstellen des pH-Werts auf 7,0 bis 7, 2;

- Hinzufügen von Aluminiumhydroxid unter Rühren;

- Zentrifugieren und Verwerfen des Präzipitats;

- Hinzufügen von CaCl&sub2;;

- Virusiraktivierung;

- Konzentrieren durch Ultrafiltration auf eine Proteinkonzentration von 60 bis 100 mg/ml;

- Hinzufügen einer Menge eines Protease-Inhibitors, die 3000 bis 5000 kIE/ml Aprotinin entspricht; und

- Herstellen einer geeigneten Lösung einer geeigneten Protease als Komponente B, wie sie in den Ansprüchen 1-7 definiert ist.

9. Gewebekleber gemäß Anspruch 1, der als Komponente A Fibrinogen, Fibronectin und Faktor XIII sowie einen Protease-Inhibitor, der einer Aprotininmenge von 3000 bis 5000 kIE/ml entspricht, umfasst.

10. Gewebekleber gemäß Anspruch 9, wobei es sich bei Komponente B um ein proteolytisches Enzym gemäß den Ansprüchen 4 und/oder 5 oder um Thrombin handelt.

11. Verwendung einer Menge eines Protease-Inhibitors, die 3000 bis 5000 kIE/ml Aprotinin entspricht, in Kombination mit konzentriertem Kryopräzipitat aus Vollblut, das erhältlich ist durch

- Auftauen einer Kryopaste;

- Auflösen in einem Puffer mit pH 7,0 bis 7, 2;

- Vorerhitzen auf 30 bis 35ºC;

- Einstellen des pH-Werts auf 7,0 bis 7,2;

- Hinzufügen von Aluminiumhydroxid unter Rühren;

- Zentrifugieren und Verwerfen des Präzipitats;

- Hinzufügen von CaCl&sub2;;

- Virusinaktivierung;

- Konzentrieren durch Ultrafiltration auf eine Proteinkonzentration von 60 bis 100 mg/ml;

zur Herstellung eines Gewebeklebers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.

12. Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei es sich bei dem Protease-Inhibitor um Aprotinin handelt.

13. Verwendung von konzentriertem Kryopräzipitat zur Herstellung eines Gewebeklebers gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6.