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Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Blutgerinnungsstörungen, insbesondere von Faktor Vill Inhibitor-Patienten Die Erfindung betrifft weiters ein Verfahren zur Herstellung einer derartigen Zusammensetzung sowie deren Verwendung.
Die Blutgerinnung wird durch eine Reihe von aufeinanderfolgenden Reaktionen verschiedener Proteine bzw. Enzyme ausgelöst Durch einen Mangel an Blutgerinnungsfaktoren wird die Bildung von Fibrin aus Fibrinogen und damit der Wundverschluss verhindert, die Folge sind Blutungen Ein
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und wird durch den Mangel an Faktor VIII hervorgerufen. Zur Substitutionsbehandlung der Hamophilie A werden Präparate eingesetzt, die den Faktor VIII enthalten. Die Behandlung mit diesen Präparaten führt in den meisten Fällen zu einer raschen Blutstillung.
Es gibt jedoch auch Patienten, bei denen nicht nur ein Mangel an Faktor Vill auftritt, sondern die auch einen gegen Faktor VIII gerichteten Hemmstoff (Inhibitor) entwickelt haben Ein weiteres Patientenkollektiv weist Faktor VIII-Inhibitoren auf, ohne an Hämophilie A zu leiden Je nach vorhandener Menge an Faktor VIII-Inhibitoren wird die Wirkung von zugeführtem Faktor Viill durch dessen Neutralisierung inhibiert
Zur Behandlung von Faktor VIII-Inhibitor-Patienten werden derzeit Präparate auf Basis einer Plasmafraktion angeboten, die ein Gemisch von Gerinnungsfaktoren enthält. Diese Plasmafraktion kann beispielsweise die Faktoren des Prothrombinkomplexes (Faktor 11, VII, IX und X) enthalten.
Eine blutgerinnungsfördernde Präparation mit Faktor V)i)-Inhibitor-Bypass-Aktivität (FEIBA*TIM 4, Fa IMMUNO AG) wird beispielsweise gemäss der AT-B 0 368 883 durch eine Behandlung von Kryoüberstand erhalten Diese Präparation enthält ebenfalls die Gerinnungsfaktoren 11, VII, IX und X
Die Wirkung eines FEIBA-Präparates ist aufgrund dessen komplexer Zusammensetzung vielschichtig Mariani et al (Thrombosis Res 31, 475-488 (1983)) nennt als ein Wirkungspnnzlp den Faktor Vil in seiner aktivierten Form. Es wurde festgestellt, dass nach Infusion einer FEIBAPräparation ein erhöhter Gehalt von Faktor Vlla im Plasma Hämophiler auftritt.
Ebenso wird von Teitel (Thrombosis and Haemostasis 66 (5) 559-564, (1991)) die Rolle von Faktor Vlla in Prothrombinkomplex-Konzentraten mit einer"Faktor VIII-Bypassing-Aktivity" disku- tiert. Gleichzeitig wird auch auf das Wirkungsprinzip von Faktor Xa in derartigen Präparaten eingegangen. Die untersuchten Prothrombinkomplex-Konzentrate enthielten Faktor Vlla, ausgedrückt durch das Verhältnis der Faktor Vil-Aktivität zu Faktor Vll-Antigen von 2, 1 und 2, 5.
Die gemäss der EP 0 044 343-B1 hergestellte Prothrombinhaltige therapeutische Zusammensetzung ist zur Behandlung von Gerinnungsfaktor-Inhibitoren geeignet und enthält einen aktivierten Prothrombinkomplex, bei dem die Faktoren teilweise aktiviert sind Der Anteil an
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liegtPräparate AUTOPLEX, welches gemäss der EP 0 044 343 hergestellt wird, und FEIBA. Wie dort gezeigt wird, zeichnet sich AUTOPLEX durch den höheren Gehalt an Thrombin (Faktor lia), gemessen in NIH-Units, im Vergleich zu FEIBA aus (siehe Tabelle 1, Seite 24).
Aber auch hochgereinigte Faktor Vlla-Präparationen werden zur Therapie von Gerinnungsfaktor-Inhibitorzuständen vorgeschlagen (z. B. EP 0 082 182-B1) und Hedner et al.
(Haemostasis 19, 335-343 (1989))
Ein Vorteil von Faktor Vlla-Präparationen ist deren Freiheit an Faktor VIII. Der Gehalt an Faktor VIII in Prothrombinkomplex-Präparaten oder in aktivierten Prothrombinkomplex-Präparaten wie z B FEIBA bewirkt nämlich in Patienten mit funktionellen Faktor VIII-Inhibitoren, dass diese inhibierenden Antikörper durch neuerliche Gabe von Faktor VIII geboostert werden, womit sich der Zustand der Inhibitor-Hämophilie vorübergehend sogar verschlechtert.
Es wurde allerdings festgestellt, dass zur effektiven Blutstillung bei der Faktor VIII-Inhibitor Hämophilie Faktor Vlla-Präparationen in ihrer Wirkung den ProthrombinkomplexfaktorenPräparaten unterlegen sind (Turecek P et al., Thrombosis & Haemostasis, 1997, p. 222).
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Präparation zur Verfügung zu stellen, die die Effektivität bzw. Effizienz von Prothrombinkomplexfaktoren-Präparaten besitzt, ohne jedoch die unerwünschten immunologischen Nebenreaktionen derartiger Präparationen
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aufzuweisen.
Die vorstehend genannte Aufgabe wird dadurch gelöst, dass gemäss der vorliegenden Erfindung eine immuntolerante pharmazeutische Prothrombinkomplex-Präparation enthaltend die Faktoren 11, IX, X und gegebenenfalls VII mit einem geringen Faktor Vlil-Aritigengehalt zur Verfügung gestellt wird.
Der Faktor VIII-Antigengehalt der erfindungsgemässen Präparation liegt vorzugsweise bei weniger als 10%, insbesondere weniger als 5% Der Faktor VIII-Gehalt ist vorzugsweise kleiner als 0, 1 Faktor Vill. C Antigen/E FEIBA In einer besonders bevorzugten Ausführungsform liegt der Faktor VIII Antigengehalt sogar unter 0, 03/E FEIBA, noch bevorzugter unter 0,02/E FEIBA und am meisten bevorzugt unter der Nachweisgrenze
Der Befund, dass insbesondere bei einer weiteren Reinigung der Prothrombinkomplexfaktoren aus Plasma oder einer Plasmafraktion, der Faktor Vill-Gehalt und gegebenenfalls auch der Phospholipid-Gehalt derart reduziert werden kann, während die Aktivität der Prothrombinkomplexfaktoren weitgehend erhalten bleibt, ist als überraschend anzusehen.
Insbesondere enthält die erfindungsgemasse pharmazeutische Praparation mindestens die Faktoren IXa, Xa und Vlla und weist FEIB-Aktivität auf, verkürzt also die Gerinnungszeit eines Faktor Vl)l-defizienten Plasmas mit einem funktionellen Inhibitor (siehe dazu beispielsweise die ATB 350 726)
Eine erfindungsgemässe Präparation kann aus Plasma oder einer Plasmafraktion hergestellt werden.
Die Plasmafraktion kann aus Plasma, insbesondere Plasma humanen Ursprungs, durch eine chromatographische Behandlung, Fällung oder Zentrifugation hergestellt werden, oder es wird der Kryopräzipitatüberstand verwendet
Die Plasmafraktion enthält Vitamin-K-abhängige Faktoren wie Faktoren des ProthrombinKomplexes, aber auch Protein S, C und/oder Z sind vorzugsweise enthalten
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Präparation frei von Phospholipiden.
Vorzugsweise liegt die Obergrenze enthaltener Phospholipide bei 0, 1 nmoVE FEIBA (zur Bestimmung siehe Beispiele).
Aufgrund dieser Freiheit von Phospholipden, kann die Bildung unerwünschter Antikörper gegen Faktor VIII vermindert bzw. verhindert werden.
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Herstellung dieser Präparation zur Verfugung gestellt. Dieses Verfahren umfasst die folgenden Schritte a) Zurverfügungstellen von Plasma oder einer Plasmafraktion enthaltend die Faktoren 11, IX, X und gegebenenfalls VH, b) Inkontaktbringen des Plasmas oder der Plasmafraktion mit einem Trägermaterial, gegebenenfalls in Gegenwart eines Detergens, so dass Faktor VIII und gegebenenfalls
Phospholipide von den Faktoren 11, IX, X und gegebenenfalls Vil getrennt werden, c) Reinigen des Plasmas oder der Plasmafraktion, und
Gewinnen einer Fraktion enthaltend die Faktoren 11, IX, X und gegebenenfalls VII
In einer bevorzugten Variante werden die Schritte b und c bzw. b, c und d als ein Verfahrensschritt durchgeführt.
Bei der verwendeten Plasmafraktion handelt es sich vorzugsweise um eine mit wenigstens intermediärer Reinheit.
Unter einer Präparation mit intermediärer Reinheit ist eine derartige Plasmafraktion zu verstehen, welche der Definition der intermediären Reinheit von Faktor VIII Präparaten analog ist (siehe hierzu beispielsweise Wood Clive (ed. ), Factor VIII : Purity and prophylaxis, Royal Society of Medicine)
Begleitproteine, die durch eine chromatographische Reinigung nicht entfernt werden, können somit bei einem Präparat intermediärer Reinheit noch vorhanden sein.
Als Ausgangsmaterial kann auch eine herkömmliche, am Markt erhältliche ProthrombinKomplex-Faktoren Präparation verwendet werden, wie z B. FEIBA S-TIM 4, IMMUNO oder aktivierter Prothrombinkomplex.
Als entsprechende Reinigungsverfahren kommen die aus dem Stand der Technik bekannten Methoden zum Einsatz, bevorzugterweise wird eine chromatographische Behandlung, Fällung oder Zentrifugation durchgeführt. Als Plasmafraktion kann auch Kryopräzipitatüberstand verwendet werden.
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Das Trägermaterial Ist ein für die Chromatographie, Filtration und/oder Nanofiltration geeignetes Material. Bei der Filtration handelt es sich insbesondere um eine Affinitäts- oder Membranfiltration.
Wird ein vorgereinigtes Material verwendet, beispielsweise ein mittels Anionenaustauscher vorgereinigtes Material, so kann eine Readsorption an einem weiteren Trägermaterial, vorzugsweise an demselben Trägermaterial wie für die Vorreinigung verwendet, unter geänderten Bedingungen erfolgen
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das TrÅagermaterial ein für Faktor VIII spezifisches Trägermaterial, insbesondere eine für die Affinitätschromatographie geeignete Matrix Besonders bevorzugt wird eine vWF-hältige Matrix verwendet.
An ein derartiges Trägermaterial wird Faktor VIII und gegebenenfalls Phospholipid bevorzugt adsorbiert, wahrend die Faktoren 11, IX, X und gegebenenfalls Vil nicht gebunden werden.
Das Trägermaterial kann aber auch ein für Faktor VIII unspezifisches Tragermaterial sein, beispielsweise ein schwacher Anionenaustauscher, beispielsweise ein DEAE-, TMAE- oder weitere aus dem Stand der Technik hinreichend bekannter Anionenaustauschem.
Je nach gewählten Bedingungen wird entweder Faktor Vlil und gegebenenfalls Phospholipde an dem Trägermaterial adsorbiert, während die Faktoren 11, IX, X und gegebenenfalls VII nicht gebunden werden oder umgekehrt
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist das Trägermaterial eine für den Prothrombinkomplex höhere Affinität auf als für den Faktor Vill So werden beispielsweise die Faktoren 11, IX, X und gegebenenfalls Vlil adsorbiert, während Faktor VU ! und gegebenenfalls Phospholipide eluiert werden.
Der Faktor V))) kann auch gezielt inaktiviert werden und dann in dieser inaktivierten Form beispielsweise nicht mehr an das Trägermaterial binden Eine derartige Inaktivierung des Faktor VIII kann beispielsweise durch Dissoziation unter Verwendung von z B. einem Chelatbildner, durch Abbau, insbesondere proteolytischen Abbau, z-B. durch Serinproteasen wie Thrombin oder aktiviertem Protein C, durch Binden von Affinitätspartnem, wie Antikörper oder Peptiden.
Alle beschriebenen Verfahrensvarianten können auch in Gegenwart eines Detergens, insbesondere eines nicht-ionischen Detergens, durchgeführt werden Vorzugsweise wird als Detergens ein Polyether oder ein Polysorbat verwendet, insbesondere wird Tween oder Triton verwendet
Ist Detergens vorhanden, wird es in einer bevorzugten Ausführungsform wieder entfernt bzw. abgetrennt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist ein Schritt zur Inaktivierung von gegebenenfalls vohandenen Pathogenen, insbesondere einer ausgewählt aus der Gruppe Hitzebehandlung, Dampfbehandlung, Behandlung mit einem Lösungsmittel undloder Behandlung mit einem Detergens, vorgesehen.
Die erfindungsgemässe Präparation ist also allgemein erhältlich nach einem vorstehend beschriebenen Verfahren Sie eignet sich insbesondere zur Herstellung eines Medikaments, welches geeignet ist fur die Behandlung von Faktor VIII-Inhibitor (= Haemophilie A) Patienten, insbesondere für solche Patienten mit einem Inhibitor-Titer von grösser 1 Bethesda Elm Plasma, vorzugsweise grösser 5 Bethesda E/ml Plasma. Sie kann auch durch Kombination der hochgereinigten Einzelfaktoren 11, IX und X sowie gegebenenfalls Vil hergestellt werden.
Da biologisches Material, also Material, das von Organismen bzw. Körperflüssigkeiten oder Mikroorganismen stammt, mit Pathogenen, wie z. B. infektiöse Moleküle oder Mikroorganismen und Viren, bzw Pyrogenen, kontaminiert sein kann, wurden bereits verschiedene Verfahren zur Inaktivierung bzw Abreicherung von Pathogenen bzw Pyrogenen entwickelt.
Derartige Verfahren beinhalten physikalische undloder chemische Behandlungen, wie beispielsweise diverse Filtrationsmethoden (z B. Nano-, Dia- oder Ultrafiltration), Hitzebehandlung, Behandlung mit Säure oder Lauge, Behandlung mit Detergens und/oder organisches Lösungsmittel sowie Behandlung mit UV-Licht oder mit Laser-Licht. Auch verschiedene Kombinationen solcher Verfahren zur Inaktivierung bzw Abreicherung von Pathogenen wurden im Stand der Technik vielfach vorgeschlagen
Aus der EP 0 197 554 ist beispielsweise ein Verfahren zum Depyrogenisieren und Inaktivieren von Viren in einem biologischen oder pharmazeutischen Produkt bekannt, weiches eine
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Behandlung mit einem virusinaktivierenden und depyrogenisierenden Mittel, wie z.
B eine amphiphile Substanz und/oder ein Lösungsmittel, an einer festen Phase, an der das Produkt adsorbiert vorliegt, umfasst Nach dieser Behandlung wird das virusinaktivierende und depyrogenisierende Mittel von der festen Phase abgetrennt, das adsorbierte Produkt gewaschen und schliesslich von der festen Phase eluiert.
Aus der EP 0 131 740 ist die Behandlung einer Protein enthaltenden Zusammensetzung in einer Lösung mit organischen Lösungsmit-teln wie Di- oder Trialkylphosphaten, gegebenenfalls in Gegen-wart eines Detergens (Solvens/Detergens-Behandlung) bekannt, wodurch ProteinZusammensetzungen frei von lipidhältigen Viren erhalten werden können.
Aus der AT-PS 402 151 ist eine Hitzebehandlung bekannt, bei welcher einem in wässriger Lösung vorliegenden Präparat vor dem Erhitzen ein Tensid in einer Konzentration von mindestens 1 Gew. % zugesetzt wird
Ein weiteres Verfahren zur Reduktion bzw Suppression unerwunschter Aktivitäten in biologischen oder pharmazeutischen Produkten ist aus der EP 0 083 999 bekannt Dieses basiert auf einem verlängerten Kontakt mit einer Lösung oder Suspension eines nicht-denaturierend wirkenden Amphiphils Das depyrogenisierte Produkt wird zur Entfernung des Amphiphils mit einem Ionenaustauscher behandelt
Ein Nachteil vieler dieser aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren ist das häufige Auftreten von Aktivitätsverlusten der in den zu behandelnden Zusammensetzungen enthaltenen labilen Proteine,
beispielsweise von Blutproteinen Insbesondere bei Durchführung eines chromatographischen Reinigungsschrittes erfolgt eine Inaktivierung von Proteinen in einem relativ hohen Ausmass Ein Abbau von Proteinen kann auch zu einer Aktivierung führen So ist beispielsweise bekannt, dass der Faktor VII bei einer chromatographischen Reinigung aufgrund autokatalytischer Vorgange sehr leicht zu unerwünschtem, weil sehr labilen, Faktor Vlla aktiviert wird
Ein weiterer Nachteil liegt in dem hohen zeitlichen und apparativen Aufwand vieler Verfahren, was deren Praktikabilität stark mindert und deshalb die Anwendung im grosstechnischen Massstab häufig ungeeignet macht.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll daher ein für Proteine, insbesondere für labile Blutproteine, schonendes Verfahren zur wirksamen Inaktivierung von Pathogenen In biologischen Materialien verwendet werden, welches auch leicht in einen grosstechnischen Massstab übertragbar Ist und ökonomisch durchgeführt werden kann. Insbesondere soll bei dem Verfahren zur Inaktivierung von Pathogenen ein Abbau und eine mögliche Aktivierung hierfür empfindlicher Proteine weitgehend vermieden werden.
Bei diesem Verfahren zur Inaktivierung von Pathogenen, insbesondere von Viren, in einem biologischen Material wird dieses Material mit einem chemischen Mittel inkubiert, wobei die Inkubation in Gegenwart eines eluotropen Salzes entsprechend einer NaCI-Konzentration von mindestens 200 mmolll, vorzugsweise mindestens 300 memo)/1, vorgenommen wird.
Die Inaktivierung von Pathogenen in Lösung bietet gegenüber der Behandlung eines Adsorbens einige Vorteile So ist beispielsweise die Praktikabilitat eines derartigen Verfahrens in einem homogenen, einphasigen System höher und die Validierung des Inaktivierungsschrittes besser möglich. Auch scheint die bessere Zugänglichkeit von Pathogenen in einer relativ homogenen Phase die Effizienz des Verfahrensschrittes zu erhöhen.
Das biologische Material enthält vorzugsweise ein humanes Protein und ist insbesondere Plasma oder eine Plasmafraktion oder stammt von einer Zellkultur. Vorzugsweise enthält das biologische Material einen Blutfaktor, wie Faktor XII, XI, Vlil, V, von Willebrand-Faktor oder Fibrinogen, insbesondere ein Vitamin-K-abhangiges Protein wie Faktor 11, Faktor VH, Faktor IX, Faktor X, Protein C, Protein S bzw. Protein Z.
Die Proteine können als Einzelfaktoren, vorzugsweise in gereinigter Form, oder in einem komplexen Gemisch vorliegen. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das biologische Material mindestens einen Faktor des Prothrombinkomplexes und ist insbesondere eine Prothrombinkomplex enthaltende Fraktion oder ein Faktor VII enthaltendes Material, beispielsweise wird nach einer Kryopräzipitation von Plasma vom entsprechenden Überstand (Kryoüberstand) ausgegangen.
Die erfindungsgemässe Präparation ist bevorzugterweise eine solche mit FEIB-Aktivität (Factor
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eineMethanol - Wasser zu Das Adsorbens kann eine feste Phase sein, insbesondere eine für die lonenaustausch-Chromatographie geeignete Matrix In der das eluotrope Salz enthaltenden Zusammensetzung können auch weitere Zusätze, beispielsweise weitere Salze, enthalten sein Vorzugsweise handelt es sich bei der Zusammensetzung um eine wässrige Zusammensetzung mit einem pH-Wert im Bereich zwischen 6, 0 bis 8, 0, bevorzugterweise um 7, 0.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird als eluotropes Salz Natriumchlorid verwendet, aber auch andere Alkali- oder auch Erdalkalisalze, darunter CaCI2 Als eluotrope Salze können auch sogenannte Chaotrope, wie z B Harnstoff, Rhodanide oder Guanidin, eingesetzt werden. Die
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Grenze für die eingesetzte Konzentration hängt insbesondere von der Löslichkeit des jeweiligen Salzes ab und liegt für NaCI beispielsweise um 2 moll. Chaotrope Substanzen, wie z. B.
Harnstoff, konnen gegebenenfalls sogar bis zu einer Konzentration von 8 mol/1 eingesetzt werden
Die Inkubation des biologischen Materials mit dem chemischen Mittel erfolgt für einen für die Inaktivierung gegebenenfalls vorhandener Pathogene ausreichend langen Zeitraum, vorzugsweise für einen Zeitraum zwischen 10 Minuten und 10 Stunden, am meisten bevorzugt zwischen 1 Stunde und 5 Stunden.
Der benötigte Zeitraum für das erfindungsgemässe Verfahren kann mittels Modellviren wie HIV, Slndbis-, FSME- oder Hepatitis-Viren in einem Vorversuch bestimmt werden
Auch die Wahl der Temperatur beeinflusst den anzuwendenden Zeitraum In dem erfindungsgemässen Verfahren wird bevorzugterweise bei Raumtemperatur, beispielsweise in einem Temperaturbereich zwischen 15 und 45 C, insbesondere zwischen 20 und 30 C, inkubiert
Beim erfindungsgemässen Verfahren wird das biologische Material bevorzugt an einem festen Träger adsorbiert, gereinigt und die Inkubation unmittelbar nach Elution des gereinigten Materials vorgenommen Elution und Inkubation können konsekutiv durchgefuhrt werden, sie können aber auch gleichzeitig erfolgen.
Gemäss einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Inkubation nach einer chromatographischen Reinigung eines biologischen Materials vorgenommen, wobei das Eluat noch weiter prozessiert wurde, beispielsweise durch Zentrifugation, Filtration oder andere physikalische Methoden
Der feste Trager ist bevorzugterweise ein für die Chromatographie geeignetes Material, insbesondere ein für die lonenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie oder die Affinitätschromatographie geeignetes Material Beispielsweise werden Materialien wie Sepharose (pertförmiges Material auf Basis von modifizierter Agarose), Superdex (pertfömmiges Copolymerisat aus quervemetzter Agarose und Dextran), Sephadex (dreidimensional vemetztes Dextran- Polysaccharid), Spherodex (quervemetztes Dextran,
in welchem poröses Silicagel eingebettet ist), Toyopearlo (Gel auf Basis von Methacrylat), oder anorganische Materialien, wie Hydroxyapatit, verwendet.
Als Ionenaustauscher können Anionenaustauscher-Materialien, wie beispielsweise Anionenaustauscher auf Zellulosebasis mit Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sephacef*), Anionenaustauscher auf Basis von quervemetztem Dextran mit Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sephadex**), Anionenaustauscher auf Agarosebasis mit Dlethylaminoethyl-Gruppen (DEAE-Sepharose CL6B0, DEAE-Sepharose Fast Flow), Anionenaustauscher auf Basis von quervemetztem Dextran mit Diethyl [2-hydroxypropyl) aminoethyl-Gruppen (QAE-Sephadex#) Anionenaustauscher auf Agarosebasis mit CH2N+ (CHs-Gruppen (Q-Sepharose Fast Flow, Q-Sepharose High Performance* (alle Fa.
Pharmacia)), sphärische Chromatographiegele, hergestellt durch Copolymerisation von N-acryloyl-2-amino-2-hydroxymethyl-1, 3-propandiol und einem anionischen Acrylderivat mit Diethylamino-ethyl-Gruppen als funktionellem Anionenaustauscher (DEAE-Tris-Acryl#), nicht kompressible Silica-Dextran-Matrizes, bei welchen poröses Silicagel in einer quervernetzten Dextranmatrix eingebettet ist, mit reaktiven Diethylaminoethylanionenaustauschergruppen (DEAE-Spherodex*), Gele aus rigiden Polystyrolpartikeln, deren Poren mit einem Hydrogel gefüllt sind, welches quartem re Amingruppen mit starker Anionenaustau-scherwirkung trägt (Q-Hyper-D4) (alle Fa.
Sepracor), Anionenaustauscher mit Diethylaminoethyl-Diethyl (2-hydroxypropyl) aminoethyl und CH2N+ (CH3) s-Gruppen (DEAEToyopearl#, QAE-Toyopearl# (alle Fa. Tosohaas)), Anionenaustauscher auf Basis von Copolyme- ren bestehend aus Oligoethylenglycol-dimethylacrylat (Fractogen EMD-TMAE#) oder andere Fractogel-Materialien verwendet werden.
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Als Beispiele für hydrophobe Chromatographiematerialien sollen beispielsweise hydrophobe Gele auf Basis von Agarose mit Butyl-Gruppen (Butyl-Sepharose'\ Octyl-Gruppen (OctylSepharose), Phenyl-Gruppen (Phenyl-Sepharose@) (alle Fa Pharmacia), Copoly-mere bestehend aus Oligoethylenglycol-dimethylacrylat, Glycidyl-methacrylat und Pentaerythrit-Dimethylacrylat mit einer hydrophilen Oberflache (Fractogel TSK-Butyl*, Fa.
MERCK), Gele auf Basis von Methacrylat (t-Butyl-HIC-Supporte (Fa BioRad) ; TSK-Gel Butyl Toyopear) * (Fa Tosohaas)), eingesetzt
Das biologische Material kann direkt aus einem komplexen Gemisch an den Träger adsorbiert und gereinigt werden, dem Inaktivierungsschritt können aber auch weitere Schritte zur Reinigung des Materials vor- oder nachgeschaltet werden, wobei im Rahmen der vorliegenden Erfindung weitere chromatographische Reinigungsschritte bevorzugt werden
Durch das erfindungsgemässe Verfahren werden Pathogene inaktiviert Unter Pathogenen werden auch Bruchstücke von z. B Viren, insbesondere auch das isolierte Genom oder dessen Fragmente, verstanden
Die Pathogene können lipidumhüllte Pathogene, wie z B. Hepatitis B-Virus oder nichtlipidumhüllte Pathogene, me z. B.
Hepatitis A-Virus, sein
Virusinaktivierungsverfahren werden heutzutage als wirksam bezeichnet, wenn nach Anwendung des Verfahrens an einer Probe eines biologischen Materials, welche mit einer hohen Dosis eines Testvirus, z B HI-Virus oder Sindbis-Virus als Modellvirus für Hepatitis-Viren, versetzt wurde, keine Viren mehr in der Probe nachgewiesen werden können und der Virustiter somit unter die Nachweisgrenze reduziert wurde. Nachweis und Quantifizlerung von Nukleinsauren kann beispielsweise mittels einer PCR-Methode, wie in der AT-PS 401 062 beschrieben, erfolgen oder durch direkte Titration
Als Mass fur die Inaktivierung ist der sogenannte Reduktionsfaktor bekannt, der nach einer eimaligen Zugabe von Testvirus aus dem dekadischen Logarithmus des Quotienten von Anfangsund Endvirustiter errechnet wird.
Aus der Europäischen Richtlinie EC lil/8115/8WEN der Kommission der Europäischen Gemeinschaften ist weiters der sogenannte GesamtReduktionsfaktor bekannt. Er wird aus der Summe der Reduktionsfaktoren von einzelnen subsequenten Inaktivierungsmassnahmen errechnet.
Auch ein weiterer unabhängiger Schritt zur Inaktivierung bzw Abreicherung von Pathogenen wird vorzugsweise durchgeführt Hierfür kommen alle aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren in Frage, um das Infektionsrisiko zu minimieren.
Insbesondere wird als ein weiterer Schritt zur Inaktivierung bzw. Abreicherung eine Filtration und/oder eine Hitzebehandlung vorgenommen
Als Filtration wird vorzugsweise eine Nanofiltration vorgenommen. Eine bevorzugte Hitzebehandlung wird am festen biologischen Material durchgeführt, z. B an einem Lyphilisat mit kontrolliertem Wassergehalt, beispielsweise einem Wassergehalt zwischen 5 bis 8% und einer Temperatur zwischen 50 und 80 C, wie in der EP-0159 311 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist eine 2-stufige Behandlung mit einem Detergens als chemischem Mittel vorgesehen. Dabei wird in einem ersten Schritt ein Detergens in einer Menge von wenigstens 1 %, vorzugsweise wenigstens 5%, am meisten bevorzugt wenigstens 10% verwendet In einer zweiten Stufe wird ein weiteres Detergens in einer Menge von mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 12%, am meisten bevorzugt mindestens 14% verwendet. Das verwendete Detergens kann für beide Stufen dasselbe sein, es können aber auch unterschiedliche Detergentien eingesetzt werden.
Ganz allgemein kann durch die Kombination von Schritten zur Virusinaktivierung das Risiko einer Virusinfektion nach Verabreichung einer entsprechenden Präparation stark reduziert bzw. ausgeschlossen werden
Gemäss der vorliegenden Erfindung wird auch eine chromatographisch gereinigte Präparation zur Verfügung gestellt, enthaltend einen autodynamisch aktivierbaren Blutfaktor mit einem Anteil an aktiviertem Blutfaktor von weniger als 50%, bezogen auf den Gehalt an dem aktivierten und nicht aktivierten Blutfaktor, vorzugsweise weniger als 40%, mehr bevorzugt weniger als 30%, noch mehr bevorzugt weniger als 20%, weiters bevorzugt weniger als 10%, am meisten bevorzugt weniger als 1%,
und einem Detergens-Gehalt
Insbesondere handelt es sich bei der Präparation um eine einen Prothrombinkomplex enthaltende Präparation mit einer Faktor Vlla-Aktivität von weniger als 50%, bezogen auf den Gehalt an aktiviertem und nicht aktiviertem Faktor VII, vorzugsweise weniger als 10%, am meisten
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bevorzugt weniger als 1 %. Der Detergensgehalt des erfindungsgemässen Präparates liegt dabei in einer pharmazeutisch akzeptablen Menge vor, vorzugsweise zwischen 1% und der Nachweisgrenze des Detergens
Unter einem autodynamisch aktivierbaren Blutfaktor ist gemäss der vorliegenden Erfindung ein Blutfaktor zu verstehen, der autokatalytisch, durch OberflÅachenkontakt oder durch Prozesse, wie beispielsweise chromatographische Prozesse, aktivierbar ist.
Insbesondere ist ein derartiger Blutfaktor ein solcher, ausgewählt aus der Gruppe Faktor VII, Faktor XH, Faktor XI und PraKallikreln
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Präparation frei von SerinproteaseInhibitoren, wie beispielsweise Thrombin-Inhibitoren, bzw. der Kofaktoren, wie z. B. Heparin. In einer speziellen Ausführungsform ist die Freiheit von derartigen Substanzen bereits während eines chromatographischen Prozesses gegeben
Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch entsprechende Praparationen, erhältlich durch das erfindungsgemässe Verfahren.
In der erfindungsgemässen Präparation können auch weitere Zusätze enthalten sein, beispielsweise stabilisierend wirkende Substanzen wie Aminosäuren.
Die nachstehenden Beispiele soll die vorliegende Erfindung näher erläutert werden, ohne diese allerdings darauf zu beschränken
Beispiel 1 : Bestimmung von Faktor Vtt)
Die Bestimmung von Faktor Vill-Antigen in FEIBA wurde nach der Methode von Moritz B al.
(Thromb Haemost 1997, Suppl 31) durchgeführt Bei dieser Bestimmung wird durch einen monoklonalen Antikörper gegen die leichte Kette des Faktor VIII-Moleküls als Capture-Antikörper und mittels eines, ebenfalls gegen die leichte Kette des Faktor Vlli-Molekuls, aber gegen ein anderes Epitop gerichteten, monoklonalen Antikörpers als Detektionsantikörper Faktor Vil selektiv neben anderen Plasmaproteinen in FEIBA nachgewiesen.
Beispiel 2 : Bestimmung von Phospholipid
Organisch gebundenes Phosphat wird aus dem Iyophilisierten Pulver der FEIBA-Fraktion nach der Methode von Folch J. et al. (J. BioI. Chem 1957, 226 : 497-509) durch ein lösungsmittelgemisch bestehend aus Chloroform, Methanol im Verhältnis von 2 Volumsteilen Chloroform zu 1 Volumsteil Methanol, extrahiert Der den gesamten Phospholipidanteil enthaltende Extrakt wurde anschliessend in Teflongefasse überführt und die organischen Lösungsmittel unter dem Stickstoffstrom abgedampft Nach Zusatz eines Puffers (20 mM Tris HCI, 150 mM NaCI, pH 7, 4) und Oxisolvreagenz (Fa. Merck) wurden die Teflongefässe dicht verschlossen und bei 1600 für 5 h digeriert.
Das durch den Digeriervorgang freigesetzte Phosphat wurde quantitativ photometrisch als Molybdatkomplex nach der Methode von Ames B. N. (Methods in Enzymology 1966, 8 : 115-118) nachgewiesen
Beispiel 3 : Herstellung eines Faktor VIII-bindenden Affinitätsträgers
Ein CHO-Zellklon, der rekombinanten von Willebrand-Faktor produziert, wird wie in FEBS Lett.
1994 ; 351 : 345-348, beschrieben, hergestellt. Durch Transfektion mit einem für die cDNA humanen Furins kodierenden Vektor (van den Ouweland et al., Nucleic Acids Res. 1990, 18 : 664) wurde die Zellinie zur Co-Expression von humanem Furin gebracht Derartige stabile Zellklone wurden im Grossmassstab in Perfusionsreaktoren auf Microcarriern fermentiert (Bluml et al, in : Spier RE, Griffith JB, Berthold W, eds Animal cell technology Oxford, London : Butterworth-Heinemann, 1994 : 267-269).
Die Reinigung wurde durch ein 2-stufiges chromatographisches Verfahren gemäss Thromb. Haemost. 1995, 731160, durchgeführt. Die durch Elution mit Kochsalz desorbierte Fraktion wurde gewonnen und durch Gelfiltration über Sephadex G25 (Fa Pharmacia) in einen Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7, 5, umgepuffert Anschliessend wurde die Präparation durch Ultrakonzentration über eine Amicon YM3O-Membran (cut-off :
30. 000 D) auf
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eine Proteinkonzentration von 3 mg/ml auf konzentriert Die von Willebrand-Faktor-Konzentration in dieser Praparation betrug 60 E vWF-Antigen/mg Protein
Die Präparation des rekombinanten von Willebrand-Faktors wurde mit einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7, 5, auf 1, 5 mglml verdünnt Ein voraktiviertes, für die Affinitätschromatographie geeignetes Gel (Actigel, ALD-Superflow. Fa.
Sterogene) wurde mit einem Puffer, enthaltend 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7, 5, exzessiv vorgewaschen Ein Volumsteil des vorgewaschenen Gels wurde mit 1, 1 Volumsteilen der zu immobilisierenden Proteinlösung versetzt und anschliessend 0, 15 Volumsteile einer Lösung von 0, 1 M Cyanborhydrid (NaCNBH3) in 0, 1 M Phosphatpuffer, pH 7, 0, zugesetzt. Das Gel wurde durch Schütteln In diesem Puffer suspendiert und unter weiterem Schütteln 16 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschliessend wurde das Gel auf einer Sintemutsche mit dem 10-fachen Volumen eines Puffers, enthaltend 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7, 5, und mit dem 5-fachen Volumen eines Puffers, enthaltend 20 mM Tris-HCI, 2 M NaCI, pH 7. 5, gewaschen Dann wurde nochmals mit 5 Volumsteilen des Puffers, 20 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, pH 7, 5, äquilibriert und das Gel in eine chromatographische Saule mit einer Dimension Durchmesser zu Gelbetthöhe von 1 : 4 übergeführt.
Durch Bestimmung der Proteinkonzentration in den auf der Sinternutsche abgetrennten Lösungen des Inkubationsüberstandes der von Willebrand Faktor-Lösung und des Affinitätsgels sowie der Waschlösungen konnte eine Kopplungsrate von über 90 % des eingesetzten Proteins ermittelt werden
Beispiel 4 :
Herstellung von Faktor VIII-freiem Prothrombinkomplex durch Kontakt mit einem Affinitätsgel :
Das pharmazeutische Präparat FEIBA S-TIM4 IMMUNO (1000 Einheiten) wurde mit 20 ml destilliertem Wasser rekonstituiert Nach vollständiger Lösung des gefriergetrockneten Pulvers, enthielt die Lösung eine Wirkstoffkonzentration von 50 Einheiten pro ml. 10 ml dieser Lösung wurden mit 100 mg des vorher beschriebenen immobilisierten von Willebrand-Faktors in Kontakt gebracht und 1 h bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert Anschliessend wurde das Immobilisat durch Filtration über eine Sintemutsche entfernt. Die im Filtrat erhaltene FEIBA-Lösung wies eine Aktivität von 49 Einheiten FEIBAlml auf.
Durch Bindung des im Präparat enthaltenen Faktor Vill an immobilisierten von Willebrand-Faktor, war Faktor VIII Antigen in dieser Präparation unter der Nachweisgrenze.
Beispiel 5 : Herstellung von Faktor VIII-freiem aktivierten Prothrombinkomplex durch Readsorption an einen unspezifischen Träger
15 mg DEAE-SephadexiI A-50, Fa. Pharmacia, wurden 15 min. bei Raumtemperatur mit 1 ml einer Lösung von 30 gil NaCI in Wasser zur Quellung inkubiert. Danach wurde das Gel durch Zentrifugation vom Quellüberstand abgetrennt. Anschliessend folgten fünf Waschungen des Gels mit je 1 ml Puffer (9 g/) NazHPC. 2H20, 7 gut NaCI, pH 7, 0) und weitere zwei Waschungen mit einem Puffer (7 g/) Na3 Citrat. 2H2O, 7 g/) NaCI) ebenfalls durch Resuspendieren und Zentrifugieren.
30 ml frisch gefrorenes menschliches Citratplasma wurden bei 0-+4 C aufgetaut und das anfallende Kryopräzipitat durch Zentrifugation bei +2"C abgetrennt. Der daraus resultierende "Kryoüber-stand"wurde mit dem gewaschenen DEAE-Sephadex* inkubiert, wobei FEIBA generiert und zusammen mit den Faktoren des Prothrombinkomplexes, Faktor VIII und inertem Protein an das Gel adsorbiert wurde. Danach wurde coadsorbiertes Inertprotein vom DEAE-Gel durch Waschen mit einem Puffer (9 g/t Na2HPO4.2H2O. 7 g/t NaCI) entfernt
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hoher Ionenstärke wurde Protein gemeinsam mit den Faktoren des Prothrombinkomplexes und Faktor VIII desorbiert.
Anschliessend wurde die Suspension durch Zugabe von 6, 5 ml Wasser verdünnt und 1 h bei Raumtemperatur readsorbiert, wobei die Prothrombinkomplexfraktion neuerlich readsorbiert wurde. Gleichzeitig wurde nur ein geringer Teil des in der Proteinfraktion enthaltenen Faktor VIII an das Gel readsorbiert. Der GellProteinkomplex wurde dann fünf mal mit
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je 1 ml einer Losung von 7 g/ ! NaC) in Wasser detergensfrei gewaschen
Zur Elution wurde das Gel mit 0, 7 ml einer Lösung von 30 g/ ! NaC ! in Wasser unter Rühren behandelt. Das Eluat wurde nun gegen destilliertes Wasser dialysiert, eingefroren und Iyophilisiert Nach Rekonstitution des Lyophilisates wurde die FEIB-Aktivität gemäss AT 350 726 bestimmt.
Ferner wurden der Faktor VIII-Antigengehalt bestimmt Als Kontrolle diente ein konventionell hergestelltes FEIBA-PRäparat, wie es in AT 350 726 beschrieben ist Die nach dem beschriebenen Verfahren gewonnene Praparation wies einen um einen Faktor 10 verminderten Faktor VIII-Gehalt im Vergleich zu Kontrolle auf
Durch den Kontakt mit dem Detergens wurden auch eventuell vorhandene Pathogene, insbesondere lipidumhüllte Viren, inaktiviert.
Beispiel 6 : Herstellung von Faktor Vil-freiem und Phospholipidfreiem aktivierten Prothrombinkomplex durch Readsorption an einen unspezifischen Träger
15 mg DEAE-Sephadex# A-50, Fa. Pharmacia, wurden 15 min bei Raumtemperatur mit 1 ml einer Lösung von 30 gli NaCI in Wasser zur Quellung nkubiert. Danach wurde das Gel durch Zentrifugation vom Quellüberstand abgetrennt.
Anschliessend flogten funf Waschungen des Gels
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einem Puffer (7 g/t Na3 Citrat 2H2O, 7 gli NaCI) ebenfalls durch Resuspendieren und Zentrifugieren
30 ml frisch gefrorenes menschliches Citratplasma wurden bei 0-+4 C aufgetaut und das anfallende Kryopräzipitat durch Zentrifugation bei +2 C abgetrennt Der daraus resultierende "Kryouberstand" wurde mit dem gewaschenen DEAE-Sephadexe inkubiert, wobei FEIBA generiert und zusammen mit den Faktoren des Prothrombin-komplexes, Faktor VIII, Phospholipid und inertem Protein an das Gel adsorbiert wurde Danach wurde coadsorbiertes Inertprotein vom DEAE-Gel durch Waschen mit einem Puffer (9 gA Na2 HP04. 2H20, 7 gA NaCI) entfernt.
Der pufferfeuchte Gel-Proteinkomplex wurde nun mit 1, 5 ml einer Lösung von 1 mgiml TWEEN#-80 und 30 mglml NaCI 1 Stunde bei Raumtemperatur suspendiert, wobei die Proteinfraktion und unspezifisch adsorbierte Verunreinigungen desorbiert wurden. Anschliessend wurde das Gel durch Filtration abgetrennt. Die Proteinlösung wurde nun durch weiteren Zusatz von TWEENS-80 auf eine Detergenskonzentration von 150 mgiml gebracht und anschliessend 1 Stunde bei 40"C unter Rühren inkubiert.
Anschliessend wurde durch die Zugabe von 6, 5 ml Wasser verdünnt und ein frisch gewaschenes vorbereitetes DEAE-Sephadex4 A-50 Get readsorbiert, wobei die Prothrombinkomplexfraktion neuerlich readsorbiert wurde Gleichzeitig wurde nur ein geringer Teil des in der Proteinfraktion enthaltenen Faktor VIII an das Gel gebunden. Anschliessend wurde durch fünf Waschungen mit je 1 ml einer Lösung von 7 gil NaCI in Wasser detergensfrei gewaschen Dabei wurde auch gebundenes Phospholipid, welches durch den Kontakt mit dem Amphiphil solubilisiert vorlag, entfernt.
Zur Elution wurde das Gel mit 0, 7 ml einer Lösung von 30 g/t NaCt in Wasser unter Rühren behandelt Das Eluat wurde nun gegen destilliertes Wasser dialysiert, eingefroren und Iyophilisiert.
Nach Rekonstitution des Lyophilisates wurde die FEIB-Aktivität gemäss der AT-B 350 726 bestimmt.
Ferner wurden der Faktor VIII-Antigengehalt und Phospholipid wie beschrieben bestimmt. Als Kontrolle diente ein konventionell hergestelltes FEIBA-Präparat, welches gemäss AT 350 726 gewonnen wurde Die nach dem beschriebenen Verfahren erhaltene Präparation wies einen im Vergleich zur Kontrolle verminderten F VIII Gehalt auf und war frei von Phospholipid Die Analysenergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst
Tabelle 1
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<tb>
<tb> FEIBA <SEP> FVIII <SEP> C <SEP> Ag <SEP> FVIII <SEP> C <SEP> :
<SEP> Ag <SEP> Phospholipid <SEP>
<tb> FEIBA
<tb> UIml <SEP> UIml <SEP> UIU <SEP> nM <SEP> Phosphat <SEP> ! <SEP>
<tb> U <SEP> FEIBA <SEP>
<tb> FEIBA
<tb> (Standard) <SEP> 51 <SEP> 7, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 14 <SEP> 0, <SEP> 14 <SEP>
<tb> FEIBA <SEP> (erfindungsgemasses <SEP> Produkt) <SEP> 70 <SEP> 1, <SEP> 0 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> < 0, <SEP> 02 <SEP>
<tb>