DE69321007T2

DE69321007T2 - Zusammensetzung zur Stabilisierung von Blutplasma im Laufe der Pasteurisation und Pasteurisationsverfahren unter Verwendung dieser Zusammensetzung

Info

Publication number: DE69321007T2
Application number: DE69321007T
Authority: DE
Inventors: Miryana Burnouf (Nee Radosevich), F-59136 Wavrin
Original assignee: AETSRN
Current assignee: Etablissement Francais du Sang
Priority date: 1992-02-13
Filing date: 1993-02-04
Publication date: 1999-04-01
Anticipated expiration: 2013-02-05
Also published as: LTIP338A; EP0556096B1; ATE171074T1; UA27102C2; JP4472672B2; JP4010573B2; DK0556096T3; ES2121065T3; SK8293A3; NO930473D0; CZ285573B6; JP2006306892A; FR2687317A1; BR9300524A; PL174098B1; FI930630A0; NO306532B1; HU9300377D0; EP0556096A1; HUT63768A

Description

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die es erlaubt, das Blutplasma während der Pasteurisierung zu stabilisieren, ein Verfahren, das die genannte Zusammensetzung benutzt, und die so erhaltenen Plasmalösungen, die insbesondere für die Therapien der Plasmaauffüllung und für die Substitutionstherapien mit Blutgerinnungsfaktoren vorgesehen sind.
Das menschliche Gesamtplasma oder das von Kryoproteinen freie menschliche Plasma wird ferner verwendet als "Therapie der Auffüllung" für Personen mit schweren Verbrennungen, für schwer traumatisierte Personen oder für solche, an denen ein schwerwiegender chirurgischer Eingriff vorgenommen wurde, d. h. in allen den Fällen, wo die Patienten große Flüssigkeitsverluste erlitten haben.
Für diese Art der Therapie verwendet man im allgemeinen Plasma, das aus einheitlichen Spenden von gesunden und vorher kontrollierten Personen stammt, um die Gefahren der Übertragung von Viruskrankheiten auszuschließen. Diese Vorgehensweise erlaubt jedoch nicht, in der präserologischen Phase alle Risiken der Kontamination mit Viren, insbesondere mit den verschiedenen Hepatitis- und AIDS-Viren, zu vermeiden.
Es scheint somit immer noch wichtig, die Entwicklung von Methoden zur Virus-Inaktivierung und von stabilisierenden Zusammensetzungen, die die wesentlichen biologischen Funktionen des Plasmas aufrechterhalten, zu verfolgen.
Es wurde gezeigt, daß das Hepatitis-B-Virus durch eine Erwärmung auf 60ºC in Gegenwart von 0,5 mol/l Natriumcitrat innerhalb von 10 Stunden vollkommen inaktiviert wird (Tabor et al., Thrombosis Res. 22, 1981, 233-238). Allerdings führt diese Behandlung zu einem biologischen Aktivitätsverlust gewisser Proteine des Plasmas (Tabor et al. und Barrowcliffe et al. Fr. J. Haematology 55, 1983, 37-46).
Verschiedene ausgehend vom Blutplasma gereinigte Proteine von therapeutischem Interesse konnten bei 60ºC für 10 Stunden in Gegenwart verschiedener Stabilisatoren einer klassischen Pasteurisierung unterzogen werden. Man bemerkt allerdings, daß Zusammensetzungen, welche eine biologische Aktivität stabilisieren, für eine andere solche Aktivität vollkommen unwirksam sein können.
Diese verschiedenen experimentellen Ergebnisse führten zu der Vorstellung, daß eine Virus-Inaktivierung des Gesamtplasmas (frisches Plasma oder eingefrorenes frisches Plasma) oder des von Kryoproteinen freien Plasmas durch Pasteurisierung nicht realisiert werden kann.
Da allerdings der medizinische Bedarf für Gesamtplasma besteht, hat die Anmelderin versucht, Zusammensetzungen zu schaffen, die den gleichzeitigen Schutz der biologischen Aktivität aller Faktoren des Plasmas von therapeutischem Interesse vor einer Denaturierung während der Pasteurisierung sicherstellen.
So hat die Anmelderin in der Patentanmeldung WO 92.00767 gezeigt, daß eine Mischung von Sorbit, Heparin, Lysin und CaCl&sub2; die biologische Aktivität der Faktoren des Plasmas während des Pasteurisierungsvorgangs wirkungsvoll stabilisiert.
Die Anwesenheit von Heparin in dieser stabilisierenden Mischung und damit in der fertigen Zubereitung gestattet es jedoch nicht, dieses Plasma Patienten zu injizieren, die bereits eine Behandlung mit Heparin erhalten.
Aus diesem Grund hat die Anmelderin eine andere Zusammensetzung gesucht, die dieselbe Stabilisierungsaufgabe erfüllt.
Da die Anmelderin früher beobachtete, daß Sorbit einen gewissen Schutz gegen die thermische Denaturierung bietet, aber mit Resultaten, die von einer Plasmaprobe zur anderen schwanken, und mit niedrigen Ausbeuten, untersuchte sie verschiedene Zusatzstoffe, deren Mischung mit Sorbit dessen stabilisierende Wirkung erhöht, und sie erzielte insbesondere durch Zusatz einer Menge von Saccharose, die nahe bei 50% der Sorbitmenge liegt, gute Resultate.
Andererseits führte die Beobachtung einer Instabilität des CaCl&sub2; während der längeren Erwärmung dazu, es durch Calciumgluconat zu ersetzen, das unter den Pasteurisierungsbedin gungen wohlbeständig ist.
Ferner verbesserte der Zusatz von Trinatriumcitrat die Schutzwirkung der Mischung, vorausgesetzt, daß man seine Konzentration sorgfältig einstellt. In der Tat ermöglicht ein zu niedriger Gehalt die spontane Koagulation des Plasmas, ein zu hoher Gehalt bremst die spätere Aktivität der Gerinnungsfaktoren während der therapeutischen Verwendung des Plasmas.
Schließlich wird die Mischung mit mindestens zwei Aminosäuren versetzt, vorzugsweise mit Lysin und Arginin.
So besteht die stabilisierende Zusammensetzung nach der Erfindung aus einer Mischung von Sorbit, Saccharose, Calciumgluconat, Trinatriumcitrat, Lysin und Arginin. Für einen Liter des zu pasteurisierenden Ausgangsplasmas werden die folgenden Konzentrationen der verschiedenen Zusatzstoffe eingestellt:
- Sorbit: von 800 bis 1400 g, vorzugsweise 1300 g,
- Saccharose: von 400 bis 600 g, vorzugsweise 514 g,
- Calciumgluconat: von 3 bis 5 mmol, vorzugsweise 4 mmol,
- Trinatriumcitrat: von 8 bis 25 mmol, vorzugsweise 15 mmol,
- Lysin: von 1 bis 10 g, vorzugsweise 5 g,
- Arginin: von 1 bis 10 g, vorzugsweise 5 g.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird dem frischen Plasma oder dem eingefrorenen und wiederaufgetauten frischen Plasma oder dem von den Proteinen des Kryopräzipitats freien Plasma zugesetzt, bevor man es durch Erwärmung auf 60ºC ± 1ºC im flüssigen Zustand für 10 Stunden einer Pasteurisierung unterzieht.
Nach der Pasteurisierung wird die Temperatur fortschreitend bis auf 20ºC abgesenkt, und die Lösung wird einer Dialyse unterzogen, um Sorbit und Saccharose zu entfernen. Der Dialysepuffer hat pH 7,5 und enthält 10 mmol/l Trinatriumcitrat, 4 mmol/l Calciumgluconat, 0,1 mol/l Natriumchlorid, Lysin in einer Konzentration von 10 g/l und Arginin in einer Konzentration von 3 g/l. In Abhängigkeit von den Anforderungen können auch Dialysepuffer abweichender Zusammensetzung verwendet werden. Die Lösung wird danach konzentriert, um den physiologischen Gehalt der Plasmaproteine wiederherzustellen. Die resultierende Lösung wird einer klärenden und danach einer sterili sierenden Filtration unterzogen, konditioniert, dann eingefroren oder gefriergetrocknet.
Die Erfindung betrifft ebenso das Verfahren zur Pasteurisierung des Plasmas, das die Zugabe der erfindungsgemäßen Zusanimensetzung zu dem Plasma vor seiner Erwärmung und anschließend die Dialyse des pasteurisierten Plasmas gegen den Puffer, so wie er oben definiert wurde, umfaßt.
Dieses Verfahren ist besonders vorteilhaft, weil es auf große Plasma-Chargen anwendbar ist, die aus mehreren unabhängigen Sammlungen stammen. So erlaubt die Pasteurisierung von Chargen der Größenordnung 60 Liter oder mehr, nachdem man die geeigneten Kontrollen ausgeführt hat, eine Konstanz der biochemischen Qualität des Produkts sicherzustellen.
Die Erfindung betrifft ebenso die pasteurisierten Plasmalösungen, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten werden, wobei genannte Lösungen das Gesamtplasma oder das von gewissen Proteinen (wie den Proteinen des Kryopräzipitats) freie Plasma enthalten, und die zu einer therapeutischen Verwendung bestimmt sind, sei es zur Ersetzung des Gesamtplasmas, sei es, um einen Mangel an einem bestimmten Blutfaktor zu kompensieren.
Die Zusammensetzung und das Verfahren nach der Erfindung können ebenso auf Blutplasma tierischen Ursprungs angewendet werden. Man wird sie beispielsweise mit Vorteil auf fetales Rinderserum anwenden, das als Zusatz für die Zellkulturen benutzt wird, die insbesondere zur Herstellung therapeutischer Produkte bestimmt sind.
Das folgende Beispiel beschreibt eine Ausführungsform der Erfindung, ohne allerdings ihre Reichweite zu begrenzen.

Beispiel

Sechzig Liter aufgetautes Blutplasma werden mit der folgenden Mischung unter leichtem Rühren versetzt:
Menge pro Liter Ausgangsplasma
Sorbit 1300 g
Saccharose 514 g
Calciumgluconat 4 mmol
Trinatriumcitrat 15 mmol
Lysin 5 g
Arginin 5 g
Die Pasteurisierung wird für 10 Stunden in einer thermostatisierten Wanne durch Erwärmung auf 60ºC ausgeführt.
Nach der Pasteurisierung wird die Temperatur fortschreitend bis auf 20ºC abgesenkt, dann wird die Lösung einer Dialyse unterzogen, um Sorbit und Saccharose zu entfernen.
Die Dialyse wird beispielsweise auf einem System zur Ultrafiltration auf Kassetten (Pellicom ) ausgeführt.
Die Zusammensetzung des Dialysepuffers ist wie folgt:
- Trinatriumcitrat 10 mmol
- Lysin 10 g/l
- Arginin 3 g/l
- Calciumgluconat 4 mmol
- Natriumchlorid 0,1 mol
Die Entfernung des Sorbits wird durch colorimetrische Bestimmung, die Entfernung der Saccharose durch enzymatische Bestimmung an dem Endprodukt bestätigt.
Gegebenenfalls kann auf die Dialyse eine Konzentrationsoperation auf derselben Ausrüstung folgen, um die Gehalte der Gerinnungsfaktoren auf ungefähr 1 E/ml wie in einem therapeutischen Plasma guter Qualität zurückzuführen. Das Produkt wird auf eine Osmolarität von 370 mosmol/l und einen pH von 7-7,5 dialysiert.
Das Produkt wird anschließend durch Filtration beispielsweise auf Filter Millipack 40 (Millipore ) mit Poren von 0,22 um sterilisiert. Dann erfolgt die Aufteilung des Materials in Plastiktaschen oder Fläschchen für das Einfrieren oder die Gefriertrocknung.
Die Wirksamkeit der Pasteurisierung für die Virus-Inakti vierung wurde an einer Auswahl von Viren bewertet, die durch die "Gruppe von Experten in Biotechnologie/Pharmazie der europäischen Institutionen für die Bewertung der Verfahren zur Virus-Elimierung und -Inaktivierung biologischer Produkte" empfohlen wurde, Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt:
+ = mit Hülle
- = ohne Hülle
Die Resultate der an 6 aufeinanderfolgenden Versuchschargen ausgeführten Qualitätskontrollen sind in den folgenden Tabellen angegeben. Tabelle II: Wiedergewinnung der Blutfaktoren

Tabelle III: Qualitätskontrolle: Abwesenheit von Proteasen und Degradationsprodukten

Konzentration (E/ml)
Thrombin < 0,01
PKA (%) < 2
Kallikrein (%) < 0,01
Faktor IXa (E/ml) < 0,1
Faktor Xa (E/ml) < 0,1
Faktor VIIb/FVIIa 0,97
Proteolytische Aktivität (5.2288 - Δ DO/mn) 0,03
Degradationsprodukte des Fibrinogens (ng/ml) < 250

Tabelle IV: Qualitätskontrolle in vivo an Tiermodellen

Tests an Ratten:
- Blutdruck < -2%
- Herzrhythmus unverändert
- Toxizität (intravenöse Injektion - 25 ml/kg) Abwesenheit von Toxizität
Tests an Kaninchen:
- pyrogene Eigenschaft nicht pyrogen
Das in Gegenwart der oben definierten Zusammensetzung pasteurisierte Plasma entspricht den für eine therapeutische Verwendung vorgesehenen Normen.

Claims

1. Zusammensetzung zur Stabilisierung des Blutplasmas bei der Pasteurisierung, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Mischung von Sorbit, Saccharose, Calciumgluconat, Trinatriumcitrat, Lysin und Arginin besteht.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Sorbit-Konzentration zwischen 800 und 1400 g pro Liter des ursprünglichen Plasmas liegt.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Sorbit-Konzentration 1300 g/l beträgt.

4. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Saccharose-Konzentration zwischen 400 und 600 g/l liegt.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Saccharose-Konzentration 514 g/l beträgt.

6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Calciumgluconat-Konzentration zwischen 3 und 5 mmol/l liegt.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Calciumgluconat-Konzentration 4 mmol/l beträgt.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Trinatriumcitrat-Konzentration zwischen 8 und 25 mmol/l liegt.

9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Trinatriumcitrat-Konzentration 15 mmol/l beträgt.

10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Lysin- und Arginin-Konzentrationen zwischen 1 und 10 g/l liegen.

11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Lysin- und Arginin-Konzentrationen 5 g/l betragen.

12. Verfahren zur Pasteurisierung des Blutplasmas, dadurch gekennzeichnet, daß es vor dem Schritt der Erwärmung die Zugabe der Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 zum Plasma und dann nach dem Schritt der Erwärmung die Entfernung der Zucker der genannten Zusammensetzung durch Dialyse gegen einen Trinatriumcitrat, Calciumgluconat, Natriumchlorid, Lysin und Arginin enthaltenden Puffer umfaßt.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer für die Dialyse 10 mmol/l Trinatriumcitrat, 4 mmol/l Calciumgluconat, 0,1 mol/l Natriumchlorid, 10 g/l Lysin und 3 g/l Arginin enthält.

14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß es auf Plasmavolumina anwendbar ist, die zwischen einem Liter und mehreren hundert Litern liegen.