SK280665B6 - Prípravok na stabilizáciu krvnej plazmy v priebehu - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka prípravku na stabilizáciu krvnej plazmy v priebehu pasterizácie a spôsobu pasterizácie krvnej plazmy. Takto získané roztoky plazmy sa používajú najmä na liečbu, pri ktorej je treba doplňovať plazmu alebo nahrádzať krvný koagulačný faktor.

Doterajší stav techniky

Pri osobách, ktoré utrpeli ťažké popáleniny alebo vážne úrazy, alebo ktoré sa podrobili väčšiemu chirurgickému zákroku, t.j. pri pacientoch, pri ktorých došlo k veľkému úbytku tekutiny, sa používa liečba, ktorá zahŕňa doplnenie úplnej humánnej plazmy alebo plazmy, ktorá neobsahuje kryoproteín.

Pri tomto type liečby sa obvykle používa plazma od individuálnych zdravých darcov, ktorí sa podrobili predbežnému vyšetreniu, aby sa zabránilo riziku prenosu vírusových chorôb. Tento postup však neumožňuje eliminovať všetky riziká vírusovej kontaminácie v presérologickom štádiu, predovšetkým nebezpečenstvo kontaminácie rôznymi vírusmi hepatitis a AIDS.

Z tohto dôvodu je dôležité pokračovať vo vývoji metód inaktivácie vírusov a stabilizačných prípravkov, pri ktorých používaní sa zachovávajú hlavné biologické funkcie plazmy.

Už bolo demonštrované, že vírus Hepatitis B sa úplne inaktivuje desaťhodinovým zohrievaním na 60 °C v prítomnosti 0,5 M citranu sodného (Tábor a ďalší, Thrombosis Res. 22, 1981, str. 233 až 238). Tento postup však vedie k strate biologickej účinnosti niektorých proteínov nachádzajúcich sa v plazme (Tábor a ďalší a Barrowcliffe a ďalší, Fr. J. Haemotology 55, 1983, str. 37 až 46).

Ukázalo sa, že je možné podrobiť rôzne terapeuticky hodnotné proteíny, ktoré boli izolované z krvnej plazmy, konvenčnej pasterizácii pri 60°C 10 hodín v prítomnosti rôznych stabilizačných činidiel. Je však treba uviesť, že prípravky stabilizujúce jednu biologickú účinnosť nemusia mať absolútne žiadny účinok na inú biologickú účinnosť.

Na základe týchto rôznych experimentálnych dát vznikol dojem, že inaktivácia vírusov v úplnej plazme (čerstvej plazme alebo zmrazenej čerstvej plazme) alebo plazme neobsahujúcej kryoproteín, sa nedá dosiahnuť pasterizáciou.

Pretože v lekárstve existuje dopyt po úplnej plazme, snažili sa pôvodcovia tohto vynálezu vyvinúť prípravky, ktoré by v priebehu pasterizácie súčasne zaručovali dosiahnutie ochrany biologickej účinnosti pred denaturáciou pri všetkých terapeuticky hodnotných faktoroch obsiahnutých v plazme.

Vo francúzskej patentovej prihláške č. 90 08375 pôvodcovia ukázali, že zmes sorbitolu, heparínu, lyzínu a chloridu vápenatého účinne stabilizuje biologickú účinnosť faktorov plazmy v priebehu pasterizačného postupu.

Pretože však tento stabilizačný prípravok, a teda i finálny preparát, obsahuje heparín, nie je možné pacientom, ktorí už uskutočňujú liečbu heparínom, podávať túto plazmu.

Z tohto dôvodu sa pôvodcovia snažili nájsť iný prípravok, ktorý by plnil rovnakú stabilizačnú funkciu.

Podstata vynálezu

Na základe skoršieho pozorovania, že sorbitol dáva určitý stupeň ochrany pred tepelnou denaturáciou, pričom však dosiahnuté výsledky boli rôzne pri rôznych vzorkách plazmy a účinnosť nebola veľká, sa pôvodcovia snažili nájsť rôzne prísady, ktoré by po zmiešaní so sorbitolom zvýšili jeho stabilizačnú schopnosť. Pritom boli dosiahnuté dobré výsledky najmä pri pridaní sacharózy, približne v množstve 50 %, vo vzťahu k množstvu sorbitolu.

Na druhej strane, ako bolo pozorované, že chlorid vápenatý je v priebehu dlhšieho zohrievania nestály, bola táto látka nahradená glukanátom vápenatým, ktorý má dobrú schopnosť odolávať podmienkam pasterizácie.

Ochranný účinok zmesi je okrem toho posilnený prídavkom citranu trisodného, za predpokladu, že jeho koncentrácia jc presne nastavená, pretože príliš malá dávka umožňuje spontánnu koaguláciu plazmy, zatiaľ čo príliš vysoká dávka spomaľuje následnú aktivitu koagulačných faktorov v priebehu terapeutického využitia plazmy.

Okrem toho sa k zmesi pridávajú aspoň dve aminokyseliny, prednostne lyzín a arginín.

Predmetom tohto vynálezu je teda prípravok na stabilizáciu krvnej plazmy v priebehu pasterizácie, ktorý sa vyznačuje tým, že je tvorený zmesou sorbitolu, sacharózy, glukonátu vápenatého, citrátu trisodného, lyzínu a arginínu.

Na jeden liter počiatočnej plazmy, ktorá má byť pasterizovaná, sa používajú jednotlivé zložky tohto prípravku v nasledujúcich koncentráciách:

- sorbitol, 800 až 1400 g, prednostne 1300 g,

- sacharóza, 400 až 600 g, prednostne 514 g,

- glukonát vápenatý, 3 až 5 mM, prednostne 4 mM,

- citrát trisodný, 8 až 25 mM, prednostne 15 mM,

- lyzín, 1 až 10 g, prednostne 5 g,

- arginín, 1 až 10 g, prednostne 5 g.

Prípravok podľa vynálezu sa pridáva k čerstvej plazme alebo zmrazenej a roztopenej čerstvej plazme, alebo k plazme, ktorá neobsahuje proteíny kryoprecipitátu, predtým, než sa plazma podrobí pasterizácii v kvapalnom stave desaťhodinovým zohrievaním na teplotu (60 ± 1)°C.

Po pasterizácii sa teplota postupne zníži na 20 °C a roztok sa dialyzuje, aby sa odstránil sorbitol a sacharóza. Dialyzačný tlmivý roztok má hodnotu pH 7,5 a obsahuje 10 mM citrátu trisodného, 4 mM glukonátu vápenatého, 0,1 M chloridu sodného, lyzín v koncentrácii 10 g/1 a arginín v koncentrácii 3 g/1. Podľa potreby je tiež možné použiť dialyzačné tlmivé roztoky odlišného zloženia. Potom sa roztok skoncentruje, aby sa obnovila fyziologická dávka plazmových proteínov. Výsledný roztok sa podrobí číriacej filtrácii a potom sterilizačnej filtrácii a nakoniec sa zabalí a hlboko zmrazí alebo lyofilizuje.

Predmetom vynálezu je tiež spôsob pasterizácie plazmy, ktorý sa vyznačuje tým, že sa k plazme pred jej zahrievaním pridá prípravok podľa vynálezu a potom sa pasterizovaná plazma dialyzuje oproti uvedenému tlmivému roztoku.

Tento spôsob je zvlášť výhodný, pretože sa dá aplikovať na veľké dávky plazmy z niekoľkých separátnych odberov. Tieto dávky môžu ležať v rozmedzí od 1 litra do niekoľko stoviek litrov. Po vykonaní príslušných kontrolných vyšetrení umožňuje pasterizácia dávky, ak veľkosť dosahuje rádovo 60 1 alebo viac, zaručiť konzistentnú biochemickú kvalitu produktu.

Pasterizované roztoky plazmy, získané spôsobom podľa vynálezu, ktoré obsahujú úplnú plazmu alebo plazmu, ktorá neobsahuje určité proteíny (ako sú proteíny kryoprecipitá2 tu) sú určené na terapeutické využitie, buď na náhradu úplnej plazmy alebo 11a kompenzáciu nedostatku určitého krvného faktoru.

Prípravok a spôsob podľa vynálezu sa dá tiež aplikovať na plazmu zvieracieho pôvodu. Výhodne ich možno použiť napríklad pri hovädzom fetálnom sére, ktoré sa používa ako prísada pre bunkové kultúry, predovšetkým určené na výrobu terapeutických produktov.

Vynález je bližšie objasnený v nasledujúcom príklade uskutočnenia. Tento príklad má výhradne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzuje.

Príklady uskutočnenia vynálezu

K 60 1 roztopenej plazmy sa za mierneho miešania pridá nasledujúca zmes:

množstvo na 1 1 počiatočnej plazmy sorbitol 1300 g, sacharóza 514 g, glukonát vápenatý 4mM, citrát trisodný 15 mM, lyzín 5g, arginín 5g.

Pasterizácia sa vykonáva v terniostatovanej nádrži desaťhodinovým zahrievaním na teplotu 60 °C. Po pasterizácii sa teplota postupne zníži na 20 °C a potom sa roztok dialyzuje, aby sa odstránil sorbitol a sacharóza. Dialýza sa uskutočňuje napríklad v kazetovom ultrafiltračnom systéme (Pcllicon (R)). Použitý dialyzačný tlmivý roztok má nasledujúce zloženie:

citrát trisodný10 mM lyzín 10 g/1 arginín3 g/1 glukonát vápenatý 4 mM chlorid sodný0,1 M

Odstránenie sorbitolu sa kontroluje kolorimetrickou analýzou a odstránenie sacharózy sa kontroluje enzymatickou analýzou výsledného produktu.

Po dialýze môže nasledovať podľa potreby koncentračný postup, ktorý' sa uskutočňuje v rovnakom zariadení. Pri tomto postupe sa obsah koagulačného faktoru opäť nastavuje na hodnotu približne 1 U/ml, čo je hodnota, ktorú má kvalitná plazma pre terapeutické použitie. Produkt sa dialyzuje za osmotického tlaku 370 mosmol/1 a pri pH 7 až 7,5.

Potom sa produkt sterilizuje filtráciou, napríklad s použitím filtračného materiálu Millipack^<R| 40 (Millipore ^(R)) s pórmi s veľkosťou 0,22 pm. Získaný produkt sa balí do vrecúšok alebo fliaš z plastu a zmrazí alebo lyofilizuje.

Účinnosť pasterizácie pri inaktivácii vírusov sa vyhodnocuje pomocou rôznych vírusov, ktoré použitie je odporúčané skupinou expertov v biotechnológii a farmakológii úradov Európskeho spoločenstva pre hodnotenie postupov, ktoré sú zamerané na elimináciu a inaktiváciu vírusov v biologických produktoch. Dosiahnuté výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

vírus genóm štruktúra zníženie trvanie infekčnosti f log 10)

HIV	RNA	E	>5	<10 min.
Polio Sabin 1	RNA	NE	>6,23	<5h
Vaccine	DNA	E	>4,30	< 1 h
Herpes-	DNA	E	>4,15	>5h
Aujeszky
Parainfluenza	RNA	E	>6,30	<2h

typ 3

Reovírus typ 3 RNA NE >3,28 <10 h

Sindbis______RNA________E________>5.74 < 5 h

Poznámky: E = s obalom

NE = bez obalu

Výsledky kontroly kvality, vykonané pri šiestich za sebou nasledujúcich poloprevádzkových dávkach, sú uvedené v nasledujúcich tabuľkách.

Tabuľka II

Regenerácia krvných faktorov

	koncentrácia (U/ml)	obsah (%)
proteíny (g/1)	60,0 ± 106	93 ±2
faktor VIII: c	1,10 ± 0,26	94 ± 7
(IU/ml)
faktor VIII: c	0,70 ± 0,09	83 ± 13
(chromogénny)
faktor V: c	1,12 ± 0,25	83 ±4
faktor XI: c	0,98 ± 0,06	88 ±7
faktor IX: c	0,64 ±0,10	59 ±7
faktor VII: c	0,65 ± 0,05	67 ±6
flbrinogén Ag (g/1)	3,10 ±0,28	92 ±5
zrážateľný fibrino-
gén (g/1)	2,50 ±0,17	92 ±3
aktivita antitrom-
bínu III (g/1)	0,99 ± 0,04	92 ±3
aktivita a-1-anti-
trypsínu (g/1)	0,96 ±0,10	92 ±3

APTT 35-38 sekúnd

Tabuľka III

Kontrola kvality: neprítomnosť proteáz a degradačných

produktov	koncentrácia (U/T)
trombín	<0,01
PKA (%)	<2
kallikreín (%)	3
faktor IXa (U/ml)	<0,1
faktor Xa (U/ml)	<0,1
faktor Vllb/FVIIa	0,97
proteolytická aktivita	0,03
(S.2288 - OD/mn)
degradačné produkty
fibrinogénu (ng/ml)	<250

Tabuľka IV

Kontrola kvality in vivo na zvieratách skúška na potkanoch: krvný tlak srdcový tep toxicita (intravenózna) injekcia - 25 ml/kg) < -2 % bez zmeny nie je toxická skúška na zajacoch:

pvrogenicita apyrogénna

Plazma pasterizovaná v prítomnosti uvedeného stabilizačného prípravku vyhovuje normám, ktoré sú kladené na plazmu na terapeutické použitie.

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Prípravok na stabilizáciu krvnej plazmy v priebehu pasterizácie, vyznačujúci sa tým, že je tvorený zmesou sorbitolu, sacharózy, glukonátu vápenatého, citrátu trisodného, lyzinu a arginínu.
2. 2. Prípravok podľa nároku 1, vyznačujúci sa t ý m , že koncentrácia sorbitolu v počiatočnej plazme leží v rozmedzí od 800 do 1400 g/1.
3. 3. Prípravok podľa nároku 2, vyznačujúci sa t ý m , že koncentrácia sorbitolu je 1300 g/1.
4. 4. Prípravok podľa niektorého z nárokov 1 až 3, v y značujúci sa tým, že koncentrácia sacharózy je v rozmedzí od 400 do 600 g/1.
5. 5. Prípravok podľa nároku 4, vyznačujúci sa t ý m , že koncentrácia sacharózy je 514 g/1.
6. 6. Prípravok podľa niektorého z nárokov 1 až 5, v y značujúci sa tým, že koncentrácia glukonátu vápenatého je v rozmedzí od 3 do 5 mM.
7. 7. Prípravok podľa nároku 6, vyznačujúci sa t ý m , že koncentrácia glukonátu vápenatého je 4 mM.
8. 8. Prípravok podľa niektorého z nárokov 1 až 7, v y značujúci sa tým, že koncentrácia citrátu trisodného je v rozmedzí od 8 do 25 mM.
9. 9. Prípravok podľa nároku 8, vyznačujúci sa t ý m , že koncentrácia citrátu trisodného je 15 mM.
10. 10. Prípravok podľa niektorého z nárokov 1 až 9, vyznačujúci sa tým, že koncentrácia lyzinu a arginínu sú v rozmedzí od 1 do 10 g/1.
11. 11. Prípravok podľa nároku 10, vyznačujúci sa t ý m , že koncentrácia lyzinu a arginínu sú 5 g/1.
12. 12. Spôsob pasterizácie krvnej plazmy, vyznačujúci sa tým, že sa k plazme pridá pred stupňom zahrievania prípravok podľa niektorého z nárokov 1 až 11 a po stupni zahrievania sa zo zmesi odstránia cukry dialýzou oproti tlmivému roztoku obsahujúcemu citrát trisodný, glukonát vápenatý, chlorid sodný, lyzín a arginin.
13. 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa t ý m , že sa použije dialyzačný tlmivý roztok, obsahujúci 10 mM citrátu trisodného, 4 mM glukonátu vápenatého, 0,1 M chloridu sodného, 10 g/1 lyzinu a 3 g/1 argininu.
14. 14. Spôsob podľa nároku 12 alebo 13, vyznačujúci sa tým, že je aplikovateľný na objem plazmy v rozmedzí od 1 litra do niekoľko stoviek litrov.