CZ285573B6 - Přípravek pro stabilizaci krevní plasmy během pasterace a pasterovaný roztok plasmy pro terapeutické použití - Google Patents

Abstract

Předmětem tohoto řešení je přípravek pro stabilizaci krevní plasmy v průběhu pasterace, který se vyznačuje tím, žže je tvořen směsí sorbitolu, sacharózy, glukonátu vápenatého, citrátu trojsodného, lysinu a argininu. Přípravek je určen pro stabilizaci úplné plasmy nebo plasmy, která neobsahuje kryoproteiny a umožňuje pasteraci velkých objemů plasmy, řádově 60 litrů. Předmětem řešení je i způsob pasterace plasmy, který se provádí tak, že se k plasmě přidá před stupněm zahřívání tento přípravek a po stupni zahřívání se ze směsi odstraní cukry dialýzou proti pufru obsahujícímu citrát trojsodný, glukonát vápenatý, chlorid sodný, lysin a arginin. Získaná pasterovaná plasma je určena pro terapeutické využití.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká přípravku, který umožňuje stabilizovat krevní plazmu během pasterace, způsobu použití tohoto přípravku. Plazma pasterovaná za použití přípravku podle vynálezu se hodí zejména pro léčbu, při níž je zapotřebí doplňovat plazmu nebo nahrazovat krevní koagulační faktor.

Dosavadní stav techniky

U osob, které utrpěly těžké popáleniny nebo vážné úrazy nebo které se podrobily většímu chirurgickému zákroku, tj. u pacientů, u nichž došlo k velkému úbytku tekutiny, se používá léčby zahrnující doplňování úplné humánní plazmy nebo plazmy, která neobsahuje kryoprotein.

Při tomto typu léčby se obvykle používá plazmy od individuálních zdravých dárců, kteří byly podrobeni předběžnému vyšetření, aby se zabránilo riziku přenosu virových chorob. Tento postup však neumožňuje eliminovat všechna rizika virové kontaminace v preserologickém stadiu, především nebezpečí kontaminace různými viry hepatitis a AIDS.

Z toho důvodu, je zřejmě důležité pokračovat ve vývoji metod inaktivace virů a stabilizačních přípravků, při jejichž použití se zachovávají hlavní biologické funkce plazmy.

Již bylo demonstrováno, že virus Hepatitis B se úplně inaktivuje desetihodinovým zahříváním na 60 °C za přítomnosti 0,5 M citranu sodného (Tábor a další, Thrombosis Res. 22, 1981, str. 233 až 238). Tento postup však vede ke ztrátě biologické účinnosti některých proteinů obsažených v plazmě (Tábor a další a Barrowcliffe a další, Fr. J. Haemotology 55, 1983, str. 37 až 46).

Ukázalo se, že je možné podrobit různé terapeuticky hodnotné proteiny, které byly izolovány z krevní plazmy, konvenční pasteraci při 60 °C po dobu 10 hodin za přítomnosti různých stabilizačních činidel. Je však třeba uvést, že přípravky stabilizující jednu biologickou účinnost nemusí mít absolutně žádný účinek na jinou biologickou účinnost.

Na základě těchto různých experimentálních dat vznikl dojem, že inaktivace virů v úplné plazmě (čerstvé plazmě nebo zmrazené čerstvé plazmě) nebo plazmě neobsahující kryoprotein, nelze dosáhnout pasteraci.

Jelikož však v lékařství existuje poptávka po úplné plazmě, snažili se původci tohoto vynálezu vyvinout přípravky, které by v průběhu pasterace současně zaručovaly dosažení ochrany biologické účinnosti před denaturací u všech terapeuticky hodnotných faktorů obsažených v plazmě.

Ve francouzské patentové přihlášce č. 90 08375 původci ukázali, že směs sorbitolu, heparinu, lysinu a chloridu vápenatého účinně stabilizuje biologickou účinnost faktorů plazmy v průběhu pasteračního postupu.

Jelikož však tento stabilizační přípravek a tedy i finální preparát, obsahuje heparin, není možno pacientům, kteří již prodělávají léčbu heparinem, podávat tuto plazmu.

Z toho důvodu se původci snažili nalézt jiný přípravek, který by plnil stejnou stabilizační funkci.

- 1 CZ 285573 B6

Podstata vynálezu

Na základě dřívějšího pozorování, že sorbitol uděluje určitý stupeň ochrany před tepelnou denaturací, přičemž však dosažené výsledky byly různé u různých vzorků plazmy a účinnost nebyla velká, se původci snažili nalézt různé přísady, které by po smíchání se sorbitolem zvýšily jeho stabilizační schopnost. Přitom bylo dosaženo dobrých výsledků zejména při přidání sacharózy, přibližně v množství 50 %, vztaženo na množství sorbitolu.

Na druhé straně, jelikož bylo pozorováno, že chlorid vápenatý je v průběhu delšího zahřívání nestálý, byla tato látka nahrazena glukonátem vápenatým, který má dobrou schopnost odolávat podmínkám pasterace.

Ochranný účinek směsi je kromě toho posílen přídavkem citranu trojsodného, za předpokladu, že jeho koncentrace je přesně nastavena, poněvadž příliš malá dávka umožňuje spontánní koagulaci plazmy, zatímco příliš vysoká dávka zpomaluje následnou aktivitu koagulačních faktorů v průběhu terapeutického využití plazmy.

Kromě toho se ke směsi přidávají alespoň dvě aminokyseliny, přednostně lysin a arginin.

Předmětem tohoto vynálezu je tedy přípravek pro stabilizaci krevní plazmy v průběhu pasterace, který se vyznačuje tím, že je tvořen směsí sorbitolu, sacharózy, glukonátu vápenatého, citrátu trojsodného, lysinu a argininu.

Najeden litr počáteční plazmy, která má být pasterována, se používá jednotlivých složek tohoto přípravku v následujících koncentracích:

- sorbitol, 800 až 1400 g, přednostně 1300 g,

- sacharóza, 400 až 600 g, přednostně 514 g,

- glukonát vápenatý, 3 až 5 mM, přednostně 4 mM,

- citrát trojsodný, 8 až 25 mM, přednostně 15 mM,

- lysin, 1 až 10 g, přednostně 5 g,

- arginin, 1 až 10 g, přednostně 5 g.

Přípravek podle vynálezu se přidává k čerstvé plazmě nebo zmrazené a roztáté čerstvé plazmě nebo k plazmě, která neobsahuje proteiny kiyoprecipitátu, před tím, než se plazma podrobí pasteraci v kapalném stavu desetihodinovým zahříváním na teplotu 60 ± 1 °C.

Po pasteraci se teplota postupně sníží na 20 °C a roztok se dialýzuje, aby se odstranil sorbitol a sacharóza. Dialyzační pufr má hodnotu pH 7,5 a obsahuje 10 mM citrátu trojsodného, 4 mM glukonátu vápenatého, 0,1 M chloridu sodného, lysin v koncentraci 10 g/1 a arginin v koncentraci 3 g/1. Podle potřeby je také možno použít dialyzačních pufrů odlišného složení. Potom se roztok zkoncentruje, aby se obnovila fyziologická dávka plazmových proteinů. Výsledný roztok se podrobí čeřící filtraci a potom sterilizační filtraci a nakonec se zabalí a hluboko zmrazí nebo lyofilizuje.

Předmětem vynálezu je také způsob pasterace plazmy, který se vyznačuje tím, že se k plazmě před jejím zahříváním přidá přípravek podle vynálezu a potom se pasterovaná plazma dialýzuje proti výše uvedenému pufru.

Tento způsob je obzvláště výhodný, poněvadž ho lze aplikovat na velké dávky plazmy z několika separátních odběrů. Tyto dávky mohou ležet v rozmezí od 1 litru do několika set litrů. Po provedení příslušných kontrolních vyšetření umožňuje pasterace dávek, jejichž velikost činí řádově 60 1 nebo více, zaručit konsistentní biochemickou kvalitu produktu.

-2 CZ 285573 B6

Předmětem vynálezu jsou také pasterované roztoky plazmy, získané způsobem podle vynálezu, které obsahují úplnou plazmu nebo plazmu, která neobsahuje určité proteiny (jako jsou proteiny kryoprecipitátu) a které jsou určeny pro terapeutické využití, buď pro náhradu úplné plazmy nebo pro kompenzaci nedostatku určitého krevního faktoru.

Přípravek a způsob podle vynálezu lze také aplikovat na plazmu zvířecího původu. S výhodou jich lze použít například u hovězího fetálního séra, kterého se používá jako přísady pro buněčné kultury, především určené pro výrobu terapeutických produktů.

Vynález je blíže objasněn v následujícím příkladu provedení. Tento příklad má výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezuje.

Příklad provedení vynálezu

K 60 1 roztáté plazmy se za mírného míchání přidá následující směs:

množství na 1 1 počáteční plazmy sorbitol 1300 g, sacharóza 514 g, glukonát vápenatý 4mM, citrát troj sodný 15 mM, lysin5 g, arginin5 g.

Pasterace se provádí v termostatované nádrži desetihodinovým zahříváním na teplotu 60 °C. Po pasteraci se teplota postupně sníží na 20 °C a potom se roztok dialýzuje, aby se odstranil sorbitol a sacharóza. Dialýza se provádí například v kazetovém ultrafíltračním systému (Pellicon ^). Použitý dialyzační pufr má následující složení:

citrát troj sodný10 mM lysin 10 g/1 arginin3 g/1 glukonát vápenatý 4mM chlorid sodný0,1 M

Odstranění sorbitolu se kontroluje kolorimetrickou analýzou a odstranění sacharózy se kontroluje enzymatickou analýzou výsledného produktu.

Po dialýze může následovat podle potřeby koncentrační postup, který se provádí ve stejném zařízení. Při tomto postupu se obsah koagulačního faktoru znovu nastavuje na hodnotu přibližně 1 U/ml, což je hodnota, kterou má kvalitní plazma pro terapeutické použití. Produkt se dialýzuje za osmotického tlaku 370 mosmol/1 a při pH 7 až 7,5.

Potom se produkt steriluje filtrací, například za použití filtračního materiálu Millipack^(R) 40 (Millipore ^w) s póry o velikosti 0,22 pm. Získaný produkt se balí do pytlíků nebo láhví z plastu a zmrazí nebo lyofilizuje.

Účinnost pasterace při inaktivaci virů se vyhodnocuje pomocí různých virů, jejichž použití je doporučováno skupinou expertů v biotechnologii a farmakologii úřadů Evropského společenství

-3 CZ 285573 B6 pro hodnocení postupů, které jsou zaměřeny na eliminaci a inaktivaci virů v biologických produktech. Dosažené výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

virus	genom	struktura	snížení infekčnosti (loglO)	trvání
HIV	RNA	E	>5	< 10 min
Polio Sabin 1	RNA	NE	>6,23	< 5 h
Vaccine	DNA	E	>4,30	< 1 h
Herpes-Auj eszky	DNA	E	>4,15	> 5 h
Parainfluenza typ 3	RNA	E	>6,30	< 2 h
Reovirus typ 3	RNA	NE	>3,28	< 10 h
Sindbis	RNA	E	>5,74	< 5 h

Poznámky:

E = s obalem NE = bez obalu

Výsledky kontroly kvality, provedené u šesti po sobě následujících poloprovozních dávek, jsou uvedeny v následujících tabulkách.

Tabulka II

Regenerace krevních faktorů

	koncentrace (U/ml)	obsah (%)
proteiny (g/1)	60,0 ± 106	93 ±2
faktor VIII: c	1,10 ±0,26	94 ±7
(IU/ml)
faktor VIII: c	0,70 ± 0,09	83 ± 13
(chromogenní)
faktor V: c	1,12 ±0,25	83 ±4
faktor XI: c	0,98 ± 0,06	88 ±7
faktor IX: c	0,64 ±0,10	59 ±7
faktor VII: c	0,65 ± 0,05	67 ±6
fibrinogen Ag (g/1)	3,10 ±0,28	92 ±5
srazitelný fibrinogen (g/1)	2,50 ±0,17	92 ±3
aktivita antithrombinu III (g/1)	0,99 ± 0,04	92 ±3
aktivita α-1-antitrypsinu (g/1)	0,96 ±0,10	92 ±3
APTT	35-38 sekund

-4CZ 285573 B6

Tabulka III

Kontrola kvality: nepřítomnost proteáz a degradačních produktů

koncentrace (U/l)
thrombin	<0,01
PKA (%)	<2
kallikrein (%)	3
faktor IXa (U/ml)	<0,1
faktor Xa (U/ml)	<0,1
faktor VIIb/FVIIa	0,97
proteolytická aktivita	0,03
(S.2288 - OD/mn)
degradační produkty fibrinogenu (ng/ml)	<250

Tabulka IV

Kontrola kvality in vivo na zvířatech zkouška na krysách: krevní tlak srdeční tep toxicita (intravenózní) injekce - 25 ml/kg) zkouška na králících:

pyrogenicita < -2 % beze změny není toxická apyrogenní

Plazma pasterovaná za přítomnosti výše uvedeného stabilizačního přípravku vyhovuje normám, které jsou kladeny na plazmu pro terapeutické použití.

Claims (8)

1. Přípravek pro stabilizaci krevní plazmy v průběhu pasterace, vyznačující se tím, že je tvořen směsí, která se skládá z následujících složek, v množstvích vztažených na jeden litr zpracovávané plazmy:

sorbitol, 800 do 1400 g, sacharóza, 400 do 600 g, glukonát vápenatý, 3 až 5 mmol, citrát trojsodný, 8 až 25 mmol a lysin a arginin, 1 až 10 g.

2. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že množství sorbitolu je

1300 g, vztaženo najeden litr zpracovávané plazmy.

3. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že množství sacharózy je

514 g, vztaženo najeden litr zpracovávané plazmy.

4. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že množství glukonátu vápenatého je 4 mmol, vztaženo najeden litr zpracovávané plazmy.

5. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že množství citrátu trojsodného je 15 mmol, vztaženo najeden litr zpracovávané plazmy.

6. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že množství lysinu a argininu je 5 g, vztaženo najeden litr zpracovávané plazmy.

7. Způsob stabilizace krevní plazmy v průběhu pasterace, vyznačující se tím, že se k plazmě přidá před stupněm zahřívání přípravek podle některého z nároků 1 až 6 a po stupni zahřívání se ze směsi odstraní cukry dialýzou proti pufru obsahujícímu citrát trojsodný, glukonát vápenatý, chlorid sodný, lysin a arginin.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se použije dialyzačního pufru obsahujícího 10 mmol/1 citrátu troj sodného, 4 mmol/1 glukonátu vápenatého, 0,1 mmol/1 chloridu sodného, 10 g/1 lysinu a 3 g/1 argininu.