DK175644B1 - Fremgangsmåde til stabilisering af biologiske og farmaceutiske midler under inaktivering af virale og bakterielle kontaminanter - Google Patents

Description

i DK 175644 B1

Denne opfindelse angår en fremgangsmåde til stabilisering af biologiske og farmaceutiske produkter med henblik på at beskytte deres aktivitet under behandling, som er bestemt til at inaktivere virale og/eller bakterielle forureninger. Mere spe-5 cifikt angår opfindelsen stabilisering af proteinholdige mate- ! rialer, som skal befries for biologiske forureninger, såsom virusser og lignende, og især Epstein-Barr-virus (EBV) og cytomegalovirus (CMV), smittefarlige hepatitisvirusser, såsom hepatitis B-virus (HBV), ikke-A ikke-B hepatitisvirus (NANBV), 10 og Human Immunsystemsvækkelsesvirus (HTLV III/LAV/HIV), som forårsager AIDS.

Biologiske og farmaceutiske produkter kan være forurenede, eller er udsatte for at blive forurenede af virusser og bakteri-15 er, hvilket gør dem uegnede og ofte temmelig farlige til terapeutisk anvendelse. En sådan forurening kan være en kilde for smitsomme sygdomme, hvilket udgør en stor risiko for brugerne af disse produkter.

20 Det er muligt at inaktivere de virale og bakterielle forureninger i produktionens indledende eller mellemliggende trin eller i slutprodukterne. Inaktiver i ngsmetoderne er imidlertid meget hårde og resulterer sædvanligvis i et væsentligt tab af aktivitet hos de labile biologiske og farmaceutiske produkter.

25 Derfor er det nødvendigt forud for inaktivering af forureningerne at stabilisere de biologiske og farmaceutiske produkter for at beskytte deres aktivitet.

Denne opfindelse angår generelt stabilisering af biologiske og 30 farmaceutiske produkter i væske- eller suspensionstilstandsform ved at frigøre dem for virale og bakterielle forureninger under anvendelse af termiske metoder, kemiske metoder eller bestrålingsmetoder til inaktivering.

35 Opfindelsen angår i et specifikt aspekt fremstilling af biologiske og farmaceutiske produkter, som pasteuriseres i væsketilstandsformen under fremstillings- eller rensningsprocessen.

I DK 175644 B1 I

I 2 I

I Væskepasteurisering er en etableret metode til inaktivering af I

I patogene mikroorganismer, som forurener produkter hidrørende I

I fra biologiske materialer, såsom humant plasma. Denne opfin- H

I delse angår specielt anvendelsen af stabilisatorer, som hin- H

5 drer inaktivering af proteiner og muliggør, at der kan udføres I

I pasteurisering med minimalt tab af biologisk og terapeutisk I

aktivitet. Stabilisering opnås ved tilsætning af passende I

mængder af et eller flere mono-, di- eller tri-sacchari der el- I

I ler sukkeralkoholer i kombination med et eller flere neutrale I

10 salte forud for pasteurisering. H

I Midler, som er afledt af biologiske kilder, og som er beregnet I

I til terapeutisk, profylaktisk eller diagnostisk anvendelse, I

I udgør en stor og vigt i g de laf de inden for sundhedsplejen an- H

15 vendte produkter. Eksempler på sådanne produkter og anvendelse I

I heraf omfatter følgende: Faktor VIII anvendes ti 1 at behandle H

I hæmofili; immunserumg1 obul in anvendes ved behandlingen af con- H

I genital gammaglobulinmangel, poliomyletitis og hepatitis A og I

Θ; antithrombin III er en koaguleringsinhibitor; plasminogen/ H

I 20 streptokinase-kompleks anvendes véd behandling af thromboembo- I

I lisme; og plasmavæksthormoner korrigerer pituitøs mangelfuld I

I vækst.

Et vigtigt anliggende, som er forbundet med anvendelsen af te- I

I 25 rapeutiske midler hidrørende fra biologiske kilder, er over- I

førselen af sygdom, især viral sygdom. Fremherskende virale I

I ' forureninger omfatter hepatitis B-virus (HBV), ikke-A, ikke-B I

hepatitisvirus (NANBV) og HTLV III/LAV/HIV, som forårsager I

I AIDS. Med henblik på at sikre, at de fra biologiske kilder

I 30 fremstillede produkter er virus-sikre, er forskellige metodik- I

ker blevet foreslået til vi rusi nakt i ver ing. Disse kan i almin-

I delighed opsummeres som følgende metoder: varmebehandling af I

I blodprodukterne i vandig opløsning om ønsket med tilsætning af I

I virucide substanser; varmebehandling af blodprodukterne i van- I 35 dig opløsning i nærværelsen af stabiliserende midler; behand-

I ling af blodprodukterne med organiske opløsningsmidler; be- I

I stråling af blodprodukterne i fast tilstand; og varmebehand- I

H ling af blodprodukterne i tør tilstand. I

3 DK 175644 B1

Alle disse metoder .sigter på at ødelægge præparaternes potentielle virale og bakterielle smittefare, mens deres ønskede 0 biologiske aktivitet i alt væsentlighed bibeholdes.

5 Kendte repræsentative metoder, som menes at være relevante i forhold til den foreliggende opfindelse, er, som følger: USP nr. 4.456.590 (Rubenstein) angår en metode til varmebehandling af plasmafraktioner på lyofiliseret form med det for-10 mål at inaktivere hepatitisvirus, som kan være til stede i fraktionerne.

I USP nr. 4.314.997 (Shanbrom) beskrives en kemisk inaktiveringsmetode, ved hvilken metode plasma og plasmaderivater i 15 opløsning eller suspension bringes i kontakt med et ikke-dena-turerende amfifilt materiale, dvs. et overfladeaktivt middel, der forårsager irreversibel ødelæggelse af endotoksiner og inaktivering af hepatitisvirusser.

20 I USP nr. 4.440.679 (Fernandes m.fl.) beskrives en metode, hvor terapeutisk aktive proteiner pasteuriseres ved at blande proteinsammensætningen med en pasteuriseringsstabiliserende mængde af en polyol forud for pasteurisering.

25 I USP nr. 4.297.344 (Schwinn m.fl.) fremlægges en fremgangsmåde til varmestabi1 i sering af koagulationsfaktorerne II, VIII, XIII, antithrombin III og plasminogen i vandig opløsning, som omfatter, at man til opløsningen sætter både en aminosyre og en eller flere af et monosaccharid, et oligosaccharid eller en 30 sukkeralkohol.

USP nr. 4.585.654 (Landaburu m.fl.) angår en fremgangsmåde til inaktivering af virusser i en plasmaproteinopløsning ved opvarmning af denne i nærværelse af en poloyl, et overfladeak-35 tivt middel og et chelateringsmiddel.

Ifølge nogle forfattere fremgår det, at våd opvarmning af visse biologiske produkter er mere effektiv end tør opvarmning.

I DK 175644 B1 I

I I

H F.eks. ved en sammenligning af våd opvarmning over for tør I

varmebehandling med hensyn til sikkerhed mod NANBV-overførsel, I

viser resultater, at våd opvarmning frembringer en højere grad I

I af sikkerhed (Kernoff m.fl., The Lancet, Sept. 28, 1985, side I

5 721). Kliniske data viser, at Faktor VI11-koncentrat, som er I

I pasteuriseret i væskefase, ikke har overført HBV, NANBV eller I

med HTLV III/LAV/HIV i mere end seks år, hvor klinisk erfaring I

haves. (International Congress of the World Federation of He- I

I mophelia, 8-13 juni (1986); N. Heimburger: "Preparation of a F I

10 VIII concentrate free from pathogenic viruses.") Virknings- I

fuldheden af virusinaktivering ved væskepasteurisering vises I

I måske bedst ved serumal buminens historie, hvor intet tilfælde I

af serumhepatitis kan føres tilbage til transfusion af varme- I

I behandlet albumin i et tidsrum på mere 35 år ("Milestones in I

15 Blood Transfusion and Immunohaemotology", Vox Sang 46:338-340 I

I (1984)). I

Direkte anskueliggørelse af viral inaktivering ved pasteurise- I

ring i væsketilstandsformen har vist, at cytomegalovirus. Ep- I

20 stein-Barr-virus, herpes simplex-virus, poliovirus, kokoppevi- I

rus, hepatitis B-virus, ikke-A ikke-B hepatitusvirus og HTLV I

III/LAV/HIV alle inaktiveres og har yderligere vist, at neo- I

antigener ikke dannes under pasteurisering i væskeform ("Pas- I

teurization as an Efficient Method to Inactivate Blood Borne I

25 Viruses in Factor VIII Concentrates", J. Hilfenhous og E. I

Weidman; Arzneim.-Forsch/Drug Res. 36(1) Nr. 4 (1986)). I

Under forudsætning af, at væskepasteurisering er en anerkendt I

måde til inaktivering af virale forureninger, bliver det nød- I

30 vendigt at stabilisere varmefølsomme bioaktive molekyler imod I

varmeinaktivering. Stabilisering mod den termiske inaktivering I

af disse produkter opnås gennem anvendelse af et eller flere I

mono-, di- eller tri-saccharider, eller sukkeralkoholer i kom- I

bination med et eller flere neutrale salte. I

35 I

Denne fremgangsmåde afviger signifikant fra de nærmest beslæg- I

tede kendte fremgangsmåder ifølge henvisningerne, som er be- I

skrevet ovenfor. Nemlig: I

DK 175644 B1 5 (a) Den afviger fra den fremgangsmåde, hvor der anvendes en kombination af monosaccharider, oligosaccharider eller sukker-alkoholer med aminosyrer eller visse am inosyreana1 oger, ved at erstatte aminosyrer og deres analoger med et neutralt salt.

5 Der er særlige fordele knyttet til denne erstatning. For det første kan tilsætningen af stabiliserende mængder af aminosyrer til et biologisk eller farmaceutisk produkt forårsage in-' aktivering på grund af bratte og ofte signifikante pH-ændrin- ger. Denne effekt bliver minimal eller elimineret gennem an- 10 vendeisen af stabiliserende salte. For det andet er mange ami nosyrer tungtopløselige i vandige opløsningsmidler, hvorimod de fleste stabiliserende salte er fuldt opløselige, hvilket muliggør tilsætningen af stabilisatorer i højere koncentration. For det tredje, når aminosyrer anvendes som stabilisato-15 rer, er det nødvendigt at fjerne al reststabilisator fra slutproduktet, idet intensiv terapi med et farmaceutisk produkt, der indeholder restami nosyr.er, kan overbelaste kroppens afgiftningssystem hos patienter med alvorlig lever- eller nyreskade.

20 (b) Den afviger også fra den fremgangsmåde, som påstår at anvende en polyol som den eneste stabilisator. Pasteurisering, hvor der kun anvendes en polyol i fraværet af noget som helst glycin, resulterer i relativ dårlig udvinding af f.eks. Faktor 25 VIII-aktivitet. Det er også åbenlyst, at slutformuleringerne ifølge de refererede produkter indeholder glycin, og derfor ligner pasteuriseringsbetingelserné dem, hvor der anvendes sukker i kombination med en aminosyre.

30 Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til inaktivering af patogener i et biologisk eller et farmaceutisk materiale, som omfatter, at materialet blandes i en vandig opløsning indeholdende mindst én primær stabilisator, valgt blandt sukkerarter eller sukkeralkoholer, og mindst én sekundær sta-35 bilisator, valgt blandt neutrale salte; at pH-værdien i den vandige opløsning indstilles på ca. 5,0 til c a. 10,0; at den vandige opløsning underkastes en patogen inaktiveringsproces; og at de primære og sekundære stabilisatorer eventuelt fjernes fra den vandige opløsning, som er ejendommelig ved, at den sekundære stabilisator er natriumacetat, kaliumacetat, lithiumacetat, magnesiumacetat, ammoniumacetat, bariumacetat, natriumsulfat, ammoniumsulfat, lithiumsulfat, bariumsulfat, kaliumsulfat eller magnesiumsulfat.

I DK 175644 B1 I

I 6 I

I Mere specifikt angår opfindelsen en fremgangsmåde til inakti- I

vering af patogener i et biologisk eller farmaceutisk materia- I

le ved at blande materialet i vandig opløsning med en eller I

flere primære stabilisatorer, valgt blandt mono-, di- eller I

5 tri-saccharider eller sukkeralkoholer i en koncentration fra I

I 10 v/r% (vægt/rumfangs%) op til mætningskoncentration; ved at I

tilsætte en eller flere sekundære stabilisatorer, valgt blandt I

neutrale salte i koncentrationer fra 0,01 M til mætningskon- I

centration til opnåelse af en blanding; ved termisk at inakti- I

H 10 vere patogener ved at fastholde en temperatur fra 30°C til I

I 100°C i 1 minut til 72 timer; ved at indstille pH-værdien i I

I området fra 6,7 til 7,7; og ved at fjerne de primære og sekun- I

I dære stabilisatorer efter termisk inaktivering. I

I 15 I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse pasteurise- I

res biologiske og farmaceutiske produkter i nærværelsen af H

I primære og sekundære stabilisatorer, hvis kombinerede virkning I

I sikrer, at produkternes aktivitet bevares under varmeproces- I

I I

I 20 I

Varmebehandlingen udføres ved en temperatur og i et tidsrum, I

I som er tilstrækkeligt til at inaktivere patogenerne, især in- I

fektiøse virusser, men som på samme tid bibeholder produkter- I

I nes aktivitet. En sådan varmebehandling fastholdes i ca. 1 mi- I

25 nut til ca. 72 timer ved en temperatur på 30°C til 100*C, for- I

I trinsvis i ca. 10 til ca. 20 timer ved 55°C til 70°C, og mest I

I foretrukket i 10 timer ved 60eC. I

I Ved frigørelse af de biologiske/farmaceutiske produkter fra I

I 30 patogener anvendes et vandigt medium, i hvilket de primære og H

I sekundære stabilisatorer er opløst eller suspenderet. Produk- I

I tet, som skal pasteuriseres, bringes i kontakt med mediet og I

I underkastes pasteuriseringsbetingelser, som er tilstrækkelige I

I til at desaktivere patogener. Behandling af produktet kan ud- I

I 35 føres på ethvert trin i fremstillingsprocessen, såsom udgangs- I

I materiale-trinnet eller på senere trin i produktionssekvensen, I

I eller for visse produkter efter at fremstillingsprocessen er I

I tilendebragt. I

DK 175644 B1 7

Efter tilsætning af stabilisatorerne indstilles pH-værdien, hvis det er nødvendigt, til en værdi på 5,0 til 10,0 og fortrinsvis på 6,7 til 7,7. Produktkoncentrationen i det vandige medium er generelt fra ca. 1 mg/ml til ca. 500 mg/ml og mere 5 foretrukket fra ca. 1 til 100 mg/ml.

Efter pasteurisering er tilendebragt fjernes stabilisatorerne på hensigtsmæssig måde, som omfatter: dialyse (McPhie, P.

(1971), Methods in Enzymol. 22, side 23-32); diafiltrering 10 (Blatt, W.F. m.fl. (1968) Anal. Biochem. 26, side 151); kolonnekromatografi (Porath, J. og Flodin, P. (1959), Nature 183, side 1657-1659); udfældning (Dixon, M. og Webb., E.C. (1961), Adv. in Protein Chem. 16, side 197-219, Academic Press, N.Y.; Honig, W og Kula, M.R. (1976) Anal. Biochem. 72, 15 side 502-512); eller enhver anden metode ved hvilken fjernelse af stabilisatorerne kan udføres.

Produkter 20 Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er anvendelig for et stort antal og en bred variation af materialer og produkter inden for de biomedicinske og farmaceutiske områder, soro er beregnet på at blive anvendt til mennesker eller dyr til biomedicinske eller terapeutiske såvel som ikke-terapeu-25 tiske eksperimentelle formål. Relevante materialer og produkter, som kan gøres fri for patogener under anvendelse af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, omfatter, men er ikke begrænset til: 30 blodfraktioner, såsom antihæmofi 1 ifaktor (Smith, J. K. og Bid-well, E. (1979) Clinics in Hoematol. 8, side 184-205); pro- thrombinkomp1eks, f.eks. Faktorerne II, VII, IX og X (Chandra, S. og Brummelhuis, H.G.0. (1981) Vox Sang. 41, side 257-273); Protein C (Stenflo, J. (1976) J. Biol. Chem. 251, side 355-363 35 og Bajaj, S. P. m.fl. (1983) Prep. Biochem. 13, side 191-214);

Protein S (DiScipio, R.G., m.fl. (1977) Biochemistry 16, side 698-706); Antithrombin III (Rosenberg, R.D., og Damus, P.S. (1973) J. Biol Chem. 248, side 6490-6505); C-l esterasehæmmer

I DK 175644 B1 I

I I

(Heimburger, N. (1974) Bayer Symposium V "Proteinase Inhibi- I

tors", side 14-22, Springer-Verlag); α-1-antitrypsin (Heimbur- I

I ger, N. supra.); Fibronectin (Mosesson, M.N. og Amrani, D.L.

(1980), Biood 56 side 145-158); Gammaglobulin (Oncley m.fl. I

I 5 (1949) J. Amer. Chem. Soc. 71, side 541-550); biologiske eller H

farmaceutiske produkter af human eller animalsk oprindelse,

I såsom insulin, enzymer, coenzymer, antistoffer og hormoner; . I

I biologiske eller farmaceutiske produkter hidrørende fra human

I eller animalsk placenta, såsom blodfraktioner og vacciner; I

I 10 biologiske og farmaceutiske produkter hidrørende fra DNA-re- I

I kombineringsteknik og dannet i bakterier, svampe eller patte- I

dyrscellekultursystemer (Vane, J. og Cuatrecases, P. (1984), I

Nature 312, side 303-305 og Maniatis, T. m.fl. (1982), Molecu- I

lar Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.). I

15 Disse produkter og materialer er tilgængelige fra forskellige I

I kommercielle kilder eller kan fremstilles ved anvendelse af I

I velkendte bearbejdningsteknikker. F.eks. kan blodfraktioner og I

blodproteiner opnås ud fra humant blodplasma ved fraktionering I

I ifølge kendte teknikker, såsom f.eks. Cohn-alkoholfraktione- I

I 20 ringen, som er beskrevet i US patentskrift nr. 2.390.074 og I

I "the Journal of the American Chemical Society" Bind 68, side I 459 (1946). Disse metoder såvel som andre teknikker er opsum-

I nieret i "The Plasma Proteins", 2. udgave, bind III, side 548- I

I 550, Academic Press, New York, N.Y. (1977). I

I 25

I Primære stabilisatorer I

I De primære stabilisatorer omfatter mono-, di- eller tri-sac- I charider og sukkeralkoholer, f.eks. glucose, sucrose, xylose, Η

I 30 fructose og mannitol, giucosaminitol, sorbitol, galactosamini - I

I tol og lignende. En eller flere af disse stabilisatorer anven- I

I des i fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse i et

I koncentrationsområde fra 10 v/r% op til mætningskoncentration. I

I 35 Den foretrukne primære stabilisator er sucrose i en koncentra- I

I tion på ca. 50 til 70 v/r%. I

DK 175644 B1 9

Sekundåre stabilisatorer

Oe sekundære stabilisatorer består af visse neutrale salte og anvendes i fremgangsmåden ifølge den foreliggéride opfindelse i 5 en koncentration fra 0,01 M til mætningskoncentration. De foretrukne stabiliserende salte til brug ved denne opfindelse er defineret som neutrale salte af almindelige organiske og uorganiske syrer og eksemplificeret ved, men ikke begrænset til, natriumacetat, kaliumacetat, natriumphosphat, natriumsulfat og 10 ammoniumsulfat såvel som 1 i thiumsulfat, kaliumsulfat, magnesiumsulfat, bariumsulfat, 1 ithiumacetat, magnesiumacetat og bariumacetat, som der er henvist i det følgende: 1. Molecular Biology of Human Proteins, Bind 1, side 3, 15 1966. Schultze, BH.E. og Heremans, J.F.

2. Biophysical Chemistry, Bind 1, side 275-277, 1958.

Edsall, J.T. og Wyman, J.

3. Handbook of Chemistry and Physics, CRC Handbook, 57.

Udgave, side 113, 1976-1977.

20 4. Textbook of Biochemistry, 3. Udgave, side 96, 1963.

West, E.S. og Todd. W.R.

Koncentration af det stabiliserende salt, der skal anvendes, afhænger af to parametre. For det første afhænger den af oplø-25 seligheden af molekylet, og for det andet af koncentrationen, ved hvilken udsaltning af proteinet/proteinerne begynder at ske i opløsningen.

De følgende eksempler skal yderligere illustrere opfindelsen, 30 alt imens det skal forstås, at opfindelsen ikke er begrænset dert i 1.

35 ------- ----------i

DK 175644 B1 I

EKSEMPEL 1 I

Pasteurisering af et lav-fibrinogen AHF-koncentrat H

Stab i 1 i ser inq med Sucrose + Natriumacetat_ fl

- I

Hver af tre glas med Factorat-LF® (lav-fibrinogen Faktor VIII, H

fremstillet af Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, IL) Η

blev restitueret i 10 ml vand til injektion. Til det ene blev B

sat 1,0 g sucrose pr. ml opløsning samt 0,5 g natriumacetat I

10 pr. ml opløsning. Til det andet blev tilsat 1,0 g sucrose pr. I

ml opløsning. Ingen stabilisatorer blev sat til det tredje I

glas. pH-værdien i disse tre opløsninger blev indstillet på fl

7,0 ved hjælp af en lille mængde 0,5 N saltsyre. Opløsningerne B

blev opvarmet til 60eC i 10 timer. Prøver før og efter pasteu- fl 15 risering blev for hver opløsning afprøvet for prokoagulant ak- fl

tivitet (Faktor VIII:C) ved "éttrinsakt i veret partiel thrombo- B

plastin tid (APTT)"-metoden, som i alt væsentligt er den samme fl som de metoder, der er beskrevet af Hardisty, R.M. og MacPher- fl son, J.C. (1962), Thrombosis et Diathesis Haemorrhagica 7, si- fl 20 de 215-229 og Zacharski, L.R. og Rosenstein, R. (1978), Amer. fl J. Clin. Path. 70, side 280-286. Resultaterne er opsummeret i fl

tabel 1. I

Tabel 1 fl 25 F.VIII Enheder/ml fl Før Efter fl

Stabi1 isatorer Pasteurisering Pasteurisering % Udvundet fl

Sucrose + I

30 natriumacetat: 11,4 9,2 80,7 fl

Sucrose: 14,2 5,9 41,5 fl

Ingen: 20,1 00 fl DK 175644 B1 11 EKSEMPEL 2

Pasteurisering af højrenset faktor VIII:C Stabilisering med sucrose + natriumacetat 5

Monoclate® (Faktor VIII:C, fremstillet af Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, IL) blev pasteuriseret på følgende måde. Tre aliquotmængder hver på 10 ml (ca. 500 enheder) af ul-trafiltreret eluat fra en anti-Faktor VI11: R-Sepharose-Cl2B-10 kolonne blev anvendt. Den første blev blandet med 1,0 g sucrose pr. ml opløsning samt 0,5 g natriumacetat pr. ml opløsning.

Til den anden al iquotmængde blev sat 1,0 g sucrose pr. ml op- . løsning. Ingen stabilisatorer blev sat til den tredje aliquot-msngde. pH-værdien i disse tre opløsninger blev indstillet til 15 7,0 med en lille mængde 0,5 N saltsyre. Opløsningerne blev op varmet til 60°C i 10 timer. Prøver før og efter pasteurisering blev afprøvet for prokoagulant aktivitet (Faktor VIII:C) ved "éttrins ΑΡΤΤ'’-metoden, som er omtalt i eksempel 1. Resultaterne er opsummeret i tabel 2.

20

Tabel 2 F.VIII Enheder/ml Før Efter

Stabi1 i satorer Pasteuri seri nq Pasteurisering % Udvundet 25

Sucrose + natriumacetat: 17,6 10,4 60,2

Sucrose: 23,2 6,9 28,9 30

Ingen: 23,0 1,0 4,0 35

I DK 175644 B1 I

I I

I EKSEMPEL 3 I

Pasteurisering af højtrenset faktor VIII:C I

I Stabilisering med sucrose ♦ natriumsulfat I

I 5 I

Monoclate® (Faktor VIII:C, fremstillet af Armour Pharmaceuti- I

I cal Company, Kankakee, IL) blev pasteuriseret på følgende må- I

I de. To al iquotmængder hver på 10 ml (ca. 500 enheder) af ul- I

I trafiltreret eluat fra en anti-Faktor VI11: R-Sepharose-C12B-

I 10 kolonne blev anvendt. Den første blev blandet med 1,0 g sucro- I

I se pr. ml opløsning samt 0,28 g natriumsulfat pr. ml opløs- I

I ning. Til den anden al iquotmængde blev sat 1,0 g sucrose pr. I

I ml opløsning. pH-værdien i de to opløsninger blev indstillet I

I på 7,0 med en lille mængde 0,5 N saltsyre. Opløsningerne blev H

I 15 opvarmet til 60°C i 10 timer. Prøver før og efter pasteurise- I

ring blev afprøvet for prokoagulant aktivitet (Faktor VIII:C) I

I ved "éttrins APTT"-metoden, som er omtalt i eksempel 1- Resul- H

I taterne er opsummeret i tabel 3.

I 20 v Tabel 3 I

I F.VIII Enheder/ml I

I Før Efter I

I Stab i 1 i satorer Pasteurisering Pasteurisering % Udvundet I

I 25 Sucrose + I

I natriumsulfat: 21,5 17,6 81,9 I

I Sucrose: 20,0 5,7 28,5 I

I 30 EKSEMPEL 4 I

I Pasteur i seringafet lav-fibri nogen AHF-koncentrat I

Stabilisering med sucrose * forskellige neutrale salte

I 35 Hver af ni glas med Factorat-LF® (1av-fibri nogen Faktor VIII, I

I fremstillet af Armour Pharmaceutical Company, Kankakee, IL) I

I blev restitueret i 10 ml vand til injektion. Efter restitution I

I var tilendebragt, blev 1,0 g sucrose pr. ml opløsning sat til I

DK 175644 B1 13 hver prøve. Forskellige stabiliserende salte blev derpå tilsat i koncentrationer på 1-2 H til hver af FactoratLF®/sucrose-op-løsningerne. De anvendte salte var som følger: kaliumacetat (2,0 g), ammoniumacetat (1,6 g), natriumsulfat (2,8 g), ammo-. 5 niumsulfat (2,6 g), natriumch1 or id (1,2 g), ammoniumchlorid (1,1 g), magnesiumchlorid (0,95 g), cholinchlorid (2,8 g) og natriumphosphat, dibasisk (1,4 g). pH-værdien i opløsningerne blev derefter indstillet på 7,0 ved hjælp af enten 0,5 N saltsyre eller 0,5 N natriumhydroxid, undtagen for opløsningen in-10 deholdende natriumphosphat. pH-værdien i denne opløsning var 8,2, ikke-justeret. Opløsningerne blev opvarmet til 60®C i 10 timer. Prøver før og efter pasteurisering fra hver opløsning blev afprøvet for prokoagulant aktivitet (Faktor VIII:C) ved "éttrins APTf-metoden, som er omtalt i eksempel 1. Resulta-15 terne er opsummeret i tabel 4.

Tabel 4

% Udvundet F. VIII

Stabi1 isatorer Efter pasteurisering 20

Sucrose + kaliumacetat 89,4

Sucrose + ammoniumacetat 72,7

Sucrose + natriumsulfat 89,1

Sucrose + ammoniumsulfat 78,6 25 Sucrose + natriumchlorid 16,7

Sucrose + ammoniumchlor id 34,7

Sucrose + magnesiumchlorid 10,9

Sucrose + cholinchlorid 10,0

Sucrose + natriumphosphat (dibasisk) 28,0 30

De følgende konklusioner ses let ud fra forsøgene, som.er beskrevet ved eksemplerne, og resultaterne, som er vist i tabellerne: * 35 Pasteurisering af de proteinholdige materialer ved 60°C i 10 timer resulterer i næsten fuldstændig destruktion af deres aktivitet; mens anvendelsen af en sukkerart alene (sucrose) forbedrer bibeholdelsen af aktivitet, er den betydelig mindre ef-

DK 175644 B1 I

fektiv, end når der anvendes en kombination af en sukkerart og H

visse stabiliserende salte som stabilisatorer og; kombinatio- H

nen af en sukkerart med visse stabiliserende salte som stabi- I

lisatorer er bedre end kombinationen af en sukkerart med andre H

5 stabiliserende salte. H

Andre udførelsesformer H

Ifølge andre udførelsesformer af den foreliggende opfindelse, H

10 kan stabilisering af biologiske eller farmaceutiske produkter H

også opnås, når andre metoder end pasteurisering anvendes til H

bakteriel og viral inaktivering. Oisse metoder omfatter: ke- I

misk inaktivering, såsom anvendelse af ozon som det patogene I

deaktiverende middel, som beskrevet i USP nr. 4.632.980, an- I

15 vendelse af en organisk forbindelse til at fremme desaktive- I

ring, som beskrevet i USP nr. 4.640.834; eller anvendelse af I

høj-energi-(UV, infrarød og gamma)-bestrål ing, som beskrevet i I

USP nr. 2.897.123. I

20 Det er klart, at adskillige modifikationer og variationer af I

opfindelsen kan udføres uden at fravige dens ånd og omgang. I

De beskrevne specifikke udførelsesformer er kun givet som ek- I

sempler, og opfindelsen er kun begrænset af omfanget af de an- I

førte krav. H

Claims (14)

1. 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den patogene inaktiverings proces omfatter, at man udsætter den vandige opløsning for en temperatur på 30°C til 100°C i ca. 1 minut til 72 timer.
2. 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den patogene inaktiverings-25 proces omfatter kemisk inaktivering eller bestråling.
3. 4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at pH-værdien i den vandige opløsning indstilles på ca. 6,7 til ca. 7,7, og at opløsningen underkastes pasteuriseringsbetingelser tilstrækkelig til at deaktivere patogener deri. 30 I DK 175644 B1 I I I
4. 5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at pasteuriseringen udføres ved I I en temperatur på ca. 55°C til ca. 70°C i 10 til 20 timer. I
5. 6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 5, kendetegnet ved, at den primæ- I 5 re stabilisator er et mono-, di- eller tri-saccharid.
6. 7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at sukkerarteme er glucose, I sucrose, xylose, fructose, mannitol, og at sukkeralkoholeme er galactitol, glucoamini- I I tol, sorbitol eller galactosaminitol. I I 10 I
7. 8. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 7, kendetegnet ved, at den primæ- . I I re stabilisator er til stede i en koncentration fra 10 v/r% til mætningskoncentration.
8. 9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at stabilisatoren er sucrose i en I I 15 koncentration på ca. 50 v/r% til 70 v/r%. I
9. 10. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 9, kendetegnet ved, at den sekun- I I dære stabilisator er til stede i en koncentration på omkring 0,01 M til mætningskoncen- I I tration. I I 20 I
10. 11. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 10, kendetegnet ved, at den se- I kundære stabilisator er til stede i en koncentration på ca. 0,5 M til ca. 2,5 Μ. I
11. 12. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 11, kendetegnet ved, at de primæ- I I 25 re og sekundære stabilisatorer fjernes ved diafiltrering, dialyse, kolonnechromatografi I eller ved udfældning. I
12. 13. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 12, kendetegnet ved, at det nævn- I I te materiale foreligger på et bearbejdningstrin under fremstillingen af det færdige pro- I I 30 dukt, som det færdige produkt, som en aktiv forbindelse, der skal indgå i det færdige I I produkt, eller som foreligger i det færdige produkt. I DK 175644 B1
13. 14. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 13, kendetegnet ved, at nævnte materiale er faktor VIII eller prothrombinkompleks.
14. 15. Proteinholdigt produkt, kendetegnet ved, at det er blevet behandlet på et hvilket som helst ønsket trin under produktets fremstilling ved en fremgangsmåde, som omfatter fremgangsmåden ifølge ethvert af kravene 1 til 14. 10