DK156698B

DK156698B - Fremgangsmaade til pasteurisering af et materiale indeholdende et termisk foelsomt, terapeutisk aktivtprotein valgt blandt alfa-l-antitrypsin, antithrombin-iii, praekallikrein, antihaemofil faktor (faktorviii) og fibronectin

Info

Publication number: DK156698B
Application number: DK098681AA
Authority: DK
Inventors: Peter M Fernandes; John L Lundblad
Original assignee: Miles Inc
Priority date: 1980-03-05
Filing date: 1981-03-04
Publication date: 1989-09-25
Also published as: JPH0611702B2; DE3176491D1; ES8201827A1; CA1187410A; DK98681A; MX6967E; EP0035204A2; EP0035204A3; EP0035204B2; ES500121A0; EP0035204B1; JPS56139422A; DK156698C

Description

DK 156698 B

Opfindelsen angâr en fremgangsmâde til pasteurisering af et materiale indeholdende et termisk folsomt, terapeutisk aktivt protein valgt blandt α-1-antitrypsin, antithrombin-III, prækallikrein, antihæmofil faktor (faktor VIII) og 5 fibronectin, der kan stabiliseres ved pasteurisering.

Mange nyttige blodfraktioner og blodproteiner fâs fra humant blodplasma ved fraktionering ifolge kendt teknik.

Disse blodfraktioner indeholder biologisk aktive proteiner, der besidder visse terapeutiske egenskaber. Eksempelvis er 10 faktor VIII eller den antihæmofile faktor nyttig mod hæmo-fili. Fibronectin er blevet fundet aktivt ved behandlingen af forbrændinger, chok, cancer etc. Antithrombin-III er en koagulationsinhibitor. α-1-antitrypsin kan anvendes til behandling af emphysema, og prækallikrein har reagensanven-15 delser og andre anvendelser.

Et problem, der opstâr ved anvendelsen af de nævnte proteiner, er disses termiske instabilitet. I mange tilfælde iagttages der væsentlige og til tider fuldstændige tab af aktivitet, hvis disse proteiner opvarmes til over fysiolo-20 giske temperaturer, dvs. til over ca. 40 til ca. 45°C. Disse materialer kræver sâledes særlig omhu under fremstillingen og opbevaringen til nedsættelse af sâdan deaktivering til et minimum.

Den termiske instabilitet af de ovennævnte proteiner 25 bevirker, at de bliver upasteuriserbare. Terapeutisk aktive proteiner isoleret fra plasma kan indeholde vira, f.eks. hepatitis-virus, der er til stede i kildematerialet for proteinfraktionen, nemlig blod fra en donor. Der bestâr sâledes en risiko for at pàdrage sig hepatitis for de per-30 soner, der modtager upasteuriserede fraktioner fra blodplas-mafraktionering, eftersom nærværelsen af den pâgældende virus ikke kan pâvises med sikkerhed ved nogen kendt metode.

I et stort antal situationer opvejes denne risiko for den skade, der pâfpres en patient, som ikke fâr indgivet det 35 terapeutiske virksomme proteinmateriale som ordineret af lægen.

DK 156698 B

2

If0lge USA-patentskrift nr. 4.137.307 er det muligt at stabilisere en vandig oplesning af haptoglobin ved til-sætning af mindst en stabilisator valgt blandt neutrale aminosyrer, monosaccharider, disaccharider og opl0selige 5 sukkeralkoholer, idet der opvarmes, indtil HB-Ag (hepatitis B-virus) er inaktiveret, hvorpâ opl0sningen befries for stabilisatoren. Stabilisatoren anvendes i en mængde pâ for-trinsvis 15-20% (efter vægt pr. rumfangsenhed).

If0lge Back et al., Biochem., 18:23, 5191-5196 (1979) 10 kan albumin varmestabiliseres med 20-50% sucrose (vægtbasis).

If0lge USA-patentskrift nr. 3.057.781 kan man varme-stabilisere protein med 1-20% (vægt pr. rumfangsenhed) in-vertsukker eller 1-4% (vægt pr. rumfangsenhed) lævulinsyre, og i japansk patentansogning nr. 53-059018 er der beskrevet 15 en varmebehandling af faktor VIII med 10-20% (vægt pr. rumfangsenhed) neutral aminosyre eller sukkeralkohol. Endelig er det angivet af Simpson et al. i J. Am. Chem. Soc., 75. nr. 21, 5139-5152 (1953) og af Donovan i J. Sci. Fd. Agric., 28. 571-578 (1977), at denatureringstemperaturen for oval-20 bumin (et æggehvideproteinstof) hæves svagt i nærværelse af sucrose i vandige opl0sninger af proteinet. Donovan pâpeger imidlertid, at denatureringstemperaturerne for ovalbumin resp. S-ovalbumin er 84,5°C resp. 92,5°C. Endvidere har hverken ovalbumin eller S-ovalbumin eller de f0mævnte en-25 zymer nogen terapeutisk aktivitet ved behandling af lidelser hos mennesker, hvorimod blodplasmaproteiner er terapeutisk aktive. Varme er ogsâ erkendt som værende effektiv mod hepa-titis-virus, idet den foretrukne behandling er opvarmning af materialet til 60eC i 10 timer. Hdjere temperaturer over 30 70 °C i kortere tidsrum eller lavere temperaturer i længere tidsrum er ogsâ blevet forsogt med heldige resultater. Det er imidlertid vigtigt at bemærke, at hojere temperaturer er uenskede pâ grund af tendensen til denaturering af prote-inerne. Endvidere undgâr man lavere temperaturer i lange 35 tidsrum, fordi forskellige proteolytiske enzymer aktiveres under disse betingelser, og disse aktiverede enzymer forâr- .

3

DK 156698B

sager proteinnedbrydning. Anvendelsen af temperaturer lavere end 60 °C til pasteurisering har heller ikke vist sig gennem-gâende at give et materiale, der ikke indeholder den infek-tibse virus.

5 Fremgangsmâden if0lge den foreliggende opfindelse, der er af den i det foregâende angivne art, er ejendommelig ved, at man (a) blander materialet med en polyol, der er en med vand blandbar polyvalent alkohol eller et carbonhydrat med 10 en molekylvægt pâ mindre end ca. 500, i en mængde pâ fra mindst 54% (vægt/rumfang) til mætning med polyolen, og at man (b) opvarmer blandingen til en temperatur pâ 60-75°C ved en pH-værdi pâ 5,5-8,0 i ca. 10 timer.

Den primære fordel ved fremgangsmâden ifdlge opfin-15 delsen er tilvejebringelsen af termisk stabile og pasteuri-serede, terapeutisk aktive proteinmaterialer, der hidtil har været ukendte og uopnâelige. Eftersom de terapeutisk aktive proteinmaterialer fremstillet ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen kan opvarmes med minimalt tab af aktivitet 20 under betingelser, der vides at inaktivere hepatitis-virus, kan disse værdifulde materialer indgives til patienter, der kan opnâ de fulde terapeutiske fordele deraf med en væsent-ligt formindsket risiko for at blive inficeret med hepatitis--virus.

25 En anden fordel ved opfindelsen er, at den kan bringes til anvendelse i forbindelse med blodplasma inden fraktio-nering, i forbindelse med partielt fraktioneret blodplasma og i forbindelse med individuelle blodplasmaproteiner som sâdanne. Den her onhandlede fremgangsmâdes mangesidede an-30 vendelsesmuligheder er sâledes âbenbare. Pasteurisering af blodplasma inden fraktionering tillader, at anden fraktione-ringsteknik end Cohn-processen anvendes i forbindelse med helplasma.

Som ovenfor nævnt omfatter produkterne fremstillet 35 ved fremgangsmâden ifolge opfindelsen pasteuriserede eller varmebehandlede materialer indeholdende et termisk fblsomt,

DK 156698 B

4 terapeutisk aktivt protein, der kan stabiliseres under pa-steurisering eller opvarmning ved temperaturer pâ fra ca.

60 til ca. 75°C, fortrinsvis fra ca. 60 til ca. 70 °C, ved blanding med termisk stabiliserende eller pasteurisations-5 stabiliserende mængder af en polyol, idet de pasteuriserede materialer indeholder eller er fri for polyol.

Ved fremgangsmâden ifolge opfindelsen suspenderes eller oploses det proteinmateriale, der skal pasteuriseres, i et vandigt medium sammen med en mængde polyol, der er 10 tilstrækkelig til at stabilisere proteinmaterialet under den pâfelgende pasteurisering. Den koncentration af polyol, der er nddvendig til stabilisering af proteinmaterialet, afhænger af typen og koncentrationen af terapeutisk aktivt protein i proteinmaterialet og af typen af polyolen selv.

15 Den termisk stabiliserende mængde eller pasteurisations-sta-biliserende mængde ligger i omrâdet fra mindst 54% (vægt/-rumfang) og op til mætning med polyolen. Det terapeutisk aktive protein anses for stabiliseret, sâfremt det bibeholder en væsentlig del, dvs. mindst 40% af dets terapeutiske ak-20 tivitet under pasteurisering. Det foretrækkes, at 70% eller mere af den terapeutiske aktivitet bibeholdes under pasteu-riseringen. Den mængde polyol, der skal tilsættes, bdr sâ-ledes være sâdan, at man bibeholder den ovennævnte mængde terapeutisk aktivitet.

25 Efter at proteinmaterialet er blevet blandt med poly olen, opvarmes blandingen til en temperatur og i et tidsrunr, der er tilstrækkeligt til pasteurisering af materialet. Blandingen pasteuriseres sâledes ved opvarmning deraf under betingelser, der vides at bevirke inaktivering af hepatitis-30 -virus. Effektiv pasteurisering til inaktivering af hepa-titis-virus eller til væsentlig nedsættelse af risikoen for hepatitis-infektion opnàs som allerede angivet ved opvarmning af det upasteuriserede proteinmateriale ved en tempeartur fra 60 til 75“C, fortrinsvis fra ca. 60 til ca. 70°C, i et 35 tidsrum pâ ca. 10 timer, sædvanligvis ved fra ca. 62 til ca. 65°C i ca. 10 timer.

5

DK 156698B

Pasteuriseringen udfores under pH-betingelser, der er tilnærmet fysiologiske betingelser. pH-værdien i blan-dingen skal sâledes som nævnt ligge i omrâdet fra 5,5 til 8,0, fortrinsvïs fra ca. 6,0 til ca. 7,5. I almindelighed er 5 fysiologiske betingelser 0nskelige, nâr dette er muligt, under pasteurisering til sikring af den mindst mulige 0de-læggelse af det terapeutisk aktive proteinmateriale.

Den mængde af en bestemt polyol, der kræves til sta-bilisering af et specifikt proteinmateriale under pasteuri-10 sering, og betingelserne, der er n0dvendige til pasteurisering af materialet, kan let bestemmes af fagfolk under anvendelse af pilotfors0g i overensstemmelse med nærværende beskrivelse.

Efter pasteurisering kan blandingen af polyol og 15 proteinmateriale behandles til fjernelse af al polyolen eller en del deraf. Der kan anvendes konventionel teknik til dette formai. Eksempelvis kan blandingen dialyseres eller diafiltreres under anvendelse af en passende semiper-meabel membran. André metoder til fjernelse af polyolen vil 20 være âbenbare for fagmanden.

Den pasteuriserede blanding kan behandles til fjernelse af vand derfra ved i teknikken kendte metoder. Eksempelvis kan blandingen fryset0rres eller ultrafiltreres og derpâ frysetorres. Endvidere kan blandingen sterilfiltreres 25 ved konventionelle metoder inden fjernelsen af vand.

De pasteuriserede proteinmaterialer fremstillet ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen kan omdannes til farmaceu-tiske præparater til terapeutisk anvendelse. Til præparering til intraven0s indgivelse oploses proteinmaterialet almin-30 deligvis i vand indeholdende fysiologiske stoffer sâsom natriumchlorid, glycin og lignende og med en pufret pH-værdi, der er forenelig med fysiologiske betingelser. Almindeligvis fastlægges der retningslinier for intraven0st indgiveligt proteinmateriale gennem officielle forskrifter.

35 Termisk sensitive, terapeutiske aktive proteiner af den her omhandlede art er proteiner, der almindeligvis ind- 6

DK 156698B

gives til patienter til præventive og/eller kurative formai, som mister nogen terapeutisk aktivitet ved opvarmning til over fra ca. 40 til ca. 45°C, og som kan stabiliseres under pasteurisering eller opvarmning ved en temperatur pâ fra 60 5 til 75 °C i nærværelse af en polyol. Eksempler pâ terapeutisk aktive proteiner, der kan pasteuriseres ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen, er de proteiner, der afledes af venest blodplasma eller placentalt plasma, og omfatter blodplasma, partielt fraktioneret blodplasma, individuelle blodplas-10 mafraktioner og individuelle blodplasmaproteiner. Protein-materialer, der kan pasteuriseres ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen, kan som det terapeutisk aktive protein omfatte antihæmofil faktor (faktor VIII), fibronectin (kolduopl0se-ligt globulin), antithrombin-III, α-1-antitrypsin og præ-15 kallikrein, samt blandinger deraf.

Det er bemærkelsesværdigt, at antihæmofil faktor B (faktor IX) og prækallikrein-aktivator ikke kan pasteuriseres i nærværelse af en polyol i overensstemmelse med den ovenfor beskrevne metode. Disse proteiner mister faktisk praktisk 20 taget al deres terapeutiske aktivitet under betingelser, under hvilke de ovennævnte proteinmaterialer bibeholder en væsentlig andel af deres aktivitet.

Udtrykket "polyol" betyder et stof med mere end én hydroxylgruppe (-0H) og omfatter polyvalente alkoholer og 25 carbonhydrater sâsom sukkerarter. Polyolen skal være blandbar med vand, fysiologisk forenelig med proteiner og hâve en lav molekylvægt, dvs. en molekylvægt mindre end ca. 5000*. Polyoler med h0jere molekylvægt, f.eks. polysaccharider, sâsom dextrin, stivelse, glycogen, cellulose, pentosaner, 30 pectin, hemicellulose og lignende, kan ikke anvendes ved den her omhandlede fremgangsmâde, fordi de er generelt ikke--blandbare med vand og er vanskelige at skille fra protein-materialet, efter at pasteuriseringen er blevet afsluttet.

Typiske eksempler pâ sukkerarter, der kan anvendes 35 ved den omhandlede f remgangsmâde, er mono-, di- og trisac-charider sâsom arabinose, glucose, galactose, fructose,

DK 156698 B

7 ribose, mannose, rhamnose, sucrose, maltose, raffinose og melezitose. Eksempler pâ polyvalente alkoholer eller redu-cerende sukkerarter, der kan anvendes ved den omhandlede fremgangsmâde er erythritol, ribitol, sylitol, sorbitol og 5 mannitol.

Ved den omhandlede fremgangsmâde kan der ogsâ anvendes blandinger af polyoler og stoffer, der danner en polyol i nærværelse af vand eller varme, f.eks. hydrater og aceto-nider.

10 Det har vist sig, at fibrinogen (faktor I)-indehol- det i det proteinmateriale, der skal pasteuriseres, er en vigtig faktor. Jo hdjere fibrinogenindholdet er, desto st0rre mængde carbonhydrat kræves. Fibrinogenindholdet i protein-materialet b0r ikke være st0rre end ca. 60%, beregnet pà 15 vægten af total protein, eller ikke stdrre end 0,6%, beregnet pâ vægten af opldsning, ved et sucroseindhold pâ f.eks. 54% efter vægt pr. rumfang. I en foretrukken udfdrelsesform b0r proteinmaterialet ikke indeholde mere end 40% fibrinogen, beregnet pâ opl0sningens vægt. Hvis mængden af fibrinogen i 20 det materiale, der skal pasteuriseres, overstiger de oven-nævnte grænser, og mængden af carbonhydrat ikke foroges, vil den termiske stabilitet, der meddeles de terapeutisk aktive proteiner af polyolen, blive væsentligt formindsket eller totalt gâ tabt.

25 Et proteinmateriale med et fibrinogenindhold st0rre end 60% kan pasteuriseres ved fremgangsmâden ifolge opfin-delsen, sâfremt (1) koncentrationen af fibrinogen i opl0s-ningen er under 0,6%, fortrinsvis under 0,4%, og (2) sâfremt et protein, der kan stabiliseres under pasteurisering, sâsom 30 albumin, f0rst sættes til proteinmaterialet til nedsættelse af dets fibrinogenindhold til mindre end 60% (det tilsatte protein b0r i almindelighed hâve den egenskab, at det let kan skilles fra det oprindelige proteinmateriale, sâfremt dette er n0dvendigt; det kan ogsâ være tilfældet, at det 35 tilsatte protein er foreneligt med den tilsigtede terapeu-tiske anvendelse af det oprindelige proteinmateriale og 8

DK 156698B

derfor ikke behover at blive fjernet derfra), eller sâfremt (3) mindst ca. 5 dele carbonhydrat anvendes pr. del fibri-nogen.

Vigtige produkter fremstillet ved fremgangsmàden 5 if0lge opfindelsen omfatter pasteuriserede vandige blandïnger af polyol og terapeutisk aktive proteinmaterialer. Ogsâ inden for rammerne af opfindelsen er pasteuriserede mate-rialer fri for polyol, men indeholdende et terapeutisk aktivt protein og de pasteuriserede proteinmaterialer, der er fri 10 for polyol og vand. Farmaceutiske præparater indeholdende terapeutiske mængder af et proteinmateriale pasteuriseret ved fremgangsmàden ifolge opfindelsen konuner ogsâ i betragt-ning. Særlige produkter fremstillet ifolge opfindelsen er pasteuriserede materialer indeholdende terapeutisk aktive 15 proteiner, der ikke er blevet pasteuriseret forud for op-findelsens fremkomst. Eksempelvis omfatter produkterne fremstillet if0lge opfindelsen pasteuriserede materialer indeholdende antihæmofil faktor (faktor VIII), fibronectin, α-1-antitrypsin og prækallikrein.

20 Som ovenfor nævnt kan de her omhandlede pasteuriserede produkter inkorporeres i farmaceutiske præparater, der kan anvendes til terapeutiske formai. Udtrykket "farmaceutisk præparat" skal imidlertid opfattes i bred forstand og omfatter her præparater indeholdende et proteinmateriale pa-25 steuriseret i overensstemmelse med fremgangsmàden ifolge opfindelsen og anvendt ikke blot til terapeutiske formai, men ogsâ til reagensformâl som kendt i teknikken? til vævs-dyrkning, hvor organismer sâsom vira til produktionen af vacciner, interferon og lignende, dyrkes pâ plasma ellër 30 plasmafraktioner, f.eks. Cohn-effluent II-III, Cohn-fraktion IV og Cohn-fraktion V.

Til enhver af de ovennævnte anvendelser er det for-delagtigt, at proteinmaterialet er frit for infektios hepa-titis sâledes, som opfindelsen gor det muligt. Det farma-35 ceutiske præparat, der onskes anvendt terapeutisk, b0r in-deholde en terapeutisk mængde af et pasteuriseret protein-

DK 156698 B

9 materiale, dvs. den mængde, der er nodvendig til præventive eller kurative helbredsformâl. Hvis det farmaceutiske præ-parat skal anvendes som reagens, b0r det indeholde reagens--mængder af pasteuriseret proteinmateriale.

5 Nâr det pasteuriserede proteinmateriale anvendes i vævskultur eller et kulturmedium, b0r det ligeledes indeholde en mængde proteinmateriale, der er tilstrækkelig til opnâelse af den onskede vækst. Det er âbenbart, at proteinmaterialer, de er pasteuriseret ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen, 10 ikke vil indeholde infektiose mængder af vira og andre or-ganismer, der inaktiveres under pasteuriseringsbetingelser.

Fremgangsmâden ifolge opfindelsen illustreres nærmere i de fdlgende udf0relseseksempler.

15 Eksemoel 1

Pasteuriserinq af antihæmofil faktor A. Fire ampuller med KOATE®-antihæmofil faktor (faktor VIII fremstillet af Cutter Laboratories, Inc., Berkeley, 20 Californien) rekonstitures i 10 ml vand til injektionsformai hver (1,9 mg protein pr. ml). Ampulindholdene slâs sammen og behandles med sucrose (0,8 g pr. ml). Blandingen opvarmes til 60"C i 10 timer til pasteurisering deraf og dialyseres derpâ natten over mod den endelige beholders AHF-puffer 25 (0,3 M glycin, 0,15 M natriumchlorid, 0,01 M natriumcitrat og 1% dextrose).

Som kontrol rekonstitueres en anden ampul med KOATE®--antihæmofil faktor med 10 ml vand til injektionsformâl og mættes med sucrose. Proven opbevares ved 5°C og opvarmes 30 ikke til 60°c i 10 timer. Den opbevarede prdve dialyseres som beskrevet i det foregâende afsnit.

Den pasteuriserede prove og kontrolprdven ovenfor undersdges og bedommes som folger:

Total protein bestemmes ved adsorbensmâlinger ved 35 280 nanometer.

Prokoagulant-aktivitet (VIII:C) bestemmes ved éttrins

DK 156698 B

10 aktiveret partiel thromboplastin-tidstest (APTT) modificeret ud fra metoderne ifolge Langdell et al., J. Lab. Clin. Med.

41. 637-647 (1953), og Proctor et al., Am. J. Clin. Path., 36, 212 (1961).

5 Ristocetin-Willebrand-faktoraktivitet (VIIIRrWF) bestemmes med gelfiltrerede blodplader if0lge metoden be-skrevet af Oison et al., Am. J. Clin. Path., 63, 210-218 (1975).

Bestemmelser af kvantitativ faktor VlII-antigen (VIII 10 R:Ag) udf0res if0lge metoden beskrevet af Laurell, Anal.Bio-Chem., 15, 45-52 (1966).

Antiserum mod faktor VlII-relaterede proteiner fâs fra Behring Diagnostics (Sommerville, New Jersey).

Proteinartsfordeling bestemmes ved celluloseacetat-15 elektroforese.

Resultaterne er sammenstillet i den felgende tabel.

Tabel I

20 VIII:C/ml A280 Udbytte af

Prove enheder enheder VIII:C (%)a

Pasteuriseret 2,0 2,5 63b 25 Kontrol 3,1 3,6 66b

Tilfort materiale 22,2 17 a enheder VIII:C/enheder A28o 30 - X 100 enheder VIII:C (tilfort mat.)/enheder A?on (tilfort mat.) 35 b Disse resultater viser, at det iagttagne tab af AHF- -aktivitet skyldes andre procedurer end pasteurise-ringstrinnet, f.eks. dialyseproceduren.

11

DK 156698B

B. AHF-koncentrat fremstilles ved en modificeret metode if0lge Hershgold et al., J. Lab. and Clin. Med., 67, 23-21 (1966), ud fra frisk frosset humant plasma.

Til en vandig oplesning af AHF-koncentrat sættes der 5 tilstraekkeligt natriumcitrat og natriumchlorid til opnâelse af koncentrationer pâ henholdsvis ο,οΐ M og 0,15 M, og glycin tilsættes til en koncentration pâ 1,6 M. Blandingen holdes ved 5°C i 1 time. Den dannede fældning opsamles ved centri-fugering og fjernes. Opl0sningen dialyseres mod 0,1 M glycin, 10 0,01 M citrat og 0,15 M natriumchlorid under anvendelse af et Amicon®-hulfiberSystem (Amicon Corp., Bedford, Massachusetts) til opnâelse af slutbeholderniveauer af de ovennævnte materialer.

AHF-oplesningen koncentreres ved hjælp af ultrafil-15 trering under anvendelse af en Amicon PM 10-membran til en værdi af A280 pâ 20· Efter dette trin blandes AHF-opl0sningen med tilstrækkelig sucrose til dannelse af en sucroseopl0sning indeholdende 0,8 g pr. ml. Blandingen opvarmes til 60°C i 10 timer til pasteurisering deraf og dialyseres derpâ mod 20 slutbeholder-AHF-puffer.

Det pasteuriserede AHF-koncentrat analyseres if01ge de metoder, der er angivet i del A af dette eksempel. Resul-taterne fremgâr af den felgende tabel II.

12 DK 156698 B

fa

·· x—% H O

Pi o\o VO O

(1) H H

-P H -P H

>Ί>

A

Ό U D ··

H

H λ VO O

H o\o VO O

> ^ H

1? fa < £ ·· ·· fa fa

H H

HH VO OV

HH - -

> > H CM

tjï H

< S

·· \ fa · H Λ H G 00 oo H <D “ > w H 00

fa H

£ S

·· \

H A

H C VO O

tt HO) ^ [j > >-· H m

H

rH

0) Ά et) Λ

* H

n o \ ·· · H Λ

H C H VO

H 0) - £> '—1 H CO »

O

CO H

CM - <; in co G -p

û) P

g 0) 3 +J en co h -h oo σν O H *· *· ·

> "- CM H

θ' fi

•H

•P g Φ οι p ®

<D H

w a

H O

p ta P &> ai a) c > -P <o θ ω θ' P «J Ό

fa fa P

DK 156698 B

13

Eksempel 2

Virkninq af fibrinogenkoncentration oâ pasteuriserinq af AHF.

5 Til fire beholderportioner (A-D) af KOATE®-AHF og én i behandling værende portion (E) sættes der tilstrækkelig sucrose til opnâelse afen koncentration deri pâ fra ca. 54 til ca. 56%. Fibrinogenindholdet i hver portion bestemmes ved RID og celluloseacetat-elektroforese-(CAE). RID-metoden 10 giver mængden af fibrinogen i proteinmaterialet. Portionerne opvarmes til 60°C i 10 timer. Resultaterne fremgâr af tabel III.

Tabel III

15

Portion Fibrinogen Fibrinogen Observationer ifolge CAE (%) ifelge RID (%) A 41 568 Ingen geldannelse 20 B 35 194 Ingen geldannelse C 37 190 Ingen geldannelse D 62 477 Geldannelse E 66 940 Geldannelse 25

Eksempel 3

Pasteuriserinq af prækallikrein 30 Prækallikrein fremstilles som folger: humant plasma dialyseres mod 0,05 M Tris, 0,2%'s Polybrene®-opl0sning (Polybrene® er en heparin-antagonist, dvs. en polymer af hexadimethrin-bromid) ved en pH-værdi pâ 8,0 til nedsættelse af dets ionstyrke. Det dialyserede plasma overfores derpâ 35 til en DEAE-Sephadex®-A 50-kolonne og fraktioneres. De aktive prækallikrein-toppe slâs sammen og bringes derpâ i kontakt

DK 156698B

14 med Concanavalin A-Sepharose®. Concanavalin A-Sepharosen vaskes, og prækallikreinet elueres med 0,5 Μ a-methy1-man-nosid. Den med prækallikrein berigede opl0sning (0,5 mg protein pr. ml) dialyseres og sterilfiltreres. 5 ml prækal-5 likreinoplosning blandes med sucrose (0,8 g pr. ml) og op-varmes til 60 eC i 10 timer. Udbyttet af prækallikrein-ak-tivitet bestemmes ved forst at aktivere det til kallikrein under anvendelse af overskud af prækallikrein-aktivator (PKA eller faktor Xlla). Det fremkomne kallikrein anvendes 10 til spaltning af standardiserede mængder af benzoylarginin-ethylester (BAEE). Graden af spaltning mâles spektrofoto-metrisk ved 253 nanometer (nm). Udbyttet af prækallikrein-aktivitet er 85%.

Som kontrol opvarmes 1 ml prækallikrein-opl0sning 15 uden sucrose til 60°C. Den totale aktivitet er tabt i l0bet af 3 timer, og der iagttages ingen visuel fældning.

Eksempel 4 20 Pasteuriserina af fibronectin

Fibronectin fremstilles ved den metode, der er be-skrevet af Engvall et al., Int. J. Cancer. 20, 2 (1977) ved gelatine-Sepharose®-af finitetsmedie-metoden. Fibronectin elueres fra affinitetsmediet ved vask med 4 M urinstof.

25 Til fjernelse af urinstof diafiltreres fibronectin- urinstof-eluatet under anvendelse af en Amicon®-hulfiber-membranpatron med en nominel rétention pâ molvægt 10.000 mod puffer A i 10% sucrose (0,1 g pr. ml).

Retentatet analyseres for fibronectinindhold ved 30 gelektroforese pâ ureduceret og reduceret natriumdodecyl-sulfat(SDS)-polyacrylamidgel. Fibronectin-bândet er ansvar-ligt for mere end 90% af det protein, der er synligt pâ gelen. Molekylvægten af fibronectinet pâ ureduceret SDS-polyacrylamidgel er 400.000 til 500.000. Den rapporterede 35 molekylvægt er 450.000 til 500.000, jfr. Yamada et al., Nature, 275r 179 (1978). Molekylvægten af fibronectinet pâ

DK 156698 B

15 reduceret SDS-polyacrylamidgel er 250.000 til 270.000. Den af Yamada et al., jfr. ovenfor, angivne værdi er 210.000 til 250.000.

Fibronectinet identificeres yderligere ved dets amino-5 syresammensaetning, der stemmer med den, der er angivet af Yamada et al., Biochemistry, 16, 5552 (1977).

Et antistof til det ovenfor fremstillede, rensede fibronectin fremstilles og krydsreageres med kommercielt tilgængeligt fibronectin (Collaboration Research, Inc., 10 Waltham, Massachusetts). Ved immunodïffusionsunders0gelser viser det som ovenfor fremstillede fibronectin en identitets-linie med det kommercielle fibronectin, nâr begge pr0ver krydsreageres mod det ovennævnte antistof.

Det som ovenfor fremstillede fibronectin viser sig 15 at være mere end 95% rent som bestemt ved hjælp af farvede SDS-polyacrylamidgeler.

Forsoq A:

Retentatet (3,6 liter) blandes med yderligere sucrose 20 sâledes, at slutkoncentrationen af sucrose er 57% (0,81 g pr. ml). Blandingen pasteuriseres ved opvarmning til 60°C i 10 timer, afk0les og diafiltreres mod puffer A (flere rum-fangsudskiftninger) under anvendelse af en Amicon®-patron som ovenfor beskrevet til fjernelse af sucrose. Opl0sningen 25 sterilfiltreres derpâ i puffer A (0,05 M Na3P04-puffer (pH

7,6) og 0,1 M (NaCl).

Aktiviteten af det pasteuriserede fibronectin (forsog A) bestemmes ved f0lgende fors0g:

Rotteleverskiveforsoq beskrevet af Molnar et al. i 30 Biochemistry, 18, 3909 (1979). Forsoget udfores i scintil-lationsampuller med 12-16 pq tilsat fibronectin, 10 enheder heparin, gelatineovertrukne latexpartikler mærket med 125I (10.000 cpm tilsat til hver ampul), Krebs-Ringer-puffer til et slutrumfang pâ 1,2 ml og en 100-150 mg skive frisk rotte-35 lever. Denne blanding inkuberes i 30 minutter ved 30-37'C under omrystning. Optagelsen af mærket gelatine-latex for0ges 16

DK 156698B

op til 10 gange af nativt fibronectin og af sucrose-pasteu-riseret fibronectin, irten ikke af fibronectin, der opvarmes til 60°C i mere end 30 minutter i fraværelse af sucrose.

Agglutinationsfors0g er beskrevet af Check et al. i 5 J.Réticuloendothélial Soc., 25, 351-362 (1979). Forsoget udfores pâ lignende mâde som leverskiveforsoget. Fibronectin (2-31 μgr til tider op til 600 μg) sættes til ampuller inde-holdende 10 enheder heparin, 300 μΐ af en 0,6%'s oplosning af umærket gelatineovertrukken latex samt Krebs-Ringer-puffer 10 til slutrumfang pâ 1,2 ml. Ampullerne rystes i 30 minutter ved 30-37eC. Agglutinering iagttages visuelt ved, at man noterer sig en overgang fra en mælkeagtig opldsning til en klar oplosning med klumpede partikler. Aktiviteter udtrykkes som den lavest tilsatte mængde af fibronectin, ved hvilken 15 der fremkommer agglutinering; og sucrose-pasteuriseret fibronectin forârsager synlig agglutinering af gelatine-latex-partikler ved 8-23 μg tilsat fibronectin pr. ampul. Fibronectin opvarmet til 60"C i mere end 30 minutter i fraværelse af sucrose mâ tilsættes i mængder storre end 570 μg pr.

20 ampul til udvisning af agglutinering, hvilket viser et be-tydeligt aktivitetstab.

Fors0g B

Eksperimentet fra forsog A gentages med folgende tilsætning; retentatet kombineres efter blanding med sucrose 25 med arginin til en slutkoncentration af arginin pâ 0,5 molær.

Forseq C

Eksperimentet fra forsog B gentages, men der sættes ikke sucrose til retentatet (ikke iftflge opfindelsen).

30 Forsoq D

Eksperimentet fra forsog C gentages med 0,5 molær lysin i stedet for arginin (ikke ifolge opfindelsen).

Forsoq E

Som kontrol opvarmes retentât (3,6 liter) til 60eC 35 i 10 timer, og der afk0les, diafiltreres og sterilfiltreres som beskrevet under forsog A.

17

DK 156698B

Forsoq F

Sont kontrol konstitueres retentât (3,6 liter) med sucrose til en koncentration pâ 57% som i fors0g A og holdes ved 50 C i 10 timer. Denne pr0ve opvarmes ikke.

5 Pr0ver fra fors0gene B-E analyseres ved de ovennævnte metoder. Resultaterne fra fors0gene A-E fremgâr af den f0l-gende tabel IV.

Tabel IV

10 Pasteuriserings- Udbytte af terapeutisk aktivitet betingelser Agglutineringsfors. Rotteleverfors.

Fors0g (60°C, 10 timer) (%) (%) A 57% sucrose 105 120

15 B 57% sucrose, 0,5M

arginin 118 60

Ca 0,5M arginin 10

Da 0,5M lysin 5

Ea kontrol <1 0 20 Fa kontrol, holdt ved 5eC 100 100 i 10 timer a Ikke if0lge opfindelsen, men angivet til sammen-25 ligningsformâl.

Det pasteuriserede fibronectins tilstand beddmmes ved hjælp af to yderligere fors0g:

Elektroforese i ikke-denaturerende puffere pâ poly-acrylamidgeler, jfr. Peacock, A.C. Science, 147. 1451 (1965).

30 Pr0ver af fibronectin opvarmes til 60 °C i puf fer A og under-soges ved den ovennævnte procedure. Efter 12 minutter ved 60°C er udtalte ændringer évidente i mdnstrene pâ de farvede geler, hvilket indicerer aggregering og oplukning af prote-inet. I modsætning hertil viser fibronectin, der er pasteu-35 riseret som ovenfor i 57% sucrose i 10 timer, kun et enkelt bând, hvilket ogsâ er tilfældet for uopvarmet fibronectin.

18

DK 156698B

Den relative mobilitet af begge pr0ver er den samme. Disse resultater viser, at fibronectin ikke aggregerer eller viser andre strukturændringer under pasteurisering i sucrose.

Immunolocriske tests ved den kvantitative mikrokom-5 plement-fikseringsmetode, jfr. Arnheim et al., J. Biol.

Chem.,242, 3951 (1967). For hver pr0ve af fibronectin be-stemes der en reaktionskurve med specifikt antiserum. Rea-gensglassene indeholder 0,5 ml fortyndet antiserum, 0,5 ml antigen (3-1000 ng fibronectin) og 0,5 ml marsvine-komple-10 ment. Antiserum til fibronectin fortyndes i forholdet 1:6000. Resultaterne af mikrokomplement-fikseringsfors0gene udtrykkes som en procent af reaktiviteten af uopvarmet, renset fibronectin.

Fibronectin pasteuriseret i 10 timer ved 60 °C i 54% 15 sucrose viser en 7-12% svagere reaktion med antiserum end uopvarmet fibronectin. Ved dette folsomme forsog indicerer en sâdan variation i krydsreaktivitet lille eller ingen ændring. Nâr f.eks. uopvarmet fibronectin sammenlignes med humant plasma (indeholdende nativt fibronectin), bemærkes 20 der en 17-30%rs ændring. I andre proteinsystemer iagttages sndringer af denne stdrrelsesorden mellem par af proteiner, der adskiller sig fra hinanden ved enkelte aminosyre-sub-stitutioner, jfr. Reichlin, J.Mol.Biol., 64, 485 (1972), eller meget svagt med hensyn til konformation, jfr. Prager 25 et al., Immunochemistry, 3, 831 (1974). Disse resultater viser, at strukturen af fibronectin er i det væsentlige uændret ved sucrose-pasteurisering.

Eksemoel 5 30

Pasteurisering af effluent II + III

Effluent II + III indeholdende antithrombin III og α-1-proteinase-inhibitor fremstilles ved alkoholfraktione-ringsmetoden ifolge Cohn (USA-patentskrift nr. 2.390.074 og 35 Journal of the American Chemical Society, jfr. ovenfor). Effluenten opbevares ved -80eC indtil anvendelsen.

DK 156698 B

19

En prove pâ 930 g af effluent II + III diafiltperes mod 5,0 kg WFI og ultrafiltreres, indtil retentatet svarer til 420 g, idet pH-værdien (6,39) for retentatet hæves til 6,87 ved tilsætning af 4 N natriumhydroxid.

5 3,4 g natriumchlorid sættes til 400 ml af den dia- filtrerede prove, som derpâ sterilfiltreres.

Til 100 ml af den sâledes fremstillede effluent II + III sættes der 80 g sucrose. Blandingen opvarmes til 60eC i 16 timer til pasteurisering deraf. Den pasteuriserede prove 10 analyseres ved CAE, der viser 4 toppe og en albuminrenhed pâ 79,6%. Som kontrol anvendes CAE i forbindelse med effluent II + III, der ikke er blevet opvarmet. Analysen giver 4 toppe og en albuminrenhed pâ 83,9%. Resultaterne indicerer, at en væsentlig del af aktiviteten af effluent II + III 15 bibeholdes under pasteuriseringsprocessen.

Den pasteuriserede prove dialyseres mod 0,85%'s natriumchlorid (1:400 efter rumfang pr. rumfang) og koncen-treres til en A2g0-værdi pâ 33,0 (den oprindelige A28o_ værdi). Proven sterilfiltreres og fryses derpâ ved -40°C.

20

Eksempel 6

Pasteurisering af antihæmofil faktor.

To ampuller fra hver af tre portioner (A, B og C) af 25 KOATE®-antihæmofil faktor rekonstitueres i 10 ml vand til injektionsformâl (WFI) hver (ca. 20 mg protein pr. ml). Ampullerne slâs sammen og behandles med sucrose i en mængde pâ 0,8 g pr. ml (54%) eller 1,2 g pr. ml (70%). Uoploseligt materiale fjernes ved centrifugering. Blandingerne opvarmes 30 derpâ ved 60°C i 10 timer til pasteurisering deraf.

Som kontrol behandles rekonstitueret antihæmofil faktor med sucrose i en mængde pâ 0,8 g pr. ml eller 1,2 g pr. ml. Kontrollerne og de pasteuriserede prover ovenfor analyseres ved fremgangsmâden ifolge eksempel 1. Resultaterne 35 er sammenstillet i tabel V.

DK 156698 B

20

Tabel V

Udbytte af VIII:C(%) Mænqde af sucrose fq/ml) 5 Portion 0,8 1,2 A 51,4 61,7 B 38,5 69,4 C 23,8 66,0

Gennemsnit 37,9 65,7 10___

Eksemoel 7

Virkninq af carbonhvdratkoncentration pâ stabilitet af anti-15 hæmofil faktor

En AHF-opl0sning fremstilles ved en modificeret metode ifolge Mozen, Rv. Hematol., 1, 135-160 (1980)).

Den nævnte AHF-oplosning fortyndes med vand til in-jektionsformâl til en A280-vær^ P® 10,0 og opdeles i lige 20 store portioner. Ta af disse aliquoter tilsættes henholdsvis 1,2 og 1,5 g sucrose pr. ml udgangsoplosning. Disse aliquoter opvarmes til 60eC i 10 timer. Kontrol-aliquoter holdes ved 5eC i dette tidsrum. Kontroller og pasteuriserede pr0ver analyseres i nærværelse af sucrose som beskrevet i eksempel 25 1. Resultaterne fremgâr af tabel VI.

Tabel VI VIII:C

Sucrose fq/ml) Udbvtte (%) 30 1,2 67% 1,5 80%

En anden AHF-opl0sning fremstillet som ovenfor be-35 skrevet fortyndes med vand til injektionsformâl til en A2go--værdi pâ 25,0 og opdeles i aliquoter. pH-vaerdien af nogle 21

DK 156698B

af disse indstilles med natriumhydroxid eller saltsyre til de værdier, der fremgâr af tabel VIA. André aliquoter gérés 0/32 M med hensyn til lysin. pH-værdien genindstilles til de i tabellen angivne værdier efter tilsætningen af lysin, 5 og der tilsættes 1,2 g sucrose pr. ml udgangsoplesning til hver. Aile aliquoter opvarmes som beskrevet ovenfor og sam-menlignes med de respektive kontroller ved den fremgangsmâde, der er beskrevet i eksempel 1.

10 Tabel VI A

VIII:C udbvtte (%) PH 0,32 M lvsin inaen lvsin 6,55 100 85 15 6,9 93 66 7,2 86 48 7,6 62 68 20 Disse data indicerer, at den optimale pH-værdi ved denne pasteurisering med eller uden lysin ligger i omrâdet fra ca. 6,5 til ca. 7,0, fortrinsvis ved ca. 6,55.

Claims

DK 156698 B PATENTKRAV. Fremgangsmâde til pasteurisering af et materiale indeholdende et termisk folsomt, terapeutisk aktivt protein valgt blandt α-l-antitrypsin, antithrombin-III, prækalli-5 krein, antihæmofil faktor (faktor VIII) og fibronectin, der kan stabiliseres ved pasteurisering, kendetegnet ved, at man (a) blander materialet med en polyol, der er en med vand blandbar polyvalent alkohol eller et carbonhydrat med 10 en molekylvægt pâ mindre end ca. 500, i en mængde pâ fra mindst 54% (vægt/rumfang) til mætning med polyolen, og at man (b) opvarmer blandingen til en temperatur pâ 60-75°C ved en pH-værdi pâ 5,5-8,0 i ca. 10 timer.