DK163029B - Fremgangsmaade til pasteurisering af vandige oploesninger af faktor viii - Google Patents

Description

i

DK 163029 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til pasteurisering af vandige opløsninger af Faktor VIII ved opvarmning til en temperatur på 55-65 °C i et tidsrum på 5-15 timer i nærvær af et saccharid eller en suk-5 keralkohol. Formålet med opfindelsen er at fjerne eller inaktivere infektiøs virus, som måtte være tilstede i præparater indeholdende koagulationsfaktoren Faktor VIII.

Det er især et formål med opfindelsen at gennemføre en varmebehandling af vandige opløsninger af Faktor VIII 10 under betingelser, hvor eventuel tilstedeværende virus med sikkerhed inaktiveres, samtidig med, at der opnås en høj genfinding af det terapeutisk aktive protein human Faktor VIII.

Den humane koagulationsfaktor Faktor VIII (herefter kaldet 15 Faktor VIII), også kaldet Antihæmofilifaktor (AHF), indgår i blodets koagulationssystem. Faktor VIII skal være tilstede for at koagulation kan finde sted. Personer med manglende eller reduceret evne til at syntetisere Faktor VIII lider af sygdommen Hæmofili A, der er en arveligt 20 betinget sygdom. Sygdommen er karakteriseret ved hyppige blødninger, især i led og muskulatur.

Det er således nødvendigt at substituere personer med Faktor VIII mangel med præparater indeholdende Faktor VIII. En sådan substitutionsterapi af Hæmofili A patienter 25 blev indledt i Europa i 1965. Denne substitutionsterapi har medført en betydelig stigning i Hæmofili A patienternes gennemsnitlige levealder. Således er den gennemsnitlige levealder for Hæmofili A patienter i Sverige steget fra ca. 16 år i 1948 til ca. 56 år i 1978. Ydermere har sub-30 stitutionsterapien medført en reduktion i antallet af invaliderende blødninger hos Hæmofili A patienter og dermed forbedret patienternes erhvervs- og livsmuligheder.

Præparater indeholdende Faktor VIII fremstilles ud fra

DK 163029B

2 humant blod eller blodplasma. Der kendes forskellige fremgangsmåder til denne fremstilling. For alle disse er den indledende fremgangsmåde ækvivalent. Blod fra donor kan tappes i et posesystem indeholdende antikoagu-5 lans. Som antikoagulans kan anvendes citrat-phosphat- dextrose (CPD), sur citrat-dextrose (ACD) eller heparin. Blodplasmaet separares fra de øvrige bestanddele ved centrifugering. Denne separation kan endvidere finde sted ved selve tapningen af donor ved såkaldt plasma-10 ferese. Blodplasmaet opbevares i frossen tilstand. Det frosne blodplasma optøes, og der foretages en såkaldt kryopræcipitering. Det derved fremkomne kryopræcipitat indeholder Faktor VIII og danner udgangspunkt for den videre fremstilling.

15 Denne kan udføres på kendt måde under anvendelse af fældningsteknikker til fjernelse af uønsket proteinmateriale. Præcipitering af dette proteinmateriale kan eksempelvis foretages ved tilsætning af ethanol (Mattock et al, Europæisk patentansøgning nr. 0 062 456, 1982), af polyethylen-20 glycol (Sarno et al, Europæisk patentansøgning nr. 0 221 556, 1987) eller glycin (Mitra et al, Europæisk patentansøgning nr. 0 126 789, 1984). Andre kendte fremgangmåder til fjernelse af uønsket proteinmateriale fra opløsninger indeholdende Faktor VIII er ved anvendelse af chromato-25 grafiske teknikker (såsom beskrevet af Chavin et al,

Europæisk patentansøgning nr. 0 104 356, 1984).

Det er endvidere kendt, at anvendelse af blodplasma fremstillet med heparin som antikoagulans, såkaldt heparini-seret blodplama, kan øge genfindingen af Faktor VIII 30 i kryopræcipitatet (Rock et al, Europæisk patentansøgning nr. 0 053 046, 1982). Heparin er en gruppe sulfaterede polysaccharider med en molekylevægt fra 5000 til 40000, typisk fra 15000 til 25000, og virker antikoagulerende i blodplasma. Selv om heparin kan øge genfindingen af 3

DK 163029 B

Faktor VIII, er anvendelsen af heparin som antikoagulans ikke udbredt, idet anvendelse af en række af blodets øvrige komponenter til terapeutiske formål forhindres.

Heparin virker antikoagulerende i blod eller blodplasma.

5 Dels virker heparin i sig selv inhiberende på thrombin, dels virker heparin katalyserende ved dannelsen af et thrombin - antithrombin III kompleks. Thrombin er et af de proteiner, der kan spalte Faktor VIII molekylet i fragmenter. I blodets koagulationssystem indgår Faktor 10 VIII som en vigtig koagulationsfaktor. Ved aktivering af Faktor VIII sker en spaltning af Faktor VIII molekylet i fragmenter. Denne aktivering forårsages af enten aktiveret Faktor X aktiveret protein C eller thrombin, af hvilke sidstnævnte er den vigtigste. Tilsætning af 13 heparin påvirker således det naturlige koagulationssystem med en stabilisering af Faktor VIII til følge.

Heparin påvirker ikke indholdet af frie calciumioner i blod eller blodplasma indeholdende Faktor VIII. Dette er i modsætning til citrat eller citratholdige antikoa-20 gulanser som citrat-phosphat-dextrose (CPD), hvor det tilstedeværende citrat virker som chelatdanner og indgår i kompleks med calcium. Da tilstedeværelsen af calcium er af betydning for stabiliteten af Faktor VIII, kan anvendelsen af heparin som antikoagulans medvirke til 23 en forøget stabilitet af Faktor VIII.

Stabiliseringen af Faktor VIII med heparin i heparini-seret blodplasma sker således dels ved inhibering af thrombin, der nedbryder Faktor VIII, og dels ved ikke at ændre tilstedeværelsen af calciumioner. 1

Faktor VIII præparater kan fremstilles ud fra heparini-seret plasma med høj genfinding af Faktor VIII aktivitet i kryopræcipitatet (Smit-Sibinga et al, Lancet, ii, 449, 1981). Det skyldes dels, at heparin stabiliserer Faktor 4

DK 163029 B

VIII i plasmaet, og dels at heparin øger udfældningen af Faktor VIII ved kryopræcipiteringen.

Det er af betydning for at opnå en høj genfinding af Faktor VIII i kryopræcipitatet, at plasmaet er heparini-5 seret under tapningen af donoren. En senere tilsætning af heparin til blodplasma fremstillet med citratholdig antikoagulans giver ikke en øget genfinding af Faktor VIII i kryopræcipitatet (Mikaelsson et al, Blood, Vol.

62, Nr. 5, 1983, p. 1006). Tilsætning af heparin under 10 fremstillingen af præparater indeholdende Faktor VIII

efter eller under genopløsning af kryopræcipitatet giver ligeledes ikke en forøget genfinding af Faktor VIII.

Effekten af heparin er således afhængig af, at heparin tilsættes i forbindelse med tapningen af donoren. Derimod 15 kan tilsætning af både heparin og calcium til citratholdig blodplasma eller fraktioner medføre en forøget genfinding af Faktor VIII.

Et væsentligt problem ved terapeutisk anvendelse af præparater eller fraktioner fremstillet ud fra humant blod 20 eller blodplasma er, at dette blod eller blodplasma kan indeholde infektiøs virus. Eksempler på sådan infektiøs virus er Hepatitis B Virus, Hepatitis non-A-non-B Virus og Human Immundeficiens Virus. Transmission af infektiøs virus kendes ikke alene fra anvendelse af præparater 25 indeholdende Faktor VIII, men generelt fra anvendelse af præparater fremstillet ud fra humant blod eller blodplasma. Eksempler på sådanne præparater er koagulations-faktor IX, koagulationsfaktor XIII, immunglobulin, anti-thrombin III. 1

Der kendes forskellige fremgangsmåder til fjernelse af infektiøs virus fra terapeutiske præparater eller opløsninger indeholdende disse fremstillet af humant blod eller blodplasma. Ved en sådan kendt fremgangsmåde gennem- 5

DK 163029 B

føres en opvarmning i 10 timer ved 60 °C af vandige opløsninger indeholdende terapeutisk protein, hvorved der opnås sikkerhed mod overførsel af infektiøs virus ved anvendelse af præparater indeholdende disse plasmapro-5 teiner. For at undgå denaturering eller anden beskadigelse af det terapeutisk aktive protein i den vandige opløsning er det imidlertid nødvendigt at tilsætte stabilisatorer under varmebehandlingen.

Således tilsættes salte af fede syrer eller aminosyrer 10 som stabilisatorer ved en varmebehandling i 10 timer ved 60°C af opløsninger indeholdende humant albumin eller proteinkoncentrat (Gellis et al, J.Clin.Invest., 27, 239, (1948)). Anvendelse af denne fremgangsmåde til behandling af humant albumin eller proteinkoncentrat har 15 medført, at der ikke er overført infektiøs virus ved anvendelse af disse præparater siden denne fremgangsmåde blev introduceret i 1948. Der er ved denne fremgangsmåde ingen eller kun ubetydelige tab af det terapeutiske plasmaprotein albumin.

20 Opløsninger indeholdende plasminogen kan stabiliseres med aminosyren lysin under en varmebehandling ved 60°C i 10 timer (Baumgarten et al, USA patentskrift nr.

3 227 626, 1966). Denne fremgangsmåde destruerer ifølge patentskriftet tilstedeværende hepatitisvirus.

25 Opløsninger indeholdende koagulationsfaktoren Faktor XIII kan i tilstedeværelse af aminosyre, monosaccharid eller sukkeralkohol opvarmes til 60°C i 10 timer (Fuku-shima, patentskrift nr. Sho 51-134878, 1976). Der er ved denne fremgangsmåde angivet et tab af aktivitet af 30 Faktor XIII på ca. 50¾.

Endvidere kan opløsninger indeholdende proteinase inhibitoren Antithrombin III stabiliseres med salte af citron- 6

DK 163029 B

syre før opvarmning i 10 timer ved 60 °C (Holleman et al, Thromb. & Haemo., 38 201, (1977)). Tabet af det terapeutiske protein Antithrombin III andrager ca. 30 % ved denne fremgangsmåde.

5 Der kendes forskellige fremgangsmåder til stabilisering af Faktor VIII ved varmebehandling i vandige opløsninger.

En fremgangsmåde til stabilisering af Faktor VIII ved varmebehandling i 10 timer ved 60°C med en polyol er beskrevet (US patentskrift nr. 4 440 697, 1984). Ved 10 denne fremgangsmåde tilsættes eksempelvis saccharose, eventuelt sammen med aminosyren glycin, i en mængde, således at opløsningen efter tilsætning indeholder 62% ιλι/ιλι saccharose eller er mættet med saccharose.

En tilsvarende fremgangsmåde til stabilisering af Faktor 15 VIII ligeledes ved varmebehandling i 10 timer ved 60°C er beskrevet med anvendelse af sukkeralkohol eller di-saccharid (Europæisk patentansøgning nr. 0 117 064, 1984).

Ved denne fremgangsmåde tilsættes eksempelvis 66% iw/vu saccharose eller sorbitol som stabilisator under varme- 20 behandlingen.

En fremgangsmåde med anvendelse af en kombination af enten en neutral aminosyre, et saccharid eller en sukker-alkohol og saltet af en carboxylsyre med fra 3 til 10 kulstofatomer til stabilisering af Faktor VIII ved varme-25 behandling ved 60°C i 10 timer er kendt (Europæisk patentansøgning nr. 0 077 870, 1983). Som yderligere stabilisator kan tilsættes humant albumin. Ved denne fremgangsmåde tilsættes eksempelvis 25% w/v glycin og 20% iw/v natriumcaprylat som stabilisator. 1

Endvidere kendes en fremgangsmåde til varmebehandling af Faktor VIII i 10 timer ved 60°C samtidig med at et 7

DK 163029 B

kontaminerende fibrinogenindhold reduceres (DE offentliggørelsesskrift nr. 29 16 711, 1980). Som stabilisator anvendes et saccharid eller sukkeralkohol i kombination med en høj koncentration af aminosyre. Den tilstedeværende 5 aminosyre bevirker, at fibrinogenet i Faktor VIII opløsningen fældes. Ved denne fremgangsmåde tilføres Faktor VIII opløsningen eksempelvis 50 % w/w saccharose og 2 M glycin under varmebehandlingen.

Endelig er det fra GB patentansøgning nr. 2.172.000 kendt 10 at foretage en varmebehandling i 10 timer ved 60°C af en opløsning, der foruden Faktor VIII indeholder spormængder af heparin eller anden sulfateret polysaccharid, som ikke er blevet fjernet fuldstændigt ved tidligere rensningstrin. Tilstedeværelse af sådanne spormængder 15 heparin viste sig ved disse tidligere forsøg uden indflydelse på udbyttet eller genfindingen af Faktor VIII efter varmebehandlingen (se s. 4, 1. 6-7 i beskrivelsen til GB 2.172.000).

Kendetegnende for de hidtil kendte fremgangsmåder til 20 stabilisering af Faktor VIII i vandige opløsninger under varmebehandling ved 60°C i 10 timer er, at genfindingen af Faktor VIII efter varmebehandlingen er lav. Således angives i eksemplerne i de ovenfor omtalte patentskrifter genfinding af Faktor VIII efter varmebehandling i 10 25 timer ved 60°C som angivet i nedenstående tabel.

Beskrivelse af fremgangsmåde Procent genfinding _F VIII aktivitet US pat. nr. 4 440 679, eksempel 1 A 63 US pat. nr. 4 440 679, eksempel IB 61 EP ans. nr. 0 077 870, tabel 1 40-70 EP ans. nr. 0 117 064, eksempel 1 58 EP ans. nr. 0 117 064, eksempel 2 56 EP ans. nr. 0 117 064, eksempel 3 58 EP ans. nr. 0 117 064, eksempel 4 57 DE off. nr. 29 16 711, eksempel 2 52 8

DK 163029 B

Den lave genfinding af Faktor VIII ved de hidtil kendte fremgangsmåder udgør en væsentlig mangel ved disse fremgangsmåder. Idet præparater eller fraktioner indeholdende Faktor VIII fremstilles ud fra humant blod eller blodplas-5 ma hidrørerende fra donorer, er dette materiale en stærkt begrænset råvare.

Således anvendes i Danmark årligt ca. 20 millioner IE Faktor VIII (1987) svarende til tapning af ca. 400.000 donorer. 1 IE (international enhed) Faktor VIII svarer 10 til Faktor VIII aktiviteten af 1 ml normalplasma. Samtidig er omkostningerne ved fremstillingen af disse præparater meget høje og genfindingen af Faktor VIII aktivitet lav, hvilket medfører, at Faktor VIII er et meget kostbart protein. Således er prisen for 1 IE Faktor VIII i et 15 højt renset Faktor VIII præparat ca. 4 kroner i Danmark.

Det årlige forbrug af Faktor VIII i Danmark svarer til ca. 80 millioner kroner. Det er således af stor betydning, at genfindingen af Faktor VIII er høj.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den opdagelse, 20 at man kan opnå en væsentligt forøget genfinding af Faktor VIII, hvis pasteuriseringen gennemføres på en renset citratholdig opløsning af Faktor VIII, der indeholder heparin som stabilisator i kombination med et saccharid eller sukkeralkohol. Det er således vigtigt for opnåel-25 se af højt udbytte, dvs. høj genfindelsesgrad, at man som udgangsmateriale anvender en renset citratholdig opløsning af Faktor VIII.

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde af den i indledningen til krav 1 angivne art og er ejen-30 dommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Denne fremgangsmåde sikrer mod transmission af infektiøs virus ved anvendelse af præparatet og giver samtidig en høj genfinding af Faktor VIII.

9

DK 163029 B

Varmebehandlingen gennemføres på i og for sig kendt måde, fortrinsvis i 10 timer ved 60 °C. Derved opnås en overraskende forbedret genfinding af Faktor VIII.

Ved anvendelsen af heparin som stabilisator i kombination 5 med et saccharid eller sukkeralkohol ved en varmebehandling i 10 timer ved 60 °C af en renset vandig opløsning indeholdende citrat og Faktor VIII er det alene effekten af inhibering af thrombin, der har betydning. Denne effekt kan forstærkes ved binding af heparin til von Willebrand 10 Faktor. På grund af det tilstedeværende citrat sker der ingen øgning i calciumniveauet med deraf følgende stabilisering af Faktor VIII.

Effekten af tilsætning af heparin ved en varmebehandling kan således tilskrives en påvirkning af det naturlige 15 koagulationssystem med en stabilisering af Faktor VIII til følge.

Dette er i modsætning til de hidtil kendte tilsætninger ved en varmebehandling i 10 timer ved 60°C af en vandig opløsning indeholdende Faktor VIII. Saccharider, sukker-20 alkohol, aminosyrer eller salte af organiske syrer har en stabiliserende effekt derved, at disse stabilisatorer påvirker hydratiseringsgraden eller ladningsfordelingen af proteinet.

Fremgangsmåden ved varmebehandling i 10 timer ved 60°C 25 af en vandig opløsning indeholdende Faktor VIII med heparin som stabilisator i kombination med et saccharid eller sukkeralkohol kan udføres på enhver fraktion eller præparater indeholdende Faktor VIII.

Til citratopløsninger indeholdende Faktor VIII tilsættes 30 et saccharid eller sukkeralkohol. Tilsætning af saccharose er en foretrukken udførelsesform. Stabiliseringen

DK 163029 B

ID

af Faktor VIII stiger med øget tilsætning af saccharid eller sukkeralkohol, således kan der tilsættes fra 20 ιλι/ιλι % til mætning. Den foretrukne ud førelses form er tilsætning af saccharose svarende til 60 w/w %. Mætning 5 af en opløsning indeholdende Faktor VIII med saccharid eller sukkeralkohol medfører dels håndteringsmæssige vanskeligheder som følge af den høje viskositet, dels en stabilisering af den infektiøse virus.

Heparin kan tilsættes før eller efter tilsætning af sac-10 charid eller sukkeralkohol svarende til fra 1,0 til 4,0 IE (internationale enheder) heparin pr. g opløsning efter tilsætning af saccharid eller sukkeralkohol. Tilsætning svarende til fra 1,5 til 2,5 IE heparin pr. g opløsning er en foretrukken fremgangsmåde.

15 Tilsætning af for høje mængder heparin bevirker en præ- cipitering af Faktor VIII. Denne præcipitering kan konstateres ved måling af opløsningens uklarhed. Det har således vist sig, at ved tilsætning af 4,0 IE heparin pr. g opløsning kan en stigning i opløsningens uklarhed detek-20 teres. Det gælder for præcipitering af proteiner, at kemiske og fysiske forhold i opløsningen som eksempelvis proteinkoncentration, proteinsammensætning, ledningsevne, pH eller saltkoncentration har indflydelse på præcipite-ringsgraden. Ændringer i eksempelvis proteinkoncentra-25 tionen eller proteinsammensætningen vil således kunne bevirke ændringer i hvilken heparinkoncentration, der giver den højeste genfinding af Faktor VIII uden at proteinopløsningen begynder at præcipitere.

For at opnå et maksimalt udbytte må pH værdien indstilles 30 i opløsningen til et fysiologisk niveau. Således bør pH værdien være mellem 6,0 og 7,5 med fra 6,2 til 7,0 som foretrukken fremgangsmåde.

11

DK 163029 B

Tilsætning af CaCl^ i begrænsede mængder kan bevirke en stabilisering af Faktor VIII under varmebehandlingen, l/ed den foreliggende fremgangsmåde anvendes fra 0 til 150 mmol CaC^ pr. g færdig opløsning.

5 Fjernelse af saccharid eller sukkeralkohol fra opløsningen indeholdende Faktor VIII efter varmebehandlingen kan foretages ved dialyse eller præcipitering af Faktor VIII fra opløsningen.

Bestemmelse af Faktor VIII aktivitet kan foretages enten 10 ved 2-trins assay eller 1-trins assay. Det er kendt, at 1-trins og 2-trins assay kan resultere i forskellige bestemmelser af Faktor VIII aktiviteten i en given prøve.

Det er endvidere kendt, at gentagne målinger med samme assay på samme prøve kan give anledning til store varia-15 tioner i bestemmelsen af Faktor VIII aktivitet. Det er endvidere kendt, at resultatet af bestemmelsen af Faktor VIII aktivitet kan afhænge af andre tilstedeværende proteiner eller andre komponenter i den givne prøve.

Bestemmelse af Faktor VIII aktivitet ved 2-trins assay 20 udføres ved hjælp af chromogent substrat metode (KABI

Coatest Factor VIII), idet den oprindelige metode i reagensglas ved 37°C er modificeret til udførelse i mikro-titerplade med reduceret reagensanvendelse ved stuetemperatur. Der anvendes 50 mikroliter prøve eller standard, 25 som efter blanding med 50 mikroliter phospholipid, Faktor IXa og Faktor X tempereres i 10 minutter. Efter tilsætning af 25 mikroliter 25 mM CaCl^ inkuberes i 15 minutter, hvorefter der tilsættes 50 mikroliter substrat.

Efter yderligere 20 minutter inkubation stoppes reaktionen 30 med tilsætning af 50 mikroliter 1 M citronsyre. Farve- udviklingen aflæses ved 405 nm med reference ved 492 nm.

12

DK 163029 B

Bestemmelse af Faktor VIII aktivitet ved 1-trins assay udføres ved hjælp af APTT metode (Activated Partial Thromboplastin Time). Der afpipetteres 100 mikroliter prøve eller standard i kuvetterne, hvorefter der tilsættes 5 100 mikroliter mangelplasma (Factor VIII deficient plasma,

General Diagnostic), Der tilsættes 100 mikroliter APTT-reagens (General Diagnostic), og opløsningen termostateres ved 37 °C i 5 minutter. Efter tilsætning af 100 mikroliter 0,03 M CaC^ måles tiden indtil opløsningen er 10 koaguleret.

Til kvantitative bestemmelser udarbejdes kalibrerings-kurver baseret på fortyndingsrækker af en intern standard, der er kalibreret over for WHO standard (3. Int. Standard of F VIII, Human Plasma, 3,9 IE/ml). 2-trins assay, som 15 her angivet, har en lavere detektionsgrænse (ca. 10 gange) end 1-trins assay. I- forbindelse med tilsætning af heparin er det en fordel at anvende 2-trins assay, idet en eventuel heparin effekt på assayet lettere kan bortfor-tyndes. Bestemmelse af uklarhed foretages ved måling 20 af extintionen ved 400 nm.

Forsøg har således vist, at tilsætning af heparin svarende til en koncentration på fra 1,0 til 4,0 IE heparin pr. g opløsning indeholdende et renset Faktor VIII stabiliseret med et saccharid eller sukkeralkohol under varme-25 behandlingen giver en forøgelse af genfindingen af Faktor VIII.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres ved efterfølgende eksempler.

EKSEMPEL 1 30 14 ml citratopløsning 80,53 g natriumcitrat/liter) inde holdende 1680 IE Faktor VIII, som er vidtgående renset

DK 163029B

13 ved kromatografi, fordeles i 7 glas, således at hver glas indeholder 2 ml opløsning. Til hver glas tilsættes 3 g saccharose, der bringes i opløsning. Der tilsættes yderligere til hvert glas heparinopløsnang (500 IE/ml), 5 således at det enkelte glas indeholder en heparmmængde som angivet i tabellen herunder, og ca. 48 IE Faktor VIII pr. færdig opløsning. Glassene forsegles og varmebehandles i 10 timer ved 60 °C. Faktor VIII bestemmes ved 1-trins assay og opløsningens uklarhed bestemmes 10 som extintionen ved 400 nm.

IE heparin talsat Procent genfinding ^400 pr. g opløsning Faktor VIII akivitet 0,0 70 0,35 0,3 70 0,34 0,5 71 0,35 1.0 87 0,35 2.0 91 0,37 4.0 93 0,40 8.0 85 0,63 EKSEMPEL 2 20 ml citratopløsning (0,53 g natriumcitrat/liter) indeholdende 6000 IE Faktor VIII, som er vidtgående renset ved kromatografi, fordeles i 10 glas, således at hver 15 glas indeholder 2 ml opløsning. Til hver glas tilsættes 3 g saccharose, der bringes i opløsning. Der tilsættes yderligere til hvert glas heparinopløsning (500 IE/ml), således at det enkelte glas indeholder en heparinmængde som angivet i tabellen herunder, og ca. 120 IE Faktor 20 VIII pr. g færdig opløsning. Glassene forsegles og varmebehandles i 10 timer ved 60°C. Faktor VIII bestemmes ved 2-trins assay.

DK 163029B

14 IE heparin tilsat Procent genfinding af pr. g opløsning Faktor VIII aktivitet 0,0 66 1,0 86 1.5 81 2,0 91 2.5 87 EKSEMPEL 3 8 ml citratopløsning (0,53 g natriumcitrat/liter) indeholdende ca. 5000 IE højrenset Faktor VIII fordeles i 4 glas, således at hver glas indeholder 2 ml opløsning.

5 Til hver glas tilsættes 3 g saccharose, der bringes i opløsning. Til 2 glas tilsættes yderligere heparin-opløsning (500 IE/ml), således at glasset indeholder en heparinmængde på 2,0 IE pr. g opløsning. Glassene forsegles og varmebehandles i 10 timer ved 60 °C. For-10 søget gentages på forskelligt prøvemateriale, ialt 5 gange. Indholdet af Faktor VIII varierede i disse forsøg fra 220 til 260 IE pr. g færdig opløsning. Faktor VIII bestemmes ved 2-trins assay.

15

DK 163029 B

Forsøg IE heparin pr. Procent genfinding af Procent g opløsning Faktor Mill aktivitet forbedring 1 0 40 0 40 5 snit 42 2 71 2 81 snit 76 81 2 0 51 10 0 55 snit 53 2 86 2 87 snit 87 63 15 3 0 55 0 60 snit 58 2 85 2 89 20 snit 87 51 4 0 71 0 71 snit 71 2 83 25 2 84 snit 84 18 5 0 59 0 66 snit 63 30 2 84 2 85 snit 85 35

Gennemsnitlig forbedring for alle forsøg er 50¾.

16

DK 163029 B

EKSEMPEL 4 2 ml citratopløsning (0,53 g natriumcitrat/liter) indeholdende 600 IE højrenset Faktor VIII, tilsættes 3 g saccharose, der bringes i opløsning. Der tilsættes yder- 5 ligere heparinopløsning (500 IE/ml) og calciumchlorid -2 (10 M), således at glasset indeholder en heparinmængde på 2,0 IE, 100 mmol calciumchlorid og 120 IE Faktor VIII pr. g opløsning. Glasset forsegles og varmebehandles i 10 timer ved 60°C. Faktor VIII bestemmes ved 2-trins 10 assay. Genfindingen af Faktor VIII var 88¾.

Claims (6)

1. Fremgangsmåde til pasteurisering af vandige opløsninger af Faktor VIII ved opvarmning til en temperatur på 55 - 65°C i et tidsrum på 5 - 15 timer i nærvær af 5 et saccharid eller en sukkeralkohol, kendetegnet ved, at en renset citratholdig opløsning af Faktor VIII iblandes 1 - 4 IE heparin pr. g færdig opløsning og derefter underkastes varmebehandlingen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved, at den tilsatte heparin-mængde udgør 1,5 - 2,5 IE pr. g færdig opløsning.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at pH værdien under varmebehandlingen holdes på 6,2 - 7,0.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-3, ken detegnet ved, at indholdet af Faktor VIII holdes mellem 10 og 300 IE pr. g færdig opløsning.

5. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved at mængden af saccharid eller sukker- 20 alkohol udgør 50 - 65% w/w, beregnet på den færdige opløsning.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at saccharidet er saccharose. 1 2 3 4 Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, k e n - 2 25 detegnet ved at varmebehandlingen udføres i nær 3 vær af CaC^ i en mængde på højst 150 mmol pr. g færdig 4 opløsning.