DK163029B

DK163029B - Process for pasteurizing aqueous solutions of factor VIII

Info

Publication number: DK163029B
Application number: DK169190A
Authority: DK
Inventors: Jesper Kihl; Allan Nyrup; Ole Nordfang
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 1988-01-15
Filing date: 1990-07-13
Publication date: 1992-01-13
Also published as: DK169190D0; DK163029C; DK169190A

Description

iin

DK 163029 BDK 163029 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til pasteurisering af vandige opløsninger af Faktor VIII ved opvarmning til en temperatur på 55-65 °C i et tidsrum på 5-15 timer i nærvær af et saccharid eller en suk-5 keralkohol. Formålet med opfindelsen er at fjerne eller inaktivere infektiøs virus, som måtte være tilstede i præparater indeholdende koagulationsfaktoren Faktor VIII.The present invention relates to a method for pasteurizing aqueous solutions of Factor VIII by heating to a temperature of 55-65 ° C for a period of 5-15 hours in the presence of a saccharide or a sugar alcohol. The object of the invention is to remove or inactivate infectious virus that may be present in preparations containing the coagulation factor Factor VIII.

Det er især et formål med opfindelsen at gennemføre en varmebehandling af vandige opløsninger af Faktor VIII 10 under betingelser, hvor eventuel tilstedeværende virus med sikkerhed inaktiveres, samtidig med, at der opnås en høj genfinding af det terapeutisk aktive protein human Faktor VIII.In particular, it is an object of the invention to conduct a heat treatment of aqueous solutions of Factor VIII 10 under conditions where any virus present is safely inactivated, while obtaining a high recovery of the therapeutically active protein human Factor VIII.

Den humane koagulationsfaktor Faktor VIII (herefter kaldet 15 Faktor VIII), også kaldet Antihæmofilifaktor (AHF), indgår i blodets koagulationssystem. Faktor VIII skal være tilstede for at koagulation kan finde sted. Personer med manglende eller reduceret evne til at syntetisere Faktor VIII lider af sygdommen Hæmofili A, der er en arveligt 20 betinget sygdom. Sygdommen er karakteriseret ved hyppige blødninger, især i led og muskulatur.The human coagulation factor Factor VIII (hereinafter referred to as Factor VIII), also called Anti-Haemophilia Factor (AHF), is part of the blood coagulation system. Factor VIII must be present for coagulation to take place. People with a lack of or reduced ability to synthesize Factor VIII suffer from the disease Haemophilia A, which is a hereditary condition. The disease is characterized by frequent bleeding, especially in the joints and muscles.

Det er således nødvendigt at substituere personer med Faktor VIII mangel med præparater indeholdende Faktor VIII. En sådan substitutionsterapi af Hæmofili A patienter 25 blev indledt i Europa i 1965. Denne substitutionsterapi har medført en betydelig stigning i Hæmofili A patienternes gennemsnitlige levealder. Således er den gennemsnitlige levealder for Hæmofili A patienter i Sverige steget fra ca. 16 år i 1948 til ca. 56 år i 1978. Ydermere har sub-30 stitutionsterapien medført en reduktion i antallet af invaliderende blødninger hos Hæmofili A patienter og dermed forbedret patienternes erhvervs- og livsmuligheder.Thus, it is necessary to substitute persons with Factor VIII deficiency with preparations containing Factor VIII. Such substitution therapy of Haemophilia A patients 25 was initiated in Europe in 1965. This substitution therapy has led to a significant increase in the average life expectancy of Haemophilia A patients. Thus, the average life expectancy of Haemophilia A patients in Sweden has risen from approx. 16 years in 1948 to approx. 56 years in 1978. In addition, substitution therapy has resulted in a reduction in the number of disabling bleeding in Haemophilia A patients, thus improving patients' occupational and life opportunities.

Præparater indeholdende Faktor VIII fremstilles ud fraFactor VIII preparations are prepared from

DK 163029BDK 163029B

2 humant blod eller blodplasma. Der kendes forskellige fremgangsmåder til denne fremstilling. For alle disse er den indledende fremgangsmåde ækvivalent. Blod fra donor kan tappes i et posesystem indeholdende antikoagu-5 lans. Som antikoagulans kan anvendes citrat-phosphat- dextrose (CPD), sur citrat-dextrose (ACD) eller heparin. Blodplasmaet separares fra de øvrige bestanddele ved centrifugering. Denne separation kan endvidere finde sted ved selve tapningen af donor ved såkaldt plasma-10 ferese. Blodplasmaet opbevares i frossen tilstand. Det frosne blodplasma optøes, og der foretages en såkaldt kryopræcipitering. Det derved fremkomne kryopræcipitat indeholder Faktor VIII og danner udgangspunkt for den videre fremstilling.2 human blood or blood plasma. Various methods are known for this preparation. For all of these, the initial process is equivalent. Donor blood can be drawn into a bag system containing anticoagulant. As anticoagulant can be used citrate-phosphate dextrose (CPD), acidic citrate-dextrose (ACD) or heparin. The blood plasma is separated from the other components by centrifugation. This separation can also take place by the donation itself by so-called plasma-feresis. The blood plasma is stored frozen. The frozen blood plasma is thawed and a so-called cryoprecipitation is performed. The resulting cryoprecipitate contains Factor VIII and forms the basis for the further preparation.

15 Denne kan udføres på kendt måde under anvendelse af fældningsteknikker til fjernelse af uønsket proteinmateriale. Præcipitering af dette proteinmateriale kan eksempelvis foretages ved tilsætning af ethanol (Mattock et al, Europæisk patentansøgning nr. 0 062 456, 1982), af polyethylen-20 glycol (Sarno et al, Europæisk patentansøgning nr. 0 221 556, 1987) eller glycin (Mitra et al, Europæisk patentansøgning nr. 0 126 789, 1984). Andre kendte fremgangmåder til fjernelse af uønsket proteinmateriale fra opløsninger indeholdende Faktor VIII er ved anvendelse af chromato-25 grafiske teknikker (såsom beskrevet af Chavin et al,This can be carried out in known manner using precipitation techniques to remove unwanted protein material. Precipitation of this protein material may be carried out, for example, by the addition of ethanol (Mattock et al, European Patent Application No. 0 062 456, 1982), of polyethylene glycol (Sarno et al, European Patent Application No. 0 221 556, 1987) or glycine ( Mitra et al, European Patent Application No. 0 126 789, 1984). Other known methods for removing unwanted protein material from solutions containing Factor VIII are using chromatographic techniques (such as described by Chavin et al.,

Europæisk patentansøgning nr. 0 104 356, 1984).European Patent Application No. 0 104 356, 1984).

Det er endvidere kendt, at anvendelse af blodplasma fremstillet med heparin som antikoagulans, såkaldt heparini-seret blodplama, kan øge genfindingen af Faktor VIII 30 i kryopræcipitatet (Rock et al, Europæisk patentansøgning nr. 0 053 046, 1982). Heparin er en gruppe sulfaterede polysaccharider med en molekylevægt fra 5000 til 40000, typisk fra 15000 til 25000, og virker antikoagulerende i blodplasma. Selv om heparin kan øge genfindingen af 3It is also known that the use of blood plasma made with heparin as an anticoagulant, so-called heparinized blood platelet, can enhance the recovery of Factor VIII 30 in the cryoprecipitate (Rock et al., European Patent Application No. 0 053 046, 1982). Heparin is a group of sulfated polysaccharides having a molecular weight of 5000 to 40000, typically from 15000 to 25000, and acts as anticoagulant in blood plasma. Although heparin may increase the recovery of 3

DK 163029 BDK 163029 B

Faktor VIII, er anvendelsen af heparin som antikoagulans ikke udbredt, idet anvendelse af en række af blodets øvrige komponenter til terapeutiske formål forhindres.Factor VIII, the use of heparin as an anticoagulant is not widespread, preventing the use of a number of the blood's other components for therapeutic purposes.

Heparin virker antikoagulerende i blod eller blodplasma.Heparin acts anticoagulant in blood or blood plasma.

5 Dels virker heparin i sig selv inhiberende på thrombin, dels virker heparin katalyserende ved dannelsen af et thrombin - antithrombin III kompleks. Thrombin er et af de proteiner, der kan spalte Faktor VIII molekylet i fragmenter. I blodets koagulationssystem indgår Faktor 10 VIII som en vigtig koagulationsfaktor. Ved aktivering af Faktor VIII sker en spaltning af Faktor VIII molekylet i fragmenter. Denne aktivering forårsages af enten aktiveret Faktor X aktiveret protein C eller thrombin, af hvilke sidstnævnte er den vigtigste. Tilsætning af 13 heparin påvirker således det naturlige koagulationssystem med en stabilisering af Faktor VIII til følge.5 On the one hand, heparin itself inhibits thrombin, and on the other, heparin acts catalyzing in the formation of a thrombin - antithrombin III complex. Thrombin is one of the proteins that can cleave the Factor VIII molecule into fragments. In the blood's coagulation system, Factor 10 VIII is included as an important coagulation factor. Upon activation of Factor VIII, the Factor VIII molecule is cleaved into fragments. This activation is caused by either activated Factor X activated protein C or thrombin, of which the latter is the most important. Addition of 13 heparin thus affects the natural coagulation system resulting in stabilization of Factor VIII.

Heparin påvirker ikke indholdet af frie calciumioner i blod eller blodplasma indeholdende Faktor VIII. Dette er i modsætning til citrat eller citratholdige antikoa-20 gulanser som citrat-phosphat-dextrose (CPD), hvor det tilstedeværende citrat virker som chelatdanner og indgår i kompleks med calcium. Da tilstedeværelsen af calcium er af betydning for stabiliteten af Faktor VIII, kan anvendelsen af heparin som antikoagulans medvirke til 23 en forøget stabilitet af Faktor VIII.Heparin does not affect the content of free calcium ions in blood or blood plasma containing Factor VIII. This is in contrast to citrate or citrate-containing anticoagulants such as citrate-phosphate dextrose (CPD), where the citrate present acts as a chelate and is complexed with calcium. Since the presence of calcium is important for the stability of Factor VIII, the use of heparin as an anticoagulant may contribute to 23 increased stability of Factor VIII.

Stabiliseringen af Faktor VIII med heparin i heparini-seret blodplasma sker således dels ved inhibering af thrombin, der nedbryder Faktor VIII, og dels ved ikke at ændre tilstedeværelsen af calciumioner. 1Thus, the stabilization of Factor VIII with heparin in heparinized blood plasma occurs partly by inhibiting thrombin which degrades Factor VIII and partly by not altering the presence of calcium ions. 1

Faktor VIII præparater kan fremstilles ud fra heparini-seret plasma med høj genfinding af Faktor VIII aktivitet i kryopræcipitatet (Smit-Sibinga et al, Lancet, ii, 449, 1981). Det skyldes dels, at heparin stabiliserer Faktor 4Factor VIII preparations can be prepared from heparinized plasma with high recovery of Factor VIII activity in the cryoprecipitate (Smit-Sibinga et al., Lancet, ii, 449, 1981). This is partly because heparin stabilizes Factor 4

DK 163029 BDK 163029 B

VIII i plasmaet, og dels at heparin øger udfældningen af Faktor VIII ved kryopræcipiteringen.VIII in the plasma, and partly that heparin increases the precipitation of Factor VIII by cryoprecipitation.

Det er af betydning for at opnå en høj genfinding af Faktor VIII i kryopræcipitatet, at plasmaet er heparini-5 seret under tapningen af donoren. En senere tilsætning af heparin til blodplasma fremstillet med citratholdig antikoagulans giver ikke en øget genfinding af Faktor VIII i kryopræcipitatet (Mikaelsson et al, Blood, Vol.It is important to obtain a high recovery of Factor VIII in the cryoprecipitate that the plasma is heparinized during the donation of the donor. A later addition of heparin to blood plasma prepared with citrate-containing anticoagulants does not result in increased recovery of Factor VIII in the cryoprecipitate (Mikaelsson et al, Blood, Vol.

62, Nr. 5, 1983, p. 1006). Tilsætning af heparin under 10 fremstillingen af præparater indeholdende Faktor VIII62, no. 5, 1983, p. 1006). Addition of heparin during the preparation of Factor VIII preparations

efter eller under genopløsning af kryopræcipitatet giver ligeledes ikke en forøget genfinding af Faktor VIII.likewise, after or during redissolution of the cryoprecipitate does not give an increased recovery of Factor VIII.

Effekten af heparin er således afhængig af, at heparin tilsættes i forbindelse med tapningen af donoren. Derimod 15 kan tilsætning af både heparin og calcium til citratholdig blodplasma eller fraktioner medføre en forøget genfinding af Faktor VIII.Thus, the effect of heparin is dependent on the addition of heparin in connection with the donation of the donor. In contrast, addition of both heparin and calcium to citrate-containing blood plasma or fractions may result in increased recovery of Factor VIII.

Et væsentligt problem ved terapeutisk anvendelse af præparater eller fraktioner fremstillet ud fra humant blod 20 eller blodplasma er, at dette blod eller blodplasma kan indeholde infektiøs virus. Eksempler på sådan infektiøs virus er Hepatitis B Virus, Hepatitis non-A-non-B Virus og Human Immundeficiens Virus. Transmission af infektiøs virus kendes ikke alene fra anvendelse af præparater 25 indeholdende Faktor VIII, men generelt fra anvendelse af præparater fremstillet ud fra humant blod eller blodplasma. Eksempler på sådanne præparater er koagulations-faktor IX, koagulationsfaktor XIII, immunglobulin, anti-thrombin III. 1A major problem with therapeutic use of preparations or fractions prepared from human blood or blood plasma is that this blood or blood plasma may contain infectious virus. Examples of such infectious virus are Hepatitis B Virus, Hepatitis non-A-non-B Virus and Human Immunodeficiency Virus. Transmission of infectious virus is known not only from the use of preparations containing Factor VIII, but generally from the use of preparations made from human blood or blood plasma. Examples of such preparations are coagulation factor IX, coagulation factor XIII, immunoglobulin, anti-thrombin III. 1

Der kendes forskellige fremgangsmåder til fjernelse af infektiøs virus fra terapeutiske præparater eller opløsninger indeholdende disse fremstillet af humant blod eller blodplasma. Ved en sådan kendt fremgangsmåde gennem- 5Various methods are known for removing infectious virus from therapeutic preparations or solutions containing them made from human blood or blood plasma. By such a known method, 5

DK 163029 BDK 163029 B

føres en opvarmning i 10 timer ved 60 °C af vandige opløsninger indeholdende terapeutisk protein, hvorved der opnås sikkerhed mod overførsel af infektiøs virus ved anvendelse af præparater indeholdende disse plasmapro-5 teiner. For at undgå denaturering eller anden beskadigelse af det terapeutisk aktive protein i den vandige opløsning er det imidlertid nødvendigt at tilsætte stabilisatorer under varmebehandlingen.For example, heating for 10 hours at 60 ° C of aqueous solutions containing therapeutic protein is achieved, thereby providing safety against transmission of infectious virus using preparations containing these plasma proteins. However, to avoid denaturation or other damage to the therapeutically active protein in the aqueous solution, it is necessary to add stabilizers during the heat treatment.

Således tilsættes salte af fede syrer eller aminosyrer 10 som stabilisatorer ved en varmebehandling i 10 timer ved 60°C af opløsninger indeholdende humant albumin eller proteinkoncentrat (Gellis et al, J.Clin.Invest., 27, 239, (1948)). Anvendelse af denne fremgangsmåde til behandling af humant albumin eller proteinkoncentrat har 15 medført, at der ikke er overført infektiøs virus ved anvendelse af disse præparater siden denne fremgangsmåde blev introduceret i 1948. Der er ved denne fremgangsmåde ingen eller kun ubetydelige tab af det terapeutiske plasmaprotein albumin.Thus, salts of fatty acids or amino acids 10 are added as stabilizers by a heat treatment for 10 hours at 60 ° C of solutions containing human albumin or protein concentrate (Gellis et al., J. Clin. Invest., 27, 239, (1948)). Use of this method for the treatment of human albumin or protein concentrate has resulted in the transmission of infectious virus using these preparations since this method was introduced in 1948. There is no or only insignificant loss of the therapeutic plasma protein albumin in this method. .

20 Opløsninger indeholdende plasminogen kan stabiliseres med aminosyren lysin under en varmebehandling ved 60°C i 10 timer (Baumgarten et al, USA patentskrift nr.Solutions containing plasminogen can be stabilized with the amino acid lysine during a heat treatment at 60 ° C for 10 hours (Baumgarten et al., U.S. Pat.

3 227 626, 1966). Denne fremgangsmåde destruerer ifølge patentskriftet tilstedeværende hepatitisvirus.3 227 626, 1966). According to the patent, this method destroys the hepatitis virus present.

25 Opløsninger indeholdende koagulationsfaktoren Faktor XIII kan i tilstedeværelse af aminosyre, monosaccharid eller sukkeralkohol opvarmes til 60°C i 10 timer (Fuku-shima, patentskrift nr. Sho 51-134878, 1976). Der er ved denne fremgangsmåde angivet et tab af aktivitet af 30 Faktor XIII på ca. 50¾.Solutions containing the coagulation factor Factor XIII can be heated to 60 ° C for 10 hours in the presence of amino acid, monosaccharide or sugar alcohol (Fuku-shima, Patent No. Sho 51-134878, 1976). This method indicates a loss of activity of 30 Factor XIII of approx. 50¾.

Endvidere kan opløsninger indeholdende proteinase inhibitoren Antithrombin III stabiliseres med salte af citron- 6Furthermore, solutions containing the proteinase inhibitor Antithrombin III can be stabilized with salts of lemon.

DK 163029 BDK 163029 B

syre før opvarmning i 10 timer ved 60 °C (Holleman et al, Thromb. & Haemo., 38 201, (1977)). Tabet af det terapeutiske protein Antithrombin III andrager ca. 30 % ved denne fremgangsmåde.acid before heating for 10 hours at 60 ° C (Holleman et al., Thromb. & Haemo., 38 201, (1977)). The loss of the therapeutic protein Antithrombin III amounts to approx. 30% by this method.

5 Der kendes forskellige fremgangsmåder til stabilisering af Faktor VIII ved varmebehandling i vandige opløsninger.Various methods for stabilizing Factor VIII by heat treatment in aqueous solutions are known.

En fremgangsmåde til stabilisering af Faktor VIII ved varmebehandling i 10 timer ved 60°C med en polyol er beskrevet (US patentskrift nr. 4 440 697, 1984). Ved 10 denne fremgangsmåde tilsættes eksempelvis saccharose, eventuelt sammen med aminosyren glycin, i en mængde, således at opløsningen efter tilsætning indeholder 62% ιλι/ιλι saccharose eller er mættet med saccharose.A method for stabilizing Factor VIII by heat treatment for 10 hours at 60 ° C with a polyol is described (U.S. Patent No. 4,440,697, 1984). In this process, for example, sucrose, optionally together with the amino acid glycine, is added in an amount so that the solution after addition contains 62% ιλι / ιλι sucrose or is saturated with sucrose.

En tilsvarende fremgangsmåde til stabilisering af Faktor 15 VIII ligeledes ved varmebehandling i 10 timer ved 60°C er beskrevet med anvendelse af sukkeralkohol eller di-saccharid (Europæisk patentansøgning nr. 0 117 064, 1984).A similar method for stabilizing Factor 15 VIII also by heat treatment for 10 hours at 60 ° C is described using sugar alcohol or di-saccharide (European Patent Application No. 0 117 064, 1984).

Ved denne fremgangsmåde tilsættes eksempelvis 66% iw/vu saccharose eller sorbitol som stabilisator under varme- 20 behandlingen.In this process, for example, 66% IW / VU sucrose or sorbitol is added as a stabilizer during the heat treatment.

En fremgangsmåde med anvendelse af en kombination af enten en neutral aminosyre, et saccharid eller en sukker-alkohol og saltet af en carboxylsyre med fra 3 til 10 kulstofatomer til stabilisering af Faktor VIII ved varme-25 behandling ved 60°C i 10 timer er kendt (Europæisk patentansøgning nr. 0 077 870, 1983). Som yderligere stabilisator kan tilsættes humant albumin. Ved denne fremgangsmåde tilsættes eksempelvis 25% w/v glycin og 20% iw/v natriumcaprylat som stabilisator. 1A method using a combination of either a neutral amino acid, a saccharide or a sugar alcohol and the salt of a carboxylic acid having from 3 to 10 carbon atoms to stabilize Factor VIII by heat treatment at 60 ° C for 10 hours is known. (European Patent Application No. 0 077 870, 1983). As additional stabilizer can be added human albumin. For example, in this process, 25% w / v glycine and 20% w / v sodium caprylate are added as a stabilizer. 1

Endvidere kendes en fremgangsmåde til varmebehandling af Faktor VIII i 10 timer ved 60°C samtidig med at et 7Furthermore, a method of heat treating Factor VIII for 10 hours at 60 ° C is known at the same time as a 7

DK 163029 BDK 163029 B

kontaminerende fibrinogenindhold reduceres (DE offentliggørelsesskrift nr. 29 16 711, 1980). Som stabilisator anvendes et saccharid eller sukkeralkohol i kombination med en høj koncentration af aminosyre. Den tilstedeværende 5 aminosyre bevirker, at fibrinogenet i Faktor VIII opløsningen fældes. Ved denne fremgangsmåde tilføres Faktor VIII opløsningen eksempelvis 50 % w/w saccharose og 2 M glycin under varmebehandlingen.contaminating fibrinogen content is reduced (DE Publication No. 29 16 711, 1980). As a stabilizer, a saccharide or sugar alcohol is used in combination with a high concentration of amino acid. The 5 amino acid present causes the fibrinogen in the Factor VIII solution to precipitate. In this process, the Factor VIII solution is added, for example, 50% w / w sucrose and 2 M glycine during the heat treatment.

Endelig er det fra GB patentansøgning nr. 2.172.000 kendt 10 at foretage en varmebehandling i 10 timer ved 60°C af en opløsning, der foruden Faktor VIII indeholder spormængder af heparin eller anden sulfateret polysaccharid, som ikke er blevet fjernet fuldstændigt ved tidligere rensningstrin. Tilstedeværelse af sådanne spormængder 15 heparin viste sig ved disse tidligere forsøg uden indflydelse på udbyttet eller genfindingen af Faktor VIII efter varmebehandlingen (se s. 4, 1. 6-7 i beskrivelsen til GB 2.172.000).Finally, from GB Patent Application No. 2,172,000, it is known to perform a heat treatment for 10 hours at 60 ° C of a solution which, in addition to Factor VIII, contains trace amounts of heparin or other sulfated polysaccharide which has not been completely removed in previous purification steps. . The presence of such trace amounts of 15 heparin was shown in these previous experiments without affecting the yield or recovery of Factor VIII after the heat treatment (see pp. 4, 1-6 in the description to GB 2,172,000).

Kendetegnende for de hidtil kendte fremgangsmåder til 20 stabilisering af Faktor VIII i vandige opløsninger under varmebehandling ved 60°C i 10 timer er, at genfindingen af Faktor VIII efter varmebehandlingen er lav. Således angives i eksemplerne i de ovenfor omtalte patentskrifter genfinding af Faktor VIII efter varmebehandling i 10 25 timer ved 60°C som angivet i nedenstående tabel.Characteristic of the known methods for stabilizing Factor VIII in aqueous solutions during heat treatment at 60 ° C for 10 hours is that the recovery of Factor VIII after the heat treatment is low. Thus, in the Examples of the above mentioned patents, the recovery of Factor VIII after heat treatment is indicated for 10 hours at 60 ° C as set forth in the table below.

Beskrivelse af fremgangsmåde Procent genfinding _F VIII aktivitet US pat. nr. 4 440 679, eksempel 1 A 63 US pat. nr. 4 440 679, eksempel IB 61 EP ans. nr. 0 077 870, tabel 1 40-70 EP ans. nr. 0 117 064, eksempel 1 58 EP ans. nr. 0 117 064, eksempel 2 56 EP ans. nr. 0 117 064, eksempel 3 58 EP ans. nr. 0 117 064, eksempel 4 57 DE off. nr. 29 16 711, eksempel 2 52 8Description of Procedure Percentage of Recovery F VIII Activity US Patent No. 4,440,679, Example 1 A 63 US Patent No. 4,440,679, Example IB 61 EP Ans. No. 0 077 870, Table 1 40-70 EP Ans. No. 0 117 064, example 1 58 EP Ans. No. 0 117 064, example 2 56 EP Ans. No. 0 117 064, Example 3 58 EP Ans. No. 0 117 064, Example 4 57 DE off. No. 29 16 711, Example 2 52 8

DK 163029 BDK 163029 B

Den lave genfinding af Faktor VIII ved de hidtil kendte fremgangsmåder udgør en væsentlig mangel ved disse fremgangsmåder. Idet præparater eller fraktioner indeholdende Faktor VIII fremstilles ud fra humant blod eller blodplas-5 ma hidrørerende fra donorer, er dette materiale en stærkt begrænset råvare.The low recovery of Factor VIII by the known methods constitutes a significant defect in these methods. Since Factor VIII preparations or fractions are prepared from human blood or blood plasma derived from donors, this material is a highly restricted raw material.

Således anvendes i Danmark årligt ca. 20 millioner IE Faktor VIII (1987) svarende til tapning af ca. 400.000 donorer. 1 IE (international enhed) Faktor VIII svarer 10 til Faktor VIII aktiviteten af 1 ml normalplasma. Samtidig er omkostningerne ved fremstillingen af disse præparater meget høje og genfindingen af Faktor VIII aktivitet lav, hvilket medfører, at Faktor VIII er et meget kostbart protein. Således er prisen for 1 IE Faktor VIII i et 15 højt renset Faktor VIII præparat ca. 4 kroner i Danmark.Thus, in Denmark, approx. 20 million IU Factor VIII (1987) corresponding to the tapping of approx. 400,000 donors. 1 IU (international unit) Factor VIII corresponds to Factor VIII activity of 1 ml of normal plasma. At the same time, the cost of producing these preparations is very high and the recovery of Factor VIII activity is low, which makes Factor VIII a very expensive protein. Thus, the price of 1 IU Factor VIII in a 15 highly purified Factor VIII preparation is approx. DKK 4 in Denmark.

Det årlige forbrug af Faktor VIII i Danmark svarer til ca. 80 millioner kroner. Det er således af stor betydning, at genfindingen af Faktor VIII er høj.The annual consumption of Factor VIII in Denmark corresponds to approx. NOK 80 million. Thus, it is of great importance that the recovery of Factor VIII is high.

Den foreliggende opfindelse er baseret på den opdagelse, 20 at man kan opnå en væsentligt forøget genfinding af Faktor VIII, hvis pasteuriseringen gennemføres på en renset citratholdig opløsning af Faktor VIII, der indeholder heparin som stabilisator i kombination med et saccharid eller sukkeralkohol. Det er således vigtigt for opnåel-25 se af højt udbytte, dvs. høj genfindelsesgrad, at man som udgangsmateriale anvender en renset citratholdig opløsning af Faktor VIII.The present invention is based on the finding that a substantially increased recovery of Factor VIII can be achieved if the pasteurization is carried out on a purified citrate-containing solution of Factor VIII containing heparin as a stabilizer in combination with a saccharide or sugar alcohol. Thus, it is important for high yield to be achieved, ie. high degree of recovery that a purified citrate-containing solution of Factor VIII is used as starting material.

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde af den i indledningen til krav 1 angivne art og er ejen-30 dommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.Thus, the present invention relates to a method of the kind set forth in the preamble of claim 1 and is peculiar to the characterizing part of the claim.

Denne fremgangsmåde sikrer mod transmission af infektiøs virus ved anvendelse af præparatet og giver samtidig en høj genfinding af Faktor VIII.This method ensures the transmission of infectious virus using the preparation and at the same time provides a high recovery of Factor VIII.

99

DK 163029 BDK 163029 B

Varmebehandlingen gennemføres på i og for sig kendt måde, fortrinsvis i 10 timer ved 60 °C. Derved opnås en overraskende forbedret genfinding af Faktor VIII.The heat treatment is carried out in a manner known per se, preferably for 10 hours at 60 ° C. This results in a surprisingly improved recovery of Factor VIII.

Ved anvendelsen af heparin som stabilisator i kombination 5 med et saccharid eller sukkeralkohol ved en varmebehandling i 10 timer ved 60 °C af en renset vandig opløsning indeholdende citrat og Faktor VIII er det alene effekten af inhibering af thrombin, der har betydning. Denne effekt kan forstærkes ved binding af heparin til von Willebrand 10 Faktor. På grund af det tilstedeværende citrat sker der ingen øgning i calciumniveauet med deraf følgende stabilisering af Faktor VIII.When using heparin as a stabilizer in combination 5 with a saccharide or sugar alcohol in a heat treatment for 10 hours at 60 ° C of a purified aqueous solution containing citrate and Factor VIII, it is only the effect of inhibition of thrombin. This effect can be enhanced by the binding of heparin to the von Willebrand 10 Factor. Due to the citrate present, there is no increase in the calcium level with consequent stabilization of Factor VIII.

Effekten af tilsætning af heparin ved en varmebehandling kan således tilskrives en påvirkning af det naturlige 15 koagulationssystem med en stabilisering af Faktor VIII til følge.Thus, the effect of adding heparin in a heat treatment can be attributed to an effect on the natural coagulation system with a stabilization of Factor VIII.

Dette er i modsætning til de hidtil kendte tilsætninger ved en varmebehandling i 10 timer ved 60°C af en vandig opløsning indeholdende Faktor VIII. Saccharider, sukker-20 alkohol, aminosyrer eller salte af organiske syrer har en stabiliserende effekt derved, at disse stabilisatorer påvirker hydratiseringsgraden eller ladningsfordelingen af proteinet.This is in contrast to the known additions by a heat treatment for 10 hours at 60 ° C of an aqueous solution containing Factor VIII. Saccharides, sugar-alcohol, amino acids or salts of organic acids have a stabilizing effect in that these stabilizers affect the degree of hydration or charge distribution of the protein.

Fremgangsmåden ved varmebehandling i 10 timer ved 60°C 25 af en vandig opløsning indeholdende Faktor VIII med heparin som stabilisator i kombination med et saccharid eller sukkeralkohol kan udføres på enhver fraktion eller præparater indeholdende Faktor VIII.The process of heat treating for 10 hours at 60 ° C an aqueous solution containing Factor VIII with heparin as a stabilizer in combination with a saccharide or sugar alcohol can be carried out on any fraction or preparations containing Factor VIII.

Til citratopløsninger indeholdende Faktor VIII tilsættes 30 et saccharid eller sukkeralkohol. Tilsætning af saccharose er en foretrukken udførelsesform. StabiliseringenTo citrate solutions containing Factor VIII, a saccharide or sugar alcohol is added. Addition of sucrose is a preferred embodiment. The stabilization

DK 163029 BDK 163029 B

IDID

af Faktor VIII stiger med øget tilsætning af saccharid eller sukkeralkohol, således kan der tilsættes fra 20 ιλι/ιλι % til mætning. Den foretrukne ud førelses form er tilsætning af saccharose svarende til 60 w/w %. Mætning 5 af en opløsning indeholdende Faktor VIII med saccharid eller sukkeralkohol medfører dels håndteringsmæssige vanskeligheder som følge af den høje viskositet, dels en stabilisering af den infektiøse virus.of Factor VIII increases with increased addition of saccharide or sugar alcohol, thus from 20 ιλι / ιλι% can be added to saturation. The preferred embodiment is the addition of sucrose corresponding to 60 w / w%. Saturation 5 of a solution containing Factor VIII with saccharide or sugar alcohol causes both handling difficulties due to the high viscosity and partly to stabilization of the infectious virus.

Heparin kan tilsættes før eller efter tilsætning af sac-10 charid eller sukkeralkohol svarende til fra 1,0 til 4,0 IE (internationale enheder) heparin pr. g opløsning efter tilsætning af saccharid eller sukkeralkohol. Tilsætning svarende til fra 1,5 til 2,5 IE heparin pr. g opløsning er en foretrukken fremgangsmåde.Heparin may be added before or after the addition of saccharide or sugar alcohol corresponding to from 1.0 to 4.0 IU (international units) of heparin per day. g of solution after addition of saccharide or sugar alcohol. Addition corresponding to 1.5 to 2.5 IU heparin per ml. g solution is a preferred method.

15 Tilsætning af for høje mængder heparin bevirker en præ- cipitering af Faktor VIII. Denne præcipitering kan konstateres ved måling af opløsningens uklarhed. Det har således vist sig, at ved tilsætning af 4,0 IE heparin pr. g opløsning kan en stigning i opløsningens uklarhed detek-20 teres. Det gælder for præcipitering af proteiner, at kemiske og fysiske forhold i opløsningen som eksempelvis proteinkoncentration, proteinsammensætning, ledningsevne, pH eller saltkoncentration har indflydelse på præcipite-ringsgraden. Ændringer i eksempelvis proteinkoncentra-25 tionen eller proteinsammensætningen vil således kunne bevirke ændringer i hvilken heparinkoncentration, der giver den højeste genfinding af Faktor VIII uden at proteinopløsningen begynder at præcipitere.Addition of excessive amounts of heparin causes the precipitation of Factor VIII. This precipitation can be ascertained by measuring the cloudiness of the solution. Thus, it has been found that by adding 4.0 IU of heparin per ml. g of solution, an increase in the cloudiness of the solution can be detected. It applies to the precipitation of proteins that chemical and physical conditions in the solution such as, for example, protein concentration, protein composition, conductivity, pH or salt concentration have an influence on the degree of precipitation. Thus, changes in, for example, the protein concentration or protein composition may cause changes in which heparin concentration gives the highest recovery of Factor VIII without the protein solution beginning to precipitate.

For at opnå et maksimalt udbytte må pH værdien indstilles 30 i opløsningen til et fysiologisk niveau. Således bør pH værdien være mellem 6,0 og 7,5 med fra 6,2 til 7,0 som foretrukken fremgangsmåde.In order to obtain maximum yield, the pH value must be adjusted to a physiological level in the solution. Thus, the pH should be between 6.0 and 7.5 with from 6.2 to 7.0 as the preferred method.

1111

DK 163029 BDK 163029 B

Tilsætning af CaCl^ i begrænsede mængder kan bevirke en stabilisering af Faktor VIII under varmebehandlingen, l/ed den foreliggende fremgangsmåde anvendes fra 0 til 150 mmol CaC^ pr. g færdig opløsning.Addition of CaCl 2 in limited amounts can cause a stabilization of Factor VIII during the heat treatment, using the present process from 0 to 150 mmol CaCl g of finished solution.

5 Fjernelse af saccharid eller sukkeralkohol fra opløsningen indeholdende Faktor VIII efter varmebehandlingen kan foretages ved dialyse eller præcipitering af Faktor VIII fra opløsningen.5 Removal of saccharide or sugar alcohol from the solution containing Factor VIII after the heat treatment can be done by dialysis or precipitation of Factor VIII from the solution.

Bestemmelse af Faktor VIII aktivitet kan foretages enten 10 ved 2-trins assay eller 1-trins assay. Det er kendt, at 1-trins og 2-trins assay kan resultere i forskellige bestemmelser af Faktor VIII aktiviteten i en given prøve.Determination of Factor VIII activity can be done either by 2-step assay or 1-step assay. It is known that the 1-step and 2-step assays can result in various determinations of Factor VIII activity in a given sample.

Det er endvidere kendt, at gentagne målinger med samme assay på samme prøve kan give anledning til store varia-15 tioner i bestemmelsen af Faktor VIII aktivitet. Det er endvidere kendt, at resultatet af bestemmelsen af Faktor VIII aktivitet kan afhænge af andre tilstedeværende proteiner eller andre komponenter i den givne prøve.Furthermore, it is known that repeated measurements with the same assay on the same sample can give rise to large variations in the determination of Factor VIII activity. Furthermore, it is known that the result of determining Factor VIII activity may depend on other proteins present or other components of the given sample.

Bestemmelse af Faktor VIII aktivitet ved 2-trins assay 20 udføres ved hjælp af chromogent substrat metode (KABIDetermination of Factor VIII activity by 2-step assay 20 is performed by chromogenic substrate method (KABI

Coatest Factor VIII), idet den oprindelige metode i reagensglas ved 37°C er modificeret til udførelse i mikro-titerplade med reduceret reagensanvendelse ved stuetemperatur. Der anvendes 50 mikroliter prøve eller standard, 25 som efter blanding med 50 mikroliter phospholipid, Faktor IXa og Faktor X tempereres i 10 minutter. Efter tilsætning af 25 mikroliter 25 mM CaCl^ inkuberes i 15 minutter, hvorefter der tilsættes 50 mikroliter substrat.Coatest Factor VIII), in which the original method in test tubes at 37 ° C is modified to be carried out in a microtiter plate with reduced reagent use at room temperature. 50 microliters of sample or standard is used, which, after mixing with 50 microliters of phospholipid, Factor IXa and Factor X is tempered for 10 minutes. After the addition of 25 microliters, 25 mM CaCl 2 is incubated for 15 minutes, after which 50 microliters of substrate is added.

Efter yderligere 20 minutter inkubation stoppes reaktionen 30 med tilsætning af 50 mikroliter 1 M citronsyre. Farve- udviklingen aflæses ved 405 nm med reference ved 492 nm.After a further 20 minutes of incubation, reaction 30 is stopped with the addition of 50 microliters of 1 M citric acid. Color development is read at 405 nm with reference at 492 nm.

1212

DK 163029 BDK 163029 B

Bestemmelse af Faktor VIII aktivitet ved 1-trins assay udføres ved hjælp af APTT metode (Activated Partial Thromboplastin Time). Der afpipetteres 100 mikroliter prøve eller standard i kuvetterne, hvorefter der tilsættes 5 100 mikroliter mangelplasma (Factor VIII deficient plasma,Determination of Factor VIII activity by 1-step assay is performed by APTT (Activated Partial Thromboplastin Time) method. Pipette 100 microliters of sample or standard into the cuvettes and add 5 100 microliters of deficient plasma (Factor VIII deficient plasma,

General Diagnostic), Der tilsættes 100 mikroliter APTT-reagens (General Diagnostic), og opløsningen termostateres ved 37 °C i 5 minutter. Efter tilsætning af 100 mikroliter 0,03 M CaC^ måles tiden indtil opløsningen er 10 koaguleret.General Diagnostic) 100 microliters of General Diagnostic (APTT) reagent is added and the solution is thermostated at 37 ° C for 5 minutes. After adding 100 microliters of 0.03 M CaCl3, the time is measured until the solution is coagulated.

Til kvantitative bestemmelser udarbejdes kalibrerings-kurver baseret på fortyndingsrækker af en intern standard, der er kalibreret over for WHO standard (3. Int. Standard of F VIII, Human Plasma, 3,9 IE/ml). 2-trins assay, som 15 her angivet, har en lavere detektionsgrænse (ca. 10 gange) end 1-trins assay. I- forbindelse med tilsætning af heparin er det en fordel at anvende 2-trins assay, idet en eventuel heparin effekt på assayet lettere kan bortfor-tyndes. Bestemmelse af uklarhed foretages ved måling 20 af extintionen ved 400 nm.For quantitative determinations, calibration curves based on dilution series of an internal standard calibrated to the WHO standard are prepared (3rd Int. Standard of F VIII, Human Plasma, 3.9 IU / ml). The 2-step assay, as indicated herein, has a lower detection limit (about 10 times) than the 1-step assay. In conjunction with the addition of heparin, it is advantageous to use the 2-step assay, as any heparin effect on the assay can be more easily diluted. Determination of haze is made by measuring the extinction at 400 nm.

Forsøg har således vist, at tilsætning af heparin svarende til en koncentration på fra 1,0 til 4,0 IE heparin pr. g opløsning indeholdende et renset Faktor VIII stabiliseret med et saccharid eller sukkeralkohol under varme-25 behandlingen giver en forøgelse af genfindingen af Faktor VIII.Thus, experiments have shown that the addition of heparin corresponding to a concentration of 1.0 to 4.0 IU heparin per g of solution containing a purified Factor VIII stabilized with a saccharide or sugar alcohol during the heat treatment provides an increase in the recovery of Factor VIII.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen illustreres ved efterfølgende eksempler.The process of the invention is illustrated by the following Examples.

EKSEMPEL 1 30 14 ml citratopløsning 80,53 g natriumcitrat/liter) inde holdende 1680 IE Faktor VIII, som er vidtgående rensetEXAMPLE 1 14 ml citrate solution 80.53 g sodium citrate / liter containing 1680 IU Factor VIII, which is purified extensively

DK 163029BDK 163029B

13 ved kromatografi, fordeles i 7 glas, således at hver glas indeholder 2 ml opløsning. Til hver glas tilsættes 3 g saccharose, der bringes i opløsning. Der tilsættes yderligere til hvert glas heparinopløsnang (500 IE/ml), 5 således at det enkelte glas indeholder en heparmmængde som angivet i tabellen herunder, og ca. 48 IE Faktor VIII pr. færdig opløsning. Glassene forsegles og varmebehandles i 10 timer ved 60 °C. Faktor VIII bestemmes ved 1-trins assay og opløsningens uklarhed bestemmes 10 som extintionen ved 400 nm.13 by chromatography, distribute in 7 glasses so that each glass contains 2 ml of solution. To each glass is added 3 g of sucrose which is dissolved. Additional glass is added to each glass of heparin solution (500 IU / ml), 5 so that each glass contains an amount of heparm as indicated in the table below, and approx. 48 IU Factor VIII per finished solution. The glasses are sealed and heat treated for 10 hours at 60 ° C. Factor VIII is determined by the 1-step assay and the cloudiness of the solution is determined as the extinction at 400 nm.

IE heparin talsat Procent genfinding ^400 pr. g opløsning Faktor VIII akivitet 0,0 70 0,35 0,3 70 0,34 0,5 71 0,35 1.0 87 0,35 2.0 91 0,37 4.0 93 0,40 8.0 85 0,63 EKSEMPEL 2 20 ml citratopløsning (0,53 g natriumcitrat/liter) indeholdende 6000 IE Faktor VIII, som er vidtgående renset ved kromatografi, fordeles i 10 glas, således at hver 15 glas indeholder 2 ml opløsning. Til hver glas tilsættes 3 g saccharose, der bringes i opløsning. Der tilsættes yderligere til hvert glas heparinopløsning (500 IE/ml), således at det enkelte glas indeholder en heparinmængde som angivet i tabellen herunder, og ca. 120 IE Faktor 20 VIII pr. g færdig opløsning. Glassene forsegles og varmebehandles i 10 timer ved 60°C. Faktor VIII bestemmes ved 2-trins assay.IU heparin counted Percent recovery ^ 400 pr. g of solution Factor VIII activity 0.0 70 0.35 0.3 70 0.34 0.5 71 0.35 1.0 87 0.35 2.0 91 0.37 4.0 93 0.40 8.0 85 0.63 EXAMPLE 2 20 ml citrate solution (0.53 g sodium citrate / liter) containing 6000 IU Factor VIII, which has been extensively purified by chromatography, is partitioned into 10 glasses, so that each 15 glasses contains 2 ml of solution. To each glass is added 3 g of sucrose which is dissolved. Further, each glass of heparin solution (500 IU / ml) is further added so that each glass contains an amount of heparin as indicated in the table below, and approx. 120 IU Factor 20 VIII per g of finished solution. The glasses are sealed and heat treated for 10 hours at 60 ° C. Factor VIII is determined by 2-step assay.

DK 163029BDK 163029B

14 IE heparin tilsat Procent genfinding af pr. g opløsning Faktor VIII aktivitet 0,0 66 1,0 86 1.5 81 2,0 91 2.5 87 EKSEMPEL 3 8 ml citratopløsning (0,53 g natriumcitrat/liter) indeholdende ca. 5000 IE højrenset Faktor VIII fordeles i 4 glas, således at hver glas indeholder 2 ml opløsning.14 IU heparin added Percent recovery of pr. Example VIII Activity 0.0 66 1.0 86 1.5 81 2.0 91 2.5 87 EXAMPLE 3 8 ml citrate solution (0.53 g sodium citrate / liter) containing approx. 5000 IU of purified Factor VIII is divided into 4 glasses so that each glass contains 2 ml of solution.

5 Til hver glas tilsættes 3 g saccharose, der bringes i opløsning. Til 2 glas tilsættes yderligere heparin-opløsning (500 IE/ml), således at glasset indeholder en heparinmængde på 2,0 IE pr. g opløsning. Glassene forsegles og varmebehandles i 10 timer ved 60 °C. For-10 søget gentages på forskelligt prøvemateriale, ialt 5 gange. Indholdet af Faktor VIII varierede i disse forsøg fra 220 til 260 IE pr. g færdig opløsning. Faktor VIII bestemmes ved 2-trins assay.5 To each glass add 3 g of sucrose which is dissolved. To 2 glasses is added additional heparin solution (500 IU / ml), so that the glass contains a heparin amount of 2.0 IU per ml. g of solution. The glasses are sealed and heat treated for 10 hours at 60 ° C. The test is repeated on different sample materials, a total of 5 times. The content of Factor VIII ranged from 220 to 260 IU in these experiments. g of finished solution. Factor VIII is determined by 2-step assay.

1515

DK 163029 BDK 163029 B

Forsøg IE heparin pr. Procent genfinding af Procent g opløsning Faktor Mill aktivitet forbedring 1 0 40 0 40 5 snit 42 2 71 2 81 snit 76 81 2 0 51 10 0 55 snit 53 2 86 2 87 snit 87 63 15 3 0 55 0 60 snit 58 2 85 2 89 20 snit 87 51 4 0 71 0 71 snit 71 2 83 25 2 84 snit 84 18 5 0 59 0 66 snit 63 30 2 84 2 85 snit 85 35Test IE heparin per Percent recovery of Percent g solution Factor Mill activity improvement 1 0 40 0 40 5 sections 42 2 71 2 81 sections 76 81 2 0 51 10 0 55 sections 53 2 86 2 87 sections 87 63 15 3 0 55 0 60 sections 58 2 85 2 89 20 section 87 51 4 0 71 0 71 section 71 2 83 25 2 84 section 84 18 5 0 59 0 66 section 63 30 2 84 2 85 section 85 35

Gennemsnitlig forbedring for alle forsøg er 50¾.The average improvement for all trials is 50¾.

1616

DK 163029 BDK 163029 B

EKSEMPEL 4 2 ml citratopløsning (0,53 g natriumcitrat/liter) indeholdende 600 IE højrenset Faktor VIII, tilsættes 3 g saccharose, der bringes i opløsning. Der tilsættes yder- 5 ligere heparinopløsning (500 IE/ml) og calciumchlorid -2 (10 M), således at glasset indeholder en heparinmængde på 2,0 IE, 100 mmol calciumchlorid og 120 IE Faktor VIII pr. g opløsning. Glasset forsegles og varmebehandles i 10 timer ved 60°C. Faktor VIII bestemmes ved 2-trins 10 assay. Genfindingen af Faktor VIII var 88¾.EXAMPLE 4 2 ml of citrate solution (0.53 g sodium citrate / liter) containing 600 IU of highly purified Factor VIII, add 3 g of sucrose which is dissolved. Further heparin solution (500 IU / ml) and calcium chloride -2 (10 M) are added so that the glass contains a heparin amount of 2.0 IU, 100 mmol calcium chloride and 120 IU Factor VIII per ml. g of solution. The glass is sealed and heat treated for 10 hours at 60 ° C. Factor VIII is determined by 2-step 10 assay. The recovery of Factor VIII was 88¾.

Claims

A process for pasteurizing aqueous solutions of Factor VIII by heating to a temperature of 55 - 65 ° C for a period of 5 - 15 hours in the presence of 5 a saccharide or a sugar alcohol, characterized in that a purified citrate-containing solution of Factor VIII is added 1-4 IU of heparin per ml. g of finished solution and then subjected to the heat treatment.

Process according to claim 1, characterized in that the amount of heparin added is 1.5 - 2.5 IU per minute. g of finished solution.

Process according to Claim 1 or 2, characterized in that the pH value is maintained at 6.2 - 7.0 during the heat treatment.

A method according to any one of claims 1-3, characterized in that the content of Factor VIII is maintained between 10 and 300 IU per minute. g of finished solution.

Process according to any one of claims 1-4, characterized in that the amount of saccharide or sugar alcohol is 50-65% w / w, based on the final solution.

Process according to claim 5, characterized in that the saccharide is sucrose. Method according to any one of claims 1-6, characterized in that the heat treatment is carried out in close to 3 weather of CaC 2 in an amount not exceeding 150 mmol per hectare. g finished 4 solution.