CZ20001909A3 - Použití tranexamové kyseliny pro výrobu prostředku lidského fibrinogenu a lidský fíbrinogenový prostředek - Google Patents

Abstract

Je popsáno použití tranexamové kyseliny pro výrobu prostředku lidského fibrinogenu, získaného z lidské plasmy nebo způsoby rekombinantní nebo transgenní technologie se současným přidáním lidského albuminu, aby se snížila doba rozpouštění, když se přidá fyziologicky slučitelný roztok. Je popsán také lidský fíbrinogenový prostředek.

Description

Použití tranexamové kyseliny pro výrobu prostředku lidského fibrinogenu a lidský fibrinogenový prostředek

Oblast techniky

Předložený vynález se týká použití tranexamové kyseliny pro výrobu prostředku lidského fibrinogenu získaného z lidské plasmy nebo způsoby rekombinantní nebo transgenní technologie se současným přidáním lidského albuminu, aby se snížila doba rozpouštění, když se přidá fysiologicky slučitelný roztok. Je popsán také lidský fibrinogenový prostředek. Tento prostředek se vysuší a teplem se deaktivují viry. Roztok tohoto prostředku se může používat místně jako adhezivum nebo jako biologické lepidlo, aby se spojily na lidské orgány nebo tkáně.

Dosavadní stav techniky

Proteinové prostředky tohoto typu, které se nalézají na trhu, obsahují antifobrinolytická činidla jako pomocná ochranná činidla fibrinové sraženiny, jako je aprotinin (zvířecího původu) nebo například ε-aminokapronová kyselina (syntetického původu) nebo podobné. Potřeba přidat tyto exogenní sloučeniny k základní koagulovatelné fibrinogenové složce byla dostatečně diskutována a projednána díky chybějícím klinickým výsledkům podporujícím tuto potřebu, jestliže se fibrinogen používá jako biologické adhezní činidlo.

Mezi současný stav oblasti techniky patří, jako nejdúležitější položky předchozí oblasti techniky související se způsobem podle vynálezu, ty, které jsou diskutovány níže.

Použití antifibrinolytických činidel, jako je aprotinin, začíná v letech kolem roku 1970 (aprotinin je dnes prodáván pod obchodními značkami Antagosan, Fase, Iniprol a dalšími). Podávání společně s fibrinogenem, pro jeho aplikaci jako biologické lepidlo, je již popsáno v SRN patentu 3 002 933 (priorita z 15.2.1979), v němž je • · · · • · · · • · · » • · · · • · · · ·· · specificky uvedena výroba fibrinového adhezního činidla a stabilita dosažená antifibrinolytickým činidlem.

Snadno rozpustitelný lyofilizovaný prostředek připravený spolu s aminokyselinami obsahující v jejich molekule močovinové a gauanidinové skupiny je popsán ve španělském patentu 519 469 (priorita 4.2.1982).

Mnohem později byly popsány prostředky, které zlepšují rozpustnost dehydratovaného fibrinogenového prostředku a/nebo jeho stabilitu v roztoku předcházejícím přidáním močoviny (patent WO 01/19519 s prioritou 15.6.1990) a přítomností neiontových detergentních činidel (španělský patent 2 080 155 s prioritou 1.8.1989, a spis WO 95/25748 s prioritou 18.3.1994).

Byly použity různé patenty, které se týkají specifických nebo nespecifických způsobů deaktivace virů u fibrinogenu. Španělský patent 536 850 (priorita 19.10. 1983) nárokuje deaktivaci virů tepelným ošetřením proteinů, včetně fibrinogenu, v suchém stavu a v přítomnosti kyselých a bazických aminokyselin. Španělský patent 524 992 (priorita 19.8.1982) se týká také způsobu deaktivace virů pasterizací v kapalině při 60 °C po dobu 10 hodin a v přítomnosti stabilizačních činidel.

Španělský patent 2 051 914 (priorita 29.4.1988) popisuje prostředek a přípravu sloučeniny, která se může použít pro opravu chrupavek a kostí, a která sestává z biologicky degradovatelného biologického lepidla, formy prostředku, která byla popsána dříve v USA patentu 4 642 120 (priorita 28.3.1983). Gel, který je nárokován v dotyčném patentu, španělském patentu 2 051 914, nebo v předchozím USA patentu 4 642 120, sestává, mimo jiné, z trombinu, chloridu vápenatého, antiproteasy (aprotininu, ε-aminokapronové kyseliny, tranexamové kyseliny nebo jiných proteinových inhibitorů, jako je antiplasmin atd.) a fibrinogenu. Podle shora uvedeného patentu může být sloučenina skladována 2 až 3 dny při inkubačních teplotách nebo 2 až 3 roky při kryogenních teplotách. Aplikace nárokovaná v tomto patentu se týká pouze • · · · • · ♦ · • · · · • · · · · ·· použití buněk kostní dřeně společně s imobilizačním mediátorem (adhezivní lepidlo), který obsahuje ne méně než 10 % hmotn. sera.

Patentový spis WO 92/22312 (priorita 17.6.1991) specificky nárokuje prostředek s adhezivními vlastnostmi, který obsahuje biologicky degradovatelný fibrinogen nebo fibrin a biologicky slučitelný polymer, takže je to v podstatě adhezní lepidlo, které uchovává známé chemické aplikace standardních přípravků tohoto typu sloučenin. Použití některých z již známých antifibrinolytických činidel lidského původu (antiplasmin), živočišného původu (aprotinin) a syntetického původu (tranexamová kyselina), je zmíněno u jejich přípravy.

Dalším z patentů týkajících se biologických lepidel je evropský patent 0 534 178 A2 (priorita z 27.9.1991). Tento patent popisuje přípravu lepidla na bázi sloučeniny A surového fibrinogenu a další sloučeniny B s výhodou sestávající z proteolytického enzymu získaného z hadího jedu (batroxobin) nebo trombinu. Tento patent bere v úvahu možnost přidání proteasového inhibitoru, jako je aprotinin. Při přípravě sloučeniny A popisuje výlučně použití kryoprecipitátu jako výchozího materiálu s konstatováním, že složení tohoto meteriálu (ze sestavy plasmy od 5 dárců): 75 mg/ml celkového proteinu (100 %), 36 mg/ml fibrinogenu (48 % vzhledem k celkovému proteinu) a 4,10 mezinárodních jednotek (m.j.) na ml faktoru XIII. Podle popisu tohoto patentu má zpracovaný produkt, to znamená po extrakci solným roztokem kyseliny citrónové a filtraci v přítomnosti hlinitého gelu, koncentraci proteinu ekvivalentní počáteční koncentraci (70 až 80 mg/ml z celkového proteinu), při čemž se uchovává v sáčcích z umělé hmoty (lyofilizace je uvažována pouze jako případná).

Patentový spis WO 94/22503 (priorita 30.3.1993) popisuje výrobu a použití adhezního fibrinového lepidla, jeho výhody, které jsou uvedeny ve vynálezu, spočívají ve větší mechanické pevnosti adhezního lepidla tohoto prostředku. Je zde uvedena tranexamová kyselina jako náhrada za aprotinin, která nemá antifibrinolytickou aktivitu s nízkou imunitní odpovědí, schopnou dodat dostatečnou pevnost v tahu, jestliže se srovnává s jinými prostředky obsahujícími aprotitin. V žádném případě zde • · · · · · • · · · • · · · • · · • · · · · • · · ♦ · · • ······· · neexistuje zmínka o použití tranexamové kyseliny nebo jejích derivátů jako excipiens fibrinogenu během lyofilizace, samotné nebo v kombinaci s jinými složkami, nebo jejím významném solubilizujícím účinku, objeveným vynálezci, který je uveden v tomto popisu. Některé znaky prostředků tohoto typu nárokované v patentu, o který se jedná, byly publikovány (Jackson M.R., MacPhee M.J. a spol.: Fibrin Sealant: Current and Potential Clinical Applications. Blood Coagulation and Fibrínolysis 1996, 7, 737 až 746).

Na druhé straně - jak chemická syntéza tak terapeutické indikace tranexamové kyseliny (antifibrinolotyická aktivita) intravenózní, subkutánní, orální nebo místní cestou (masti a roztoky) jsou uvedeny v belgickém patentu č. 617 216 (priorita 1961), který zdůrazňuje specifickou aktivitu prostředku vzhledem k jeho inhibičnímu účinku na přítomnost plasminu, vzhledem k lyži fibrinové sraženiny vytořené fibrinogenem a trombinem v přítomnosti Ca(2+) iontů. Tento patent nárokuje také možné použití produktu kombinovaného s jinými účinnými principy nebo složkami, jejichž povaha podporuje fibrinolytickou aktivitu.

Toto nové složení prostředku popsané ve vynálezu řeší některé z problémů, které běžně mají koagulovatelné fibrinogenové sloučeniny pro místní použití a které spočívají v:

1) Použití sloučenin s nízkou koncentrací koagulovatelných proteinů, které mají účinek na aktivitu prostředku, se zachováním terapeutické užitečnosti.

2) Fyzikální a/nebo chemické způsoby deaktivace/sterilizace dávají dnes produktům odvozeným od lidské plasmy prakticky nulové riziko infekce většinou nejnebezpečnějších patogenních virů přenosných plasmou, jako jsou ty, které způsobují lidskou imunitní nedostatečnost a hepatitidu B nebo C (a velmi pravděpodobně G) nebo jakýchkoliv známých virů, které mají tukovou obálku. Neexistují však žádné absolutně jisté způsoby celkové sterilizace virů, které nemají tukovou obálku a jsou přenosné plasmou.

3) Výroba prostředků koagulovatelného fibrinogenu, které jsou uchovávány v suchém (lyofilizovaném) stavu, deaktivovány teplem a snadno se rozpouštějí ve ··· 9····· 99 99

999 9 9 · 9 · 9 ·

9 9 9 ·· · 9 · 9 ·

9 9999 99 99 99 *9 · 999 9·· 9···

9 9· · 99 99 vodném nosiči a ve vysokých koncentracích, představuje i nadále faktor, který omezuje místní aplikaci přípravku s maximální terapeutickou účinností.

Shora uvedenými body se zabývali autoři tohoto vynálezu, který poskytuje prostředek adhezního proteinového komplexu, který je lepší než současné ekvivalentní výrobky z oblasti techniky.

Pro místní použití proteinového komplexu, který vynález označuje jako biologické adhezní činidlo, je pro adhezního fibrinu vyžadována tvorba sraženiny. Pomocná sloučenina, sestávající z aktivovaného enzymu, jako je trombin, poskytuje pevnou fibrinovou mřížku, jestliže se uvede do kontaktu s proteinovým komplexem podle vynálezu v přítomnosti vápenatých iontů.

Jedním ze základních proteinů tvořících prostředek podle vynálezu je koagulovatelný fibrinogen. Tento majoritní protein je doprovázen dalšími adhezními proteiny, které jsou, v případě místní aplikace jako lepidlo, zvláště cenné, protože se účastní mechanismu připojování tkáně zlepšenou adhezitou. Tento proteinový komplex se tedy vyznačuje tím, že vedle toho, že obsahuje převážně fibrinogen, je doprovázen fibrinonektinem a také faktorem XIII a dalšími minoritními proteiny.

Koncentrace koagulovatelného fibrinogenu je jedním z předmětů předloženého vynálezu. Je známo, že jak rychlost tvorby fibrinové mřížky tak její pevnost jsou funkcí koncentrace koagulovatelného proteinu v aplikovaném proteinovém komplexu. Je tedy životním požadavkem podávat místně vysokou koncentraci fibrinogenu tak, aby při uvedení do kontaktu s jeho aktivátorem poskytl pevnou mřížku zesíťovaného fibrinu.

Předložený vynález se týká problémů uchování prostředku za takových podmínek, které nepožadují mrazící teploty, tak, aby se mohly skladovat za teploty místnosti nebo v ledničce. Pro tento účel bylo vyvinuto takové složení, které umožňuje, aby byl získán lyofilizovaný prostředek, který splňuje požadavky lékopisu a který je ·· ···« • · lepší vzhledem k několika prostředkům, které jsou registrovány a prodávány nebo které jsou stále ještě ve vývojovém stadiu.

Dalším ze zvláště důležitých bodů předloženého vynálezu je zahrnutí alespoň jednoho specifického stupně deaktivace virů s danou účinností. Tato deaktivace se provádí konečným celkovým tepelným ošetřením za vysoké teploty ve vysušeném stavu (například po lyofilizaci) a u konečného produktu v jeho koncovém balení. Takto ošetřená fibrinogenová sloučenina si udržuje nezměněné svoje biologické a fyzikální vlastnosti.

Aby se získal prostředek adhezních proteinů se znaky uvedenými ve shora uvedených bodech, autoři vynálezu vyvinuli optimální prostředek pro místní použití jako biologické lepidlo.

Monografie Evropského lékopisu pro fibrinová adheziva uvádí, že koagulovatelná fibrinogenová složka musí obsahovat ne méně než 60 g/litr a také ne méně než 10 m.j. faktoru Xlll/ml a resolubilizační doba lyofilizovaného produktu nesmí být větší než 20 minut za uvedené výhodné teploty.

Shora uvedená koncentrace fibrinogenu se nesnadno dosáhne v prostředcích získaných jednoduchým způsobem výroby adhezních proteinových komplexů, jestliže se například vychází z kryoprecipitátu, vzhledem k velkému množství doprovázejících proteinů, které znečišťují základní fibrinogenový přípravek. I když však bylo možné těmito způsoby dosáhnout nutnou koncentraci fibrinogenu, získaný materiál se s výhodou udržuje ve zmrazeném stavu, dokud se nepoužije. Vysušené (lyofilizované) prostředky jsou špatně rozpustné v rozumných dobách v koncentracích požadovaných pro jejich použití jako biologická adheziva pro tkáně, takže roztok se uchovává ve zmrazeném stavu (aplikovaný na doma vyrobené prostředky).

V současné době se pokračuje v obvyklé praxi výroby fibrinogenových sloučenin, při čemž se vychází z kryoprecipitátu autologní plasmy, od jednoho dárce nebo • · « « · • · 9 9 9

9 9 9 9 9 • ······♦ ·

9 9 9 9

9 99

9

9

9 9 9 9 · • 9 9 9 9

9 9 99 od směsi několika málo dárců (například od pěti). Tyto typy přípravků (vyrobené doma nebo domácí přípravky) jsou vyráběny nemocničními středisky pro jejich vlastní použití (interní použití), ale vykazují zcela zřetelně chybějící standardizaci a reprodukovatelnost, pokud jde o kvalitu prostředku, a získávají se tedy nepřesné výsledky a nízká terapeutická účinnost. Tato praxe ani úplně nevylučuje riziko přenosu virů (kromě případu autologní plasmy) a získávají se velmi nízké konečné koncentrace fibrinogenu v rozmezí přibližně od 10 do 29 mg/ml (1 až 2,9 % hmotn.) koagulovatelného fibrinogenu (Jackson M.R., MacPhee M.J. a spol.: Fibrin Sealant: Currentand Potential Clinical Applications. Blood Coagulation and Fibrinoiysis 1996, 7, 737 až 746).

Podobně by použití shora uvedeného fibrinogenového prostředku mohlo mít významně negativní účinek týkající se jednoho ze zbývajících doprovázejících proteinů (pravděpodobné obsahuje pouze přibližně 50 % a v každém případě méně než 70 % hmotn. koagulovatelného fibrinogenu) a může být tedy prakticky nezbytné přidat inhibitor proteasy poskytující stabilitu a ochranu nejdříve fibrinogenu a potom vytvořené fibrinové mřížce, jestliže se aplikuje místně.

Rozpustnost lyofilizovaného prostředku se zvýšila tím, že se do prostředku zahrnou aminokyseliny obsahující močovinovou nebo guanidinovou skupinu, jako je arginin, isoleucin atd, nebo chaotropními činidly, jako je močovina samotná. Bylo popsáno také použití rozpustných mastných kyselin a detergentů, které podle toho, co bylo publikováno, mohou podporovat solubilizaci lyofilizátu.

V každém případě je nutné udržovat podmínky přibližně fysiologické iontové síly v době tvoření fibrinové mřížky. Je považováno za nepřijatelné připravit roztoky, u nichž konečná koncentrace iontu jasně převyšuje fysiologickou hodnotu (například více než dvojnásobnou hodnotu).

Autoři vynálezu řešili problém uchování stability fibrinogenového přípravku obsahujícího většinu adhezních proteinů, o které se jedná, a faktor XIII, zachovaných • * · · · · • · v lyofilizovaném stavu, vytvoření možnosti deaktivace virů teplem v suchém stavu kvůli získání koagulovatelných proteinů ve vysoké koncentraci.

Podstata vynálezu

Autoři vynálezu překvapivě objevili konečný prostředek, který při optimálních množstvích excipiens, umožňuje solubilizaci lyofilizované fibrinogenové sloučeniny v koncentracích převyšujících 60 g/litr koagulovatelného proteinu, s dobou její rekonstituce zřetelně nižší než povinných 20 minut pro solubilizaci lyofilizovaného produktu, v podstatě obvykle od 5 do 10 minut. Sestavení prostředku podle vynálezu umožňuje účinnou deaktivaci virů teplem za vysoké teploty bez poškození funkčního charakteru prostředku a současně si prostředek zachovává svoje fyzikální vlastnosti bez významné změny.

Pokud jde o vznik imunitní odpovědi prostředkem, může být prakticky nulová u infuzne sloučenin, které jsou vyčištěny do vysokého stupně a v nichž byla dostatečně snížena přítomnost imunoglobulinů (isoaglutininů). Možná tvorba neoantigenů, která existuje v principu díky působení tepla během posledního stupně tepelné deaktivace lyofilizovaného produktu, může být prakticky vyloučena, jestliže byl účinně regulován stupeň sušení lyofilizovaného produktu a jestliže byla účinně regulována příznivá atmosféra (nepřítomnost kyslíku) při zahřívání pevné látky.

Pokud jde o již uvedenou virovou bezpečnost fibrinogenových sloučenin, existuje prakticky nulové riziko přítomnosti virů, které mají tukovou obálku, jestliže prostředek byl podroben jednomu z uznávaných způsobů deaktivace (rozpouštědlo-detergent). Historicky - fíbrinogen používaný v letech kolem roku 1970 nebo dříve vykazoval velmi vysoké riziko přenášení virových onemocnění způsobených hlavně hepatitidou (B a/nebo ne-A, ne-B), jestliže nebyl do jeho výroby zahrnut žádný stupeň specifické deaktivace virů, jestliže se jako výchozí materiál používala sestava plasmy od stovek nebo tisíců dárců. Existovala tedy potřeba vyrobit fibrinogen z autologní plasmy nebo od velmi malého a kontrolovaného počtu dárců.

·· · «φ »·*φ ft · · · φ · • 9 9 · 9 9 9

9 9999 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 99 Λ ·· 9 9

9 9 « • · Φ · • 9 9 9

9 9 9

99

V současné době společnosti frakcionizující plasmu prodávají sloučeniny koagulovatelného fibrinogenu s deaktivovanými viry, s alespoň jedním vysokoúčinným a specifickým stupněm eliminace viru (je vyhodnoceno, že je nutné mít alespoň přibližně 8 až 10 log(10) snížení původního obsahu virů v celkovém výrobním procesu u virů, které mají tukovou obálku, a alespoň jeden stupeň, v němž je zbývající infekčnost nulová). Fibrinogenové produkty, které se v současné době vyvíjejí, by tedy měly zahrnovat dvojí stupeň deaktivace, pň čemž alespoň jeden z těchto stupňů je účinný také na viry bez tukové obálky, aby se dosáhla dostatečná úroveň bezpečnosti produktu.

Způsob podle vynálezu vyhovuje výzvě dvojí deaktivace s možností kombinování chemické deaktivace (rozpouštědlo-detergent) zavedené do způsobu čištění výrobku s vysokoúčinnou tepelnou deaktivací u konečného balení, tyto stupně jsou tedy doplňkové a selektivní.

Mělo by být vyzdviženo, že virová deaktivace pomocí tepla v suchém stavu může snadno působit proti rychlosti solubilizace takto ošetřeného lyofilizovaného produktu a proti kvalitě získaného roztoku. Pomocí nového lyofilizovaného prostředku způsob podle vynálezu překonává tuto klíčovou obtíž při získání vhodného fibrinogenového přípravku, který bere v úvahu deaktivaci teplem.

Aytoři vynálezu objevili, že vhodná kombinace proteinů, aminokyselin a chemických reakčních činidel byla schopna podporovat solubilizaci dehydratovaného materiálu. Překvapivě zjistili, že adhezní komplex fibrinogenu vhodně smíchaný s albuminem, glycinem a solemi citrátu sodného, k nimž bylo přidáno alespoň jedno solubilizační činidlo ze skupiny tvořené aminovou skupinou substituovaných karboxylových kyselin s nelineárním uhlovodíkovým řetězcem, v přesné koncentraci, vede k prostředku, který vyhovuje specifikaci produktu na jeho uchování v suchém stavu.

·» » » · · · • · · * ♦ · • ··*··»· · 9 9 9 99

9 99 »9 99

9 9 9 9 ♦ · · · « • · · 9 · *

9 9 9 9

Λ 9 9 *♦

Solubilizační činidlo, o které se jedná, odpovídá podrobněji vzorci chemicky syntetizované sloučeniny, která je tvořena skupinou karboxylové kyseliny navázanou na alifatický cyklický kruh se 6 uhlíkovými jednotkami a pravděpodobně je substituována koncovou aminomethylovou skupinou v poloze 4 neboli para-poloze. Částečný vzorec odpovídá výrazu NH3CH2-A-CO.OH, kde A znamená cyklohexanový kruh. Tato sloučenina znamená 4-aminomethylcyklohexankarboxylovou kyselinu, která je známa zkratkou AMCHA (nebo také AMCA), která má dva polohové isomery, cis-AMCHA a trans-AMCHA, druhý má antifibrinolytickou aktivitu, a která je známa také jako tranexamová kyselina, Cyklokapron, nebo pod jinými jmény (patentová přihláška USA 3 499 925, priorita 1965).

Autoři vynálezu nyní překvapivě objevili a popsali v tomto spisu, že tato sloučenina působí jako solubilizační činidlo fibrinogenu (a doprovázejících adhezních proteinů) v suchém (lyofilizovaném) stavu, když tvoří část vhodné kombinace dalších složek (albumin, glycin, soli). Jestliže jedna ze shora uvedených složek není přítomna, ať jde o albuminm, glycin nebo soli, solubilizační účinek přidané AMCHA je významně snížen.

Aby se dosáhl žádaný cíl, pokud jde o solubilizaci produktu, autoři vynálezu provedli experimentální výzkum, aby zjistili, které prostředky mohou být přijatelné, jak kvalitativně tak kvantitativné, aby bylo možné dosáhnout optimalizace solubilizace.

Prostředek produktu podle tohoto vynálezu má mimořádnou přidanou výhodu, která umožňuje aplikaci stupně deaktivace virů teplem za zvýšené teploty, která poskytuje maximální hladinu virové bezpečnosti, jestliže se kombinuje s chemickou deaktivací rozpouštědlem/detergentem. Excipiens nebo stabilizátory prostředku jsou za podmínek ošetření teplem rezistentní vůči teplu. Albumin, který se v prostředku používá, se účastní stabilizování produktu během tepelného zpracování a substituovaná karboxylová kyselina pokračuje v usnadnění solubilizace lyofilizovaného produktu po ošetření.

«9 99·· •« * • · · » · • 9 · 9 · 9 9 • 9 9999 9 · 9* • 9 9 9 9 9 •99 99 9 *·

9 9 9

9 9 «

9 9 9 «

9 9 « • 9 *·

Podrobný popis prostředku a způsobu výroby podle vynálezu je popsán níže,

Proteinový roztok výchozího materiálu, který je vyčištěn a zahuštěn na přibližně 4 % hmotn. celkového proteinu, z čehož alespoň 90 % hmotn. představuje koagulovatelný fibrinogen, je ve vodném medium, které obsahuje glycin v koncentraci od 0,05 M do 0,2 M, chlorid sodný v koncentraci od 0,05 M do 0,2 M a citrát sodný v koncentraci od 0,01 M do 0,05 M, při pH s výhodou od 6,0 do 8,0.

Výchozí produkt prakticky neobsahuje agregáty vysokomolekulámího fibrinogenu a také nestálé lipoproteinové sloučeniny nebo jiné sloučeniny, které mohou být lyofilizací nebo některými jinými typy sušících operací změněny.

K roztoku produktu se pňdá od 0,25 do 0,75 % hmotn. lidského sérového albuminu, následuje přidání koncentrovaného roztoku slučitelného solubilizačního činidla představovaného substituovanou cyklickou karboxylovou kyselinou a s výhodou 4-aminomethylcyklohexanovou kyselinou (AMCHA), za dosažení 1 až 4%, výhodněji 2 až 2,5% (hmotn.) koncentrace, jakmile byl roztok jednou upraven na koncentraci 3 až 4 % hmotn. fibrinogenu.

Před tím, než se vysuší (lyofilizuje, atomizuje), se upravený roztok vyčiští a steriluje filtrací póry o velikosti 0,2 mikrometru, změří se příslušný objem žádoucí pro žádanou presentaci a s výhodou se odměří objem ekvivalentní dvojnásobku zamýšlené rekonstituce, například 10 ml 3 až 4% (hmotn.) roztoku fibrinogenu, který se rekonstituuje pouze 5 ml rozpouštědla (vody pro injekci).

Produkt se vysuší s výhodou vhodným lyofilizačním cyklem (s výhodou předběžným zmrazením výrobku za teplot kolem -60 °C nebo nižších a konečným vysušením při 30 až 40 °C ve vysokém vakuu) nebo atomizací. Produkt se pak podrobí stupni zahřívání, který je účinný pro deaktivaci virů citlivých na teplo, za vysokých teplot při 80 nebo více °C až 115 °C s dobou vystavení teplu s výhodou od 5 minut do 100 hodin v zataveném konečném balení ve vakuu.

« ·

Lyofilizovaná fibrinogenové sloučenina zamýšlená pro použití jako adhezní lepidlo, jakmile má jednou teplem deaktivované viry, se rozpustí s výhodou ve vodě pro injekci použitím takového objemu rozpouštědla, aby konečná koncentrace fibrinogenu nebyla menší než 60 mg/ml a byla s výhodou od 60 do 80 mg/ml. Obsah koagulovatelného fibrinogenu ve vztahu k celkovému proteinu je větší než 70 % hmotn. Podobně - koncentrace excipens, jakmile je jednou dehydratovaný produkt rozpuštěn, je u chloridu sodného s výhodou 0,1 až 0,4M, u citrátu sodného s výhodou od 0,02M do 0,1M, u glycinu s výhodou od 0,1 do 0,4M, u lidského albuminu s výhodou od 0,5 do 1,5% (hmotn.) a koncentrace substituované cyklické karboxylové kyseliny (AMCHA) je s výhodou od 2 do 8, výhodněji od 4 do 5 % hmotn. Solubilizační doba výrobku pň rotačním míchaní je menší než 20 minut, obvykle je od 2 do 10 minut, jestliže výrobek není podroben tepelnému ošetření a s výhodou 2 až 15 minut, jakmile je jednou zahřát za shora uvedených výhodných podmínek. Teplota, při které se lyofilizát rozpouští, může být teplota místnosti (přibližně 22 °C) nebo vyšší, ale nesmí překročit 40 °C. S výhodou se pevná látka rozpustí ve vodě za teploty od 35 do 37 °C, nádoba (ampulka), která obsahuje suspenzi produktu, se podrobí přiměřenému a konstantnímu míchání, které lze provádět různými způsoby, ať ručně nebo mechanicky (otáčením), dokud rozpuštění není úplné. Získaný roztok je průhledný a bezbarvý nebo má mírně žlutavý nádech.

Přidání aktivátoru (trombinu) k adhezní fibrinogenové sloučenině podle vynálezu podporuje rychlou aktivaci za tvorby rezistentní a stabilní, biologicky slučitelné a adsorbovatelné fibrinové sraženiny, která se může použít jako adhezní činidlo pro tkáně s klinickými indikacemi, které jsou charakteristické pro tento typ prostředku.

Způsob, kterého se předložený vynález týká, je uveden níže pomocí schematického diagramu:

• ·· · • · · · · • · · · · • · · · · * · · · · · • · ···· ·· ·· ·· ·· · • · · · · · ···· ·· · ·· · · · ··

Fibrinogenový proteinový komplex I prostředek (albumin, glycin, chlorid sodný a citrát sodný)

I + AMCHA I sterilizace (0,2 gm)

I zmrazení a vysušení I tepelné ošetření (5 minut až 100 hodin při 80 až 115 °C)

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Dávka (č. 7000) pro získání fibrinogenu (proteinový komplex), vyčištěná vysrážením glycinem, byla zpracována tak, že se získá lyofilizovaný konečný produkt pro možnou místní aplikaci jako biologické lepidlo.

Výchozím materiálem bylo 474 g sraženiny fibrinogenu glycinem suspendovaných ve 1422 g roztoku pro solubilizaci. 1422 g roztoku pro solubilizaci precipitátu obsahovalo 10,69 g chloridu sodného, 8,36 g dihydrátu citrátu sodného a 45,504 g sacharosy. Tato sraženina se míchá ne méně než 45 minut při teplotě kolem 30 °C. Po upravení pH suspenze 1M kyselinou octovou na hodnotu 6,6 se suspenze odstřeďuje na Sorvallově odstředivce, model RC-3, rychlostí 4000 otáček za minutu při teplotě kolem 23 °C. Hmotnost získané sraženiny byla 11,6 g. Supematant z odstřeďování vykazoval zakalení 106 NTU a optickou hustotu 49,9 UA při 280 nm.

• «

Shora uvedený supematant byl vyčištěn filtrací pomocí CP-20 (Millipore). Získalo se tak 1730 g filtrátu s optickou hustotou 49,6 UA při 280 nm a se zakaleností 103 NTU.

Diafiltrace byla provedena ultrafiltračním zařízením s kazetami nominální molekulové sekce 3100 000 (tj. 3100 kDa) a celkovou plochou povrchu 1,39 m² zkonstruovaných z polyethersulfonu s nízkou kapacitou proteinové adsorpce (řada Omega od Pall-Filtron). Podmínky pro ultrafiltraci byly obvyklé pro tento typ operace, dodávaný tlak byl od 1,0 do 1,4 kPa a zadržený podíl byl menší než 0,5 kPa. Rychlost průtoku filtrátu při 23 °C byla přibližně 150 ml/minutu na počátku operace. Roztok byl podroben diafiltraci přidáním frakcí až do 6 objemů použitého dialyzačního roztoku a snížením objemu. Dialyzační roztok byl složen z 0,124M chloridu sodného a 0,02M citrátu sodného, pH 6,5 až 6,7.

Nakonec měl roztok produktu takovou koncentraci, že optická hustota při 280 nm byla 62,6 UA.

K části koncentrovaného konečného roztoku byly přidány různé koncentrace argeninu až 1, 2 a 3 % hmotn. Ke 240 ml tohoto roztoku bylo přidáno 3,0 ml terapeutického albuminu zahuštěného na 20 % hmton. Tento posledně uvedený roztok, stabilizovaný albuminem, byl rozdělen na dva podíly. K jednomu z nich byl přidán glycin až na koncentraci 0,1 Μ. K předchozím dvěma roztokům byly přidány různé koncentrace AMCHA tak, aby se získala konečná koncentrace 0, 1 a 2 % hmotn. Každý z roztoků, které měly různé složení, byl sterilován filtrací membránou PVDF (Durapore) s póry o velikosti 0,22 mm ve formě disků s průměrem 47 mm.

Byly odměřeny do skleněných ampulek o nominálním objemu 10 ml. Tyto ampulky byly zmrazený v boxu na teplotu přibližně -70 °C, potom byly lyofilizovány ve vysokém vakuu a konečná sušící operace byla prováděna při přibližně 37 °C po dobu ne menší než 24 hodin.

• · • ·

Lyofilizované ampulky byly resolubilizovány 5 ml vody pro injekci za teploty 35 až 37 °C, v každém případě byla získána koncentrace fibrinogenu vyšší než 60 mg/ml, což se projevuje na dobách rozpouštění lyofilizátu v tabulce 1.

Tabulka 1

arginin (% hmotn.)	AMCHA (% hmotn.)	glycin (molární)	doba rozpouštění (minuty)
1	0	0	28
2	0	0	18; 20(n=2)
3	0	0	20
0	0	0,1	>20;>20;20 (=:
0	1	0,1	15
0	2	0,1	4;4 (n=2)
0	1	0	>25;25 (n=2)
0	2	0	12

Poznámka: Všechny prostředky obsahovaly také 0,124M chlorid sodný a 0,02M citrát sodný, pH 6,5 až 6,7. Ty, které byly připraveny s AMCHA, obsahovaly až 0,5 % hmotn. albuminu.

Podle dob rozpouštění lyofilizovaných produktů ve vodě (5 ml) pň 35 až 37 °C skupina, která má AMCHA v prostředku, vyčnívá z ostatních. Koncentrace AMCHA pnbližně 2 % hmotn. poskytuje dobu rozpouštění 4 minuty, jestliže prostředek obsahuje také 0,1 M glycin, vedle chloridu sodného - citrátu sodného - albuminu.

Tyto výsledky ukazují, že je možné dosáhnout doby rozpouštění podstatně nižší než 20 minut, jestliže AMCHA a glycin jsou v základním prostředku chloridu • · · · sodného, citrátu sodného a 0,5% (hmotn.) albuminu přítomny. V nepřítomnosti AMCHA a/nebo giycinu se hodnoty těchto dob zřetelně zvýši.

Příklad 2

S cílem optimalizace podmínek prostředku produktu pro účinnou deaktivaci jakýchkoliv virů přítomných v konečné fibrinogenové sloučenině teplem, byly testovány různé koncentrace albuminu v konečném prostředku produktu, což stanoví isolaci fibrinogenu a doprovázejícího faktoru XIII.

Vyčištěný produkt obsahující fibrinogenový komplex byl zpracován jako v příkladu 1. Jeho prostředek byl upraven na konečnou koncentraci chloridu sodného 0,124 M, citrátu sodného 0,02 M, giycinu 0,1 M s různými množstvími albuminu, což vedlo ke koncentracím 0,4, 0,6 a 0,8 % hmotn. Když byl produkt lyofilizován, byl zahříván 1 hodinu na 100 °C.

Produkt před a po tepelném ošetření byl rozpuštěn v vodě a charakterizován kvantifikováním proteinu Bio-Rad. Stanovena byla také koagulovatelná aktivita fibrinogenu a faktoru XIII a doba rozpouštění materiálů.

Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

• · · · • · • · · ·· · ···· • · · · ·· · · · · · a a ···» ·· ·· ·* * · · a·· a · · a · · · aa · a· · ·· ··

Tabulka 2

prostředek; %	nezahřátý produkt	zahřátý produkt
albuminu	protein	fibri-	faktor	protein	fibri- protein
	(%)	nogen	XIII	(%)	nogen XIII
		(%)	(mj/ml)		(%) (mj/ml)
0,4	4,44	4,7	55,52	4,48	5,0 48,25
0,6	5,03	5,06	61,13	4,67	5,48 51,6
0,8	ND	5,22	44,18	ND	5,64 43,21

ND: znamená nestanoveno

Doba rozpouštění byla od 14 do 20 minut u nezahřátého produktu a byla ve všech případech po zahřátí produktu delší než 20 minut.

Isolace fibrinogenu a faktoru XIII v zahřátém produktu vzhledem k jeho obsahu v předchozím stupni, upravena na celkový obsah jeho proteinu, je uvedena v tabulce 3.

Tabulka 3

prostředek; % albuminu	isolace fibrinogenu (%)	isolace faktoru XIII (%)
0,4	105	86
0,6	117	91
0,6	108	98

• ·· · • ·

« · » « ♦ · · · • · · · • · · · • · · ·

Výsledky ve shora uvedených tabulkách 2 a 3 na jedné straně ukazují vysokou koncentraci faktoru XIII v lyofilizovaném koncovém materiálu, jakmile je regenerován vodou na koncentraci přibližně 5 % hmotn. fibrinogenu. Ve všech případech je aktivita faktoru XIII větší než 40 m.j./ml.

Na druhé straně hodnoty isolované aktivity, jak fibrinogenu tak faktoru XIII, které jsou produkovány aplikací tepelného ošetření, jsou uvedeny v tabulce 3. Z výsledků lze odvodit, že fibrinogen je dostatečně stabilní pň jakýchkoliv koncentracích albuminu v pňpraveném prostředku. Aktivita faktoru XIII je většinou během zahřívání zachována u těch prostředků, které měly studované koncentrace albuminu, tj. od 0,4 do 0,8 % hmotn. Existuje však jasné snížení aktivity faktoru XIII zahřátím, což odpovídá snížení koncentraci albuminu v prostředku.

Příklad 3

Byly zpracovány různé dávky vyčištěného fibrinogenového komplexu tak, že se získal žádaný konečný prostředek. Potom byl konečný prostředek lyofilizován a rozpuštěn.

Hmotnost výchozího materiálu vzatého z každé ze tří dávek vyčištěného fibrinogenového komplexu (č. 7006, 7007 a 7008) byla přibližně stejná, kolem 500 g v každém případě. Výchozí materiál byl zpracován nezávisle, jak je popsáno v příkladu 1, takže se získal lyofilizovaný konečný produkt. Byla připravena různá složmí konečného produktu, která jsou uvedena v tabulce 6. Získané výsledky týkající se doby rozpouštění lyofilizátu v době od vytvoření fibrinové sraženiny v přítomnosti trombinu (roztok nějakých 100 m.j./ml), zakalenosti rekonstituovaného lyofilizátu a doby gelovatění jsou uvedeny v tabulce 4.

φφφ φ « φ · φφφφ φφ · ♦ *· φφφ · φφφ · φφ φ φφ

Tabulka 4

zpra- covaná dávka v c.	prostř. (% AMCHA)	doba solubi- lizace (min) (n=3)	doba koagu- lace (sek)	zaka- lení (NTU) (n=2)	gelo- vatění (po 24 h)
7006	0	>20	11	56,5±0,6	ne
	1	13±2	16	48,2±0,7	ne
	2	4+1	16	38,7±0,1	ne
	2,5	9+1	16	34,7±3,9	ne
	3	7+4	21	34,7±1,7	ne
7007	0	>20()	ND	63, If)	ne
	1	>20f)	ND	53,9(‘)	ne
	2	8()	ND	47,9()	ne
	3	8()	ND	43,80	ne
7008	0	>20	9	79,3±0,7	ne
	1	>20	12	59,2+0,6	ne
	2	13+10	14	46,4±2,9	ne
	2,5	9+4	12	44,6+0,9	ne
	3	8+3	13	42,5±2,5	ne

() Jediné stanovení z jedné ampulky.

ND znamená nestanoveno

Poznámka: 1) Uvedené procento koncentrace AMCHA odpovídá roztoku před lyofilizací, měřením a rekonstitučnímu objemu 10 a 5 ml ve všech případech.

• · •9 9999 • 9 ·

9 9 9 9

9 9 9 9 9 • 9999999 9

9 9 9 9

2) Aby se stanovily doby tvorby fibrinové sraženiny, byly použity dvě různé dávky lidského trombinového přípravku, jedna aplikovaná na dávku zpracováni č. 7006, další na č. 7008.

ND znamená nestanoveno

Průměrné výsledky doby rozpouštění tří zpracovaných dávek pro každý prostředek jsou souhrnně uvedeny v tabulce 5.

Tabulka 5

prostředek (% AMCHA)	doba rozpouštění (minuty; x±SD; n=3)
0	>20
1	>20
2	8,3±4,5
2,5	9,0±0,6
3	7,7±0,6

Shora uvedené výsledky ukazují, že prostředek produktu s AMCHA významně snižuje dobu rozpouštění, jestliže koncentrace solubilizačního činidla je v rozmezí od 2 do 3 % hmotn. Přidání solubilizačního činidla také podporuje významné snížení zakalenosti rekonstituovaného roztoku i při koncentraci 1 % hmotn. (u měřeného roztoku), minimální hodnota se téměř dosáhne, jestliže koncentrace je 2,5 nebo více % hmotn. Přítomnost AMCHA nesnižuje dobu gelovatění (negativní hodnota po 24 hodinách u vzorků v roztoku) a doba koagulace s trombinem je poněkud větší u přípravků obsahujících AMCHA při srovnání s jejich kontrolou při 0 % hmotn.

• <* • · · • ·♦·· ·· ··«· • · · • · · ·· · • · · · • · · * • · · · • · · · • · · · • · ··

Příklad 4

V tomto aplikačním příkladu jsou uvedeny deaktivace virů teplem a jejich vliv na některé vlastnosti produktu.

Lyofilizované ampulky skupin různých prostředků uvedených v předcházejícím příkladu 3 byly použity jako výchozí materiál. Byly použity pro tepelné ošetření, které je účinné pro deaktivaci některých virů bez obálky. Pro tento účel byly vloženy do horkovzdušné trouby při takové teplotě, aby ampulky dosáhly teploty 100 až 102 °C během 50 minut (ampulky s kontrolní sondou) a byly ponechány za termostatické regulace pň této teplotě přesně jednu hodinu. Okamžitě potom byly v okolním prostředí chlazeny, dokud nedosáhly teplotu místnosti.

Získané výsledky, které se týkaly doby rozpouštění lyofilizátu, doby tvoření trombinu fibrinové sraženiny v přítomnosti trombinu (kolem 250 až 500 m.j./ml), zakalenost rekonstituovaného lyofilizátu a doby gelovatění jsou uvedeny v tabulce 6.

• 9 99 · 9 9 9

9 9 9

9 9 9 ·

9 9 9

99 • 9 9 • 9 9 9 • 9 999« · • 99

9 9

9 ··»♦

9«

Tabulka 6

zpra- covaná dávka č.	prostř. (% AMCHA)	doba solubi- lizace (min)	doba koagu- lace (sek)	zaka- lení (NTU)	gelo- vatění (po 24 h)
7006	0	>20	7,5±0,7	64,2±2,9	ano
		(n=2)	(n=2)	(n=2)
	1	>17	8,5±0,7	55,3+0,1	ne
		(n=2)	(n=2)	(n=2)
	2	10±2	9,0±0,7	47,1 ±0,8	ne
		(n=2)	(n=2)	(n=2)
	2,5	9+1	11,0±1,4	40,1 ±3,4	ne
		(n=2)	(n=2)	(n=2)
	3	11±4	13,5±0,7	44,2±2,5	ne
			(n=2)	(n=2)
7007	0	>20	ND	ND	ano
	1	>20	ND	56,6	ne
	2	14	12,5±0,7	51,0±1,7	ne
			(n=2)	(n=2)
	3	8	12	50,8	ne
7008	0	>20(n=2)	12	ND	ano
	1	>20(n=2)	ND	ND	ano
	2	13+1	7,5±0,7	66,1 ±0,1	ne
		(n=2)	(n=2)	(n=2)
	2,5	15±7(n=2)	12	49,0	ne
	3	15	11,5±0,7	47,7±4,4	ne
			(n=2)	(n=2)

»« ··· • · · · • · · ♦ · » • * * ·· · • 9 · ♦ · · · • · · · · · · • · · 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 · · · 99

Poznámka: 1) Uvedené procento koncentrace AMCHA odpovídá roztoku před lyofilizaci, měřením s rekonstitučním objemem 10 a 5 ml ve všech případech.

2) Aby se stanovily doby tvorby fibrinové sraženiny, byly použity dvě různé dávky lidského trombinového přípravku, jedna aplikovaná na dávku zpracování č. 7006, další na č. 7008.

ND znamená nestanoveno

Průměrné výsledky doby rozpouštění každého z různých prostředků všech připravených dávek jsou souhrnně uvedeny v tabulce 7.

Tabulka 7

prostředek (% AMCHA)	doba rozpouštění (minuty; x±SD; n=3)
0	>20
1	>17
2	12,3±2,1
2,5	12,0±4,2
3	11,3±3,5

Výsledky získané u dokončeného konečného produktu po deaktivaci teplem potvrzují možnost provedení tohoto ošetření v konečném stupni, to znamená, jestliže je produkt převeden na prostředek a zabalen. Nutné koncentrace solubilizačního činidla jsou s výhodou od 2 do 3 % hmotn. (u měřeného roztoku), protože v tomto rozmezí nebyly pozorovány žádné významné rozdíly mezi koncentracemi, pokud jde o ·· 9 9» ···· >· • 9 · 9 9 · · • 99« ·♦ · 9

9999*99 9 · · ·

9 9 9 ·9 *

9 99 « 99 dobu solubilizace nebo zakalenost solubilizovaného materiálu. Podobně lze z těchto výsledků odvodit, že zahřívání stěží ovlivňuje dobu solubilizace, která je prodloužena o 3 až 5 minut pň srovnání s nezahřívaným produktem v prostředcích, které obsahují 2 až 3 % hmotn. AMCHA.

Zdá se, že zahřívání podporuje gelovatění sloučeniny snížením užitečné doby v kapalném stavu, jestliže koncentrace AMCHA je 1 nebo méně % hmotn, Zakalenost produktu není zvýšena jako důsledek zahřívání za popsaných podmínek zpracování.

Claims (6)

1. Použití tranexamové kyseliny pro výrobu prostředku lidského fibrinogenu získaného z lidské plasmy nebo způsoby rekombinantní nebo transgenní technologie se současným přidáním lidského albuminu, aby se snížila doba rozpouštění, když se přidá fysiologicky slučitelný roztok.

2. Lidský fibrinogenový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že koncentrace tranexamové kyseliny je s výhodou od 2 do 8 % hmotn., výhodněji od 4 do 5 % hmotn., jakmile je produkt rozpuštěn, a že viry v prostředku jsou deaktivovány působením tepla.

3. Lidský fibrinogenový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že koncentrace většiny proteinů přípravku, jakmile je uveden do roztoku, je od 0,5 do 1,5 % hmotn. v případě albuminu a od 6 do 8 % hmotn. v případě fibrinogenu a že prostředek obsahuje ne méně než 70 % hmotn. koagulovatelného proteinu vzhledem k celkovému proteinu.

4. Lidský fibrinogenový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že koncentrace glycinu v rozpuštěném konečném produktu je od 0,1 do 0,4 M.

5. Lidský fibrinogenový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že koncentrace solných citrátových solí, jakmile je produkt uveden do roztoku, je od 0,1 do 0,4 M u chloridu sodného a od 0,02 do 0,1 Mu citrátu sodného.

6. Lidský fibrinogenový prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že deaktivace virů teplem se provádí za teploty od 80 do 115 °C u vysušeného konečného produktu po dobu od 5 minut do 100 hodin a rozpuštění ve vodném prostředí se provádí za méně než 20 minut, s výhodou 2 až 15 minut, pň výhodné teplotě od 35 do 37 °C.