CN104105502A - 制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法以及通过使用其制备纤维蛋白封闭剂的方法 - Google Patents

制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法以及通过使用其制备纤维蛋白封闭剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法，和制备包含所述高度浓缩的纤维蛋白原溶液和因子XIII的纤维蛋白封闭剂组分1的方法。更具体地，根据本发明的制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法可通过向从人血浆分离的低度浓缩的纤维蛋白原溶液加入氨基酸或氨基酸衍生物和/或盐等并使用超滤法高度浓缩纤维蛋白原制备，并且为了在纤维蛋白封闭剂产品中使用的纤维蛋白封闭剂组分1可通过在制备所述高度浓缩的纤维蛋白原的方法中的超滤前或超滤后加入因子XIII制备。通过根据本发明的方法制备的纤维蛋白封闭剂组分1可在液态下冷冻保存，在室温保存很长时间，以及立即应用于治疗而无需进行重构过程。另外，本发明涉及由所述纤维蛋白封闭剂组分1和纤维蛋白封闭剂组分2(其为填充在单独的容器中的包含凝血酶和氯化钙的溶液)配置的纤维蛋白封闭剂产品。根据本发明的纤维蛋白封闭剂产品可以其中所述纤维蛋白封闭剂组分1和纤维蛋白封闭剂组分2被分别填充在单独的瓶中的瓶型，或者其中所述纤维蛋白封闭剂组分1和纤维蛋白封闭剂组分2被填充在彼此连接的单独的注射器中从而可立即使用的预填充型提供。

Description

制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法以及通过使用其制备纤维蛋白封闭剂的方法
技术领域
本发明涉及制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法和制备包含所述高度浓缩的纤维蛋白原溶液和因子XIII的纤维蛋白封闭剂组分1的方法。更具体地，根据本发明的制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法，其特征在于，向从血浆分离的低度浓缩的纤维蛋白原溶液加入氨基酸或氨基酸衍生物、盐类等，然后使用超滤方法由此制备高度浓缩的纤维蛋白原。制备用于纤维蛋白封闭剂产品的纤维蛋白封闭剂组分1的方法，其特征在于，在制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法中的超滤前或超滤后加入因子XIII。此处，根据本发明的纤维蛋白封闭剂组分1优选为溶液态。
通过根据本发明的方法制备的纤维蛋白封闭剂组分1可在液态下冷冻，在室温下保存以进行长时间的存储，并立即应用于处理而不进行重构(reconstitution)过程。
另外，本发明涉及由所述纤维蛋白封闭剂组分1和纤维蛋白封闭剂组分2(其为填充在单独的容器中的包含凝血酶和氯化钙的溶液)配置的纤维蛋白封闭剂产品。根据本发明的纤维蛋白封闭剂产品可以其中所述纤维蛋白封闭剂组分1和纤维蛋白封闭剂组分2被分别填充在单独的瓶中的瓶型，或者以其中所述纤维蛋白封闭剂组分1和纤维蛋白封闭剂组分2被填充在彼此连接的单独的注射器中从而可立即使用的预填充型提供。
背景技术
纤维蛋白封闭剂(fibrin sealant)，其被称为纤维蛋白胶或纤维蛋白组织粘合剂，使用人体血液凝结机制。更具体地，血液凝结通过血液凝结因子的链反应进行，并且纤维蛋白原、因子XIII和凝血酶等等参与所述凝结途径的最终步骤。此处，所述纤维蛋白封闭剂使用因子XIII、纤维蛋白原、氯化钙和凝血酶被混合以形成纤维蛋白聚合物的原理，并且这个时候，因子XIII用于交联所述纤维蛋白聚合物，这样所述纤维蛋白聚合物被转化为不能溶解的纤维蛋白聚合物。
所述纤维蛋白封闭剂将上文描述的血液凝结机制应用到粘合剂。也就是说，所述纤维蛋白封闭剂是基于当创伤等发生在组织时，纤维蛋白原与来自创伤组织周围的毛细血管的血液组分一起释放以形成纤维蛋白，从而粘合到所述创伤的周边的原理。用于治疗目的比如粘合到组织和止血的纤维蛋白封闭剂的应用(对愈合创伤等起支撑作用)已在不断扩展。所述纤维蛋白封闭剂除了具有物理优势比如快速粘合、不受粘附性部分的湿度的影响等，还具有生物学优势比如没有血小板凝固障碍、极好的组织相容性以及适当的吸收等，这样使得所述纤维蛋白封闭剂已作为下一代医用粘合剂而备受关注。
基于上文所述的纤维蛋白封闭剂的优势使用所述纤维蛋白封闭剂的粘合作用的外周神经缝合、微血管缝合上的纤维蛋白封闭剂的临床研究已在欧洲进行，并且在日本所述纤维蛋白封闭剂已作为外科粘合剂而用于血管外科、外科、神经外科手术、骨的粘合等。
为了制备该纤维蛋白封闭剂，最初，在欧洲将凝血酶(其为纤维蛋白组分之一)从牛血浆分离以供使用(专利文献1，美国注册专利第4627879号)，但是由于安全问题等而在欧洲以外不销售。另外，尽管已开发出使用自体血的纤维蛋白封闭剂制剂(参见美国专利第4714457号，美国专利第5030215号等)，然而由于需要采血过程和另外的制作过程，临床使用它还是很不方便。
因此，在要进行商业销售的从人血浆制备的纤维蛋白封闭剂中，针对病毒的安全应该是有保证的，并且临床使用应该是便利的。
最近，作为纤维蛋白封闭剂，冷冻干燥型纤维蛋白封闭剂和冷冻液型纤维蛋白封闭剂也被推向市场。在所述冷冻干燥型纤维蛋白封闭剂中，由于纤维蛋白原的分解时间长并且需要相当长的时间进行重构，所以其不便在于所述冷冻干燥的纤维蛋白封闭剂应被迅速使用。另一方面，所述冷冻液产品相对于所述冷冻干燥型产品的优势在于其实际使用需要相当短的时间。代表性的产品为Tisseel(BaxterHealthcare Corp.)。Tisseel作为可在液态下被冷冻的预填充型产品，即，可立即注射的现成注射形式的产品而在售，并且预计作为大大减少使用的制备时间的产品。
然而，在所述冷冻液产品的情况中，存在为了去除来源于血液的任何病毒应进行溶剂/去垢剂(S/D)处理和使用蒸汽的热处理的缺点(参见美国专利第5962405号和Tisseel数据(www.baxter.com))。
特别地，存在不便在于，为了使用蒸汽进行热处理，冷冻干燥应在工艺中间进行(参见欧洲专利公开号345246和欧洲专利公开号159311)。另外，自为获得高度浓缩的纤维蛋白原使用冷冻干燥纤维蛋白原以分解纤维蛋白原的方法以来，存在不便在于，为获得对于制备纤维蛋白封闭剂所需的具有高浓度，特别是70mg/ml或更高的浓度的纤维蛋白原溶液，应进行所述冷冻干燥工艺。
已迫切需要能够解决如上文所述当前使用的制备纤维蛋白封闭剂的工艺中的问题并且更经济和容易地制备所述纤维蛋白封闭剂的技术，特别是，能够更经济、容易和高度浓缩纤维蛋白原以制备所述纤维蛋白封闭剂的技术。
相关技术文献
专利文献
(专利文献1)美国专利第4627879号：Fibrin adhesive prepared as a concentratefrom single donor fresh frozen plasma,授予:1986年12月9日,专利权人:Rose等。
(专利文献2)美国专利第4714457号：Method and apparatus for use inpreparation of fibrinogen from a patients blood,授予:1987年12月22日,专利权人:Alterbaum。
(专利文献3)美国专利第5030215号：Preparation of fibrinogen/Factor XIIIprecipitate，授予:1991年7月9日,专利权人:Morse等。
(专利文献4)美国专利第5962405号：Storage-stable fibrinogen preparations,授予:1999年10月5日,专利权人:Seelich。
发明内容
技术问题
为了解决这些问题，本发明人进行了持续的研究并开发出制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液和能够确保对来源于人血浆的病毒的安全性并被用于制备可在室温保存和在液态下冷冻，无需冷冻干燥工艺，的纤维蛋白封闭剂产品的纤维蛋白封闭剂组分1的方法，从而完成本发明。
技术方案
在一个总的方面，提供了通过向低度浓缩的纤维蛋白原溶液加入氨基酸或氨基酸衍生物，和/或盐等并通过超滤工艺浓缩所述纤维蛋白原溶液而制备高度浓缩的纤维蛋白原的方法，以及此外，除了上文提到的方法外进一步包括加入因子XIII的制备纤维蛋白封闭剂组分1的方法，以及制备纤维蛋白封闭剂的方法。
以下，将详细描述本发明。
尽管本领域中已知由于纤维蛋白原溶液的高粘度使得使用超滤高度浓缩纤维蛋白原是不可能的，但是本发明人发现在其中氨基酸或氨基酸衍生物，和/或盐等被加入包含纤维蛋白原的溶液的情况下，所述溶液的粘度显著降低，这样使得所述超滤可容易地应用。也就是说，在根据本发明的制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法中，向从血浆获得的低度浓缩的纤维蛋白原溶液加入氨基酸或氨基酸衍生物，和/或盐等，然后进行超滤工艺。
在本发明中，术语“低度浓缩的纤维蛋白原溶液”，其为使用冷冻沉淀法通过分离从人血浆冷冻沉淀的材料并通过进行众所周知的工艺比如使用溶剂/去污剂等的病毒灭活方法，阴离子色谱法，甘氨酸沉淀法等获得的溶液，意为没有通过超滤工艺浓缩的溶液。所述低度浓缩的纤维蛋白原溶液中的纤维蛋白含量可小于40mg/ml，并且优选地，为35mg/ml或更少。
例如，所述低度浓缩的纤维蛋白原溶液可通过加入乙醇、硫酸铵、β丙氨酸/甘氨酸、聚合物(聚乙二醇)和具有低度离子化的溶液中的一种而以相对高的产量沉淀均匀的纤维蛋白原，以及使用比如离子交换色谱法、亲和色谱法等但不限于此的方法额外地纯化所沉淀的纤维蛋白原而以高纯度获得。
在本发明中，术语“高度浓缩的纤维蛋白原溶液”意为通过使用超滤方法浓缩低度浓缩的纤维蛋白原溶液而获得的纤维蛋白原溶液。所述高度浓缩的纤维蛋白原溶液中的纤维蛋白原含量并无特别限制，只要所述含量高于能够应用于所述纤维蛋白封闭剂产品的预定浓度。然而，所述含量可高于40mg/ml，优选高于70mg/ml，并且更优选为100至120mg/ml。
能够被加入用于超滤所述低度浓缩的纤维蛋白原溶液的氨基酸或氨基酸衍生物并无特别限制，但是优选地可为选自由甘氨酸、异亮氨酸、L-谷氨酸钠和L-精氨酸盐酸盐组成的组中的至少一种，并且能够被加入用于超滤所述低度浓缩的纤维蛋白原溶液的盐类并无特别限制，但是优选地可为氯化钠或柠檬酸钠。该氨基酸或氨基酸衍生物以及盐在浓缩纤维蛋白溶液期间或在制备后储存高度浓缩的纤维蛋白溶液期间防止由于纤维蛋白的高浓度而导致的自发凝结，从而有助于增加高度浓缩的纤维蛋白原溶液的溶解度和稳定性。
至于在根据本发明的高度或低度浓缩的纤维蛋白原溶液中包含的氨基酸或氨基酸衍生物和盐，优选地，异亮氨酸可具有10至70mM、优选地40至50mM的浓度，L-谷氨酸钠可具有10至50mM、优选地20至30mM的浓度，L-精氨酸盐酸盐可具有5至30mM、优选地10至20mM的浓度，甘氨酸可具有50至200mM、优选地100至150mM的浓度，柠檬酸钠可具有10至30mM的浓度，并且氯化钠可具有100至200mM的浓度，并且至少一种材料可选自具有如上所述浓度的氨基酸或氨基酸衍生物以及盐类并且被加入。
根据本发明的所述高度或低度浓缩的纤维蛋白原溶液可具有5至9、优选地6至8，并且更优选7至8的pH。
至于能够用于本发明中的超滤的膜，可没有限制地使用任何膜，只要所述膜可选择性地过滤纤维蛋白原。例如，膜可由改良型的聚醚砜或纤维素材料制成，但不限于此。为了制备本发明中的高度浓缩的纤维蛋白原溶液而用于超滤的膜的截留值(cut-off value)可为50至300kDa，并且更优选地，为80至150kDa。改良型的聚醚砜或纤维素意为其中部分聚醚砜或纤维素由具有特定功能的取代基等取代的形式。作为该膜的具体实例，Biomax或Ultracel(Millipore corp.),Centrasette(Pall Corp.),Sartocon(Satorius Corp.)等等可被使用。产品的材料和特性示于下面的表1。
表1、能够被用于超滤的膜和其特性
为了获得高度浓缩的纤维蛋白原溶液的低度浓缩纤维蛋白原溶液的超滤可在10至37℃，并且优选地，在15至30℃进行，并且所述超滤并无特别限制，但是可在2小时之内进行，并且优选为10至90分钟。
进一步地，在制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法中，为了去除病毒污染风险和增加安全性，可在超滤前进行热处理工艺。
在所述热处理时，所述溶液中包含的蛋白(纤维蛋白原，因子XIII等)的浓度，稳定剂的成分和浓度是重要的。也就是说，所述蛋白可具有基于整个溶液的1至5mg/ml，优选地，2至4mg/ml的浓度，并且作为所述稳定剂，糖类比如白糖等可为优选的，但并不限于此。另外，所述热处理可在40至90℃，优选地在50至70℃，并且更优选地在55至65℃进行2至20小时，优选5至15小时，并且更优选7至12小时。进一步地，为了增加热处理的稳定性，额外的稳定剂比如甘氨酸等可额外地加入。为了去除热处理后产生的杂质和所述稳定剂，可使用一般的分离和纯化方法比如阴离子色谱法等。
在另一个总的方面，提供了制备所述纤维蛋白封闭剂成分1的方法，包括在制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法中加入因子XIII等，以及由所述方法制备的纤维蛋白封闭剂成分1。
在本发明中，术语“纤维蛋白封闭剂组分1”，其为当提供由凝血酶和氯化钙配置的纤维蛋白封闭剂组分2时可立即作为纤维蛋白封闭剂产品使用的溶液，意为其中包含纤维蛋白原、因子和其它必要成分的溶液。
根据本发明的制备纤维蛋白封闭剂组分1的方法进一步包括在制备高度浓缩的纤维蛋白原的方法中在超滤前或超滤后额外地加入因子XIII。也就是说，因子XIII可在用于制备高度浓缩的纤维蛋白原的超滤前加入低度浓缩的纤维蛋白原溶液中，或在所述超滤后加入高度浓缩的纤维蛋白原溶液中。
考虑到纯化和病毒灭活的容易性，将因子XIII在超滤前加入低度浓缩的纤维蛋白原溶液以被用于制备纤维蛋白封闭剂组分1可能是优选的，并且在其中将因子XIII在超滤后加入高度浓缩的纤维蛋白原溶液以被用于制备纤维蛋白封闭剂组分1的情况中，比如病毒灭活等的处理可在加入的因子XIII等上预先进行。在其中将因子XIII在超滤前加入低度浓缩的纤维蛋白原溶液以经受热处理工艺(其为病毒灭活工艺)的情况中，在所述热处理时在优选浓度的蛋白中的蛋白预计包括纤维蛋白原和因子XIII。
在根据本发明的制备纤维蛋白封闭剂组分1的方法中，在高度浓缩的纤维蛋白原溶液中，因子XIII和纤维蛋白原的混合比可优选为0.1至0.8IU，优选地，0.7至0.8IU每1mg的纤维蛋白原。在本发明中，为了制备所述纤维蛋白封闭剂组分1而使用的因子XIII可来自使用众所周知的工艺比如沉淀、热变性、病毒灭活、阴离子色谱法等从人血浆通过乙醇沉淀获得的馏分I(Fraction I)的沉淀物。
另外，根据本发明的制备纤维蛋白封闭剂组分1的方法可包括在超滤后向包含因子XIII的高度浓缩的纤维蛋白原溶液中加入选自由抑肽酶、去垢剂比如吐温系列(吐温20、吐温80等)和白蛋白组成的组的至少一种材料。
抑肽酶可以100至5000KIU/mL，优选地200至3000KIU/mL的浓度被包含在所述纤维蛋白封闭剂组分1中，白蛋白可以2至50mg/mL，优选地5至30mg/mL的浓度包含其中，并且所述去垢剂比如吐温系列(吐温20、吐温80等)可以0.01至0.05重量％，优选地0.02至0.04重量％的浓度被包含其中。
随着根据本发明的制备纤维蛋白封闭剂组分1的方法，可在不进行冷冻干燥工艺等的情况下提供能够在液态下冷冻的所述纤维蛋白封闭剂组分1。另外，在由根据本发明的方法制备的纤维蛋白封闭剂组分1中，去除病毒的工艺被包括在所述制备工艺中，这样使得不会发生由来源于血液的病毒引起的问题并且所述纤维蛋白封闭剂组分1可在4至25℃保存2至8个月以及在-18℃或更低温保存超过24个月。根据本发明的最终的纤维蛋白封闭剂组分1可具有6.0至9.0，优选地，7.0至8.0的pH。
在另一个总的方面，提供了包含根据如上文所述的方法制备的纤维蛋白封闭剂组分1的纤维蛋白封闭剂产品和其方法。
根据本发明的纤维蛋白封闭剂产品可通过向由如上文所述的方法制备的纤维蛋白封闭剂组分1提供填充在单独的容器中的包含凝血酶和氯化钙的纤维蛋白封闭剂组分2制备，并且根据本发明的纤维蛋白封闭剂产品可以其中所述纤维蛋白封闭剂组分1和包含凝血酶和氯化钙的纤维蛋白封闭剂组分2被分别填充在单独的瓶中的瓶型，或者以其中所述纤维蛋白封闭剂组分1和纤维蛋白封闭剂组分2被填充在彼此连接的单独的注射器中从而可立即使用的预填充型(见图2)提供，但不限于此。另外，本领域技术人员将理解，通常在本领域使用的所有类型均被包括在本发明的所附权利要求中，只要它们满足本发明的目标。
包含凝血酶和氯化钙的纤维蛋白封闭剂组分2可包含4至1200IU/ml、优选400至600IU/mL的凝血酶和20至60mM、优选30至50mM的氯化钙。
在根据本发明的纤维蛋白封闭剂产品中，白蛋白可额外地被包括在填充在单独的容器中的纤维蛋白封闭剂组分2中。填充在单独的容器中的纤维蛋白封闭剂组分2包含5至100mg/mL、优选10至50mg/mL的白蛋白。
更具体地，制备纤维蛋白封闭剂产品的方法的实例包括：
(1)使用冷冻沉淀法沉淀人血浆；
(2)从所沉淀的馏分获得低度浓缩的纤维蛋白原溶液；
(3)从使用所述冷冻沉淀法沉淀的人血浆的上清液获得因子XIII；
(4)向低度浓缩的纤维蛋白原溶液中加入因子XIII、氨基酸和/或盐并进行超滤以获得包含因子XIII的纤维蛋白封闭剂组分1；以及
(5)向所述纤维蛋白封闭剂组分1提供填充在单独的容器中的纤维蛋白封闭剂组分2。
在上文的方法中，本领域技术人员将理解，步骤(2)和步骤(3)可以改变的顺序进行，以及热处理步骤可在进行超滤前额外地进行。
更具体地，制备纤维蛋白封闭剂产品的方法的另一个实例包括：
(1’)使用冷冻沉淀法沉淀人血浆；
(2’)从所沉淀的馏分获得低度浓缩的纤维蛋白原溶液；
(3’)从使用所述冷冻沉淀法沉淀的人血浆的上清液获得因子XIII；
(4’)向低度浓缩的纤维蛋白原溶液中加入氨基酸和/或盐并进行超滤以获得高度浓缩的纤维蛋白原溶液；
(5’)向所获得的高度浓缩的纤维蛋白原溶液加入因子XIII等以获得纤维蛋白封闭剂组分1；以及
(6)提供所述纤维蛋白封闭剂组分1和填充在单独的容器中的纤维蛋白封闭剂组分2。
在上文的方法中，本领域技术人员将理解，步骤(2)和步骤(3)可以改变的顺序进行，以及热处理步骤可在进行超滤前额外地进行。
有益效果
如上文所列举的，随着根据本发明的使用超滤制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法，能够被用于制备纤维蛋白封闭剂的高度浓缩的纤维蛋白原溶液可不同于现有方法在不进行冷冻干燥工艺的情况下经济、有效和快速地获得。
另外，由于使用由如上文所述的方法制备的高度浓缩的纤维蛋白原溶液制备的纤维蛋白封闭剂组分1和纤维蛋白封闭剂产品可以液态提供从而可立即使用而无需重构操作，所以所述纤维蛋白封闭剂组分1和纤维蛋白封闭剂产品可便于临床使用，在室温保存很长时间，并且在冷冻保存的情况下保存至少24个月。
附图说明
从下面的结合附图给出的优选实施方案的描述中，本发明的上述和其它目标、特征和优势将变得显而易见，其中：
图1为说明制备包含因子XIII的高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法的视图。
图2为说明根据本发明的纤维蛋白封闭剂产品中的预填充型产品的视图。
图3A和3B为商业销售的冷冻干燥型纤维蛋白封闭剂产品和根据本发明的液体型纤维蛋白封闭剂产品的电子显微镜照片：
(a)商业销售的冷冻干燥型产品；以及
(b)根据本发明的液体型纤维蛋白封闭剂。
最佳实施方式
实施例1：高度浓缩的纤维蛋白原溶液的制备
本发明中的低度浓缩的纤维蛋白原溶液和因子XIII从人血浆分离和制备。首先，在将冷冻沉淀物从所述人血浆分离后，使用冷冻沉淀法、病毒灭活法(使用溶剂/去垢剂(S/D)处理方法)、阴离子色谱法、甘氨酸沉淀法制备纤维蛋白原沉淀物(见图1)。
在从人血浆去除所述冷冻沉淀物后，通过柠檬酸盐沉淀工艺、所述S/D处理工艺、阴离子色谱工艺和浓缩工艺从由乙醇沉淀获得的馏分I制备因子XIII后，将所述纤维蛋白原沉淀溶解和混合，然后进行热处理(10小时，在60℃)，其为病毒灭活工艺、阴离子色谱工艺、透析浓缩工艺，这样使得低度浓缩的纤维蛋白原溶液具有大约40mg/mL的蛋白浓度并包含因子XIII(见图1)。
其中氨基酸被加入包含因子XIII的低度浓缩的纤维蛋白原溶液的情况和其中氨基酸没有被加入其的情况是分开的，分别进行超滤。
在其中氨基酸被加入的情况中，包含因子XIII的低度浓缩的纤维蛋白原溶液在pH7.5包含50mM的异亮氨酸、30mM的L-谷氨酸钠、20mM的L-精氨酸盐酸盐、150mM的甘氨酸、20mM的柠檬酸钠、150mM的氯化钠和30mg/mL的蛋白(因子XIII和纤维蛋白原)，并且在其中氨基酸不被加入的情况中，包含因子XIII的低度浓缩的纤维蛋白原溶液在pH7.5包含20mM的柠檬酸钠、150mM的氯化钠和30mg/mL的纤维蛋白原。在所有的情况中，所述溶液具有7.5的pH值。
高度浓缩的纤维蛋白原溶液和纤维蛋白封闭剂组分1通过超滤制备。此处，BiomaxTM(Millipore Corp.)作为用于超滤的膜使用，并且使用Pellicon2mini-cassettes(50至100kDa，0.1㎡，A，C和V型)。
所述超滤在其中溶液进入超滤膜的一侧的压力维持在1至2巴(bar)的状态下进行。
作为结果，据确认，在其中氨基酸比如异亮氨酸、L-谷氨酸钠、L-精氨酸盐酸盐、甘氨酸等(其为稳定剂)被包含的情况中，具有最大量140mg/mL的因子XIII的高度浓缩的纤维蛋白原溶液在2小时内获得，乃至在其中纤维蛋白原被高度浓缩的情况下，也不发生自发凝结，如表2所示。
表2、根据超滤膜和稳定剂加入的纤维蛋白原的浓缩效率
实施例2：根据温度保存条件的纤维蛋白封闭剂组分1的稳定性
将10mg/mL的白蛋白、1000KIU/mL的抑肽酶、Tween80与根据实施例1制备的高度浓缩的纤维蛋白原溶液混合，这样制备纤维蛋白封闭剂组分1。
将所制备的纤维蛋白封闭剂组分1使用0.2μm过滤器通过过滤杀菌以填充在1mL注射器中，这样根据保存条件确认稳定性。用于本实验的纤维蛋白封闭剂组分1包含88mg/mL的纤维蛋白原和65IU/mL的因子XIII。
测量凝结纤维蛋白原蛋白的时间减少10％作为保存期限，从而评估稳定性。
作为结果，据观察，根据本发明的包含因子XIII的纤维蛋白封闭剂组分1可在-18℃稳定地保存至少24个月以及在25℃保存多达6个月(见表3)。
表3、根据保存条件的纤维蛋白封闭剂组分1的稳定性
实施例3：纤维蛋白封闭剂产品的制备
向实施例2中制备的纤维蛋白封闭剂组分1提供填充在单独的容器中的包含凝血酶和氯化钙的纤维蛋白封闭剂组分2以制备纤维蛋白封闭剂产品，以及最后，将两种溶液彼此混合，这样纤维蛋白聚合物形成并可用于医学目的等。在填充在单独容器中的纤维蛋白封闭剂组分2中，包含500IU/mL的凝血酶和40mM的氯化钙，并可额外加入40mg/mL的白蛋白。
实施例4：纤维蛋白封闭剂的电子显微镜观察
为了比较和确认根据实施例3制备的纤维蛋白封闭剂产品形成纤维蛋白聚合物时和商业销售的用于治疗目的的冷冻干燥型纤维蛋白封闭剂(Greenplast1mLkit,Green Cross Corp.)形成纤维蛋白聚合物时的物理性质，进行扫描电子显微镜观察实验。
在本实验中使用的扫描电子显微镜为场发射扫描电子显微镜(FESEM,设备:Supra55vp,Carl Zeiss,德国)。作为结果，根据本发明的纤维蛋白封闭剂产品的凝结纤维蛋白的物质具有其中纤维蛋白象一束线一样被缠结的网状，类似于商业销售的冷冻干燥的纤维蛋白封闭剂的那个，如图3A和3B所示。
实施例5：纤维蛋白封闭剂的毒性测试
为了测试根据实施例3制备的纤维蛋白封闭剂产品的毒性，使用两个物种，即SD大鼠和兔子。设置在其中使用比根据本发明制备的纤维蛋白封闭剂产品的预期的最大临床剂量高5倍的低剂量组(0.5mL/kg)和在其中使用比其预期的最大临床剂量高50倍的高剂量组(5mL/kg)，并且在单剂量皮下施用后评估毒性反应。在向所有雌性和雄性SD大鼠和兔子施用测试材料14天后，进行一般症状、体重、采食量、血液学检测、尸体解剖、组织病理学检测，并将数据进行统计学处理。
作为使用雌性和雄性大鼠和兔子的毒性测试结果，所有的大鼠和兔子都没有死亡，并且没有观察到测试材料的施用对体重、采食量和血液学检测的影响。在一般症状中，在测试材料施用组的施用位点观察到硬结，并且在尸体解剖和组织病理学检测中，除了异物反应以外，在所有的器官和组织中均没有观察到异常。因此，在SD大鼠和兔子中在多达5mL/kg的剂量没有观察到测试材料的毒性效应，并且可以理解，在雌性和雄性大鼠和兔子中的原理致死剂量(schematic lethal dose)均高于5mL/kg。

Claims (21)

1.一种通过向低度浓缩的纤维蛋白原溶液加入氨基酸或氨基酸衍生物和盐并进行超滤以浓缩纤维蛋白原以制备高度浓缩的纤维蛋白原溶液的方法。
2.如权利要求1所述的方法，其中，氨基酸或氨基酸衍生物为选自由甘氨酸、异亮氨酸、L-谷氨酸钠和L-精氨酸盐酸盐组成的组的至少一种。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述盐为柠檬酸钠或氯化钠。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其中，所述低度或高度浓缩的纤维蛋白原具有5至9的pH。
5.如权利要求1至3任一项所述的方法，其中，所述超滤使用具有50至300kDa的截留值的改良的聚醚砜膜或纤维素膜进行。
6.如权利要求1至3任一项所述的方法，其中，所述超滤在15至30℃进行。
7.一种制备纤维蛋白封闭剂组分1的方法，包括：
向低度浓缩的纤维蛋白原溶液加入氨基酸或氨基酸衍生物和盐；
进行超滤以获得高度浓缩的纤维蛋白原溶液；
加入选自由抑肽酶、去垢剂和白蛋白组成的组的至少一种材料；以及
在进行所述超滤前或后加入因子XIII。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述加入因子XIII在进行所述超滤前进行。
9.如权利要求7所述的方法，其中，因子XIII被加入以致在高度浓缩的纤维蛋白原溶液中每1mg的纤维蛋白原为0.1至0.8IU。
10.如权利要求7所述的方法，其中，氨基酸或氨基酸衍生物为选自由甘氨酸、异亮氨酸、L-谷氨酸钠和L-精氨酸盐酸盐组成的组的至少一种。
11.如权利要求7所述的方法，其中，所述盐为柠檬酸钠或氯化钠。
12.如权利要求7所述的方法，其中，所述低度或高度浓缩的纤维蛋白原具有5至9的pH。
13.如权利要求7所述的方法，其中，所述超滤使用具有50至300kDa的截留值的改良的聚醚砜膜或纤维素膜进行。
14.如权利要求7所述的方法，其中，所述超滤在15至30℃进行。
15.如权利要求7所述的方法，其中，在纤维蛋白封闭剂组分1中，抑肽酶以100至5000KIU/mL的浓度被包含，白蛋白以5至30mg/mL的浓度被包含，并且去垢剂以0.02至0.04重量％的浓度被包含。
16.由权利要求7至15任一项所述的方法制备的纤维蛋白封闭剂组分1。
17.如权利要求16所述的纤维蛋白封闭剂组分1，其中，它在-18℃或更低温冷冻至少24个月。
18.由权利要求16所述的纤维蛋白封闭剂组分1和填充在单独的容器中的包含凝血酶和氯化钙的纤维蛋白封闭剂组分2配置的纤维蛋白封闭剂产品。
19.如权利要求18所述的纤维蛋白封闭剂产品，其中，它为其中所述纤维蛋白封闭剂组分1和纤维蛋白封闭剂组分2被分别填充在单独的瓶中的瓶型，或者其中所述纤维蛋白封闭剂组分1和纤维蛋白封闭剂组分2被填充在彼此连接的单独的注射器中从而可立即使用的预填充型。
20.如权利要求18所述的纤维蛋白封闭剂产品，其中，在所述纤维蛋白封闭剂组分2中，凝血酶以4至1200IU/mL的浓度被包含，并且氯化钙以20至60mM的浓度被包含。
21.如权利要求18所述的纤维蛋白封闭剂产品，其中，所述纤维蛋白封闭剂组分2额外地以10至50mg/mL的浓度包含白蛋白。
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