CN104524603B - 可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法 - Google Patents
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Abstract
一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法，包括以下步骤中的一种或多种：(a)利用S/D法去除原料血浆中的病毒，然后从原料血浆中提取得到凝血酶并制成凝血酶溶液，利用过滤法去除凝血酶溶液中的病毒；(b)利用低pH孵放法对胶原蛋白溶液中的病毒进行灭活；(c)利用S/D法或巴斯德消毒法对纤维蛋白原溶液中的病毒进行去除/灭活；(d)由上述(a)、(b)、(c)中的凝血酶溶液、胶原蛋白溶液和纤维蛋白原溶液制得止血生物制品/生物材料，利用干热法对止血生物制品/生物材料进行病毒灭活。本发明采用多种对病毒的去除/灭活方式，有效去除/灭活生物制品/生物材料FSP成品中潜在的各种脂包膜病毒和非脂包膜病毒，而且这几种方法都是操作简便、效果显著、成本较低的病毒去除/灭活方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药及制品，尤其是可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法。
背景技术
生物制品/生物材料FSP(Fibrin Sealant Patch)是一种止血用的生物材料，可用于手术和急救场合的辅助止血、创伤封闭等目的。具有易使用、易携带、止血迅速、可被人体完全吸收、人体相容性好、副作用小等特点。由于其主要成分中含有源自血浆的纤维蛋白原和凝血酶以及来源于富含胶原组织的胶原蛋白，因此具有潜在的病毒感染的风险。为了尽可能地降低和(或)消除这种风险，需要在其制造工艺中加入病毒灭活的处理步骤。
目前应用较多的去除/灭活病毒方法有巴氏消毒法、干热法、有机溶剂/去污剂处理法、膜过滤法、低pH孵化法。这些方法有的只能针对特定类型的病毒，如有机溶剂/去污剂处理法；有的方法由于其灭活条件的要求，只能用于少数特定的制品生产工艺，如低pH孵放法、干热法等。随着技术的进步，新的去除/灭活病毒方法不断出现，例如亚甲基蓝光照法、紫外照射法、臭氧去除/灭活法、γ射线辐射法等。这些方法在一些产品生产工艺中取得了积极的去除/灭活病毒效果，尤其是针对一些不适宜使用常规方法的生物制品/生物材料。同时新方法的使用，也能起到缩 短工艺步骤、节约生产成本、简便生产操作等作用。
考虑到各种病毒灭活方法都存在一定的局限性，也为了尽量减少病毒对生物制品/生物材料感染的风险，在生产过程中一般要求采用的病毒去除/灭活方法必须能去除/灭活各种类型的病毒，包括脂包膜病毒、非脂包膜、DNA病毒、RNA病毒以及细小病毒等。
现有技术中也存在许多关于病毒去除/灭活的方法：
CN102210854B 猪纤维蛋白原冻干加热病毒灭活的方法
CN102286095B 纤维蛋白原的制备方法
CN102295696B 由冷沉淀制备凝血因子VIII、纤维蛋白原和纤维结合蛋白的方法
CN103785065A 一种软骨再生支架材料的制备方法
CN87101294A 免疫球蛋白溶液的巴氏灭菌法
CN1448407A 静脉注射用人免疫球蛋白的生产工艺
CN101974070B 一种人凝血酶原复合物的制备工艺
CN102036740A 过滤方法
USP5116950 Process for heat treating fibrinogen
USP5639730 Method of producing a virus-safe biological preparation
上述专利中，USP5116950和USP5639730采用的干热方法灭活病毒，它们是针对纤维蛋白原或其他凝血因子在溶液状态或西林瓶装冻干粉时进行灭活。专利CN102210854B是在65±2℃时加热140±1小时灭活猪纤维蛋白原西林瓶装冻干粉中的病毒。专利CN102286095B和CN102295696B虽然不是专门针对血液制品的病毒灭活，但在其权利要求书中提到100℃加热30分钟灭活病毒。专利CN103785065A是一种生 物材料的制备方法，同其他一些膜状材料类似，其采用的是过氧乙酸-乙醇浸泡灭活病毒的方法。专利CN87101294A采用低pH值和巴氏消毒法相结合，两种方法同时对免疫球蛋白进行病毒灭活。专利CN1448407A采用60℃加热10小时的巴氏消毒法灭活免疫球蛋白中的病毒。专利CN101974070B中凝血酶原制备中采用S/D法和99.5±0.5℃干热30分钟的方法灭活病毒。专利CN102036740A涉及蛋白制剂中间品的病毒去除的过滤方法。不同产品所采用的病毒去除/灭活方法不一样，效果也不同。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法，具有操作简便、效果显著、成本较低的优点。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法，凝血酶溶液、胶原蛋白溶液和纤维蛋白原溶液制得止血生物制品/生物材料，病毒去除/灭活方法包括以下步骤中的一种或多种：
(a)利用S/D法去除原料血浆中的病毒，然后从原料血浆中提取得到凝血酶并制成凝血酶溶液，利用过滤法去除凝血酶溶液中的病毒；
(b)利用低pH孵放法对胶原蛋白溶液中的病毒进行灭活；
(c)利用S/D法或巴斯德消毒法对纤维蛋白原溶液中的病毒进行去除/灭活；
(d)利用干热法对止血生物制品/生物材料进行病毒灭活。
本发明针对的产品为海绵状或膜状的生物材料，它的主要成分含纤维蛋白原、凝血酶、白蛋白、第XIII凝血因子以及胶原蛋白；其辅助成 分含糖、糖醇、氨基酸、盐、PEG或其衍生物、维生素等。本发明的病毒灭活产品不仅包含纤维蛋白原、凝血酶和胶原蛋白，而且还首次将干热法用于海绵状或膜状的生物材料灭活病毒。本发明采用多种对病毒的去除/灭活方式，有效去除/灭活生物制品/生物材料FSP成品中潜在的各种脂包膜病毒和非脂包膜病毒，而且这几种方法都是操作简便、效果显著、成本较低的病毒去除/灭活方法。
干热法灭活病毒的验证
在生物制品/生物材料FSP生产过程中的纤维蛋白原、凝血酶、胶原蛋白等原液中加入脑心肌炎病毒、Sindbis病毒、伪狂犬病毒和猪细小病毒等四种指示病毒(其中含有脂包膜病毒和非脂包膜病毒)，真空冷冻干燥，将FSP装入包装盒和包装袋中密封，然后于100±1℃干热处理30分钟。加热后将FSP剪碎，按10ml/cm2加入0.9％氯化钠溶液37℃水浴30分钟，检测浸提液中病毒滴度。4种指示病毒的灭活效果如表1所示，均大于4Lg，符合国家相关规定要求，达到了病毒灭活的效果。
表1生物制品/生物材料FSP干热灭活病毒的滴度结果
| 病毒名称 | 最低灭活滴度 |
| 脑心肌炎病毒(EMCV) | ≥4.00LgTCID50/0.1ml |
| Sindbis病毒 | ＞4.23LgPFU/ml |
| 伪狂犬病毒(PRV) | ≥4.31LgTCID50/0.1ml |
| 猪细小病毒(PPV) | ＞4.00LgTCID50/0.1ml |
作为改进，所述S/D法为在溶液中加入有机溶剂/去污剂聚山梨酯80至0.5％～2.0％(V/V)或TritonX-100至0.5％～2％(V/V)和磷酸三丁 酯至0.1％～0.5％(V/V)，搅拌均匀后于16～30℃孵育1～10小时。优选方式为聚山梨酯80至0.75％～1.5％(V/V)或Triton X-100至0.75％～1.5％(V/V)和磷酸三丁酯至0.15％～0.45％(V/V)，搅拌均匀后于18～28℃孵育2～8小时。优选方式为聚山梨酯80至1％(V/V)或Triton X-100至1％(V/V)和磷酸三丁酯至0.3％(V/V)，搅拌均匀后于22～26℃孵育4～6小时。优选方式为聚山梨酯80至1％(V/V)和磷酸三丁酯至0.3％(V/V)，搅拌均匀后于24±1℃孵育6小时。
作为改进，所述巴斯德消毒法为让溶液于50～80℃中加热4～12小时。优选方式为60℃中加热10小时。
作为改进，利用巴斯德消毒法对纤维蛋白原溶液去除/灭活病毒时，在纤维蛋白原溶液中添加白蛋白、蔗糖、精氨酸或盐酸精氨酸、氯化钠、柠檬酸三钠作为保护剂。
作为改进，所述过滤法为利用滤膜将溶液过滤去除病毒的方法。优选为用Millipore公司的Viresolve Pro或Viresolve Pro+滤膜或Pall公司的Pegasus除病毒过滤器去除病毒。
作为改进，所述低pH孵放法为将溶液于pH2.5～4.5环境下放置0.5～24天。优选方式为pH2.8～3.5放置4～15天。优选方式为pH3.0±0.1放置12天。
作为改进，所述干热法为将产品置于80～100℃环境加热0.5～72小时。优选方式为80～100℃环境加热0.5～72小时。优选方式为100±2℃环境加热0.5小时。
作为改进，所述止血生物制品/生物材料的制备方法步骤：
(1)将纤维蛋白原溶液在模盒中冷冻形成第一固体；
(2)在冻结的第一固体上喷洒凝血酶溶液，并迅速冷冻形成第二固体；
(3)在冻结的第二固体上倒入胶原蛋白溶液，并迅速冷冻形成第三固体；
(4)将冻结的第三固体于冻干机内真空冷冻干燥即得到止血生物制品/生物材料。
作为改进，所述止血生物制品/生物材料用于手术和急救中的辅助止血、封闭和粘合。包括各种创伤、实质性脏器断面的止血，手术过程中术野出血的止血，封闭缺损组织，防止组织粘连，促进创伤愈合。
本发明与现有技术相比所带来的有益效果是：
本发明的病毒灭活产品不仅包含纤维蛋白原、凝血酶和胶原蛋白，而且还首次将干热法用于海绵状或膜状的生物材料灭活病毒。本发明采用多种对病毒的去除/灭活方式，有效去除/灭活生物制品/生物材料FSP成品中潜在的各种脂包膜病毒和非脂包膜病毒，而且这几种方法都是操作简便、效果显著、成本较低的病毒去除/灭活方法。
具体实施方式
实施例1
一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法，包括以下步骤：
(a)利用S/D法去除原料血浆中的病毒，然后从原料血浆中提取得到凝血酶并制成凝血酶溶液，利用过滤法去除凝血酶溶液中的病毒；
(b)利用低pH孵放法对胶原蛋白溶液中的病毒进行灭活；
(c)利用S/D法对纤维蛋白原溶液中的病毒进行去除/灭活；
(d)由上述(a)、(b)、(c)中的凝血酶溶液、胶原蛋白溶液和纤维 蛋白原溶液制得止血生物制品/生物材料，利用干热法对止血生物制品/生物材料进行病毒灭活。
上述S/D法为在血浆和纤维蛋白原溶液中加入有机溶剂/去污剂聚山梨酯80至0.5％～2.0％(V/V)或TritonX-100至0.5％～2％(V/V)和磷酸三丁酯至0.1％～0.5％(V/V)，搅拌均匀后于16～30℃孵育1～10小时。
上述低pH孵放法为将溶液于pH2.5～4.5环境下放置0.5～24天。
上述过滤法为利用滤膜将凝血酶溶液过滤去除病毒的方法。优选为用Millipore公司的Viresolve Pro除病毒过滤器去除病毒。
上述干热法为将止血生物制品/生物材料置于80～100℃环境加热0.5～72小时。
所述止血生物制品/生物材料的制备方法步骤：
(1)将纤维蛋白原溶液在模盒中冷冻形成第一固体；
(2)在冻结的第一固体上喷洒凝血酶溶液，并迅速冷冻形成第二固体；
(3)在冻结的第二固体上倒入胶原蛋白溶液，并迅速冷冻形成第三固体；
(4)将冻结的第三固体于冻干机内真空冷冻干燥即得到止血生物制品/生物材料。
所述止血生物制品/生物材料用于手术和急救中的辅助止血、封闭和粘合。包括各种创伤、实质性脏器断面的止血，手术过程中术野出血的止血，封闭缺损组织，防止组织粘连，促进创伤愈合。
本发明针对的产品为海绵状或膜状的生物材料，它的主要成分含纤维蛋白原、凝血酶、白蛋白、第XIII凝血因子以及胶原蛋白；其辅助成分含糖、糖醇、氨基酸、盐、PEG或其衍生物、维生素等。本发明的病 毒灭活产品不仅包含纤维蛋白原、凝血酶和胶原蛋白，而且还首次将干热法用于海绵状或膜状的生物材料灭活病毒。本发明采用多种对病毒的去除/灭活方式，有效去除/灭活生物制品/生物材料FSP成品中潜在的各种脂包膜病毒和非脂包膜病毒，而且这几种方法都是操作简便、效果显著、成本较低的病毒去除/灭活方法。
实施例2
一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法，包括以下步骤：
(a)利用S/D法去除原料血浆中的病毒，然后从原料血浆中提取得到凝血酶并制成凝血酶溶液，利用过滤法去除凝血酶溶液中的病毒；
(b)利用低pH孵放法对胶原蛋白溶液中的病毒进行灭活；
(c)利用S/D法对纤维蛋白原溶液中的病毒进行去除/灭活；
(d)由上述(a)、(b)、(c)中的凝血酶溶液、胶原蛋白溶液和纤维蛋白原溶液制得止血生物制品/生物材料，利用干热法对止血生物制品/生物材料进行病毒灭活。
上述S/D法为在血浆和纤维蛋白溶液中加入有机溶剂/去污剂聚山梨酯80至0.75％～1.5％(V/V)或Triton X-100至0.75％～1.5％(V/V)和磷酸三丁酯至0.15％～0.45％(V/V)，搅拌均匀后于18～28℃孵育2～8小时。
上述低pH孵放法为将溶液于pH2.8～3.5环境下放置4～15天。
上述过滤法为利用滤膜将凝血酶溶液过滤去除病毒的方法。优选为用ViresolvePro+滤膜除病毒过滤器去除病毒。
上述干热法为将止血生物制品/生物材料置于80～100℃环境加热0.5～72小时。
所述止血生物制品/生物材料的制备方法步骤：
(1)将纤维蛋白原溶液在模盒中冷冻形成第一固体；
(2)在冻结的第一固体上喷洒凝血酶溶液，并迅速冷冻形成第二固体；
(3)在冻结的第二固体上倒入胶原蛋白溶液，并迅速冷冻形成第三固体；
(4)将冻结的第三固体于冻干机内真空冷冻干燥即得到止血生物制品/生物材料。
所述止血生物制品/生物材料用于手术和急救中的辅助止血、封闭和粘合。包括各种创伤、实质性脏器断面的止血，手术过程中术野出血的止血，封闭缺损组织，防止组织粘连，促进创伤愈合。
本发明针对的产品为海绵状或膜状的生物材料，它的主要成分含纤维蛋白原、凝血酶、白蛋白、第XIII凝血因子以及胶原蛋白；其辅助成分含糖、糖醇、氨基酸、盐、PEG或其衍生物、维生素等。本发明的病毒灭活产品不仅包含纤维蛋白原、凝血酶和胶原蛋白，而且还首次将干热法用于海绵状或膜状的生物材料灭活病毒。本发明采用多种对病毒的去除/灭活方式，有效去除/灭活生物制品/生物材料FSP成品中潜在的各种脂包膜病毒和非脂包膜病毒，而且这几种方法都是操作简便、效果显著、成本较低的病毒去除/灭活方法。
实施例3
一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活 方法，包括以下步骤：
(a)利用S/D法去除原料血浆中的病毒，然后从原料血浆中提取得到凝血酶并制成凝血酶溶液，利用过滤法去除凝血酶溶液中的病毒；
(b)利用低pH孵放法对胶原蛋白溶液中的病毒进行灭活；
(c)利用S/D法对纤维蛋白原溶液中的病毒进行去除/灭活；
(d)由上述(a)、(b)、(c)中的凝血酶溶液、胶原蛋白溶液和纤维蛋白原溶液制得止血生物制品/生物材料，利用干热法对止血生物制品/生物材料进行病毒灭活。
上述S/D法为在血浆和纤维蛋白原溶液中加入有机溶剂/去污剂聚山梨酯80至1％(V/V)或Triton X-100至1％(V/V)和磷酸三丁酯至0.3％(V/V)，搅拌均匀后于22～26℃孵育4～6小时。
上述低pH孵放法为将溶液于pH3.0±0.1放置12天。
上述过滤法为利用滤膜将凝血酶溶液过滤去除病毒的方法。优选为用Pall公司的Pegasus除病毒过滤器去除病毒。
上述干热法为将止血生物制品/生物材料置于100±2℃环境加热0.5小时。
所述止血生物制品/生物材料的制备方法步骤：
(1)将纤维蛋白原溶液在模盒中冷冻形成第一固体；
(2)在冻结的第一固体上喷洒凝血酶溶液，并迅速冷冻形成第二固体；
(3)在冻结的第二固体上倒入胶原蛋白溶液，并迅速冷冻形成第三固体；
(4)将冻结的第三固体于冻干机内真空冷冻干燥即得到止血生物制品/生物材料。
所述止血生物制品/生物材料用于手术和急救中的辅助止血、封闭和粘合。包括各种创伤、实质性脏器断面的止血，手术过程中术野出血的止血，封闭缺损组织，防止组织粘连，促进创伤愈合。
本发明针对的产品为海绵状或膜状的生物材料，它的主要成分含纤维蛋白原、凝血酶、白蛋白、第XIII凝血因子以及胶原蛋白；其辅助成分含糖、糖醇、氨基酸、盐、PEG或其衍生物、维生素等。本发明的病毒灭活产品不仅包含纤维蛋白原、凝血酶和胶原蛋白，而且还首次将干热法用于海绵状或膜状的生物材料灭活病毒。本发明采用多种对病毒的去除/灭活方式，有效去除/灭活生物制品/生物材料FSP成品中潜在的各种脂包膜病毒和非脂包膜病毒，而且这几种方法都是操作简便、效果显著、成本较低的病毒去除/灭活方法。
实施例4
一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法，包括以下步骤：
(a)利用S/D法去除原料血浆中的病毒，然后从原料血浆中提取得到凝血酶并制成凝血酶溶液，利用过滤法去除凝血酶溶液中的病毒；
(b)利用低pH孵放法对胶原蛋白溶液中的病毒进行灭活；
(c)利用巴斯德消毒法对纤维蛋白原溶液中的病毒进行去除/灭活；
(d)由上述(a)、(b)、(c)中的凝血酶溶液、胶原蛋白溶液和纤维蛋白原溶液制得止血生物制品/生物材料，利用干热法对止血生 物制品/生物材料进行病毒灭活。
上述S/D法为在血浆溶液中加入有机溶剂/去污剂聚山梨酯80至1％(V/V)和磷酸三丁酯至0.3％(V/V)，搅拌均匀后于24±1℃孵育6小时。
所述巴斯德消毒法为让纤维蛋白原溶液于50～80℃中加热4～12小时。利用巴斯德消毒法对纤维蛋白原溶液去除/灭活病毒时，在纤维蛋白原溶液中添加白蛋白、蔗糖、精氨酸或盐酸精氨酸、氯化钠、柠檬酸三钠作为保护剂。
上述低pH孵放法为将溶液于pH2.5～4.5环境下放置4～15天。
上述过滤法为利用滤膜将凝血酶溶液过滤去除病毒的方法。优选为用Millipore公司的Viresolve Pro除病毒过滤器去除病毒。
上述干热法为将止血生物制品/生物材料置于80～100℃环境加热0.5～72小时。
所述止血生物制品/生物材料的制备方法步骤：
(1)将纤维蛋白原溶液在模盒中冷冻形成第一固体；
(2)在冻结的第一固体上喷洒凝血酶溶液，并迅速冷冻形成第二固体；
(3)在冻结的第二固体上倒入胶原蛋白溶液，并迅速冷冻形成第三固体；
(4)将冻结的第三固体于冻干机内真空冷冻干燥即得到止血生物制品/生物材料。
所述止血生物制品/生物材料用于手术和急救中的辅助止血、封闭和粘合。包括各种创伤、实质性脏器断面的止血，手术过程中术野出血的止血，封闭缺损组织，防止组织粘连，促进创伤愈合。
本发明针对的产品为海绵状或膜状的生物材料，它的主要成分含纤 维蛋白原、凝血酶、白蛋白、第XIII凝血因子以及胶原蛋白；其辅助成分含糖、糖醇、氨基酸、盐、PEG或其衍生物、维生素等。本发明的病毒灭活产品不仅包含纤维蛋白原、凝血酶和胶原蛋白，而且还首次将干热法用于海绵状或膜状的生物材料灭活病毒。本发明采用多种对病毒的去除/灭活方式，有效去除/灭活生物制品/生物材料FSP成品中潜在的各种脂包膜病毒和非脂包膜病毒，而且这几种方法都是操作简便、效果显著、成本较低的病毒去除/灭活方法。
实施例5
一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法，包括以下步骤：
(a)利用S/D法去除原料血浆中的病毒，然后从原料血浆中提取得到凝血酶并制成凝血酶溶液，利用过滤法去除凝血酶溶液中的病毒；
(b)利用低pH孵放法对胶原蛋白溶液中的病毒进行灭活；
(c)利用巴斯德消毒法对纤维蛋白原溶液中的病毒进行去除/灭活；
(d)由上述(a)、(b)、(c)中的凝血酶溶液、胶原蛋白溶液和纤维蛋白原溶液制得止血生物制品/生物材料，利用干热法对止血生物制品/生物材料进行病毒灭活。
上述S/D法为在血浆溶液中加入有机溶剂/去污剂聚山梨酯80至0.5％～2.0％(V/V)或TritonX-100至0.5％～2％(V/V)和磷酸三丁酯至0.1％～0.5％(V/V)，搅拌均匀后于16～30℃孵育1～10小时。
所述巴斯德消毒法为让纤维蛋白原溶液于60℃中加热10小时。利用巴斯德消毒法对纤维蛋白原溶液去除/灭活病毒时，在纤维蛋白原溶 液中添加蔗糖、精氨酸或盐酸精氨酸、氯化钠、柠檬酸三钠作为保护剂。
上述低pH孵放法为将溶液于pH2.5～4.5环境下放置4～15天。
上述过滤法为利用滤膜将凝血酶溶液过滤去除病毒的方法。优选为用ViresolvePro+滤膜除病毒过滤器去除病毒。
上述干热法为将止血生物制品/生物材料置于80～100℃环境加热0.5～72小时。
所述止血生物制品/生物材料的制备方法步骤：
(1)将纤维蛋白原溶液在模盒中冷冻形成第一固体；
(2)在冻结的第一固体上喷洒凝血酶溶液，并迅速冷冻形成第二固体；
(3)在冻结的第二固体上倒入胶原蛋白溶液，并迅速冷冻形成第三固体；
(4)将冻结的第三固体于冻干机内真空冷冻干燥即得到止血生物制品/生物材料。
所述止血生物制品/生物材料用于手术和急救中的辅助止血、封闭和粘合。包括各种创伤、实质性脏器断面的止血，手术过程中术野出血的止血，封闭缺损组织，防止组织粘连，促进创伤愈合。
本发明针对的产品为海绵状或膜状的生物材料，它的主要成分含纤维蛋白原、凝血酶、白蛋白、第XIII凝血因子以及胶原蛋白；其辅助成分含糖、糖醇、氨基酸、盐、PEG或其衍生物、维生素等。本发明的病毒灭活产品不仅包含纤维蛋白原、凝血酶和胶原蛋白，而且还首次将干热法用于海绵状或膜状的生物材料灭活病毒。本发明采用多种对病毒的去除/灭活方式，有效去除/灭活生物制品/生物材料FSP成品中潜在的各种脂包膜病毒和非脂包膜病毒，而且这几种方法都是操作简便、效果显著、成本较低的病毒去除/灭活方法。
实施例6
将三批血浆按照有机溶剂/去污剂法(1％聚山梨酯80和0.3％磷酸三丁酯，搅拌均匀后于24±1℃孵育6小时)病毒灭活处理后，检测Sindbis和PRV病毒灭活效果。
表2S/D法灭活血浆病毒效果
血浆经S/D法25±1℃孵育6小时后可灭活Sindbis病毒>4.53LgPFU/ml，可灭活PRV病毒≥4.43LgTCID50/0.1ml。
两种脂包膜病毒灭活效果均大于4Lg，符合国家食品药品监督管理总局对于血液制品及生物制品/生物材料的病毒灭活工艺的要求。
实施例7
将三批纤维蛋白原沉淀切碎，加入5倍重量的水于37℃溶解，离心后在上清液中加入Sindbis和PRV病毒，再加入病毒灭活剂至浓度为1％聚山梨酯80和0.3％磷酸三丁酯。搅拌均匀后于24℃孵育6小时，病毒灭活处理后，检测Sindbis和PRV病毒灭活效果。
表3S/D法灭活纤维蛋白原病毒效果
纤维蛋白原溶液经S/D法25±1℃孵育6小时，可灭活Sindbis病毒>4.40LgPFU/ml，可灭活PRV病毒≥4.29LgTCID50/0.1ml。
病毒灭活效果均大于4Lg，符合国家食品药品监督管理总局对于血液 制品及生物制品/生物材料的病毒灭活工艺的要求。
实施例8
取三批凝血酶中间体溶液稀释至4mg/ml，溶液中加入小囊性口腔炎病毒(VSV)、单纯疱疹病毒(HSV-1)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪细小病毒(PPV)等病毒，用Millipore公司的Viresolve Pro+病毒过滤设备进行过滤处理，检测四种病毒的降低滴度。
表4凝血酶过滤法去除病毒效果
| 病毒名称 | 降低滴度Lg |
| VSV | 4.37 |
| HSV-1 | 5.84 |
| EMCV | 6.15 |
| PPV | >4.00 |
凝血酶溶液过滤后四种病毒降低滴度都大于4Lg，符合规定的病毒灭活工艺的要求。检测过滤前凝血酶效价为278IU/ml，过滤后为273IU/ml，凝血酶效价基本无变化，说明凝血酶溶液可以采用过滤法去除各种类型病毒。
实施例9
将三批纤维蛋白原中间体固体切碎后加2倍重量的水溶解，过滤取滤液，测定蛋白质含量。另用水溶解白蛋白、盐酸精氨酸、蔗糖、氯化钠、柠檬酸三钠，并加入小囊性口腔炎病毒(VSV)、单纯疱疹病毒 (HSV-1)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪细小病毒(PPV)等病毒溶液与纤维蛋白原溶液混匀，至纤维蛋白原蛋白含量2.5％、白蛋白3％、盐酸精氨酸0.64％、蔗糖4.5％、氯化钠0.22％、柠檬酸三钠0.36％(均为W/V)，将混匀后的溶液于60±0.5℃水浴10小时，测定病毒滴度。
表5巴氏消毒法灭活病毒效果
| 病毒名称 | 降低滴度Lg |
| VSV | 4.26 |
| HSV-1 | 4.78 |
| EMCV | 4.69 |
| PPV | >4.00 |
纤维蛋白原溶液经巴氏消毒法加热后四种病毒灭活滴度均大于4Lg，符合规定的病毒灭活工艺的要求。加热前溶液中可凝固蛋白含量23.1mg/ml，加热后溶液可凝固蛋白含量23.0mg/ml，说明60±0.5℃水浴10小时对可凝固蛋白含量基本无影响，纤维蛋白原溶液采用巴氏消毒法灭活病毒是可行的。
实施例10
取破碎的猪跟腱20g，加水400ml后搅拌分散，加入小囊性口腔炎病毒(VSV)、单纯疱疹病毒(HSV-1)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪细小病毒(PPV)等病毒，再加入冰乙酸，至pH3.0±0.1，充分搅拌至跟腱完全被酸解，溶液呈均匀状态。将胶原蛋白溶液于2～8℃放置10天后取样测定病毒滴度。
表6低pH孵放法灭活病毒效果
| 病毒名称 | 降低滴度Lg |
| VSV | 5.33 |
| HSV-1 | 5.12 |
| EMCV | 4.98 |
| PPV | >4.00 |
胶原蛋白溶液经低pH孵放10天后四种病毒灭活滴度均大于4Lg，符合国家食品药品监督管理总局对于血液制品及生物制品/生物材料的病毒灭活工艺的要求。
实施例11
血浆加入1％聚山梨酯80和0.3％磷酸三丁酯经S/D法灭活后采用硫酸钡吸附法提取出凝血酶原，激活后得到凝血酶。稀释至约3.5g/L，将凝血酶溶液用Pall公司的Pegasus除病毒过滤器过滤。另从血浆冷沉淀分离出纤维蛋白原，溶解后加入1％聚山梨酯80和0.3％磷酸三丁酯再经低温乙醇沉淀法得到纤维蛋白原沉淀。将该沉淀切碎后加2倍重量的水溶解，过滤取滤液，测定蛋白质含量。另用水溶解白蛋白、盐酸精氨酸、蔗糖、氯化钠、柠檬酸三钠，与纤维蛋白原溶液混匀，至纤维蛋白原蛋白含量2.0％、白蛋白2.5％、盐酸精氨酸1％、蔗糖3％、氯化钠0.2％、柠檬酸三钠0.35％(均为W/V)，将混匀后的溶液于60±0.5℃水浴10小时进行巴氏消毒法灭活。从猪跟腱中提取出胶原蛋白，加入冰醋酸至pH2.5±0.1，充分搅拌至跟腱被完全酸解，置于2～8℃放置14天。纤维 蛋白原、凝血酶、胶原蛋白添加相应的辅助成分配制成3种混合溶液，按顺序分别倒入模盒中，冻干成FSP成品。
将冻干后生物制品/生物材料FSP剪切密封包装后，按照20ml/cm2的量加入生理盐水37℃水浴萃取1h。检测萃取溶液中猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒、伪狂犬病毒和猪细小病毒，均未检测出活病毒，说明采用S/D法+过滤法+巴氏消毒法+低pH孵放法去除/灭活病毒的生产工艺，可以有效灭活/去除FSP中潜在的各种类型病毒。按标准检测FSP成品，各项质量指标均符合要求。该病毒去除/灭活工艺安全有效，操作简便。
实施例12
在猪血浆中于0～8℃时加入甘氨酸4g/L和乙酸钠140g/L，搅拌均匀后静置30分钟。离心分离沉淀。沉淀加5倍重量的水溶解后加入1％聚山梨酯80和0.3％磷酸三丁酯，搅拌均匀后于25℃静置处理6小时。再采用盐析法分离提取得到猪纤维蛋白原并去除残余的灭活剂。将纤维蛋白原37℃水浴溶解，同时配制一定量的添加剂溶液，与纤维蛋白原溶液混合均匀，制成混合液中含纤维蛋白原浓度50mg/ml、蔗糖20mg/ml、海藻糖10mg/ml、精氨酸10mg/ml、NHS-PEG 3mg/ml、氯化钠3mg/ml、柠檬酸三钠7mg/ml、维生素E 20μg/ml、维生素B210μg/ml。
在猪血浆中加入1％聚山梨酯80和0.3％磷酸三丁酯，搅拌均匀后于25℃静置处理6小时。用凝胶过滤层析和离子交换层析，分离得到凝血酶原。在凝血酶原溶液中加入0.1mol/L氯化钙和2％甘氨酸，室温激活 48h，得到凝血酶溶液。脱盐去除氯化钙，然后调节浓度至凝血酶效价500IU/ml，加入猪甘氨酸5mg/ml、PEG20002mg/ml。将凝血酶溶液用Millipore公司的Viresolve Pro滤膜过滤。
从猪跟腱中提取出胶原蛋白，加酸溶解后稀释至胶原蛋白浓度10g/L，pH3.0±0.2，置于2～8℃放置12天。
分别将纤维蛋白原、凝血酶、胶原蛋白溶液冷冻后，进行真空冷冻干燥。将冻干后生物制品/生物材料FSP剪切密封包装后100℃±2℃ 30分钟干热灭活病毒，生物制品/生物材料FSP水分含量小于4.5％。
将灭活后的FSP成品，按照20ml/cm2的量加入生理盐水37℃水浴萃取1h。检测萃取溶液中猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒、伪狂犬病毒和猪细小病毒，滴度均小于0Lg。按标准检测FSP成品，各项质量指标均符合要求，说明FSP生产工艺中采用S/D法+过滤法+低pH孵放法+干热灭活法，可以有效灭活/去除FSP中潜在的病毒。该工艺安全有效，操作简便。
实施例13
在人血浆中加入1％Triton X-100和0.3％磷酸三丁酯，搅拌均匀后于24℃静置处理4小时。按实施例4的方法，从血浆中提取纤维蛋白原和凝血酶。其中纤维蛋白原浓度75mg/ml、蔗糖20mg/ml、海藻糖10mg/ml、精氨酸10mg/ml、PEG30005mg/ml、氯化钠3mg/ml、SSA-PEG 2mg/ml、柠檬酸三钠7mg/ml、维生素E 20μg/ml、维生素B210μg/ml、芦丁10μg/ml。另外从猪皮中提取胶原蛋白。
按实施例7方法制备生物制品/生物材料FSP。将冻干后生物制品/生物材料FSP剪切密封包装后进行干热灭活100℃±2℃ 30分钟，生物制品/生物材料FSP水分含量小于6％。
将干热灭活后的FSP成品，按照20ml/cm2的量加入生理盐水37℃水浴萃取1h。检测萃取溶液中猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪口蹄疫病毒、伪狂犬病毒和猪细小病毒，滴度均小于0Lg。按标准检测FSP成品，各项质量指标均符合要求，因此FSP生产工艺中采用TritonX-100和磷酸三丁酯的S/D法灭活及干热灭活法，可以有效灭活/去除FSP中潜在的病毒。
实施例14
为了检测干热法对纤维蛋白原和凝血酶的活性影响，将实施例8的纤维蛋白原和凝血酶混合溶液分别进行冻干，将其冻干的制品进行100℃±2℃ 30分钟干热灭活病毒。然后分别检测其在干热灭活前后的可凝固蛋白质含量和凝血酶酶活，如表7所示。从表7可见采用实施例8的FSP中纤维蛋白原和凝血酶相应的辅助成分，可以起到一定的蛋白质活性保护剂的作用。
表7干热灭活对纤维蛋白原、凝血酶活性的影响
实施例15
将经过干热法灭活病毒的FSP成品进行动物实验观察其在正常压力时对西藏小型猪肝、脾创面出血的影响。
为考察干热灭活后FSP的止血作用，选用正常西藏小型猪为研究对象，采用直接创伤法将小型猪肝、脾损伤，然后用适量大小的FSP进行治疗。试验分2组，即模型组、医用生物蛋白胶组，每组2只。各组小型猪肝损伤标准为：深约0.5cm，长约5cm；脾损伤标准：深约0.5cm，长约5cm，宽约2.0cm。FSP给药剂量为：肝：约2.4×7.0×0.5cm，脾：约4.8×6.0×0.5cm，给药方法：直接将FSP贴于损伤面，然后用湿生理盐水纱布轻压数分钟，单次给药。
与模型组相比，生物制品/生物材料FSP组能显著减少西藏小型猪肝损伤面的出血量(p<0.01)，小型猪脾的出血量(p<0.05)，也能缩短肝和脾的止血时间。试验过程中能明显观察到生物制品/生物材料FSP与肝、脾创伤面结合非常紧密，不易脱落。
表8FSP对正常压力小型猪肝创面出血量、出血时间的影响
| 组别 | n | 剂量 | 出血量(ml) | 出血时间(s) |
| 模型组 | 2 | — | 4.452±0.847 | 781±173 |
| FSP | 2 | 2.4×7.0cm2/ | 0.768±0.105* | 330±78 |
注：与模型组进行比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01
表9FSP对正常压力小型猪脾创面出血量、出血时间的影响
| 组别 | n | 剂量 | 出血量(ml) | 出血时间(s) |
| 模型组 | 2 | — | 46.335±4.265 | 948±179 |
| FSP | 2 | 4.8×6.0cm2/ | 9.412±0.124* | 531±210 |
注：与模型组进行比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01
从表8和表9中的数据可以看出，干热灭活后的FSP仍具有良好的止血效果，说明本工艺能够在安全有效灭活病毒的前提下，保持较好的药效，正常发挥其功能。
Claims (2)
1.一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法，其特征在于，凝血酶溶液、胶原蛋白溶液和纤维蛋白原溶液制得止血生物制品/生物材料，病毒去除/灭活方法包括以下步骤：
(a)利用S/D法去除原料血浆中的病毒，然后从原料血浆中提取得到凝血酶并制成凝血酶溶液，利用过滤法去除凝血酶溶液中的病毒；
(b)利用低pH孵放法对胶原蛋白溶液中的病毒进行灭活；
(c)利用S/D法或巴斯德消毒法对纤维蛋白原溶液中的病毒进行去除/灭活；
(d)利用干热法对止血生物制品/生物材料进行病毒灭活；
所述止血生物制品/生物材料的制备方法步骤：
(1)将纤维蛋白原溶液在模盒中冷冻形成第一固体；
(2)在冻结的第一固体上喷洒凝血酶溶液，并迅速冷冻形成第二固体；
(3)在冻结的第二固体上倒入胶原蛋白溶液，并迅速冷冻形成第三固体；
(4)将冻结的第三固体于冻干机内真空冷冻干燥即得到止血生物制品/生物材料；
所述S/D法为在溶液中加入有机溶剂/去污剂，有机溶剂为磷酸三丁酯至0.1％～0.5％(V/V)，去污剂为聚山梨酯80至0.5％～2.0％(V/V)或TritonX-100至0.5％～2％(V/V)，搅拌均匀后于16～30℃孵育1～10小时；
所述巴斯德消毒法为让溶液于50～80℃中加热4～12小时；
利用巴斯德消毒法对纤维蛋白原溶液去除/灭活病毒时，在纤维蛋白原溶液中添加蔗糖、白蛋白、精氨酸或盐酸精氨酸、氯化钠、柠檬酸三钠作为保护剂；
所述过滤法为利用滤膜将溶液过滤去除病毒的方法；
所述低pH孵放法为将溶液于pH2.5～4.5环境下放置0.5～24天；
所述干热法为将产品置于80～100℃环境加热0.5～72小时。
2.根据权利要求1所述的一种可被生物机体吸收的止血生物制品/生物材料的病毒去除/灭活方法，其特征在于：所述止血生物制品/生物材料用于手术和急救中的辅助止血、封闭和粘合。
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