WO2017082441A1 - 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 유효성분으로 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물 - Google Patents

활성화된 혈소판 풍부 혈장을 유효성분으로 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물 Download PDF

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rich plasma
wounds
wound
activated
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정태호
박철
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중부대학교 산학협력단
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    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators

Definitions

  • the present invention is a veterinary composition for treating wounds of animals comprising platelet-rich plasma as an active ingredient, after activating platelet-rich plasma extracted from allogenic, as an active ingredient, and wound wounds
  • wound healing refers to the restoration of histological and functional integrity of damaged tissue.
  • This wound healing process is a complex series of processes regulated and mediated by the sophisticated interactions of cells with various mediators.
  • the wound healing process is usually expressed simultaneously with tissue damage and progresses to a series of processes such as hemostasis, inflammation, granulation tissue formation, re-epithelialization, and tissue reconstitution. Each step is primarily driven by molecular signals such as cytokines and growth factors. Elaborately mediated
  • platelets play a very important role in tissue regeneration. Once the tissues and blood vessels are damaged, the circulating platelets gather at the site of tissue damage and undergo adhesion, aggregation, and degranulation.
  • ⁇ -granules are platelet-derived growth factors, vascular endothelial growth factors, transforming growth factor- ⁇ and insulin-like growth factor. It contains a variety of growth factors that are essential for the wound healing process, such as -like growth factors, and each of these growth factors induces inflammatory cells to the damaged tissue site, cell proliferation, angiogenesis, extracellular matrix accumulation and tissue reconstitution. It mediates a series of processes in detail. In order for these platelet-derived growth factors to have a therapeutic effect during wound healing, they should generally be concentrated and concentrated at four to five times the normal circulating platelet concentration.
  • Chronic wounds generally mean wounds or wounds that do not heal despite the use of the usual treatment methods used to heal wounds for a period of time necessary for healing.
  • Chronic wounds in soft tissues are a frequent problem in the field of veterinary medicine, and at the same time, it is an economic burden for caregivers and one of the most difficult challenges for veterinarians.
  • Traditional wound healing therapies include dressing and debridement.
  • these general therapies themselves have the effect of eliminating infectious agents and cleaning the affected and necrotic tissues, but often do not significantly affect the angiogenesis or healing growth factors needed to regenerate new tissue. There are cases where it is invisible.
  • Chronic wounds are delayed by a number of factors. Most of these chronic wounds are typical causes of delayed healing of infections, tissue necrosis, reduced tissue reflux to the affected area, and the absence of neovascular and healing growth factors. Although adequate healing growth factors to the affected area at the right time in wound healing are an indispensable factor, the lack or absence of such healing growth factors slows the healing of wounds and eventually causes chronic wounds and delays healing. .
  • Platelet-rich plasma is a technology that can accelerate the recovery of wounds that are not healed chronically by supplying wound healing and healing growth factors essential for skin, soft tissue, and angiogenesis to chronic wounds that are delayed in healing.
  • Platelet rich plasma PRP.
  • Platelet rich plasma activates autologous platelets by concentrating and activating platelet-derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), and insulin-like growth factor (IGF), which are essential for the healing process of wounds. It is effective in treating chronic wounds by promoting the secretion of platelet-derived growth factors.
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • IGF insulin-like growth factor
  • the supply of healing growth factors using platelet-rich plasma has the advantage of providing the growth factors for healing at one time.
  • the supply of growth factors in this manner is the most similar to the method of supply of growth factors that occur naturally when wound healing in our body, and there is a great advantage in the physiological similarity of the most physiological.
  • platelet-rich plasma Because of the utility of platelet-rich plasma, the technology has been used for decades in orthopedic, dental, and cardiac surgeons. In addition, in the field of veterinary medicine, platelet-rich plasma has been widely used in recent years, and there have been reports of successful treatment by applying autologous platelet-rich plasma to chronic soft tissue wounds.
  • Platelet-rich plasma taken from other healthy homogenous individuals, is a simple and rapid method of tissue and neovascularization by inducing growth factors useful for regenerating more tissue than platelets taken from whole blood of a diseased state. It is effective in promoting regeneration and prevents the risk and error of using platelets in a pathological state, which is more effective in treating chronic wounds of animals.
  • the present inventors extracted platelet-rich plasma from allogenic and mixed platelet-rich plasma and platelet activator to produce activated platelet-rich plasma, and the activated platelet-rich plasma thus prepared was used to chronically wound the wound. As a result of application to the site, it was confirmed that the effect is excellent in the treatment of chronic soft tissue wound of the constriction, and completed the present invention.
  • the present invention is to provide a veterinary composition for treating wounds of animals comprising platelet-rich plasma activated by mixing platelet-rich plasma extracted from allogenic as an active ingredient.
  • the present invention is to provide a method for treating wounds in an animal comprising applying the activated platelet-rich plasma to the wound affected part of the shaft.
  • the present invention provides a veterinary composition for treating wounds in an animal comprising platelet-rich plasma activated by mixing platelet-rich plasma extracted from allogenic as an active ingredient.
  • the present invention also provides a method for treating wounds in an animal comprising applying the activated platelet-rich plasma to the wound wound of the shaft.
  • Activated platelet-rich plasma is a platelet-rich plasma (Platelet Rich Plasma, PRP) extracted from the platelet itself to provide a platelet rich platelet-rich plasma from the allogene (Allogenic) after separation and concentration Applied to the wound site, normal and healthy healing derived from healthy platelets and platelets from healthy allogenes, even if the autologous platelets have pathological conditions such as coagulation disorders or systemic hematopoietic disorders and thus autologous platelets are not available for the treatment of wounds.
  • PRP Platelet Rich Plasma
  • Figure 1 is a diagram showing the affected area of the dog axis subjected to necrosis tissue removal (debridement) of the present invention.
  • Figure 2 is an ointment comprising activated platelet-rich plasma of the present invention applied to wound wounds of dogs, and is a diagram showing the affected part of the ring dog after 5 days.
  • Figure 3 is an ointment comprising activated platelet-rich plasma of the present invention applied to wound wounds of dogs, and is a view showing the affected part of the ring dogs after 13 days.
  • Figure 4 is an ointment comprising the activated platelet-rich plasma of the present invention applied to wound wounds of dogs, 25 days after showing the affected part of the ring dog.
  • the present invention provides a veterinary composition for treating wounds in an animal comprising platelet-rich plasma extracted from allogenic and mixed with a platelet activator, and then activating the platelet-rich plasma as an active ingredient.
  • Activated platelet rich plasma which is an active ingredient of the composition of the present invention, may be prepared by the following method.
  • PRP platelet rich plasma
  • whole blood is collected from a healthy allotrope in a vacuum test tube containing sodium citrate, and then centrifuged first with an ultrafast centrifuge.
  • the supernatant (plasma layer) containing the buffy coat was collected by primary centrifugation, transferred to a new vacuum test tube, followed by secondary centrifugation, and the bottom layer (corresponding to 1-2 mL from the bottom of the test tube).
  • Concentrated platelet rich plasma (PRP) Concentrated platelet rich plasma
  • the extracted platelet-rich plasma is only an aggregate of platelets that are physically concentrated, and platelet-derived healing growth factors that promote healing in the wound site are substantially inactive.
  • platelets themselves must first be activated.
  • the activated platelet-rich plasma obtained by performing the above procedure is activated with a solution containing platelet activator to prepare activated platelet-rich plasma capable of promoting the secretion of platelet-derived healing growth factors.
  • Platelet activators for activating platelets of the platelet-rich plasma may include calcium chloride, thrombin, collagen, serotonin, adenosine diphosphate (ADP) and acetylcholine (ACH), preferably calcium chloride, More preferably in the form of a calcium chloride solution mixed with a solvent.
  • the solvent may include a phosphate buffer solution, physiological saline or distilled water.
  • the calcium chloride solution may be mixed with 5 to 15 volumes of calcium chloride relative to 100 volumes of physiological saline.
  • Calcium chloride (CaCl 2 ) is used as a source of calcium, which is required for the activation of each coagulation factor, and plays an important role in the activation of platelets. That is, thrombin acts on platelet cell membranes to induce structural changes in the membrane. When platelet cell membranes interact with fibrinogen, calcium ions are required in the process of adhering with other platelet cell membranes.
  • platelets When platelets are activated by an activator, growth factors are released by degranulation of alpha granules of platelets, which plays an important role in early wound healing.
  • platelet-rich plasma PRP
  • cytokines and the like in vitro to synthesize fibroblast DNA and increase collagen production, thereby organizing collagen structure.
  • the healing growth factor was platelet-derived growth factor (PDGF), conversion growth factor-b1 (TGF-b1), fibroblast growth factor (FGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), epithelial cell growth Factor (EGF), insulin-like growth factors 1 and 2 (IGF), platelet-derived angiogenesis factor (PDAF), platelet-derived epidermal growth factor (PDEGF), platelet factor 4 (PF-4), acidic fibroblast growth Factor (FGF-A), basic fibroblast growth factor (FGF-B), transforming growth factor- ⁇ (TGF-A), ⁇ -thromboglobulin-related protein (BTG), thrombospondin (TSP), fibronectin, Present Wallinbrand factor (vWF), fibropeptide A, fibronogen, albumin, plasminogen activity inhibitor-1 (PAI-1), osteonectin, normal T cell activation modulated to be expressed and secreted (RANTES) , Gro- ⁇ , Vitronectin, Fibrin D-Dimer,
  • platelet is one of the blood constituents of the tangible component of the blood, a cell fragment of 2 ⁇ 3 ⁇ m diameter from which the cytoplasm split from the megakaryocyte in the bone marrow plays an important role in the coagulation and hemostatic action of the blood do. Platelets are activated first when blood vessels are damaged and bleeding on the skin or mucous membranes.When platelets adhere to damaged blood vessel walls and come into contact with air, an enzyme called thrombokinase converts one of the plasma proteins, prothrombin, into thrombin. Fibrinogen is then converted into fibrin, which causes the blood to coagulate through a complex process that causes fibrin to coagulate. When such platelets are activated, various growth factors and factors involved in regeneration are released into connective tissues, thereby regenerating and restoring epithelial and subcutaneous tissues to improve skin and have excellent effects on wound recovery.
  • plasma is a light yellow neutral liquid having a blood coagulation factor as a liquid component excluding red blood cells, white blood cells and the like nucleated cells in the blood. Centrifugation of whole blood with anticoagulant results in plasma being divided into plasma at the top and nucleated cells at the bottom.
  • the composition of plasma is about 90% water, 7-8% plasma protein, and lipids, sugars, inorganic salts, and nonproteinaceous nitrogen compounds contain urea, amino acids, uric acid, and the like.
  • Such plasma can be easily separated from the blood by well-known conventional methods such as centrifugation, sedimentation or filtration methods. Centrifugation can be carried out under conditions suitable for settling blood cells from plasma. For example, centrifugation for about 5-15 minutes at about 1500 g force, which is sufficient to precipitate virtually all cell fragments as well as red blood cells and white blood cells. Supernatants containing plasma can be easily separated from the settled cells by standard techniques.
  • the filtration can be carried out by passing the blood through a filter suitable for separating blood cells from the plasma, and the filter is preferably a microporous membrane that can easily permeate the protein.
  • Plasma is known to be preserved in various states before use, in addition to the fresh liquid plasma state or liquid state obtained by centrifugation or sedimentation after blood collection, for example, fresh frozen agent, lyophilized agent, lyophilized agent or concentrated agent. It may be in the form of. In the present invention, all types of plasma may be used as described above.
  • Platelet rich plasma of the present invention is a plasma containing a lot of platelets in the plasma, which is the most abundant rich platelets of the plasma separated from the whole blood using a centrifuge.
  • Activated platelet rich plasma according to the present invention is isolated and concentrated by two centrifugation of platelet rich plasma collected from a healthy allogene and release a growth factor useful for tissue regeneration from platelets by adding calcium In addition, it promotes the regeneration of connective tissue and induces the formation of neovascularization, and thus has an excellent effect of promoting angiogenesis and skin regeneration of wound tissue of dogs.
  • the activated platelet rich plasma of the present invention can be usefully used for the treatment of wounds in animals.
  • the wounds are non-healing traumatic wounds, destruction of tissue by irradiation, abrasions, bone fractures, lacerations, colonic wounds, penetrating wounds, gunshot wounds, cuts, burns, frostbite, skin ulcers, dry skin, keratosis, cracking, bursting, Dermatitis, Pain caused by Dermatophytosis, Surgical or vascular disease wounds, bruises, corneal wounds, pressure sores, ulcers, diabetes mellitus, such as diabetic erosion, chronic ulcers, sutures after plastic surgery, spinal injury At least one selected from the group comprising wounds, gynecological wounds, chemical wounds and acne is preferred, but is not limited thereto.
  • compositions containing a veterinary effective amount of activated platelet rich plasma as the active ingredient according to the invention can be formulated in a variety of different forms with a veterinary acceptable carrier. Formulation can be carried out according to methods known in the art.
  • the form of the preparation includes, but is not limited to, conventional forms of external preparations such as liquid coatings, sprays, lotions, creams, gels, pastas, linings, ointments, aerosols, powders and transdermal absorbents. These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042 (Chapter 87: Blaug, Seymour), a prescription generally known in all pharmaceutical chemistries.
  • the volume of activated platelet rich plasma can be increased by adding water for injection or distilled water.
  • antibiotics may be used to prevent fixation and improve fixation of activated platelet rich plasma. It can be mixed and applied to ointment preparations used in soft tissue wounds such as.
  • the activated platelet rich plasma can be stably applied to the affected area until it is completely absorbed by the skin. There is this.
  • the veterinary composition according to the present invention may be formulated in the form of a liquid coating agent by mixing activated platelet rich plasma and physiological saline in a constant volume ratio and adjusting the pH to 3.5 to 6.5.
  • the veterinary composition according to the present invention may be formulated in the form of an ointment by mixing the activated platelet rich plasma and the water-soluble ointment described above and adding saline solution thereto.
  • the veterinary composition according to the present invention can be formulated by adjusting the pH of the ointment to 3.5 to 6.5.
  • a pharmaceutical carrier such as gel or microspheres may be used to accelerate the healing of the wound.
  • a pharmaceutical carrier such as gel or microspheres.
  • U.S. Pat.Nos. 5,264,207, WO2000 / 24378, WO96 / 13164 and WO 94/13333 describe microspheres of polymers which serve as carriers for one or more active pharmaceutical or cosmetic substances.
  • the veterinary composition of the present invention can be used to treat various wound symptoms of constriction. This includes infections, malignant, macrovascular artery insufficiency, small vessel artery insufficiency, cardiac vein blockage or insufficiency, superficial vein insufficiency, lymphatic insufficiency, endogenous circulation deficiency, blood abnormalities, collagen angiogenesis, radiation dermatitis, nutritional causes, etc. It is effective against most malignant ulcers.
  • the veterinary effective amount of the plasma component from which the commercial component used in the composition of the present invention is removed refers to the amount of the active ingredient which exhibits the therapeutic effect of the wound by normalizing abnormal cells and various cellular active substances at the wound site.
  • the effective amount may vary depending on the type of wound, the area of application, the number of treatments, the time of treatment, the formulation, the condition of the patient, the type of adjuvant, and the like. Generally, doses containing 2 to 5% by weight of the plasma component powder from which the commercial component has been removed are administered. Frequency of administration may be 1 to 4 times daily.
  • the daily effective amount of the veterinary composition of the present invention is 0.01 to 0.1 g / cm 2, preferably 0.02 to 0.09 g / cm 2, more preferably 0.02 to 0.07 g / cm 2 when the powder is applied to the total skin loss wound.
  • the administration may be to apply to the proliferative and tissue reconstructor, the end of the inflammatory period and begins to sprout the flesh.
  • the present invention also provides a method of treating wounds in an animal, comprising applying the activated platelet-rich plasma to a wound site of a circular axis.
  • inflammatory exudate decreased after application of the activated platelet-rich plasma of the present invention to a patient who did not obtain an effective therapeutic effect after the conventional necrotic tissue removal procedure. It started to grow (regenerate). In addition, a gradual clinical improvement of the lesion was confirmed by the 15th day of treatment. 25 hours after application of allogeneic activated platelet-rich plasma (37 days after lesion discovery), skin stiffness and corrosion, sores, swelling and swelling were reduced, the hairs began to appear on the lesion, and necrotic tissue was almost You can see that it is played completely.
  • the present invention provides a platelet-rich plasma that is activated by receiving platelets from healthy allogenic rather than concentric, and thus derived from platelets and platelets of other healthy donor dogs even when the concentric blood is in a pathological state. It can supply normal and healthy healing growth factors, avoid the use of pathological platelets and growth factors, and maximize the effect of promoting wound healing.
  • platelets themselves unlike erythrocytes, have low antigenicity (Antigenicity), even if platelets derived from allogenic (Allogenic) applied to the affected part of the ring, the rejection or immune response rarely occurs. Therefore, if there is only a healthy allogeneic (Allogenic) that can collect blood can easily apply the present invention at any time to maximize the effect of promoting wound healing more effectively.
  • Antigenicity antigenicity
  • homologous in the present invention means all individuals of the same species, ie the same bioclass.
  • animal means all animals except humans, and preferably includes, but is not limited to, canine animal groups.
  • the canine fauna includes, but is not limited to, dogs, wolves, foxes, coyotes, jackals, hunters, and the like.
  • the term "healthy” means a physically / physically free and sturdy state, and in the present invention, it may mean a state in which there is no pathological condition such as a coagulation disorder or a systemic blood circulation disorder.
  • treatment in the present invention means any action that improves or benefits from the wound affected by the administration of the composition.
  • the activated platelet-rich plasma of the present invention can be applied to a circular shaft having homogenous wounds to maximize the wound healing effect of the circular shaft.
  • a concentric can be a concentric with chronic soft tissue injury, coagulation disorder or hemostatic disorder.
  • the soft tissue may be organs including organs, muscles, connective tissue, fat, blood vessels, lymphatic vessels, joints, and nerves, but is not limited thereto.
  • Such soft tissue damage may mean that soft tissues such as joints, muscles, and muscle tendons of the human body are structurally damaged due to external violence or shock, strong torsion, pulling, compression, and long-term fatigue.
  • the wound treatment of animals using the activated platelet-rich plasma of the present invention in the treatment of chronic soft tissue wounds of dogs that are not treated even after treatment for a certain period of time with conventional wound treatment, simply disinfects the affected area and scrapes the necrotic tissue. It is an important treatment that promotes angiogenesis and skin regeneration of wound tissue, rather than conventional passive treatment, and it is widely used in veterinary medical industry because it can be easily extracted and applied at any time if only healthy allogenic exists. Can be used.
  • the basic platelet rich plasma (PRP) preparation of the present invention was referred to the method of Weibrich and Kleis (Tozum TF, Demiralp B. Journal of the Canadian Dental Association. 2003; 69 (10): 664.).
  • the platelet-rich plasma extracted in 1. of Example 1 is merely an aggregate of platelets that are physically concentrated, and platelet-derived healing growth factors that substantially promote healing in the wound area are not activated.
  • platelets themselves must first be activated. It is the presence of calcium that plays an important role in the activation of these platelets.
  • Example 1 of 1 To the platelet-rich plasma extracted in Example 1 of 1, a calcium chloride solution of 10 L of calcium chloride was mixed in a volume ratio of 1: 1 with respect to 100 L of physiological saline, and adjusted to pH 5 to form a liquid coating agent to activate the formulation. Platelet rich plasma was prepared.
  • a necrotic tissue debridement was performed and twice a day with saline heated with permeable ceparexin (systemic cephalexin) having excellent antimicrobial activity against Gram-negative bacilli to prevent secondary infection. It was applied to the affected area and washed.
  • permeable ceparexin systemic cephalexin
  • this conventional treatment did not show an effective treatment effect on the lesion until 14 days after the start of treatment.
  • the activated platelet-rich plasma prepared in Example 1 was mixed with a bacterial ointment containing antibiotics and formulated in the form of an ointment, and the pH of the ointment was adjusted to 5 and applied to the wound site (lesion) of the round dog. .
  • Erythropoietin and hematopoietic granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) were added to activate hematopoietic action.
  • a healthy allogenic platelet-rich plasma was applied to the affected dogs of the dogs, which had not been effectively treated with the conventional treatment of surgically removing the wound lesion.
  • PRP platelet-rich plasma
  • a donor dog a 5 year old healthy female beagle dog was selected.
  • the activated platelet-rich plasma prepared in Example 1 was applied to the affected part of the ring dog to observe the progress of the lesion for one month.
  • a composition comprising activated platelet-rich plasma of the present invention to a wound wound of a dog releases the growth factor from the activated platelet, and the released growth factor promotes regeneration of the connective tissue and induces angiogenesis.
  • the wound and promoting new vascular tissue regeneration around the wound wound it is thought that the improvement and treatment effect of the chronic wound lesion can be maximized.

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Abstract

본 발명은 동물의 동종이체(Allogenic)로부터 분리된 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물, 및 이를 이용한 동물의 창상 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 활성화된 혈소판 풍부 혈장은, 동종이체(Allogenic)로부터 채취한 혈소판 풍부 혈장을 두 번의 원심분리를 통해 분리 및 농축해 내고 칼슘을 첨가함으로써 혈소판으로부터 조직 재생에 유용한 성장인자를 방출시켜, 결체조직의 재생을 촉진하고 신생혈관 생성을 유도하여 동물의 창상 조직의 혈관 신생 및 피부 재생을 촉진시키는 효과가 우수하므로, 동물의 창상치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

활성화된 혈소판 풍부 혈장을 유효성분으로 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물
본 발명은 동종이체(Allogenic)로부터 추출한 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화시킨 후, 그 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 유효성분으로 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물, 및 이를 환축의 창상부위에 도포하는 단계를 포함하는, 동물의 창상 치료 방법에 관한 것이다.
일반적으로 창상 치유과정은 손상된 조직의 조직학적, 기능적 완전성이 복구되는 과정을 말한다. 이러한 창상 치유 과정은 다양한 매개 인자들과 관련된 세포들의 정교한 상호 작용에 의해 조절되고 매개되는 복잡한 일련의 과정이다. 창상 치유과정은 일반적으로 조직의 손상과 동시에 발현되어 지혈, 염증, 육아조직 형성, 재상피화 및 조직 재구성의 일련의 과정으로 진행되며 각각의 단계들은 일차적으로 싸이토카인이나 성장인자 등의 분자 신호들에 의해 정교하게 매개된다.
창상 치유 과정 중에서 혈소판은 조직 재생에 굉장히 중요한 역할을 담당한다. 일단 조직 및 혈관이 손상되며 순환 중인 혈소판은 조직 손상 부위에 모여 접착, 응집, 그리고 탈과립의 과정을 거친다. 혈소판 세포질 내의 과립 중 α-과립은 혈소판 유래 성장인자 (Platelet Derived Growth Factors), 혈관내피성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factors), 전환성장인자-β (Transforming Growth Factor-β), 인슐린 유사 성장인자 (Insulin-like Growth Factors) 등 창상 치유 과정에 필수적인 다양한 성장 인자들을 함유하고 있으며, 각각의 이러한 성장인자들은 손상된 조직 부위로 염증세포를 불러들이고, 세포 증식, 혈관 신생, 세포외 기질 축적 및 조직 재구성 등의 일련의 과정들을 정교하게 매개한다. 이러한 혈소판 유래 성장 인자들이 창상 치유 과정에서 치료 효과를 발휘하기 위해서는 일반적으로 정상 순환 혈소판 농도의 4~5배 이상이 농축되어 집중되어야만 한다.
만성적 창상은 일반적으로 치유에 필요한 일정 시간 동안, 창상 치유에 이용되는 일반적인 치료 방법들을 사용함에도 불구하고 치유가 되지 않는 상처 내지는 창상을 의미한다. 연부조직의 만성적 창상은 수의학 분야에서 자주 접하는 문제이면서, 동시에 보호자에게는 경제적 부담을 주며 수의사에게도 굉장히 어려운 난제 중 하나이다. 전통적인 창상 치유 치료법으로는 소독(dressing)과 괴사 조직 제거(debridement)가 있다. 하지만, 이러한 일반적인 치료법 자체는 감염원을 제거하고 환부 및 괴사 조직을 깨끗하게 만들어주는 효과는 있지만, 실질적으로 새로운 조직이 재생되는데 필요한 혈관 신생이나 치유 성장인자들에는 영향을 미치지 못하기 때문에 종종 큰 치료 효과를 보이지 못하는 경우들이 있다.
만성적 창상은 여러 가지 요인들에 의해 그 치유가 지연된다. 대부분의 이러한 만성적 창상들은 감염, 조직 괴사, 환부로의 조직 환류량 감소, 그리고 신생혈관 및 치유 성장인자의 부재들이 만성적 창상의 치유를 지연시키는 대표적인 원인이다. 창상의 치유에서 적절한 시기에 환부로의 적절한 치유 성장인자의 공급은 필수 불가결한 요소임에도 불구하고, 이러한 치유 성장인자의 부족 또는 부재는 창상의 치유를 더디게 만들어 결국 만성적 창상을 유발하고 치유를 지연시킨다.
이렇게 치유가 지연되는 만성적 창상 부위에 창상 치유 및 피부, 연부조직, 및 혈관신생에 필수적인 치유 성장인자들을 공급시켜줌으로써 만성적으로 치유가 되지 않는 창상 부위의 회복을 촉진시켜줄 수 있는 기술이 바로 혈소판 풍부 혈장(Platelet rich plasma, PRP)이다. 혈소판 풍부 혈장은 자가 혈소판을 고농축시켜 활성화 시킴으로써 창상의 치유 과정에 필수적인 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 혈관내피 성장인자 (VEGF), 전환 성장인자-β (TGF-β), 인슐린 유사 성장인자 (IGF) 등의 혈소판 유래 성장인자들의 분비를 촉진시켜 만성적 창상 치료에 효과적이다.
치유에 필요한 성장 인자들을 일일이 단일 투여하는 경우와 비교하여 혈소판 풍부 혈장을 이용하여 치유 성장인자들을 공급하여 줄 경우, 첫째로 치유에 필요한 성장인자들을 한 번에 공급해줄 수 있다는 편리성에 장점이 있음과 동시에, 둘째로는 이러한 성장인자들이 같이 공급됨으로써 단일 성장인자 공급시에는 나타날 수 없는 성장인자들 간의 상호 보완적 시너지즘(synergism)이 생길 수 있다는 장점이 있다. 또한, 마지막으로 이와 같은 방식의 성장인자 공급은 우리 몸에서 창상 치유 시 자연적으로 일어나는 성장인자의 공급 방법과 가장 유사하며 가장 생리학적이라는 생리적 유사성에 큰 장점이 존재한다.
이러한 혈소판 풍부 혈장의 유용성 때문에 지난 수십 년간 이 기술은 정형외과, 치과, 심장외과 등에 유용하게 이용되어 왔다. 또한, 수의학 분야에서도 최근 들어 혈소판 풍부 혈장을 이용한 치료 방법이 많이 이용되고 있는데, 특별히 만성적인 연부조직 창상 부위에 자가(Autologous) 혈소판 풍부 혈장을 적용함으로써 성공적으로 치료한 보고도 존재한다.
동물의 만성적 창상 부위에 대한 혈소판 풍부 혈장을 이용한 기존의 치료법은, 환축의 자가 혈소판을 고농축시킨 후 활성화하여 주입하는 자가 혈소판 풍부 혈장 주입의 방법이다. 그런데 환축견에 응고장애나 혈행 장애 등이 있어 그 혈액이 병적인 상태에 있는 경우에는, 질적으로 건강한 혈액이 아니어서 자가 혈소판 풍부 혈장을 이용한 창상 치료효과는 그 효과에 한계가 있을 수밖에 없었다. 이런 이유로 다른 건강한 동종이체로부터 혈소판 풍부 혈장을 추출하여 창상 치료에 적용할 필요성이 대두되었으나, 아직까지 수의학 분야에서 동종의 건강한 다른 개체(Allogenic)로부터 혈소판 풍부혈장을 추출하여 연부조직 창상 환부에 적용한 사례는 전무하다. 또한, 동물의 만성적 창상 부위에 대한 전통적인 치료방법인 소독과 괴사조직 제거, 자가 혈소판풍부혈장 주입의 방법 외에 효과적인 연부조직 창상치료법이 없다는 문제점이 있었다. 건강한 동종의 다른 개체로부터 채취한 혈소판풍부혈장은, 병적인 상태에 있는 환축의 전혈에서 채취한 혈소판보다 더 많은 조직 재생에 유용한 성장인자(growth factor)를 유도함으로써, 간편하고 빠르게 조직 및 신생혈관의 재생을 촉진시키는데 효과적이며, 병적인 상태의 혈소판을 이용하는 위험성 및 오류를 방지할 수 있어 동물의 만성적 창상 치료에 더욱 효과적이다.
또한, 현재까지 연부조직 치유 과정에서의 혈소판 풍부혈장의 적용에 있어서는 그 효과가 보고되고는 있으나, 실제 인간을 제외한 동물에서의 사용은 아직까지 보편화 되어 있지 않아, 이에 대한 치료 및 연구의 필요성이 요구되고 있다.
본 발명자들은 동종이체(Allogenic)로부터 혈소판 풍부 혈장을 추출하고, 그 혈소판 풍부 혈장과 혈소판 활성인자를 혼합하여 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 제조하였으며, 이와 같이 제조된 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축의 만성적 창상 부위에 적용한 결과, 환축의 만성적 연부조직 창상치료에 그 효과가 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 동종이체(Allogenic)로부터 추출한 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 유효성분으로 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 상기 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축의 창상 환부에 도포하는 단계를 포함하는 동물의 창상 치료방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 동종이체(Allogenic)로부터 추출한 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 유효성분으로 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축의 창상 환부에 도포하는 단계를 포함하는 동물의 창상 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 활성화된 혈소판 풍부 혈장은, 혈소판을 제공하는 환축 자신으로부터 추출한 자가 혈소판 풍부혈장(Platelet Rich Plasma, PRP)이 아닌, 동종이체(Allogenic)로부터 혈소판 풍부 혈장을 분리 및 농축한 후 환축의 창상부위에 적용함으로써, 환축이 응고장애, 전신 혈행 장애 등 병적인 상태의 혈액을 가지고 있어서 자가 혈소판을 창상 치료에 이용할 수 없는 경우에도 건강한 동종이체로부터의 건강한 혈소판 및 혈소판으로부터 유래한 정상적이고 건강한 치유 성장 인자들을 이용함으로써 창상 치유 촉진 효과를 극대화시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 괴사조직 제거술(debridement)을 시행한 환축견의 환부를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 연고제를 개의 창상환부에 도포하고, 5일 후 환축견의 환부를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 연고제를 개의 창상환부에 도포하고, 13일 후 환축견의 환부를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 연고제를 개의 창상환부에 도포하고, 25일 후 환축견의 환부를 나타낸 도이다.
본 발명은 동종이체(Allogenic)로부터 추출한 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화시킨 후, 그 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 유효성분으로 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.
이하 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.
본 발명의 조성물의 유효성분인 활성화된 혈소판 풍부 혈장은 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있다.
먼저, 기본적인 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 Weibrich와 Kleis의 방법(Tozum TF, Demiralp B. Journal of the Canadian Dental Association. 2003;69(10):664.)을 변형하여 분리한다.
구체적으로, 건강한 동종이체(Allogenic)로부터 구연산나트륨 (Sodium citrate)이 함유된 진공시험관으로 전혈을 채취한 후, 초고속 원심분리기로 1차 원심분리한다. 1차 원심분리에 의해 연막(軟膜: Buffy coat)을 포함한 상층액(혈장층)을 수집하고, 이를 새 진공시험관으로 옮긴 후, 2차 원심분리한 다음, 바닥층(시험관 바닥에서부터 1-2mL에 해당)의 농축된 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 수득한다.
상기 추출한 혈소판 풍부 혈장은 물리적으로 혈소판을 농축시킨 집합체일 뿐, 실질적으로 창상부위에 치유를 촉진시키는 혈소판 유래 치유 성장인자들은 활성화되지 않은 상태이다. 혈소판 내의 과립에 존재하는 혈소판 유래 치유 성장인자들을 활성화시키고 분비시키기 위해서는 먼저 혈소판 자체가 활성화 되어야만 한다. 이를 위하여 상기의 과정을 수행하여 얻은 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자를 함유하는 용액으로 활성화시켜 혈소판 유래 치유 성장인자의 분비를 촉진시킬 수 있는 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 제조한다.
상기 혈소판 풍부 혈장의 혈소판을 활성화시키기 위한 혈소판 활성인자로는, 염화칼슘, 트롬빈, 콜라겐, 세로토닌, 아데노신 이인산염(ADP) 및 아세틸콜린(ACH)을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 염화칼슘일 수 있고, 보다 바람직하게는 용매와 혼합된 염화칼슘 용액의 형태로 수행될 수 있다. 상기 용매는 인산완충용액, 생리식염수 또는 증류수를 포함할 수 있다. 또한, 염화칼슘 용액은 생리식염수 100 부피에 대하여 염화칼슘 5 내지 15 부피로 혼합될 수 있다. 염화칼슘(CaCl2)은 칼슘의 공급원으로 사용되는데 칼슘은 각각의 응고인자가 활성화되는 과정에서 필요하며, 혈소판의 활성화에도 중요한 역할을 한다. 즉, 트롬빈이 혈소판 세포막에 작용하여 막의 구조적 변화를 유발하는 과정에도 필요하며 혈소판 세포막이 피브리노겐과 작용할 때, 다른 혈소판 세포막과 접착(adhesion)이 일어나는 과정에서도 칼슘 이온이 필요하다.
활성인자에 의해 혈소판이 활성화되면 혈소판의 알파 과립(alpha granules)의 탈과립(degranulation)으로 성장인자(growth factor)가 방출되어 초기 상처 치유(wound healing)에 중요한 역할을 하게 된다. 또한 혈소판 풍부 혈장(PRP)은 생체 외 조건에서 싸이토카인(cytokine) 등을 방출하여 섬유아세포의 DNA를 합성하고, 콜라겐의 생성을 증가시켜, 콜라겐 구조를 조직화하게 한다.
상기 치유 성장인자는 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 전환성장인자-b1(TGF-b1), 섬유아세포 성장인자(FGF), 혈관내피세포성장인자(vescular endothelial growth factor, VEGF), 상피세포성장인자(EGF), 인슐린-유사 성장인자1 및 2(IGF), 혈소판-유래 혈관 형성 인자(PDAF), 혈소판-유래 표피성장인자(PDEGF), 혈소판인자 4(PF-4), 산성 섬유아세포성장인자(FGF-A), 염기성 섬유아세포성장인자(FGF-B), 전환성장인자-α(TGF-A), β-트롬보글로불린-관련 단백질(BTG), 트롬보스폰딘(TSP), 피브로넥틴, 본 왈린브랜드인자(vWF), 피브로펩티드 A, 피브로노겐, 알부민, 플라스미노겐 활성 억제제-1(PAI-1), 오스테오넥틴, 발현되고 분비될 것인 정상 T 세포 활성화 조절(RANTES), 그로-α, 비트로넥틴, 섬유소 D-이량체, 인자 V, 항트롬빈 III, 면역글로불린-G(IgG), 면역글로불린-M(IgM), 면역글로불린-A(IgA), a2-매크로글로불린, 안지오제닌, Fg-D, 엘라스타제, 각질세포성장인자(KGF), 종양괴사인자(TNF) 또는 인터루킨-1(IL-1)을 포함할 수 있으며, 이제 제한되지 않는다.
본 발명에서, "혈소판"이란 혈액의 유형성분인 혈구의 하나로, 골수 내에 있던 거대핵세포(megakaryocyte)로부터 세포질이 갈라져 나온 지름 2~3㎛의 세포 조각으로 혈액의 응고와 지혈작용에 중요한 역할을 한다. 혈소판은 혈관이 손상되어 피부나 점막 등에 출혈이 생겼을 경우 가장 먼저 활성화되는데, 혈소판이 손상된 혈관벽에 붙어 공기와 맞닿게 되면 트롬보키나아제라는 효소의 작용으로 혈장단백질 중 하나인 프로트롬빈을 트롬빈으로 바꾸고, 트롬빈이 다시 피브리노겐을 피브린으로 변화시켜 피브린이 혈액을 응고시키는 복잡한 과정을 거쳐 혈액이 응고되어 지혈작용을 하는 것이다. 이러한 혈소판이 활성화되면 다양한 성장인자 및 재생에 관여하는 인자들이 결체조직으로 방출되어 상피조직 및 피하조직을 재생, 복원시켜 피부가 개선되고, 상처회복 등에 뛰어난 효과를 가진다.
본 발명에서, "혈장"이란 혈액 속의 유핵세포인 적혈구, 백혈구 등을 제외한 액체성분으로 혈액응고 인자를 가진 담황색을 띠는 중성의 액체이다. 전혈을 항응고제를 넣고 원심분리시키면 위쪽에는 혈장이, 아래쪽에는 유핵 혈구 성분으로 나누어지므로 혈장을 수득할 수 있다. 일반적으로, 혈장의 조성은 물이 약 90%, 혈장단백질이 7~8%이고, 그 밖에 지질, 당류, 무기염류와 비단백질성 질소화합물로서 요소, 아미노산, 요산 등이 함유되어 있다.
이러한 혈장은 잘 알려진 통상의 방법, 예를 들면 원심분리, 침강 또는 여과 방법에 따라 혈액으로부터 쉽게 분리할 수 있다. 원심분리는 혈장으로부터 혈액 세포를 침강시키는데 적합한 조건하에서 실시할 수 있다. 예를 들면, 약 1500g force로 약 5 ~ 15분 동안 원심분리하는데, 이것은 적혈구 및 백혈구뿐만 아니라 실질적으로 모든 세포 단편을 침전시키는데 충분하다. 혈장을 함유한 상등액은 표준 기술에 의해 침강된 세포로부터 쉽게 분리할 수 있다.
상기 여과법은 혈액을 혈장으로부터 혈액 세포를 분리하기에 적합한 여과기에 통과시킴으로써 수행할 수 있으며, 상기 여과기는 단백질을 용이하게 투과시킬 수 있는 미세공 막인 것이 바람직하다.
혈장은 채혈 후 원심분리 또는 침전시켜 얻은 신선액상혈장 상태 또는 액상제제 상태 이외에, 사용하기 전에 여러 상태로 보존하는 방법이 알려져 있으며, 예로는 신선동결제제, 동결침전제제, 동결건조제제 또는 농축제제 등의 형태를 들 수 있다. 본 발명에서는 상기와 같은 모든 형태의 혈장을 사용할 수 있다.
본 발명의 혈소판 풍부 혈장(Platelet Rich Plasma, PRP)은 혈장 내에 혈소판이 많이 함유된 혈장으로, 원심분리기를 이용하여 전혈로부터 분리된 혈장 하단부의 혈소판이 가장 풍부하게 함유된 것이다.
본 발명에 따른 활성화된 혈소판 풍부 혈장은, 건강한 동종이체(Allogenic)로부터 채취한 혈소판 풍부 혈장을 두 번의 원심분리를 통해 분리 및 농축해 내고 칼슘을 첨가함으로써 혈소판으로부터 조직 재생에 유용한 성장인자를 방출시켜, 결체조직의 재생을 촉진하고 신생혈관 생성을 유도하여 개의 창상 조직의 혈관 신생 및 피부 재생을 촉진시키는 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장은 동물의 창상 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 창상은 비-치유 외상성 창상, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상, 골괴저, 열상, 결출상, 관통상, 총상, 절상, 화상, 동상, 피부궤양, 피부건조, 피부각화증, 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부사상균증에 의한 통증, 수술상 또는 혈관질환 창상, 타박상, 각막창상, 욕창, 와창, 당뇨성 피부미란과 같은 당뇨병 및 순환불량에 관련된 상태, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 창상, 부인과적 창상, 화학적 창상 및 여드름을 포함하는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 활성 성분으로서 수의학적으로 유효한 양의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 함유한 조성물은 수의학적으로 허용되는 담체와 함께 여러 가지 다양한 형태로 제형될 수 있다. 제형화는 당 분야에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.
제제의 형태는 이에 한정되지는 않으나 액상도포제, 분무제, 로션제, 크림제, 겔제, 파스타제, 리니멘트제, 연고제, 에어로졸, 분말제 및 경피흡수제 등의 통상적인 외용제의 형태가 포함된다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour]에 기술되어 있다.
본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축의 환부에 적용함에 있어서, 수득한 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 양이 너무 소량일 경우, 주사용수나 증류수를 첨가하여 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 부피를 증가시킬 수 있고, 액상으로 된 활성화된 혈소판 풍부 혈장 자체를 환부에 적용함에 있어 환부에 고정되지 않고 흐르거나 원하는 양만큼 도포가 되지 않을 수 있기 때문에, 이를 방지하고 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 고정력을 향상시키기 위해 항생제와 같은 연부조직 창상 시에 쓰이는 연고 제제에 섞어 도포할 수 있다. 만약, 상기와 같이 항생제와 같은 연부조직 창상 시 사용되는 연고 제제와 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 혼합물을 도포할 경우, 활성화된 혈소판 풍부 혈장이 피부에 완전히 흡수될 때까지 안정적으로 환부에 적용될 수 있다는 장점이 있다.
본 발명에 따른 수의학적 조성물은 활성화된 혈소판 풍부 혈장과 생리식염수를 일정한 부피비로 혼합하고 pH를 3.5 내지 6.5로 조절하여 액상 도포제의 형태로 제형화 할 수 있다. 다른 양태로서, 본 발명에 따른 수의학적 조성물은 상기한 활성화된 혈소판 풍부 혈장과 수용성 연고기제를 혼합하고 여기에 생리식염수를 첨가하여 연고제의 형태로 제형화 할 수 있다. 바람직한 양태로서, 본 발명에 따른 수의학적 조성물은 상기 연고제의 pH를 3.5 내지 6.5로 조절하여 제형화 할 수 있다.
본 발명에서 창상의 치유를 가속화하기 위해 겔 또는 미소구와 같은 제약 담체가 사용될 수 있다. 미국특허 제5,264,207호, WO2000/24378, WO96/13164 및 WO 94/13333에는 하나 또는 그 이상의 활성 제약 또는 화장용 물질을 위한 담체로서 작용하는 폴리머의 미소구가 기술되어 있다.
본 발명의 수의학적 조성물은 환축의 다양한 창상 증세를 치료하는데 사용할 수 있다. 이는 감염 상태, 악성, 거대 혈관 동맥 부족, 소혈관 동맥 부족, 심정맥 차단 또는 부족, 표층 정맥 부족, 림프관 장애, 내인성 순환부족, 혈액이상, 콜라겐 혈관이상, 방사선 피부염, 영양성 원인 등에 기인하는 것을 포함한 대부분의 악성 궤양에 대해 효과적이다.
본 발명의 조성물에 사용되는 상용성분이 제거된 혈장성분의 수의학적 유효량은 창상 부위의 비정상적인 세포 및 각종 세포활성물질들을 정상화시킴으로써 창상의 치료 효과를 나타내는 활성성분의 양을 말한다. 유효량은 환자의 창상 종류, 적용부위, 처리 횟수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 2 내지 5 중량％의 상용성분이 제거된 혈장성분 분말을 함유한 용량이 투여된다. 투여 횟수는 일일 1회 내지 4회일 수 있다. 또한, 본 발명의 수의학적 조성물의 일일 유효량은 분말제를 전층피부손실 창상에 적용시 0.01 내지 0.1 g/㎠, 바람직하게는 0.02 내지 0.09 g/㎠, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.07 g/㎠일 수 있다. 상기 투여는 염증기가 끝나고 새살이 돋기 위해 시작되는 증식기와 조직 재구성기에 적용하여 주는 것일 수 있다.
또한 본 발명은 상기 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축의 창상 부위에 도포하는 단계를 포함하는, 동물의 창상 치료 방법을 제공한다.
응고 장애 또는 전신 혈행 장애 등의 병적 상태가 존재하는 창상을 갖는 환축에 대한 전통적인 창상치료 방법으로는 소독(dressing)과 괴사 조직 제거(debridement)가 있다. 하지만 이러한 일반적인 치료법 자체는 감염원을 제거하고 환부 및 괴사 조직을 깨끗하게 만들어주는 효과는 있지만, 실질적으로 새로운 조직이 재생되는데 필요한 혈관 신생이나 치유 성장인자들에는 영향을 미치지 못하기 때문에 종종 큰 치료 효과를 보이지 못하는 경우들이 있었다. 이와 같은 이유로 만성적 창상이 유발되고, 이러한 만성적 창상은 여러 가지 요인들에 의해 그 치유가 지연되는데, 대부분의 이러한 만성적 창상들은 감염, 조직 괴사, 환부로의 조직 환류량 감소, 그리고 신생혈관 및 치유 성장인자의 부재들이 만성적 창상의 치유를 지연시키는 대표적인 원인들이었다.
따라서, 동종이체(allogenic)로부터 추출한 전혈로부터 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 만들어 환축의 창상 부위에 적용함으로써, 병적상태에 있는 자신의 전혈에서 채취한 혈소판에서 보다 더 많은 조직 재생에 유용한 성장인자(growth factor)를 방출하고, 방출된 성장인자는 결체조직의 재생을 촉진하여 신생혈관 생성을 유도하여 간편하고 빠르게 상처를 치유하거나, 주변에 새로운 혈관 조직 재생을 촉진시켜 만성적 창상 환부의 개선 및 치료 효과를 극대화할 수 있으며, 종래의 창상을 치료하는데 있어 단순히 환부를 소독하고 괴사조직을 긁어내는 종래의 수동적인 치료법이 아닌 보다 근본적이고 궁극적으로 창상 조직의 혈관 신생 및 피부 재생을 촉진시키기 때문에 더 높은 치료효과를 나타낼 수 있다.
구체적으로, 종래의 창상치료법인 괴사조직 제거술 시행 후, 효과적인 치료효과를 얻지 못한 환축에 대하여, 본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 도포 후 염증성 삼출액(inflammatory exudate)이 감소하였으며, 거칠거리던 조직이 성장(재생)하기 시작하였다. 또한, 치료 시작 15일까지 병변에 대해 점진적인 임상적 개선이 확인되었다. 동종이체의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 도포한지 25 후(병변 발견 37일 후)에는 피부의 딱딱함 및 부식, 짓무름, 종창이 줄어들었고, 병변의 겉으로 털(hair)이 나기 시작했으며, 괴사조직이 거의 완벽히 재생됨을 확인할 수 있었다.
결국, 본 발명은 환축이 아닌 건강한 동종이체(Allogenic)로부터 혈소판을 제공받아 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 손쉽게 제조함으로써, 환축의 혈액이 병적 상태에 있을 때에도 다른 건강한 공혈견의 혈소판과 그 혈소판으로부터 유래한 정상적이고 건강한 치유 성장 인자들을 공급할 수 있고, 병적인 상태의 혈소판과 성장인자를 사용하는 것을 피하고, 우리가 원하는 창상 치유 촉진 효과를 극대화할 수 있다.
또한, 혈소판 자체는 적혈구와 달리 항원성(Antigenicity)이 낮기 때문에 동종이체(Allogenic)에서 유래한 혈소판을 환축의 환부에 적용하더라도 이에 대한 거부 반응이나 면역 반응이 일어나는 경우는 드물다. 따라서 채혈할 수 있는 건강한 동종이체(Allogenic)만 존재한다면 언제든 쉽게 본 발명을 적용하여 더 효과적으로 창상 치유 촉진 효과를 극대화시킬 수 있다.
본 발명에서 용어 "동종"은 같은 종(species), 즉 동일한 생물분류의 모든 개체를 의미한다.
본 발명에서 용어 "동물"은 인간을 제외한 모든 동물을 의미하며, 바람직하게는 개과 동물군을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 개과 동물군으로는 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼, 승냥이 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 용어 "건강한"은 육체적/신체적으로 아무 탈이 없고 튼튼한 상태를 의미하며, 본 발명에 있어서 바람직하게는 응고 장애 또는 전신 혈행 장애 등의 병적 상태가 존재하지 않는 상태를 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어 "치료"는 조성물의 투여에 의해 창상환부에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장은 동종의 창상을 갖는 환축에게 도포되어 환축의 창상 치유 효과를 최대화 할 수 있다. 환축은 만성적 연부조직 손상, 응고장애 또는 혈행 장애를 가진 환축일 수 있다.
상기 연부조직은 장기, 근육, 결합조직, 지방, 혈관, 림프관, 관절, 신경을 포함하는 조직일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 연부조직의 손상은 인체의 각 관절, 근육, 근건 등의 연부조직이 외부의 폭력이나 충격, 강력한 비틀림, 당김, 압박 및 장기간의 피로 등으로 인해 구조적으로 손상을 일으킨 것을 의미할 수 있다.
본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 이용한 동물의 창상 치료법은, 전통적인 창상 치료법으로 일정시간 치료하여도 치료가 되지 않는 개의 만성적 연부조직의 창상을 치료하는데 있어, 단순히 환부를 소독하고 괴사조직을 긁어내는 종래의 수동적인 치료법이 아닌 보다 근본적이고 궁극적으로 창상 조직의 혈관 신생 및 피부 재생을 촉진시키는 중요한 치료법으로, 건강한 동종이체(Allogenic)만 존재하면 언제든 손쉽게 추출하여 적용할 수 있으므로 수의학 의료 산업에 널리 손쉽게 이용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 제조
1. 혈소판 풍부 혈장의 추출
본 발명의 기본적인 혈소판 풍부 혈장(Platelet Rich Plasma, PRP) 제조법은 Weibrich와 Kleis의 방법을 참고하였다(Tozum TF, Demiralp B. Journal of the Canadian Dental Association. 2003;69(10):664.).
건강한 공혈견으로부터 혈액 8ml를 채혈하고, 채혈한 혈액은 항응고제인 구연산 나트륨(sodium citrate)이 처리된 튜브에 담아 초고속 원심분리기에 넣고 629×g에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리한 혈액은 밀도에 따라 제일 아래층부터 적혈구, 백혈구, 혈장 순으로 층이 형성된다. 가장 위층인 혈장층은 일반적으로 혈소판이 풍부한 아랫층과 혈소판이 비교적 적은 상층으로 구분되는데, 이 중 혈소판이 풍부한 혈장 하층을 200㎕ 추출하였다. 이렇게 분리해낸 혈소판 풍부 혈장은 그 자체로는 치료 효과를 나타내기에는 부족하며 초고속 원심분리를 통해 다시 한번 고농축시켜야만 우리가 원하는 치료효과를 가진 고농축 혈소판 풍부 혈장을 만들 수 있으므로, 상기 분리한 혈장층을 초고속 원심분리기에서 1233×g에서 15분 동안 다시 원심분리시킨 후, 상기 과정과 동일하게 상층액 0.6 ~ 0.7 ㎖를 추출하여 최종적으로 고농축 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 얻었다.
2. 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 제조
상기 실시예 1.의 1.에서 추출한 혈소판 풍부 혈장은 물리적으로 혈소판을 농축시킨 집합체일 뿐, 실질적으로 창상부위에 치유를 촉진시키는 혈소판 유래 치유 성장인자들은 활성화되지 않은 상태이다. 혈소판 내의 과립에 존재하는 혈소판 유래 치유 성장인자들을 활성화시키고 분비시키기 위해서는 먼저 혈소판 자체가 활성화되어야만 한다. 이러한 혈소판의 활성화에 중요한 역할을 하는 것이 칼슘의 존재이다.
상기 실시예 1의 1에서 추출된 혈소판 풍부 혈장에 생리식염수 100 ℓ에 대하여 염화칼슘 10 ℓ의 염화칼슘 용액을 1:1의 부피비로 혼합하고, pH를 5로 조절하여 액상 도포제의 형태로 제형화하여 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 제조하였다.
실험예 1. 실험 동물(환축견)의 준비
본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장이 개의 창상 치료에 효과적인지 확인하기 위하여, 실험 동물(환축견)을 준비하였다.
신체 상태 점수가 2/5점인 1.7kg 무게의 2년생의 건강한 미니어쳐 핀셔(Miniature Pinscher dog)견을 준비하였다. 상기 견은 이틀 동안 급성 구토 및 무기력한 상태로 급성 췌장염 진단을 받았고, 급성 췌장염과 관련된 임상 증상은 수 일 내로 개선되었지만, 7일 동안 왼쪽 부위에 작은 점상 출혈과 함께 조직 괴사가 빠르게 진행되었다.
상기 환축견의 치료를 위하여, 괴사조직 제거술(debridement)을 시행하고, 2차 감염을 막기 위하여 그람음성간균에 뛰어난 항균력을 갖는 침투성의 세파렉신(systemic cephalexin)을 데워진 생리식염수와 함께 하루에 두 번씩 환부에 적용하여 세척해 주었다.
그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 이러한 종래의 치료법은 치료 시작 14일까지도 병변에 대해서는 효과적인 치료효과를 나타내지 못했다.
실험예 2. 창상환부 도포 및 치료방법
상기 실시예 1에 의해 제조된 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 항생제를 함유한 세균성 연고제와 혼합하여 연고제의 형태로 제형화하고, 연고제의 pH를 5로 조절하여 환축견의 창상 환부(병변)에 도포하였다. 조혈작용을 활성화시키기 위하여 에리스로포이에틴(Erythropoietin) 및 조혈성 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)를 첨가해 주었다.
창상 병변을 외과술로 제거하는 종래의 치료법으로는 효과적인 치료효과를 얻지 못했던 환축견의 환부에 건강한 동종이체(Allogenic)의 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 도포하였다. 공혈견으로서는 5년생의 건강한 암컷 비글견을 선택하였다. 상기 실시예 1에서 제조된 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축견의 환부에 도포하여 1개월간 병변의 진행 결과를 관찰하였다.
결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 괴사조직 제거술 후, 창상 병변에 대해 큰 치료효과를 얻지못했으나, 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 도포를 시작한지 5일 후 염증성 삼출액(inflammatory exudate)이 감소되었으며, 거칠거리던 조직이 성장(재생)하기 시작하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 활성화된 혈소판 풍부 혈장 도포 13일까지, 병변에 대해 점진적인 임상적 개선을 확인할 수 있었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 동종이체의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 도포한지 25 후(병변 발견 37일 후)에는 피부의 딱딱함 및 부식, 짓무름, 종창이 줄어들었고, 병변의 겉으로 털(hair)이 나기 시작했으며, 괴사조직이 거의 완벽히 재생됨을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 조성물을 개의 창상 환부에 도포하게 되면, 활성화된 혈소판으로부터 성장인자가 방출되고, 방출된 성장인자는 결체조직의 재생을 촉진하고 신생혈관 생성을 유도하여 상처를 치유하고, 창상 환부 주변에 새로운 혈관 조직 재생을 촉진시켜 만성적 창상 환부의 개선 및 치료 효과를 극대화할 수 있을 것으로 생각된다.

Claims (6)

  1. 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 활성화된 혈소판 풍부 혈장은 환축의 동종이체(Allogenic)로부터 분리된 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화된 것을 특징으로 하는, 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 혈소판 활성인자는 염화칼슘, 트롬빈, 콜라겐, 세로토닌, 아데노신 이인산염 (ADP) 및 아세틸콜린(ACH)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 창상은 비-치유 외상성 창상, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상, 골괴저, 열상, 결출상, 관통상, 총상, 절상, 화상, 동상, 피부궤양, 피부건조, 피부각화증, 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부사상균증에 의한 통증, 수술상 또는 혈관질환 창상, 타박상, 각막창상, 욕창, 와창, 당뇨성 피부미란과 같은 당뇨병 및 순환불량에 관련된 상태, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 창상, 부인과적 창상, 화학적 창상 및 여드름을 포함하는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것임을 특징으로 하는, 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물.
  5. 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축의 창상 부위에 도포하는 단계를 포함하는, 동물의 창상 치료 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 활성화된 혈소판 풍부 혈장은 환축의 동종이체(Allogenic)로부터 분리된 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화된 것을 특징으로 하는, 동물의 창상 치료 방법.
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