KR20150061806A

KR20150061806A - 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 유효성분으로 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물

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Publication number: KR20150061806A
Application number: KR1020130145977A
Authority: KR
Inventors: 정태호; 박철; 김남수; 김종훈; 백대승; 김윤혜; 오승국; 이종석
Original assignee: 중부대학교
Priority date: 2013-11-28
Filing date: 2013-11-28
Publication date: 2015-06-05

Abstract

본 발명은 동물의 동종이체(Allogenic)로부터 분리된 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물, 및 이를 이용한 동물의 창상 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 활성화된 혈소판 풍부 혈장은, 동종이체(Allogenic)로부터 채취한 혈소판 풍부 혈장을 두 번의 원심분리를 통해 분리 및 농축해 내고 칼슘을 첨가함으로써 혈소판으로부터 조직 재생에 유용한 성장인자를 방출시켜, 결체조직의 재생을 촉진하고 신생혈관 생성을 유도하여 동물의 창상 조직의 혈관 신생 및 피부 재생을 촉진시키는 효과가 우수하므로, 동물의 창상치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

활성화된 혈소판 풍부 혈장을 유효성분으로 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물{Veterinary composition for wound healing of animal containing activated platelet rich plasma}

본 발명은 동종이체(Allogenic)로부터 추출한 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화시킨 후, 그 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 유효성분으로 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물, 및 이를 환축의 창상부위에 도포하는 단계를 포함하는, 동물의 창상 치료 방법에 관한 것이다.

일반적으로 창상 치유과정은 손상된 조직의 조직학적, 기능적 완전성이 복구되는 과정을 말한다. 이러한 창상 치유 과정은 다양한 매개 인자들과 관련된 세포들의 정교한 상호 작용에 의해 조절되고 매개되는 복잡한 일련의 과정이다 (Everts, P. A., et al. (2006). Journal of ExtraCorporeal Technology 38(2): 174.). 창상 치유과정은 일반적으로 조직의 손상과 동시에 발현되어 지혈, 염증, 육아조직 형성, 재상피화 및 조직 재구성의 일련의 과정으로 진행되며 각각의 단계들은 일차적으로 싸이토카인이나 성장인자 등의 분자 신호들에 의해 정교하게 매개된다(Singer, A. J. and R. Clark (1999). N Engl J Med 341(10): 738-746.).

창상 치유 과정 중에서 혈소판은 조직 재생에 굉장히 중요한 역할을 담당한다. 일단 조직 및 혈관이 손상되며 순환 중인 혈소판은 조직 손상 부위에 모여 접착, 응집, 그리고 탈과립의 과정을 거친다 (HUNT, T. K. (1990). The Journal of Trauma and Acute Care Surgery 30: 122-128.). 혈소판 세포질 내의 과립 중 α-과립은 혈소판 유래 성장인자 (Platelet Derived Growth Factors), 혈관내피성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factors), 전환성장인자-β (Transforming Growth Factor-β), 인슐린 유사 성장인자 (Insulin-like Growth Factors) 등 창상 치유 과정에 필수적인 다양한 성장 인자들을 함유하고 있으며, 각각의 이러한 성장인자들은 손상된 조직 부위로 염증세포를 불러들이고, 세포 증식, 혈관 신생, 세포외 기질 축적 및 조직 재구성 등의 일련의 과정들을 정교하게 매개한다(Robson, M. C. (1991). Current opinion in biotechnology 2(6): 863-867.). 이러한 혈소판 유래 성장 인자들이 창상 치유 과정에서 치료 효과를 발휘하기 위해서는 일반적으로 정상 순환 혈소판 농도의 4~5배 이상이 농축되어 집중되어야만 한다(Liu, Y., et al. (2002). Wound Repair and regeneration 10(5): 336-340.).

만성적 창상은 일반적으로 치유에 필요한 일정 시간 동안, 창상 치유에 이용되는 일반적인 치료 방법들을 사용함에도 불구하고 치유가 되지 않는 상처 내지는 창상을 의미한다(Saad Setta, H., et al. (2011). International Wound Journal 8(3): 307-312). 연부조직의 만성적 창상은 수의학 분야에서 자주 접하는 문제이면서, 동시에 보호자에게는 경제적 부담을 주며 수의사에게도 굉장히 어려운 난제 중 하나이다. 전통적인 창상 치유 치료법으로는 소독(dressing)과 괴사 조직 제거(debridement)가 있다. 하지만 이러한 일반적인 치료법 자체는 감염원을 제거하고 환부 및 괴사 조직을 깨끗하게 만들어주는 효과는 있지만, 실질적으로 새로운 조직이 재생되는데 필요한 혈관 신생이나 치유 성장인자들에는 영향을 미치지 못하기 때문에 종종 큰 치료 효과를 보이지 못하는 경우들이 있다.

만성적 창상은 여러 가지 요인들에 의해 그 치유가 지연된다. 대부분의 이러한 만성적 창상들은 감염, 조직 괴사, 환부로의 조직 환류량 감소, 그리고 신생혈관 및 치유 성장인자의 부재들이 만성적 창상의 치유를 지연시키는 대표적인 원인들이다(Liu, J., et al. (2011). Transfusion and Apheresis Science 45(2): 151-155). 창상의 치유에 있어서 적절한 시기에 환부로의 적절한 치유 성장인자의 공급은 필수 불가결한 요소임에도 불구하고, 이러한 치유 성장인자의 부족 또는 부재는 창상의 치유를 더디게 만들어 결국 만성적 창상을 유발하고 치유를 지연시킨다.

이렇게 치유가 지연되는 만성적 창상 부위에 창상 치유 및 피부, 연부조직, 및 혈관신생에 필수적인 치유 성장인자들을 공급시켜줌으로써 만성적으로 치유가 되지 않는 창상 부위의 회복을 촉진시켜줄 수 있는 기술이 바로 혈소판 풍부 혈장(Platelet rich plasma, PRP)이다(Cross, K. J. and T. A. Mustoe (2003). Surgical Clinics of North America 83(3): 531-545). 혈소판 풍부 혈장은 자가 혈소판을 고농축시켜 활성화 시킴으로써 창상의 치유 과정에 필수적인 혈소판 유래 성장인자 (PDGF), 혈관내피 성장인자 (VEGF), 전환 성장인자-β (TGF-β), 인슐린 유사 성장인자 (IGF) 등의 혈소판 유래 성장인자들의 분비를 촉진시켜 만성적 창상 치료에 효과적이다(Anitua, E., et al. (2005). Journal of Orthopaedic Research 23(2): 281-286.).

치유에 필요한 성장 인자들을 일일이 단일 투여하는 경우와 비교하여 혈소판 풍부 혈장을 이용하여 치유 성장인자들을 공급하여 줄 경우, 첫째로 치유에 필요한 성장인자들을 한번에 공급해줄 수 있다는 편리성에 장점이 있음과 동시에, 둘째로는 이러한 성장인자들이 같이 공급됨으로써 단일 성장인자 공급시에는 나타날 수 없는 성장인자들 간의 상호 보완적 시너지즘(synergism)이 생길 수 있다는 장점이 있다. 또한 마지막으로 이와 같은 방식의 성장인자 공급은 우리 몸에서 창상 치유 시 자연적으로 일어나는 성장인자의 공급 방법과 가장 유사하며 가장 생리학적이라는 생리적 유사성에 큰 장점이 존재한다(Akhundov, K., et al. (2012). Annals of burns and fire disasters 25(4): 207.).

이러한 혈소판 풍부 혈장의 유용성 때문에 지난 수십 년간 이 기술은 정형외과, 치과, 심장외과 등에 유용하게 이용되어 왔다(Bikash Bose, M. and M. A. Balzarini (2002). Advances in therapy 19(4): 170-175.) (Whitman, D. H., et al. (1997). Journal of Oral and Maxillofacial Surgery 55(11): 1294-1299.) (DelRossi, A., et al. (1990). The Journal of thoracic and cardiovascular surgery 100(2): 281-286.). 또한 수의학 분야에서도 최근 들어 혈소판 풍부 혈장을 이용한 치료 방법이 많이 이용되고 있는데, 특별히 만성적인 연부조직 창상 부위에 자가(Autologous) 혈소판 풍부 혈장을 적용함으로써 성공적으로 치료한 보고도 존재한다(Kim, J. H., et al. (2009)).

동물의 만성적 창상 부위에 대한 혈소판 풍부 혈장을 이용한 기존의 치료법은, 환축의 자가 혈소판을 고농축시킨 후 활성화하여 주입하는 자가 혈소판 풍부 혈장 주입의 방법이다. 그런데, 환축견에 응고장애나 혈행 장애 등이 있어 그 혈액이 병적인 상태에 있는 경우에는, 질적으로 건강한 혈액이 아니어서 자가 혈소판 풍부 혈장을 이용한 창상치료효과는 그 효과에 한계가 있을 수 밖에 없었다. 이런 이유로 다른 건강한 동종이체로부터 혈소판 풍부 혈장을 추출하여 창상 치료에 적용할 필요성이 대두되었으나, 아직까지 수의학 분야에서 동종의 건강한 다른 개체(Allogenic)로부터 혈소판 풍부혈장을 추출하여 연부조직 창상 환부에 적용한 사례는 전무하다. 또한 동물의 만성적 창상부위에 대한 전통적인 치료방법인 소독과 괴사조직 제거, 자가 혈소판풍부혈장 주입의 방법 외에 효과적인 연부조직 창상치료법이 없다는 문제점이 있었다. 건강한 동종의 다른 개체로부터 채취한 혈소판풍부혈장은, 병적인 상태에 있는 환축의 전혈에서 채취한 혈소판에서 보다 더 많은 조직 재생에 유용한 성장인자(growth factor)를 유도함으로써, 간편하고 빠르게 조직 및 신생혈관의 재생을 촉진시키는데 효과적이며, 병적인 상태의 혈소판을 이용하는 위험성 및 오류를 방지할 수 있어 동물의 만성적 창상 치료에 더욱 효과적이다.

또한, 현재까지 연부조직 치유 과정에서의 혈소판 풍부혈장의 적용에 있어서는 그 효과가 보고되고는 있으나, 실제 인간을 제외한 동물에서의 사용은 아직까지 보편화 되어 있지 않아, 이에 대한 치료 및 연구의 필요성이 요구되고 있다.

본 발명자들은 동종이체(Allogenic)로부터 혈소판 풍부 혈장을 추출하고, 그 혈소판 풍부 혈장과 혈소판 활성인자를 혼합하여 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 제조하였으며, 이와 같이 제조된 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축의 만성적 창상 부위에 적용한 결과, 환축의 만성적 연부조직 창상치료에 그 효과가 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 동종이체(Allogenic)로부터 추출한 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 유효성분으로 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물을 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 상기 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축의 창상 환부에 도포하는 단계를 포함하는 동물의 창상 치료방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 동종이체(Allogenic)로부터 추출한 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 유효성분으로 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축의 창상 환부에 도포하는 단계를 포함하는 동물의 창상 치료방법을 제공한다.

본 발명에 따른 활성화된 혈소판 풍부 혈장은, 혈소판을 제공하는 환축 자신으로부터 추출한 자가 혈소판 풍부혈장(Platelet Rich Plasma, PRP)이 아닌, 동종이체(Allogenic)로부터 혈소판 풍부 혈장을 분리 및 농축한 후 환축의 창상부위에 적용함으로써, 환축이 응고장애, 전신 혈행 장애 등 병적인 상태의 혈액을 가지고 있어서 자가 혈소판을 창상 치료에 이용할 수 없는 경우에도 건강한 동종이체로부터의 건강한 혈소판 및 혈소판으로부터 유래한 정상적이고 건강한 치유 성장 인자들을 이용함으로써 창상 치유 촉진 효과를 극대화시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 괴사조직 제거술(debridement)을 시행한 환축견의 환부를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 연고제를 개의 창상환부에 도포하고, 5일 후 환축견의 환부를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 연고제를 개의 창상환부에 도포하고, 13일 후 환축견의 환부를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 연고제를 개의 창상환부에 도포하고, 25일 후 환축견의 환부를 나타낸 도이다.

본 발명은 동종이체(Allogenic)로부터 추출한 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화시킨 후, 그 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 유효성분으로 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물을 제공한다.

이하 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 활성화된 혈소판 풍부 혈장은 하기와 같은 방법으로 제조될 수 있다.

먼저, 기본적인 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 Weibrich와 Kleis의 방법(Tozum TF, Demiralp B. Journal of the Canadian Dental Association. 2003;69(10):664.)을 변형하여 분리한다.

구체적으로, 건강한 동종이체(Allogenic)로부터 구연산나트륨 (Sodium citrate)이 함유된 진공시험관으로 전혈을 채취한 후, 초고속 원심분리기로 1차 원심분리한다. 1차 원심분리에 의해 연막(軟膜: Buffy coat)을 포함한 상층액(혈장층)을 수집하고, 이를 새 진공시험관으로 옮긴 후, 2차 원심분리한 다음, 바닥층(시험관 바닥에서부터 1-2mL에 해당)의 농축된 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 수득한다.

상기 추출한 혈소판 풍부 혈장은 물리적으로 혈소판을 농축시킨 집합체일 뿐, 실질적으로 창상부위에 치유를 촉진시키는 혈소판 유래 치유 성장인자들은 활성화되지 않은 상태이다. 혈소판 내의 과립에 존재하는 혈소판 유래 치유 성장인자들을 활성화시키고 분비시키기 위해서는 먼저 혈소판 자체가 활성화 되어야만 한다. 이를 위하여 상기의 과정을 수행하여 얻은 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자를 함유하는 용액으로 활성화시켜 혈소판 유래 치유 성장인자의 분비를 촉진시킬 수 있는 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 제조한다.

상기 혈소판 풍부 혈장의 혈소판을 활성화시키기 위한 혈소판 활성인자로는, 염화칼슘, 트롬빈, 콜라겐, 세로토닌, 아데노신 이인산염(ADP) 및 아세틸콜린(ACH)을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 염화칼슘일 수 있고, 보다 바람직하게는 용매와 혼합된 염화칼슘 용액의 형태로 수행될 수 있다. 상기 용매는 인산완충용액, 생리식염수 또는 증류수를 포함할 수 있다. 또한, 염화칼슘 용액은 생리식염수 100 부피에 대하여 염화칼슘 5 내지 15 부피로 혼합될 수 있다. 염화칼슘(CaCl₂)은 칼슘의 공급원으로 사용되는데 칼슘은 각각의 응고인자가 활성화되는 과정에서 필요하며, 혈소판의 활성화에도 중요한 역할을 한다. 즉, 트롬빈이 혈소판 세포막에 작용하여 막의 구조적 변화를 유발하는 과정에도 필요하며 혈소판 세포막이 피브리노겐과 작용할 때, 다른 혈소판 세포막과 접착(adhesion)이 일어나는 과정에서도 칼슘 이온이 필요하다.

활성인자에 의해 혈소판이 활성화되면 혈소판의 알파 과립(alpha granules)의 탈과립(degranulation)으로 성장인자(growth factor)가 방출되어 초기 상처 치유(wound healing)에 중요한 역할을 하게 된다. 또한 혈소판 풍부 혈장(PRP)은 생체 외 조건에서 싸이토카인(cytokine) 등을 방출하여 섬유아세포의 DNA를 합성하고, 콜라겐의 생성을 증가시켜, 콜라겐 구조를 조직화하게 한다.

상기 치유 성장인자는 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 전환성장인자-b1(TGF-b1), 섬유아세포 성장인자(FGF), 혈관내피세포성장인자(vescular endothelial growth factor, VEGF), 상피세포성장인자(EGF), 인슐린-유사 성장인자1 및 2(IGF), 혈소판-유래 혈관 형성 인자(PDAF), 혈소판-유래 표피성장인자(PDEGF), 혈소판인자 4(PF-4), 산성 섬유아세포성장인자(FGF-A), 염기성 섬유아세포성장인자(FGF-B), 전환성장인자-α(TGF-A), β-트롬보글로불린-관련 단백질(BTG), 트롬보스폰딘(TSP), 피브로넥틴, 본 왈린브랜드인자(vWF), 피브로펩티드 A, 피브로노겐, 알부민, 플라스미노겐 활성 억제제-1(PAI-1), 오스테오넥틴, 발현되고 분비될 것인 정상 T 세포 활성화 조절(RANTES), 그로-α, 비트로넥틴, 섬유소 D-이량체, 인자 V, 항트롬빈 III, 면역글로불린-G(IgG), 면역글로불린-M(IgM), 면역글로불린-A(IgA), a2-매크로글로불린, 안지오제닌, Fg-D, 엘라스타제, 각질세포성장인자(KGF), 종양괴사인자(TNF) 또는 인터루킨-1(IL-1)을 포함할 수 있으며, 이제 제한되지 않는다.

본 발명에서, "혈소판"이란 혈액의 유형성분인 혈구의 하나로, 골수 내에 있던 거대핵세포(megakaryocyte)로부터 세포질이 갈라져 나온 지름 2~3㎛의 세포 조각으로 혈액의 응고와 지혈작용에 중요한 역할을 한다. 혈소판은 혈관이 손상되어 피부나 점막 등에 출혈이 생겼을 경우 가장 먼저 활성화되는데, 혈소판이 손상된 혈관벽에 붙어 공기와 맞닿게 되면 트롬보키나아제라는 효소의 작용으로 혈장단백질 중 하나인 프로트롬빈을 트롬빈으로 바꾸고, 트롬빈이 다시 피브리노겐을 피브린으로 변화시켜 피브린이 혈액을 응고시키는 복잡한 과정을 거쳐 혈액이 응고되어 지혈작용을 하는 것이다. 이러한 혈소판이 활성화되면 다양한 성장인자 및 재생에 관여하는 인자들이 결체조직으로 방출되어 상피조직 및 피하조직을 재생, 복원시켜 피부가 개선되고, 상처회복 등에 뛰어난 효과를 가진다.

본 발명에서, "혈장"이란 혈액 속의 유핵세포인 적혈구, 백혈구 등을 제외한 액체성분으로 혈액응고 인자를 가진 담황색을 띠는 중성의 액체이다. 전혈을 항응고제를 넣고 원심분리시키면 위쪽에는 혈장이, 아래쪽에는 유핵 혈구 성분으로 나누어지므로 혈장을 수득할 수 있다. 일반적으로, 혈장의 조성은 물이 약 90%, 혈장단백질이 7~8%이고, 그 밖에 지질, 당류, 무기염류와 비단백질성 질소화합물로서 요소, 아미노산, 요산 등이 함유되어 있다.

이러한 혈장은 잘 알려진 통상의 방법, 예를 들면 원심분리, 침강 또는 여과 방법에 따라 혈액으로부터 쉽게 분리할 수 있다. 원심분리는 혈장으로부터 혈액 세포를 침강시키는데 적합한 조건하에서 실시할 수 있다. 예를 들면, 약 1500g force로 약 5 ~ 15분 동안 원심분리하는데, 이것은 적혈구 및 백혈구뿐만 아니라 실질적으로 모든 세포 단편을 침전시키는데 충분하다. 혈장을 함유한 상등액은 표준 기술에 의해 침강된 세포로부터 쉽게 분리할 수 있다.

상기 여과법은 혈액을 혈장으로부터 혈액 세포를 분리하기에 적합한 여과기에 통과시킴으로써 수행할 수 있으며, 상기 여과기는 단백질을 용이하게 투과시킬 수 있는 미세공 막인 것이 바람직하다.

혈장은 채혈 후 원심분리 또는 침전시켜 얻은 신선액상혈장 상태 또는 액상제제 상태 이외에, 사용하기 전에 여러 상태로 보존하는 방법이 알려져 있으며, 예로는 신선동결제제, 동결침전제제, 동결건조제제 또는 농축제제 등의 형태를 들 수 있다. 본 발명에서는 상기와 같은 모든 형태의 혈장을 사용할 수 있다.

본 발명의 혈소판 풍부 혈장(Platelet Rich Plasma, PRP)은 혈장 내에 혈소판이 많이 함유된 혈장으로, 원심분리기를 이용하여 전혈로부터 분리된 혈장 하단부의 혈소판이 가장 풍부하게 함유된 것이다.

본 발명에 따른 활성화된 혈소판 풍부 혈장은, 건강한 동종이체(Allogenic)로부터 채취한 혈소판 풍부 혈장을 두 번의 원심분리를 통해 분리 및 농축해 내고 칼슘을 첨가함으로써 혈소판으로부터 조직 재생에 유용한 성장인자를 방출시켜, 결체조직의 재생을 촉진하고 신생혈관 생성을 유도하여 개의 창상 조직의 혈관 신생 및 피부 재생을 촉진시키는 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장은 동물의 창상 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 창상은 비-치유 외상성 창상, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상, 골괴저, 열상, 결출상, 관통상, 총상, 절상, 화상, 동상, 피부궤양, 피부건조, 피부각화증, 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부사상균증에 의한 통증, 수술상 또는 혈관질환 창상, 타박상, 각막창상, 욕창, 와창, 당뇨성 피부미란과 같은 당뇨병 및 순환불량에 관련된 상태, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 창상, 부인과적 창상, 화학적 창상 및 여드름을 포함하는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 활성 성분으로서 수의학적으로 유효한 양의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 함유한 조성물은 수의학적으로 허용되는 담체와 함께 여러 가지 다양한 형태로 제형될 수 있다. 제형화는 당 분야에 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.

제제의 형태는 이에 한정되지는 않으나 액상도포제, 분무제, 로션제, 크림제, 겔제, 파스타제, 리니멘트제, 연고제, 에어로졸, 분말제 및 경피흡수제 등의 통상적인 외용제의 형태가 포함된다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour]에 기술되어 있다.

본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축의 환부에 적용함에 있어서, 수득한 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 양이 너무 소량일 경우, 주사용수나 증류수를 첨가하여 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 부피를 증가시킬 수 있고, 액상으로 된 활성화된 혈소판 풍부 혈장 자체를 환부에 적용함에 있어 환부에 고정되지 않고 흐르거나 원하는 양만큼 도포가 되지 않을 수 있기 때문에, 이를 방지하고 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 고정력을 향상시키기 위해 항생제와 같은 연부조직 창상 시에 쓰이는 연고 제제에 섞어 도포할 수 있다. 만약, 상기와 같이 항생제와 같은 연부조직 창상 시 사용되는 연고 제제와 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 혼합물을 도포할 경우, 활성화된 혈소판 풍부 혈장이 피부에 완전히 흡수될 때까지 안정적으로 환부에 적용될 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에 따른 수의학적 조성물은 활성화된 혈소판 풍부 혈장과 생리식염수를 일정한 부피비로 혼합하고 pH를 3.5 내지 6.5로 조절하여 액상 도포제의 형태로 제형화 할 수 있다. 다른 양태로서, 본 발명에 따른 수의학적 조성물은 상기한 활성화된 혈소판 풍부 혈장과 수용성 연고기제를 혼합하고 여기에 생리식염수를 첨가하여 연고제의 형태로 제형화 할 수 있다. 바람직한 양태로서, 본 발명에 따른 수의학적 조성물은 상기 연고제의 pH를 3.5 내지 6.5로 조절하여 제형화 할 수 있다.

본 발명에서 창상의 치유를 가속화하기 위해 겔 또는 미소구와 같은 제약 담체가 사용될 수 있다. 미국특허 제5,264,207호, WO2000/24378, WO96/13164 및 WO 94/13333에는 하나 또는 그 이상의 활성 제약 또는 화장용 물질을 위한 담체로서 작용하는 폴리머의 미소구가 기술되어 있다.

본 발명의 수의학적 조성물은 환축의 다양한 창상 증세를 치료하는데 사용할 수 있다. 이는 감염 상태, 악성, 거대 혈관 동맥 부족, 소혈관 동맥 부족, 심정맥 차단 또는 부족, 표층 정맥 부족, 림프관 장애, 내인성 순환부족, 혈액이상, 콜라겐 혈관이상, 방사선 피부염, 영양성 원인 등에 기인하는 것을 포함한 대부분의 악성 궤양에 대해 효과적이다.

본 발명의 조성물에 사용되는 상용성분이 제거된 혈장성분의 수의학적 유효량은 창상 부위의 비정상적인 세포 및 각종 세포활성물질들을 정상화시킴으로써 창상의 치료 효과를 나타내는 활성성분의 양을 말한다. 유효량은 환자의 창상 종류, 적용부위, 처리 횟수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할 수 있다. 일반적으로, 2 내지 5 중량％의 상용성분이 제거된 혈장성분 분말을 함유한 용량이 투여된다. 투여 횟수는 일일 1회 내지 4회일 수 있다. 또한, 본 발명의 수의학적 조성물의 일일 유효량은 분말제를 전층피부손실 창상에 적용시 0.01 내지 0.1 g/㎠, 바람직하게는 0.02 내지 0.09 g/㎠, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.07 g/㎠일 수 있다. 상기 투여는 염증기가 끝나고 새살이 돋기 위해 시작되는 증식기와 조직 재구성기에 적용하여 주는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축의 창상 부위에 도포하는 단계를 포함하는, 동물의 창상 치료 방법을 제공한다.

응고 장애 또는 전신 혈행 장애 등의 병적 상태가 존재하는 창상을 갖는 환축에 대한 전통적인 창상치료 방법으로는 소독(dressing)과 괴사 조직 제거(debridement)가 있다. 하지만 이러한 일반적인 치료법 자체는 감염원을 제거하고 환부 및 괴사 조직을 깨끗하게 만들어주는 효과는 있지만, 실질적으로 새로운 조직이 재생되는데 필요한 혈관 신생이나 치유 성장인자들에는 영향을 미치지 못하기 때문에 종종 큰 치료 효과를 보이지 못하는 경우들이 있었다. 이와 같은 이유로 만성적 창상이 유발되고, 이러한 만성적 창상은 여러 가지 요인들에 의해 그 치유가 지연되는데, 대부분의 이러한 만성적 창상들은 감염, 조직 괴사, 환부로의 조직 환류량 감소, 그리고 신생혈관 및 치유 성장인자의 부재들이 만성적 창상의 치유를 지연시키는 대표적인 원인들이었다.

따라서, 동종이체(allogenic)로부터 추출한 전혈로부터 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 만들어 환축의 창상 부위에 적용함으로써, 병적상태에 있는 자신의 전혈에서 채취한 혈소판에서 보다 더 많은 조직 재생에 유용한 성장인자(growth factor)를 방출하고, 방출된 성장인자는 결체조직의 재생을 촉진하여 신생혈관 생성을 유도하여 간편하고 빠르게 상처를 치유하거나, 주변에 새로운 혈관 조직 재생을 촉진시켜 만성적 창상 환부의 개선 및 치료 효과를 극대화할 수 있으며, 종래의 창상을 치료하는데 있어 단순히 환부를 소독하고 괴사조직을 긁어내는 종래의 수동적인 치료법이 아닌 보다 근본적이고 궁극적으로 창상 조직의 혈관 신생 및 피부 재생을 촉진시키기 때문에 더 높은 치료효과를 나타낼 수 있다.

구체적으로, 종래의 창상치료법인 괴사조직 제거술 시행 후, 효과적인 치료효과를 얻지 못한 환축에 대하여, 본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 도포 후 염증성 삼출액(inflammatory exudate)이 감소하였으며, 거칠거리던 조직이 성장(재생)하기 시작하였다. 또한, 치료 시작 15일까지 병변에 대해 점진적인 임상적 개선이 확인되었다. 동종이체의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 도포한지 25 후(병변 발견 37일 후)에는 피부의 딱딱함 및 부식, 짓무름, 종창이 줄어들었고, 병변의 겉으로 털(hair)이 나기 시작했으며, 괴사조직이 거의 완벽히 재생됨을 확인할 수 있었다.

결국, 본 발명은 환축이 아닌 건강한 동종이체(Allogenic)로부터 혈소판을 제공받아 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 손쉽게 제조함으로써, 환축의 혈액이 병적 상태에 있을 때에도 다른 건강한 공혈견의 혈소판과 그 혈소판으로부터 유래한 정상적이고 건강한 치유 성장 인자들을 공급할 수 있고, 병적인 상태의 혈소판과 성장인자를 사용하는 것을 피하고, 우리가 원하는 창상 치유 촉진 효과를 극대화할 수 있다.

또한, 혈소판 자체는 적혈구와 달리 항원성(Antigenicity)이 낮기 때문에 동종이체(Allogenic)에서 유래한 혈소판을 환축의 환부에 적용하더라도 이에 대한 거부 반응이나 면역 반응이 일어나는 경우는 드물다. 따라서 채혈할 수 있는 건강한 동종이체(Allogenic)만 존재한다면 언제든 쉽게 본 발명을 적용하여 더 효과적으로 창상 치유 촉진 효과를 극대화시킬 수 있다.

본 발명에서 용어 "동종"은 같은 종(species), 즉 동일한 생물분류의 모든 개체를 의미한다.

본 발명에서 용어 "동물"은 인간을 제외한 모든 동물을 의미하며, 바람직하게는 개과 동물군을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 개과 동물군으로는 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼, 승냥이 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어 "건강한"은 육체적/신체적으로 아무 탈이 없고 튼튼한 상태를 의미하며, 본 발명에 있어서 바람직하게는 응고 장애 또는 전신 혈행 장애 등의 병적 상태가 존재하지 않는 상태를 의미할 수 있다.

본 발명에서 용어 "치료"는 조성물의 투여에 의해 창상환부에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장은 동종의 창상을 갖는 환축에게 도포되어 환축의 창상 치유 효과를 최대화 할 수 있다. 환축은 만성적 연부조직 손상, 응고장애 또는 혈행 장애를 가진 환축일 수 있다.

상기 연부조직은 장기, 근육, 결합조직, 지방, 혈관, 림프관, 관절, 신경을 포함하는 조직일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 연부조직의 손상은 인체의 각 관절(關節), 근육(筋肉), 근건(筋腱) 등의 연부조직(軟部組織)이 외부의 폭력이나 충격, 강력한 비틀림, 당김, 압박 및 장기간의 피로 등으로 인해 구조적(構造的)으로 손상을 일으킨 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 이용한 동물의 창상 치료법은, 전통적인 창상 치료법으로 일정시간 치료하여도 치료가 되지 않는 개의 만성적 연부조직의 창상을 치료하는데 있어, 단순히 환부를 소독하고 괴사조직을 긁어내는 종래의 수동적인 치료법이 아닌 보다 근본적이고 궁극적으로 창상 조직의 혈관 신생 및 피부 재생을 촉진시키는 중요한 치료법으로, 건강한 동종이체(Allogenic)만 존재하면 언제든 손쉽게 추출하여 적용할 수 있으므로 수의학 의료 산업에 널리 손쉽게 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 제조

1. 혈소판 풍부 혈장의 추출

본 발명의 기본적인 혈소판 풍부 혈장(Platelet Rich Plasma, PRP) 제조법은 Weibrich와 Kleis의 방법을 참고하였다(Tozum TF, Demiralp B. Journal of the Canadian Dental Association. 2003;69(10):664.).

건강한 공혈견으로부터 혈액 8ml를 채혈하고, 채혈한 혈액은 항응고제인 구연산 나트륨(sodium citrate)이 처리된 튜브에 담아 초고속 원심분리기에 넣고 629×g에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리한 혈액은 밀도에 따라 제일 아래층부터 적혈구, 백혈구, 혈장 순으로 층이 형성된다. 가장 위층인 혈장층은 일반적으로 혈소판이 풍부한 아랫층과 혈소판이 비교적 적은 상층으로 구분되는데, 이 중 혈소판이 풍부한 혈장 하층을 200㎕ 추출하였다. 이렇게 분리해낸 혈소판 풍부 혈장은 그 자체로는 치료 효과를 나타내기에는 부족하며 초고속 원심분리를 통해 다시 한번 고농축시켜야만 우리가 원하는 치료효과를 가진 고농축 혈소판 풍부 혈장을 만들 수 있으므로, 상기 분리한 혈장층을 초고속 원심분리기에서 1233×g에서 15분 동안 다시 원심분리시킨 후, 상기 과정과 동일하게 상층액 0.6 ~ 0.7 ㎖를 추출하여 최종적으로 고농축 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 얻었다.

2. 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 제조

상기 실시예 1.의 1.에서 추출한 혈소판 풍부 혈장은 물리적으로 혈소판을 농축시킨 집합체일 뿐, 실질적으로 창상부위에 치유를 촉진시키는 혈소판 유래 치유 성장인자들은 활성화되지 않은 상태이다. 혈소판 내의 과립에 존재하는 혈소판 유래 치유 성장인자들을 활성화시키고 분비시키기 위해서는 먼저 혈소판 자체가 활성화되어야만 한다. 이러한 혈소판의 활성화에 중요한 역할을 하는 것이 칼슘의 존재이다.

상기 실시예 1.의 1.에서 추출된 혈소판 풍부 혈장에 생리식염수 100 ℓ에 대하여 염화칼슘 10 ℓ의 염화칼슘 용액을 1:1의 부피비로 혼합하고, pH를 5로 조절하여 액상 도포제의 형태로 제형화하여 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 제조하였다.

실험예 1. 실험 동물(환축견)의 준비

본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장이 개의 창상 치료에 효과적인지 확인하기 위하여, 실험 동물(환축견)을 준비하였다.

신체 상태 점수가 2/5점인 1.7kg 무게의 2년생의 건강한 미니어쳐 핀셔(Miniature Pinscher dog)견을 준비하였다. 상기 견은 이틀 동안 급성 구토 및 무기력한 상태로 급성 췌장염 진단을 받았고, 급성 췌장염과 관련된 임상 증상은 수 일 내로 개선되었지만, 7일 동안 왼쪽 부위에 작은 점상 출혈과 함께 조직 괴사가 빠르게 진행되었다.

상기 환축견의 치료를 위하여, 괴사조직 제거술(debridement)을 시행하고, 2차 감염을 막기 위하여 그람음성간균에 뛰어난 항균력을 갖는 침투성의 세파렉신(systemic cephalexin)을 데워진 생리식염수와 함께 하루에 두 번씩 환부에 적용하여 세척해 주었다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 이러한 종래의 치료법은 치료 시작 14일까지도 병변에 대해서는 효과적인 치료효과를 나타내지 못했다.

실험예 2. 창상환부 도포 및 치료방법

상기 실시예 1.에 의해 제조된 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 항생제를 함유한 세균성 연고제와 혼합하여 연고제의 형태로 제형화하고, 연고제의 pH를 5로 조절하여 환축견의 창상 환부(병변)에 도포하였다. 조혈작용을 활성화시키기 위하여 에리스로포이에틴(Erythropoietin) 및 조혈성 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF)를 첨가해 주었다.

창상 병변을 외과술로 제거하는 종래의 치료법으로는 효과적인 치료효과를 얻지 못했던 환축견의 환부에 *(Allogenic)의 혈소판 풍부 혈장(PRP)을 도포하였다. 공혈견으로서는 5년생의 건강한 암컷 비글견을 선택하였다. 상기 실시예 1.에서 제조된 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축견의 환부에 도포하여 1개월간 병변의 진행 결과를 관찰하였다.

결과를 도 2 내지 도 4에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 괴사조직 제거술 후, 창상 병변에 대해 큰 치료효과를 얻지못했으나, 활성화된 혈소판 풍부 혈장의 도포를 시작한지 5일 후 염증성 삼출액(inflammatory exudate)이 감소되었으며, 거칠거리던 조직이 성장(재생)하기 시작하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 활성화된 혈소판 풍부 혈장 도포 13일까지, 병변에 대해 점진적인 임상적 개선을 확인할 수 있었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 동종이체의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 도포한지 25 후(병변 발견 37일 후)에는 피부의 딱딱함 및 부식, 짓무름, 종창이 줄어들었고, 병변의 겉으로 털(hair)이 나기 시작했으며, 괴사조직이 거의 완벽히 재생됨을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 활성화된 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 조성물을 개의 창상 환부에 도포하게 되면, 활성화된 혈소판으로부터 성장인자가 방출되고, 방출된 성장인자는 결체조직의 재생을 촉진하고 신생혈관 생성을 유도하여 상처를 치유하고, 창상 환부 주변에 새로운 혈관 조직 재생을 촉진시켜 만성적 창상 환부의 개선 및 치료 효과를 극대화할 수 있을 것으로 생각된다.

Claims

활성화된 혈소판 풍부 혈장을 포함하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 활성화된 혈소판 풍부 혈장은 환축의 동종이체(Allogenic)로부터 분리된 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화된 것을 특징으로 하는, 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 혈소판 활성인자는 염화칼슘, 트롬빈, 콜라겐, 세로토닌, 아데노신 이인산염 (ADP) 및 아세틸콜린(ACH)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 활성화된 혈소판 풍부 혈장은 치유 성장인자의 분비를 촉진시킴으로써 조직 및 신생혈관의 재생을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 치유 성장인자는 혈소판-유래 성장인자(PDGF), 전환성장인자-b1(TGF-b1), 섬유아세포 성장인자FGF), 혈관내피세포성장인자(vescular endothelial growth factor, VEGF), 상피세포성장인자(EGF), 인슐린-유사 성장인자1 및 2(IGF), 혈소판-유래 혈관 형성 인자(PDAF), 혈소판-유래 표피성장인자(PDEGF), 혈소판인자 4(PF-4), 산성 섬유아세포성장인자(FGF-A), 염기성 섬유아세포성장인자(FGF-B), 전환성장인자-α(TGF-A), β-트롬보글로불린-관련 단백질(BTG), 트롬보스폰딘(TSP), 피브로넥틴, 본 왈린브랜드인자(vWF), 피브로펩티드 A, 피브로노겐, 알부민, 플라스미노겐 활성 억제제-1(PAI-1), 오스테오넥틴, 발현되고 분비될 것인 정상 T 세포 활성화 조절(RANTES), 그로-α, 비트로넥틴, 섬유소 D-이량체, 인자 V, 항트롬빈 III, 면역글로불린-G(IgG), 면역글로불린-M(IgM), 면역글로불린-A(IgA), a2-매크로글로불린, 안지오제닌, Fg-D, 엘라스타제, 각질세포성장인자(KGF), 종양괴사인자(TNF) 및 인터루킨-1(IL-1)으로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 동물은 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼 및 승냥이를 포함하는 개과 동물군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 창상은 비-치유 외상성 창상, 방사선조사에 의한 조직의 파괴, 찰과상, 골괴저, 열상, 결출상, 관통상, 총상, 절상, 화상, 동상, 피부궤양, 피부건조, 피부각화증, 갈라짐, 터짐, 피부염, 피부사상균증에 의한 통증, 수술상 또는 혈관질환 창상, 타박상, 각막창상, 욕창, 와창, 당뇨성 피부미란과 같은 당뇨병 및 순환불량에 관련된 상태, 만성궤양, 성형수술 후 봉합부위, 척추상해성 창상, 부인과적 창상, 화학적 창상 및 여드름을 포함하는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것임을 특징으로 하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 크림, 겔, 입자, 분말, 시트, 패드, 페이스트, 패치, 액제 및 스폰지로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 제형화되는 것을 특징으로 하는 동물의 창상 치료용 수의학적 조성물.
활성화된 혈소판 풍부 혈장을 환축의 창상 부위에 도포하는 단계를 포함하는, 동물의 창상 치료 방법.
제9항에 있어서, 상기 활성화된 혈소판 풍부 혈장은 환축의 동종이체(Allogenic)로부터 분리된 혈소판 풍부 혈장을 혈소판 활성인자와 혼합하여 활성화된 것을 특징으로 하는, 동물의 창상 치료 방법.
제9항에 있어서, 상기 동물은 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼 및 승냥이를 포함하는 개과 동물군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 동물의 창상 치료 방법.