JP2013537889A - 活性化白血球馴化上清および創傷治癒のための使用 - Google Patents

Abstract

治療用の活性化白血球馴化上清、それらの作製方法、および該馴化上清を使用して、創傷の修復または治癒促進のための方法が開示される。
【選択図】 図１

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１０年９月９日に出願された仮出願番号第６１／３８１，２９６号に基づく利益を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

創傷治癒のプロセスには、白血球としても知られる、白色の血液細胞の働きが関与している。白血球には、顆粒球、単球、およびリンパ球が含まれる。異なる種類の顆粒球としては、好中球、好塩基球、および好酸球が挙げられる。単球は、壊死組織片または侵入した外来物質の貪食を担う、マクロファージへと分化する。３種の一般的な種類のリンパ球は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞である。Ｔ細胞およびＢ細胞は、体内の抗原認識において、重要な役割を果たす（Parkin, 2001）。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のレベルを変化させることにより、感染細胞を特定し、感染細胞を破壊する（Moretta, 2008）。

創傷治癒のプロセスは、３つの重複する段階で発生する（Li, 2007; Broughton, 2006; Tsirogianni, 2006; Singer, 1999; Martin, 1997）。第一段階は炎症段階である。炎症段階は、創傷部位への好中球の動員、その後の単球の動員を特徴とし、これらは創傷部位で、細菌を死滅させ、貪食する（Agaiby, 1999）。

増殖段階として知られる第２の創傷治癒段階は、新たな肉芽組織の形成を含む。線維芽細胞は増殖して創傷空間に移動し、細胞外マトリックスのコラーゲンおよび他の成分を合成する（Greiling, 1997）。同時に血管新生が発生し、栄養および酸素を代謝的に活性な新しい肉芽組織に提供する（Tonnesen, 2000）。無傷の表皮由来のケラチノサイトが一時的なマトリックス上を移動し始め、増殖を開始し、新たな上皮組織を誘導する（Kim, 1992）。

再構築は、創傷治癒の第３段階かつ最終段階である。線維芽細胞の筋線維芽細胞への分化を特徴とし、筋線維芽細胞は収縮して、創傷の両端を互いに近付ける（Tomasek, 2002）。分解および再合成によるコラーゲン線維の再構築は、コラーゲン線維の再配向により、創傷部に活力を与えることができる（成長因子によって厳密に制御されるプロセス）（Werner, 2003）。

治癒プロセスにおける白血球の関与は、主に、白血球によるサイトカインおよび成長因子の産生に関連している（Keen, 2008）。白血球サブセットの動員は、種々の白血球サブセットを活性化して選択的に創傷部へと誘導する化学走化性サイトカイン（ケモカイン）、例えばインターロイキン（ＩＬ）−８、成長調節タンパク質α（ＧＲＯ−ａ）、および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）により制御されている（Rossi and Zlotnik, 2000）。顆粒球はプロテアーゼを産生し、反応性酸素はマクロファージが炎症性サイトカインおよび成長因子を産生するのを仲介する（Riches, 1996）。インターロイキン１−αおよび１−β（ＩＬ−１−αおよびＩＬ−１−β）、ＩＬ−６、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αを含む、炎症性サイトカインは、創傷修復の炎症段階および増殖段階の両方において、重要な役割を果たす。これらのサイトカインはまた、免疫応答も制御する。血管新生は、低酸素、一酸化窒素（ＮＯ）、ＶＥＧＦおよび線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ−２）により増強される（Liekens, 2001）。ＴＧＦ−βは、線維芽細胞を動員すること、ならびに線維芽細胞によるコラーゲンＩ、ＩＩＩ、およびＶ、プロテオグリカン類、フィブロネクチンおよび他のＥＣＭ成分の合成を促進することにより、線維形成過程に貢献する。ＴＧＦ−βは、同時に、プロテアーゼを阻害する（C.U. Niesler, and M.W.J. Ferguson, 2001）。血小板により、ならびに活性化されたマクロファージ、内皮細胞、および線維芽細胞によっても放出されるＰＤＧＦは、線維芽細胞および平滑筋細胞の動員および増殖の制御において、主要な役割を果たす（C.H. Heldin and B. Westermark, 1999）。同様に、リンパ球は、免疫エフェクター細胞であるだけでなく、成長因子をも産生し（Blotnik, 1994）、創傷治癒の後期の間、組織再構築に貢献する。

創傷治療における課題は、しばしば、糖尿病、冠動脈疾患および高血圧などの多様な病状を有する患者において、より困難となる。これらの疾患は、種々の生理的状態によって、血管合併症を悪化させるという共通の影響を有する。創傷による合併症は、罹患率および死亡率の増加を招き得る（Doshi, 2008）。

従来の創傷治療法としては、創面切除、抗生物質治療、および種々の被覆材が挙げられる（Moran, 2008; Fonder, 2008）。従来の治療に抵抗性である創傷は、難治性創傷とも呼ばれる。これらの創傷は、生活の質の低下を招き、罹患率および死亡率の増加を招き得る。従って、創傷治癒のための有効な組成物および方法が、必要とされ続けている。

本発明の一態様は、活性化白血球により馴化された、実質的に細胞を含まない上清−活性化白血球馴化上清（activated leukocyte conditioned supernatant:「ＡＬＣＳ」）の作製方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は以下のステップ含む：ａ）ヒト白血球を、白血球を活性化させる時間および温度の条件下（例えば、約９０分間から約２４時間、約室温から約３７℃の温度にて、およびいくつかの実施形態においては、約８時間〜約２０時間、室温にて）でインキュベートする（本明細書では、第１インキュベーションとも呼ぶ）、ｂ）白血球を低浸透圧ショックに付す（例えば、白血球を、生理学的に許容できる水溶液、例えば蒸留水に接触させることにより）、ｃ）ステップｂの白血球に、等張性を回復するのに有効な量で、生理学的に許容できる塩溶液を添加する、ｄ）ステップｃの白血球を、培地、例えば血清（白血球と同一または異なる血液試料から得てもよい）と混合して、インキュベーション組成物を作製する、ｅ）組成物を、培地を馴化する時間および温度の条件下でインキュベートし、それによりＡＬＣＳを作製する（本明細書では、第２インキュベーションとも呼ぶ）、およびｆ）実質的に細胞を含まないＡＬＣＳを作製するために、少なくともｅ）のインキュベーション組成物由来の白血球および他の細胞物質の一部を分離する。

別の実施形態において、本発明は、以下のステップを含む、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）の作製方法に関する：ａ）ヒト白血球を、白血球を活性化させる時間および温度の条件下でインキュベートする、ｂ）白血球を低浸透圧ショックに付す、ｃ）ステップｂ）の白血球に、等張性を回復する量で塩溶液を添加し、次いで、得られた溶液から白血球を分離する、ｄ）ステップｃ）の白血球を血清と混合して、インキュベーション組成物を作製する、ｅ）インキュベーション組成物を、インキュベーション組成物中の少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させる時間および温度の条件下でインキュベートする、およびｆ）実質的に細胞を含まないＡＬＣＳを作製するために、白血球および他の細胞物質をｅ）のインキュベーション組成物から分離する。

いくつかの実施形態においては、ステップａ）のインキュベーションを、約１２℃〜約２８℃の温度で、約８時間〜約２０時間の範囲の時間行う。他の実施形態においては、ステップａ）のインキュベーションを、約１８℃〜約２４℃の温度で、約８時間〜約１２時間の範囲の時間行う。さらなる他の実施形態においては、ステップａ）のインキュベーションを、１２℃〜約２８℃の温度で、約９０分間から２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、または１２時間〜約２０時間の範囲の時間で行う。さらなる他の実施形態においては、ステップａ）のインキュベーションを、最高約３７℃までの温度で、５時間〜約２４時間までの範囲の時間行う。

いくつかの実施形態においては、ステップａ）を、白血球が接着する容器中、および／または白血球アゴニストもしくは接着分子を含む足場を含む容器中で実施する。

いくつかの実施形態において、ステップｂ）は、白血球を水または低張塩溶液に、約２５秒〜約４５秒間接触させることを含む。

いくつかの実施形態において、ａ）の白血球およびｄ）の血清は、同一の提供者由来である。他の実施形態において、ａ）の白血球およびｄ）の血清は、異なる提供者由来である。

いくつかの実施形態においては、ｄ）の血清を以下により得る：ｇ）個々のヒト血漿試料を凝固剤と接触させることであり、ここでａ）の血漿および白血球は、同一または異なる提供者由来であってよいこと、および、ｈ）凝固した固形物を除去することであって、ここでｇ）の接触は、ａ）のインキュベーションと実質的に同時に行われる。ある実施形態においては、ｇ）の血清を、白血球に接触させる前に凍結させること。さらに、ある実施形態においては、血漿はＡＢ＋の提供者由来である。ある実施形態において、凝固剤はＣａＣｌ₂である。

さらなる他の実施形態において、本発明は、以下を含む、実質的に細胞を含まないＡＬＣＳ活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）の作製方法に関する：ａ）活性化白血球を得ること、ｂ）活性化白血球をインキュベーション培地と接触させ、インキュベーション組成物を作製すること、ｃ）インキュベーション組成物を、インキュベーション組成物中で少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させるのに十分な温度および時間にてインキュベートすること、およびｄ）白血球をインキュベーション組成物から除去して、実質的に細胞を含まないＡＬＣＳ活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）を作製すること。

ＡＬＣＳの作製方法に関する実施形態のいずれにおいても、インキュベーション組成物を、室温で約８時間〜約１８時間、最大７２時間までインキュベートしてもよい。あるいは、インキュベーション組成物を、約３７℃で、約１時間〜約５時間、インキュベートしてもよい。

加えて、ＡＬＣＳの作製方法に関する実施形態のいずれにおいても、方法はさらに、ＡＬＣＳを、凍結、凍結乾燥またはフリーズドライすることを含んでもよい。

同様に、ＡＬＣＳの作製方法に関する実施形態のいずれにおいても、方法はさらに以下を含んでもよい：最初のＡＬＣＳの作製後に残った白血球を、第２の血清または他の生理学的媒体と混合して、第２のインキュベーション組成物を作製すること；第２のインキュベーション組成物を、インキュベーション組成物中の少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させる時間および温度の条件下でインキュベートし、それによりＡＬＣＳの第２の試料を作製すること；および、実質的に細胞を含まないＡＬＣＳの第２の試料を作製するために、白血球および他の細胞物質を第２のインキュベーション組成物から分離すること。

血清を利用するこれらの実施形態において、血清は、血漿試料から得てもよく、血漿試料は、約３７℃で凝固剤と接触させた、同一または異なる全血試料（すなわち、同一または異なるヒト由来の）から得てもよい。いくつかの実施形態において、接触は、ａ）の白血球のインキュベーションと実質的に同時であってもよく、その後凝固した血漿試料から血清を分離してもよい。他の実施形態において、血清または血漿は、商業的または非営利の供給業者から入手してもよく、および新鮮、または保存に適合した形態、例えば冷凍のどちらであってもよい。

いくつかの実施形態においては、活性化白血球による上清の馴化を、一般的に、約１時間〜約１８時間、および約２２℃〜約３７℃の範囲である、時間および温度の条件下で実施する。

別の態様において、本発明は、本発明の方法により作製された、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清に関する。

さらなる別の態様において、本発明は、少なくとも約１０００ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−８、少なくとも約１０〜２０ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６、および少なくとも約２０ｐｇ／ｍＬのヒトＴＮＦαを含む、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清に関する。

他の態様において、本発明は、創傷治療における使用のための、本発明の実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態において、創傷は、褥瘡性潰瘍、褥瘡、下肢潰瘍、腱炎、胸骨の深創傷、術後創傷、胴部の難治性術後創傷、大伏在静脈採取後の大伏在静脈の創傷、静脈性潰瘍、火傷、戦場での創傷、または裂肛である。いくつかの実施形態において、下肢潰瘍は、糖尿病患者におけるものである。いくつかの実施形態において、創傷は、静脈性潰瘍、褥瘡、または術後潰瘍である。

他の態様において、本発明は、創傷における感染症発症を阻害するための、本発明の実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清のうちのいずれかに関する。いくつかの実施形態において、創傷は、外傷を原因とするものである。ある実施形態において、外傷は、手術を原因とするものである。

本発明の別の態様は、創傷治癒の促進とも呼ばれる、創傷治療の方法に関し、本明細書に記載の、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化血清（ＡＬＣＳ）（本明細書に記載の作製方法により作製されたＡＬＣＳを含む）、またはＡＬＣＳおよび被覆材、足場、もしくはマトリックスを含む製品を、創傷に投与または他の方法により適用することを含む。従って、本発明は、創傷治療または創傷治癒促進の方法における、本明細書に記載の、実質的に細胞を含まないＡＬＣＳ（本明細書に記載の作製方法により作製されたＡＬＣＳを含む）、またはＡＬＣＳおよび被覆材、足場、もしくはマトリックスを含む製品の使用にも関する。

いくつかの実施形態において、創傷は、褥瘡性潰瘍、褥瘡、下肢潰瘍、腱炎、胸骨の深創傷、術後創傷、胴部の難治性術後創傷、大伏在静脈採取後の大伏在静脈の創傷、静脈性潰瘍、火傷、戦場での創傷、または裂肛である。いくつかの実施形態において、下肢潰瘍は、糖尿病患者におけるものである。いくつかの実施形態において、創傷は、静脈性潰瘍、褥瘡、または術後潰瘍である。

本発明の別の態様は、本明細書に記載の、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化血清（ＡＬＣＳ）（本明細書に記載の作製方法により作製されたＡＬＣＳを含む）、またはＡＬＣＳおよび被覆材、足場、もしくはマトリックスを含む製品を、創傷部に投与または他の方法により適用することを含む、創傷における感染症発症の阻害方法に関する。従って、本発明は、創傷における感染症発症の阻害方法における、本明細書に記載の実質的に細胞を含まないＡＬＣＳ（本明細書に記載の作製方法により作製されたＡＬＣＳを含む）、またはＡＬＣＳおよび被覆材、足場、もしくはマトリックスを含む製品の使用にも関する。

いくつかの実施形態において、創傷は外傷を原因とするものである。ある実施形態において、外傷は手術を原因とするものである。

本発明のＡＬＣＳの創傷への適用を含む実施形態のいずれにおいても、ＡＬＣＳを創傷中に注入してもよく、創傷周囲の組織中に注入してもよく、開放創に適用してもよく、または被覆材を介して創傷に適用してもよい。さらに、本発明のＡＬＣＳの創傷への適用を含む実施形態のいずれにおいても、ＡＬＣＳは、自己の血液試料であっても、同種異系の血液試料由来であってもよい。

他の態様において、本発明は、本発明の実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清、および被覆材、足場、またはマトリックスを含む製品に関する。いくつかの実施形態において、被覆材は、ガーゼ、包帯、非癒着性メッシュ、膜、箔、泡、または組織接着剤である。他の実施形態において、被覆材は、ペースト、クリーム、軟膏、非透過性もしくは半透過性の膜もしくは箔、親水コロイド、ハイドロゲル、またはそれらの組み合わせから選択される、保湿性バリアである。さらなる他の実施形態において、被覆材は抗菌性被覆材である。

足場またはマトリックスを含むこれらの実施形態において、足場またはマトリックスは、移植前に固体であってもよい。あるいは、足場またはマトリックスは、移植後に凝固するゲルであってもよい。

本明細書において、上清の「馴化（conditioning）」および「馴化上清（conditioned supernatant）」という用語は、正常な生理学的レベルを超える濃度のサイトカイン（少なくともＩＬ−８）および成長因子を有し、創傷治癒に有効である上清を指す。液体画分から容易に分離することが出来る細胞ペレットの形態に白血球を凝集させる、遠心分離または重力沈降法により、白血球を分離するステップｆ）を実施して、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清の一実施形態を調製してもよい。

本発明は、いくつかの利点を提供し、それらには、例えば、高濃度のサイトカインおよび成長因子を含むが実質的に細胞を含まない、有効な創傷治癒組成物が含まれる。この特徴は、そうでなければ白血球と有害に相互作用する可能性もある、創傷治癒に有用な麻酔薬および他の薬剤との、協調した使用を可能にする。組成物の実質的に細胞を含まない性質はまた、免疫細胞、例えば顆粒球およびリンパ球に因る有害な副作用の可能性をさらに減少させる。従って、より高濃度の白血球を使用して上清を馴化することにより、上清中の生物学的に活性なアゴニストを増加させることが出来る。組成物は、出発材料の点に関して、提供者−患者適合のための厳密な基準なく作製することが出来る。組成物は、凍結または凍結乾燥しやすく、従って使用の点に関して、より長い有効期間および多用途性を提供する。例えば、一回分の一部を凍結し、追加の投与に使用することもでき、従って同一の提供者から追加の血液を得る必要がなくなる。この特長はまた、より均一でより安全な製品を提供する。さらに、液体画分からの除去後、短期間の保管後または直ちに、活性化白血球を使用して、血清の新たな部分を馴化することができる。従って、該方法は、馴化血清の追加回数分の調製のための、活性化白血球の再利用を可能にする。

本発明のＡＬＣ組成物の作製方法の代表的システムの最初の部分を、模式的に表した図であり、その部分は血液保存バッグまたは容器であるバッグＡ〜Ｃ（セット１）を含み、バッグＡには、提供者から採取した濃厚赤血球、バッグＢには血漿、およびバッグＣには白血球（全血からの最初の分離の後、一般にバフィーコートと呼ばれる層を形成する）が入っている。 図２Ａは、本発明のＡＬＣ組成物の作製方法の代表的システムの第２の部分を、模式的に示した図であり、その部分は、赤血球（RBC）が入ったバッグＡがシステムから取り外され、図１のバッグＢおよびＣがバッグ１〜５（セット２）に接続された後の７つのバッグのセットを含む。 図２Ｂは、図２Ａのバッグ１〜５の代わりに使用することができる、６つのバッグのセットを示す図である。

本明細書において、血液は、全血またはその構成部分（例えば、血漿、白血球、血小板または赤血球細胞）のいずれかとして定義される。本発明のＡＬＣＳ内に存在し得る可溶性因子の量は、全血中のものに比べ、少なくても多くてもよい。

本明細書において「約」という用語は、＋／−０．５％〜＋／−２０％の偏差の許容範囲を有する任意の値（およびその間にある値、例えば、±１％、±１．５％、±２％、±２．５％、±３％、±３．５％、±４％、±４．５％、±５％、±５．５％、±６％、±６．５％、±７％、±７．５％、±８％、±８．５％、±９％、±９．５％、±１０％、±１０．５％、±１１％、±１１．５％、±１２％、±１２．５％、±１３、±１３．５％、±１４％、±１４．５％、±１５％、±１５．５％、±１６％、±１６．５％、±１７％、±１７．５％、±１８％、±１８．５％、±１９％、±１９．５％および±２０％）として（数値範囲の下限および上限を含む）あらゆる値に関連して使用される。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される、単数形である不定冠詞（「ａ」、「ａｎ」）、「または」および定冠詞（「ｔｈｅ」）は、文脈上、他に指示されない限り複数形を含む。

本発明を実施するための出発材料は、いくつかの供給源から得ることができる。全血または１つ以上のその成分（例えば、白血球および血漿）は、自己供給源または同種異系供給源から得られることができる。本発明の一実施形態において、血液試料は、最終的にＡＬＣＳで治療される患者から採取され、これを本明細書において、自己血液試料または自己血液供給源と呼ぶ。いくつかの実施形態において、（１つまたは複数の）供給源、すなわち血液またはその成分が、対象のＡＬＣＳレシピエント以外の個人から得られる場合、これを同種異系血液試料または同種異系供給源と呼び、これらの出発材料は、従来血液銀行から得られることができる。これらの試料に、血液銀行が赤血球細胞の抗原に対する不規則抗体および輸血伝達性疾患に関するスクリーニングを行うことができる。より具体的には、スクリーニングは、アボットＰＲＩＳＭ計測器を使用して以下に対する抗体で行うことができる：Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ １／２、ＨＴＬＶおよび梅毒（−ＨＣＶ、Ｈｂｓ抗原、抗ＨＩＶ １／２ Ｏ＋および抗ＨＴＬＶ Ｉ／ＩＩ）。試料に、分子法（ＮＡＴ−核酸試験）によるＨＩＶ、ＨＣＶおよびＨＢＶに関するスクリーニングも行うことができる。分子スクリーニングを市販の計測器、例えば、カイロン社のＴＩＧＲＩＳ装置を使用して実行することができる。

同種異系供給源が関与する実施形態において、試料を対象のＡＬＣＳレシピエントと同じ血液型のドナーから得ることができる。他の実施形態において、試料を対象のＡＬＣＳレシピエントと異なる血液型を含む任意の血液型のドナーから得ることができる。例えば、白血球は、実質的にＡＬＣＳを調製する過程で除去されるので、血漿または血清を使用する場合、血漿および血清において万能ドナーであるＡＢ＋型の血液のドナーなどの代替供給源から得られることができる。血漿および／または血清は新鮮であるか、（例えば、１〜６℃にて２４時間未満）保存され、乾燥または前処理（例えば、感染性因子低減化血漿および／または血清、ならびに溶剤／界面活性剤（ＳＤ）処理した血漿および／血清）することができる。本発明のいくつかの実施形態を作製するために使用される血漿は新鮮であり得、または１〜６℃にて２４時間未満で保存され得、または新鮮な凍結血漿もしくは乾燥血漿または感染性因子低減化血漿あるいは溶剤／界面活性剤（ＳＤ）処理した血漿であってもよい。白血球を任意の血液型の患者から得ることができる。供給源に関わらず、（１つまたは複数の）試料の全ての必要な加工を高度に専門化した機器を必要とせず実施することができる。

次に、本発明のＡＬＣＳ組成物を作製する実施形態の例を、相互連結された２セットの滅菌バッグを含有するシステムを示した図１および２を参照して説明する。このシステムは外部の環境にさらされないように密封されている。具体的には、この２セットを連結するチューブは合わせて接合され、すなわち、滅菌連結デバイス（例えば、テルモ社製ＴＳＣＤ（登録商標）−ＩＩ 品番 ＭＥ−２０３ＡＨ）を使用して１つのシステムを形成するように結合されている。より具体的には、滅菌基準にたいする準拠を確保するため、チューブの接合および切断を特殊なウェハーを典型的に約３００℃にて予熱することにより行うことができる（しかし、より低い温度またはさらに高い温度で予熱することにより、滅菌を効果的に行うことができる）。この高温により、接合手順の滅菌性が高められる。さらに滅菌性を確実にするため、接合をクラス１０００００の封じ込め施設内のクラス１００の生物学的安全キャビネット内で行うことができる。

これらの図に示されるように、このシステムは、２つの滅菌バッグのセットを含む。バッグＡ、ＢおよびＣを含むセット１は、一般に輸血に使用される標準的な市販の３連のバッグのセットである。典型的に約４００〜約５５０ｍｌの容量のヒトの血液試料が、静脈穿刺により血液銀行で採取され、バッグＡに入れられた後、標準的な技法を使用し、バッグＡ、ＢおよびＣにその成分毎に分画される。例えば、血液試料を含むバッグＡを遠心分離する。遠心分離後、血液成分を、例えば、バクスター社により製造された血液成分抽出器を使用して分離する。白血球を含有するバフィーコートをバッグＣに入れ、血漿をバッグＢに入れ、赤血球はバッグＡに残る。このようにして、このプロセスの結果として、バッグＡは、充填された赤血球を含み、バッグＢは血漿を含み、バッグＣは白血球を含有するバフィーコート（およびおそらく残留血漿および残留赤血球）を含む。別法として、血液成分を当技術分野で公知のアフェレーシス技法により全血から分離することができる。

次いで、バッグＡを３つのバッグのセットから切り離す。図２に示されるように、次いでバッグＢおよびＣを特注の輸血バッグ１〜５（セット２）に接合し、活性化白血球懸濁液およびその後ＡＬＣＳを作製するために使用するシステムを形成する。これらの実施形態に記載されるように、バッグ１〜５は、それぞれ５００ｍｌ、５０ｍｌ、５０ｍｌ、１００ｍｌおよび５００ｍｌの容量である。上記のように、接合を、滅菌連結デバイスを用いて行う。

バッグ１は、白血球の第１のインキュベーションおよび第２のインキュベーション双方のために使用されるが、滅菌濾過された空気２００ｍｌを含有する。バッグ１がガス透過性である場合、空気のバッグを必要としない。ガス透過性のバッグも、白血球に接着性となるように処理または改変することができる。例えば、バッグは接着性ビーズなどの足場および／または補体タンパク質、インターフェロン−α、インターフェロン−γおよびインターロイキン−１２などの白血球アゴニストを含有することができる。バッグ表面への白血球の接着は、可溶性アゴニストを放出する性質に有益となり得る。バッグは接着性プラスチックまたは接着性となるように処理（コロナ放電、液体ガスプラズマなど）、または細胞外マトリックスタンパク質で被覆あるいは化学修飾した通常のプラスチックから作製することができ得る。足場は様々な形状であってよく、具体的に、マクロビーズであってよく、生物分解性であってよく、または生物分解性でなくてよい。足場すなわちビーズは生物分解性であってよく、または生物分解性でなくてよく、例えば、コラーゲン、もしくはＰＬＡ、ＰＧＡ（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）または類似の合成ポリマー、ヒアルロン酸、アルギン酸、あるいはフィブリンシーラー製であってよい。ビーズは合成ハイドロゲルビーズ、ゼラチンビーズ、刺激を活性し、もしくは抗体を刺激する接着性受容体で被覆したビーズであってよい。次いで足場すなわち接着細胞を有するビーズを、他の全ての細胞と合わせて遠心分離することができる。さらに、製品に特に所望されない刺激は足場すなわちビーズと合わせて排除される。

バッグ２は、溶液（例えば、２０ｍｌの塩化ナトリウム緩衝液（８．９１％ＮａＣｌ、ＵＳＰ）または無機イオンを含有する任意の他の生理学的に許容される溶液、ショ糖などの有機オスモライト、あるいは乳酸加リンゲル（ハルトマン）液などのそのいくつかの組み合わせ）を含有し、これは白血球を低浸透圧ショック後に等張性に戻すのに役立つ。塩化ナトリウム溶液を２００ｍｌの蒸留水に添加した場合（バッグ５）、０．９％ＮａＣｌ溶液となる。バッグ３は、２０ｍｌの滅菌濾過された空気を含有する。バッグ４は、溶液（例えば、約６０ｍｌの塩化カルシウム緩衝液（１．１７％ＣａＣｌ₂二水和物、ＵＳＰ））を含有し、これはバッグＢの血漿を凝固させ、血小板と血清への分離を促進するよう作用する。バッグ５は約２００ｍｌの水を含有する。

他の実施形態において、図２Ｂに示される６個のバッグのセットを、図２Ａに示されるバッグ１〜５の代わりに使用し得る。追加のバッグは、滅菌室の生成場所の滅菌性の維持を助ける。本方法のこの実施形態において、上記のようにバフィーコート、血漿およびＲＢＣに分離後、白血球をバッグＣから滅菌バッグ１に移し、血漿をこれも滅菌されている６番目のバッグに入れた後、６バッグのシステムを元の３連のバッグのセットから分離する。

このセットを１単位としてパッケージとし、高圧蒸気を使用して滅菌し、これにより患者への二次感染の危険がかなり減少する。

次いで、白血球をバッグＣからバッグ１に移し、バッグを垂直な位置または平らな位置に保持しながら、時間および温度を含む活性化条件下においてインキュベートし、活性化させるようにする。

本発明の目的のために、本発明の種々の態様および実施形態において、「白血球の活性化」は、少なくとも１段階を含むプロセスとして定義され、これにより細胞（白血球）を不活性から機能的に活性する状態に移し、この状態は、生物学的に活性な物質の合成または合成前の物質、例えば、ＩＬ−８などのサイトカインの細胞質から細胞膜への転移、あるいは細胞外培地への放出が伴う。

「上清」は、遠心分離、重力による沈降、濾過または他の細胞除去方法により実質的に細胞を含有していない状態にされた細胞外培地である。

本発明の目的のために、本発明の種々の態様および実施形態において、「実質的に細胞を含まない」上清は、約１×１０⁶個／ｍｌより少ない白血球を含有する上清として定義される。いくつかの実施形態において、実質的に細胞を含まない上清は、約１×１０⁵個／ｍｌ、約１×１０⁴個／ｍｌ、約１×１０³個／ｍｌ、約１×１０²個／ｍｌまたは１×１０¹個／ｍｌより少ない白血球を含有する。いくつかの実施形態において、実質的に細胞を含まない上清は、白血球を検出できないものである。

インビボでの白血球の活性化は、細胞の血管壁に近く、およびこれに沿った遊走を含むことができ、これには、白血球の内皮壁への接着性、拡散および溢出を増加させる、Ｐ−セレクチン（およびＣＤ４２ｂ発現の増加）が介在し、内皮細胞のリガンドであるＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２と相互作用する活性化ＣＤ１１ｂ、細胞外マトリックスタンパク質（ラミニン）との相互作用を介した炎症巣への遊走および呼吸バースト、脱顆粒、食作用およびサイトカインの放出などの炎症性刺激に対する機能的反応がかなりの程度介在する。

本発明の目的のために、白血球の活性化は、以下のいくつかの指標の少なくとも１つであるが、多くの場合、２つ以上により示される。白血球の活性化の１つ指標は、顆粒球、単球およびリンパ球を含む白血球集団上のＣＤ１１ｂ受容体の活性形態の発現の増加および／またはセレクチン接着受容体であるＣＤ６２Ｌの発現レベルの低下があり、これは白血球表面から排出し、ＣＤ１１ｂを介して白血球の内皮細胞への強力な接着を促進させる。いくつかの実施形態において、白血球はまた、リンパ球特異的活性化マーカーであるＣＤ６９レベルの増加を呈し、（ｐ−セレクチンを介してバフィーコート内の残留血小板を含む活性化顆粒球と単球との間の相互作用の結果として）血小板マーカー４２Ｂを発現し、および／またはＩＬ−８の生成の増加を呈し得る。さらに白血球活性化の他の指標には、タンパク質またはポリペプチド、脂質、糖、接着分子として機能する酸素ラジカルおよび他の生化学部分、ＩＬ−８を含むサイトカイン、成長因子、酵素、転写因子および細胞シグナル受容体および細胞シグナル伝達物質のうちの１つ以上の生成の増加を含み得る。これらの分子のいずれの発現レベルの変化も、インキュベーションさせることなく、（本明細書に記載のように）「新鮮なバフィーコート」に含有される白血球の観点から評価する。白血球が活性化すると、活性化を維持し、本明細書に記載のように、高い活性化レベル、例えば、かなり高いＣＤ１１ｂの発現レベルまたは高いもしくはかなり高いＣＤ６９の発現レベルおよびかなり低いＣＤ６２Ｌの発現レベルを獲得し得る。さらに、活性化すると、白血球はまた、ＩＬ−８、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＶＥＧＦなどのサイトカインを生成する能力を増加させる。白血球活性化を示す細胞表面マーカーおよび分泌型可溶性因子の他の例は、実施例に記載される。したがって、「活性化白血球組成物」は、活性化の指標の少なくとも１つを呈する白血球を含む組成物である。いくつかの実施形態において、活性化白血球はさらに血小板を含む。

いくつかの実施形態において、白血球を単に室温で静置させることによりインキュベーションする。本発明の目的のために、室温は、約１２℃〜約２８℃、およびいくつかの実施形態において、約１６℃〜約２５℃、約１８〜２５℃および約２０〜２５℃の温度を指す。インキュベーション時間は、温度により変化し得、一般に、約３０分〜約２４時間で変化する。白血球を活性化するために必要なインキュベーション時間は、インキュベーションを行う温度におよそ反比例する。したがって、インキュベーション時間は、高温時に短くなる。例えば、白血球を室温で静置させる実施形態において、インキュベーション時間は、一般に、約９０分〜２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３以上および２４時間以上の範囲である（およびその部分的な範囲として、例えば、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間以上のいずれかの最短時間がある）。好ましい実施形態において、インキュベーション時間は、約３、４、５、６、７または８時間〜約２０時間の範囲である。より好ましい実施形態において、白血球のインキュベーションは、約１８℃〜約２４℃にて約８時間〜約１２時間で起こる。他の実施形態において、白血球のインキュベーションは、例えば、室温以上〜約３７℃にて熱にさらすことを含む。高温でのインキュベーション時間は、一般に、３０、４５、６０または９０分〜約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２時間（および約２４時間までのさらなる時間増分以上）のいずれかの範囲である（その部分的な範囲には、例えば、３０、４５、６０または９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間などのいずれかの最短時間がある。）

インキュベーション後、白血球懸濁液に、一般に低浸透圧ショックを行う。好ましい実施形態において、低浸透圧ショックは即時に（すなわち、任意の干渉ステップまたは不要な間を入れずに、前ステップの完了時に、典型的には２分未満で）行われる。例えば、各図に記載のシステムでは、低浸透圧ショックはバッグ５から、白血球を含有するバッグ１に蒸留水を移すことにより開始され得る。低浸透圧ショック処理は、典型的に約２４〜４５秒間で行われる。ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少が少ないと考えられるため、この範囲内での、より短い方の時間が好ましい。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、種々のサイトカイン（例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１７）を生成することが知られており、これは、創傷治癒に有益であり得る。このステップの後に、好ましくはこの直後に、白血球を等張性に戻す。再度、実施形態の例として、各図に記載のシステムを参照すると、これはバッグ２からバッグ１に塩化ナトリウム溶液を移すことにより達成される。塩化ナトリウム溶液の体積の、細胞懸濁水溶液の体積に対する比は、一般に約１：１０である。

等張性を戻す処理の後に、システム全体を遠心分離する。このプロセスは、前の２ステップの過程に添加された水および塩溶液を除去し、白血球が（赤血球の）溶血液にさらされることを防ぐ。遠心分離の結果として、白血球はペレットを形成する。遠心分離後、バッグ１由来の上清をバッグＣに移し、遠心分離の結果としてバッグ１に形成された白血球のペレットを血清または白血球により馴化させるために使用される他の培地に再懸濁させる。

一実施形態において、血清は一連の個別のステップにより得られ、これを第１の白血球インキュベーションと同時に行うことができ、ＣａＣｌ₂などの凝固剤と血漿を接触させることを必要とする。このプロセスにより、大部分がフィブリン鎖の血塊および血小板の凝集体が形成される。この処理の結果として、得られた血清は、一般に約０〜約０．２×１０³個／μＬの範囲の残留血小板レベルを有する。したがって、この実施形態において、バッグ４由来のＣａＣｌ₂をバッグＢに移す。バッグＢは、ここでは血漿およびＣａＣｌ₂の組成物を含有し、典型的には約３７℃で凝集する。この実施形態において、血漿は、白血球が活性化のためにインキュベーションされた時間と実質的同じ時間で凝固剤と接触したままであるが、血漿は、異なる時間および実質的に短い時間、例えば約９０分〜約２４時間で凝固剤と接触させたままであってよい。

等張性に戻し、遠心分離した後に得られたバッグ１の白血球のペレットを（白血球と同じまたは異なる血液試料から得られることができる）バッグＢからの約２０ｍｌ〜約２００ｍｌ以上の血清と混合させ、この場合は血清を含むインキュベーション組成物を形成する。

バッグシステムの例を使用して調製された活性化白血球について記載したが、白血球が不活性から機能的に活性する状態に移るような時間に白血球をインキュベーションし、白血球に低浸透圧ショックを行い、白血球組成物の等張性を戻すことにより調製された任意の組成物を使用し、活性化白血球馴化上清の調製時に使用する活性化白血球を提供することができる。

さらに、血清（具体的にヒト血清）が多くの場合、インキュベーション組成物に使用されるが、サイトカイン、成長因子および／または活性化白血球由来の他の可溶性成分の放出を補助する生理学的培地である限り他の培地を使用することができる。例えば、血漿が血清の代わりに使用され得る。使用され得る他のインキュベーション培地はさらに、培養培地または生理食塩水もしくは糖およびアミノ酸などの細胞生存性および細胞機能性に不可欠な他の成分（例えば、乳酸加リンゲル液、酢酸加リンゲル液、ハンク平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、アール平衡塩溶液（ＥＢＳＳ）、標準クエン酸生理食塩水（ＳＳＣ）、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）、ゲイ平衡塩溶液（ＧＢＳＳ））の添加が可能な生理食塩緩衝液を含む。生理食塩溶液および培養培地をヒト血清または臨床グレードの動物血清あるいは血清置換物で補充することができ得る。インキュベーション組成物は、別にまたは加えて、血清タンパク質、例えば、ヒトアルブミンもしくはウシアルブミン、γ−グロブリン、トランスフェリンまたは異なる組織由来の他のタンパク質、移植タンパク質あるいは移植抽出物を含有し得る。さらに、インターフェロン−γなどの（１つまたは複数の）アゴニストをインキュベーション組成物に添加し、細胞から可溶性アゴニストの放出を促進することができる。

インキュベーション組成物を、上清を馴化させる時間および温度条件下においてインキュベーションし、そうして活性化白血球馴化上清を生成する。これらの条件は約室温（すなわち、約１２℃〜約２８℃およびいくつかの実施形態において、約１６℃〜約２５℃、約１８〜２５℃および約２０〜２５℃）〜約３７℃を含む。一般に、インキュベーション時間は、３０、４５、６０または９０分〜約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３６、４８、６０、〜約７２時間以上のいずれかの範囲である。いくつかの実施形態において、組成物を、室温にて約１〜約４８時間、例えば、約１８℃〜約２４℃にて約８時間〜約１８時間または約１時間、約２４時間あるいは約４８時間インキュベーションする。他の実施形態において、組成物を約３７℃にて約１〜約５時間または約３０分、約６０分あるいは約５時間インキュベーションする。結果として、上清は、白血球が多くのサイトカイン、成長因子および他の可溶性生物学的活性分子を上清に分泌するという点で馴化されるようになり、これは、プロセスの終わりに正常以上の（すなわち、正常な非病原性のドナーから単離された血清より高い、かつ自己血清の場合、創傷のある患者の血清より高い）濃度において上清に存在する。サイトカインの生成および分泌を刺激するため、インターフェロン−γなどのアゴニストをインキュベーション組成物に添加し得る。実施例に示されるように、第２のインキュベーションの結果として、白血球は、高い活性レベル、例えば、より高いＣＤ１１ｂおよび特にＣＤ６９の発現レベル、より低いＣＤ６２Ｌの発現レベルならびにＩＬ−８および他のサイトカインおよび成長因子の生成の増加を獲得する。

この第２のインキュベーション後、白血球を実質的に、例えば、遠心分離、重力により沈降、濾過または他の細胞除去法により除去する。いくつかの実施形態において、白血球を完全に除去し、細胞非含有のＡＬＣＳを得る。例えば、バッグシステムを利用するこれらの実施形態において、バッグシステム全体を再度、（バッグ１の白血球ペレットをＡＬＣＳから分離するため）遠心分離する。別法として、白血球および馴化血清を含むバッグ１を遠心分離の前にシステムから分離し、（図２に図示されていない）新たな空のバッグをバッグ１に接合、すなわち結合し、次いで、これらの２つのバッグを遠心分離し、白血球ペレットをＡＬＣＳから分離する。遠心分離後、バッグ１の液体部分をシステムの残りの空のバッグまたは新たなバッグのいずれかに移す。

白血球を遠心分離により除去する実施形態において、一般に遠心力は３００ｇ〜１００００ｇ、遠心時間は５分〜６０分の範囲である。残留血小板を減少または排除することが望ましい実施形態において、血小板もペレットになるように、１０００ｇより高いｇ力を使用する。残留赤血球、ＲＢＣ残留物および他の残骸を減少または排除することが望ましい実施形態において、高速（約１００００ｇ）を使用することができる。

本発明の一態様において、ＡＬＣＳは、少なくとも１つのサイトカイン、成長因子またはＩＬ−８、ＰＤＧＦ、抗体−１、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＴＮＦαまたはＩＬ−１βから選択された可溶性伝達物質の濃度が、そのＡＬＣＳをもたらしたインキュベーション組成物を調製するために使用された同じ培地であるが、培地と活性化白血球組成物の接触前の同じサイトカイン、成長因子または可溶性伝達物質の濃度の少なくとも約１．２５、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上である。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＬＣＳは、少なくとも１つのサイトカイン、成長因子またはＩＬ−８、ＰＤＧＦ、抗体−１、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＬ−１βまたはその組み合わせあるいはその部分的組み合わせから選択された可溶性伝達物質の濃度がすなわち、標準偏差を含み、または含まないかのいずれかにおいて、表７に記載の非馴化血清のＩＬ−８、ＰＤＧＦ、抗体−１、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＴＮＦαまたはＩＬ−１βの濃度の少なくとも約１．２５、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上である。いくつかの実施形態において、少なくともＩＬ−８、少なくともＰＤＧＦ、少なくとも抗体−１、少なくともＶＥＧＦ、少なくともＩＬ−６、少なくともＴＮＦαまたは少なくともＩＬ−１βに対して高濃度である。他の実施形態において、ＩＬ−８、ＰＤＧＦ、抗体−１、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６、ＴＮＦαまたはＩＬ−１βの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つまたは７つ全てに対して高濃度である。

この手順の次に、実質的に細胞非含有のＡＬＣＳを凍結もしくは凍結乾燥またはフリーズドライすることができる。防腐剤（例えば、抗酸化剤、トレハロースなどの糖、塩化ナトリウム）などの添加剤が、サイトカインおよび成長因子の活性を維持させる点から有益であり得る。白血球のペレットを同様に保存することができ、そうして他の培地を馴化させるために再利用し、追加のＡＬＣＳを得ることができる。

血清および／または血漿を利用する実施形態において、本発明の種々の態様における使用のための血清および／または血漿を、（同じまたは異なる血液試料由来に関わらず）活性化白血球組成物として同時に調製することができるが、他の実施形態において、血清および／または血漿は、独立して活性化白血球組成物として調製されることを記載しておく。例えば、血清および／または血漿を市販のまたは非営利供給業者の血液製剤から得ることができる。最近に、血清および／または血漿を１つ以上のドナーから得ることができ、または一定期間保存していてもよく、凍結保存されてもよい。さらに、血清および／または血漿を調製するために使用される血液試料は、（同じドナー由来に関わらず）活性化白血球を調製するために使用されるものと同じである必要はないため、これらの調製は、活性化白血球組成物の調製と同じ物理的場所または同じ時間になされる必要はない。

ＡＬＣＳが使用前に保存される実施形態において、室温にて、冷蔵または凍結して保存することができる。ＡＬＣＳが室温にて保存される実施形態において、その生成後に最大約５日間、例えば、その生成後に約１２、２４、４８、７２時間以上の範囲の保存期間を有する。

ＡＬＣＳが冷蔵で保存される実施形態において、少なくとも約７日間以上、例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７または８週間あるいは約１〜２週間、約１〜３週間、約１〜４週間、約１〜５週間、約１〜６週間、約１〜７週間または約１〜８週間の保存期間を有する。

ＡＬＣＳを凍結して保存する実施形態において、凍結して保存後、必要時に解凍することができる。いくつかの実施形態において、凍結ＡＬＣＳは、少なくとも約１週間〜１カ月または少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１カ月〜１年、または少なくとも約１年、少なくとも約２年もしくは少なくとも約３年の保存期間を有する。

他の実施形態において、ＡＬＣＳ組成物を、全ての溶液の容量を同等に減らした、より少量の血液試料から調製することができ、小さいバッグを使用することができる。さらに、これらの異なる大きさのバッグおよび異なる用量の血清の使用により、異なる濃度の可溶性物質を含むＡＬＣＳが生成される。これらの実施形態においてでも、同種異系血液試料または自己血液試料を出発材料として使用することができる。より少量の使用により、他の状況では健常な免疫システムを有するが、ある種の外傷による創傷（例えば、戦場および戦闘状態）に苦しむ患者を治療する緊急状況において、外部の血液銀行を使用することなく、臨床医が自律的に血液採取を行うことができる。これらの実施形態において、伝染性の疾患および抗原の試験の手間を省くことができる。しかし、このような場合、難治性の創傷のある患者は、有効なＡＬＣＳ調製物に臨床的に許容される血液ドナーではない。この状況が起きた場合、ＡＬＣＳは、本明細書に記載の手段により同種異系のドナーから生成されるだろう。

創傷に苦しむ患者は、生理学的に障害があり得、または創傷以外は健常であり得る。例えば、既に損傷した代謝系により、糖尿病患者および他の医学的に危険な患者は、患者自身の白血球がこの手順に適切でない可能性があるため、異種の血液由来のＡＬＣＳの使用候補である。しかし、外傷患者の例などのように、他の状況では健常な患者も本発明のＡＬＣＳ組成物に良好な候補となる。

本発明は、いかなる種類の創傷の治療、および治癒を促進させるのにも有用である。いくつかの実施形態において、ＡＬＣＳ、例えば、実質的に細胞非含有のＡＬＣＳを唯一の活性創傷治癒剤として創傷に投与する。他の実施形態において、他の治療様式と併用する。例えば、標準的なシリンジまたは同様な投薬デバイスを用いた投薬の簡易性が、本発明のＡＬＣＳ組成物を安全かつ使いやすくしている。

本発明の治療に適している創傷は、典型的に生体組織の火傷、刺傷、切傷または裂傷の形態である。皮膚の創傷は、表皮、真皮または、全層の創傷の場合は皮下組織を貫通し得る。したがって、本発明の組成物および方法を用いた治療に適している代表的な創傷の種類は、火傷（例えば、火または皮膚に対して強い腐食性のある薬剤にさらされたことにより生じる）、潰瘍（例えば、褥瘡性潰瘍または任意の他の圧迫潰瘍、静脈性潰瘍および糖尿病性潰瘍）、腱炎、開心手術後などの深部胸骨創傷、冠血流再建術後の大伏在静脈への外科手術による創傷および大伏在静脈摘出に対する外科手術による創傷ならびに腹部外科手術および任意の他の種類の外科手術後の術後創傷がある。他の創傷は、銃撃、ナイフまたは皮膚に切傷または裂傷を生じ得る任意の他の物体により生じる創傷を含む、戦闘または他の激しい活動中に被るなどの外傷を生じるものである。口腔の創傷（例えば、歯）、ならびに投薬の副作用としてまたは種々の病状の症状（例えば、カポジ肉腫に関連した痛み）として生じる創傷、内部創傷（例えば、裂肛などの筋組織の断裂）および胃または腸の潰瘍などの胃腸管に対する創傷または病変もまた、本発明の治療に適し得る。

ＡＬＣＳを血管不全により悪化した任意の創傷を治療するために使用することができる。本発明の目的のために、血管不全は、罹患領域へのかん流不全を生じる不十分な血液循環を指す。このような不全は、外傷（例えば、骨折に隣接する血管系への損傷）または種々の病状（例えば、糖尿病およびアテローム性動脈硬化）により生じる恐れがある。いずれの例においても、外傷または疾患が誘発した場合であれ、血管不全は有効な創傷治癒の可能性を低下させる。ＡＬＣＳはこれらの患者の創傷治癒転帰を改善する場合に有用であり得、本明細書に記載の方法により投与されるべきである。さらに、治療のアルゴリズムは創傷の重症度または種類あるいは血管不全の程度により限定されるべきではない。ＡＬＣＳは最も重篤な創傷および血管不全を示す患者により効果的であり得る。

活性化白血球馴化上清は、具体的に糖尿病性足部潰瘍および褥瘡性潰瘍の治療に有用である。褥瘡性潰瘍は、寝たきりの患者の体表面上の長期圧迫および妨げられた血流により生じる皮膚および下層組織の慢性圧迫潰瘍である（Berlowitz, 2007）。褥瘡性潰瘍は、高齢者の疾病率および死亡率の原因となる。ＩＶ期の圧迫潰瘍の少なくとも４８％は治療１年後においても治癒していないままである（Girouard, 2008）。褥瘡に苦しむ患者はまた、通常、糖尿病および高血圧などの併発病状を有する。これらの病状はさらに、褥瘡の治療の成果を複雑にする。

他の態様において、本発明は、本発明の組成物を創傷に投与することを含む創傷の感染の発症を阻害する方法に関する。一実施形態において、創傷は外傷により生じる。別の実施形態において、創傷は外科手術により生じる。

創傷を治療する方法が関与する態様において、創傷はまた、本発明の組成物を含む製品を創傷に投与することにより治療され得る。

一般に、活性化白血球馴化血清の投薬は、ＡＬＣＳを創傷にまたは創傷周辺の組織に直接１つ以上の注入手段により実行される。ＡＬＣＳは直接開放性創傷に投薬され得る。シリンジ内の試料全体を配置することができ、臨床医は臨床パラメーターに基づいて必要であると決定した場合、追加のＡＬＣＳを投与することを選択することができる。

ＡＬＣＳは種々の部位の創傷に注入することができる。一実施形態において、注入は、創傷の全長に対して約１ｃｍ毎〜約３ｃｍ毎に行う。各注入部位にて、０．１〜０．３ｍｌのＡＬＣＳを注入する。他の実施形態において、シリンジ全体を創傷内の単一の部位に１回で注入することができる。

創傷への注入において、ルアーロックシリンジまたはシリンジおよび針の間にロック機能がある任意の他の市販のシリンジを使用することが好ましい。創傷、具体的に圧迫創傷の生物学的空間は、多くの場合限定されている。創傷に注入する場合、圧力がシリンジに生じ、針と分離する危険がある。ロックしたシリンジを使用すると、この危険が排除される。１８Ｇ以上の針を吸引に使用する場合、創傷への注入においては２２〜３５Ｇの大きさの針に交換する。

創傷組織に注入が可能でない場合、ＡＬＣＳを創傷の傷口に直接投薬することができる。この方法の投薬は、シリンジまたはチューブを用いた直接投薬を使用して行われることができる。

ＡＬＣＳを創傷に、またはその周りに被覆材の補助とともに投薬することができる。乾燥被覆材は、ガーゼおよび救急絆、非粘着性メッシュ、膜および箔、泡状物質および組織接着剤を含む。保湿保護バリア被覆材には、ペースト、クリームおよび軟膏、非透過性もしくは半透過性の膜もしくは箔、親水コロイド、ハイドロゲルおよび配合剤を含む。生物活性被覆材は、抗菌性被覆材、双方性被覆材、単一成分の生物学的被覆材および配合剤（例えば、軟膏、ゲル、フィブリンシーラント、成長因子および血管新生因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、コラーゲン））を含む。いくつかの実施形態において、創傷をＡＬＣＳに含浸させた滅菌ガーゼで包む。乳酸加リンゲル（ハルトマン）溶液などの組成物を染み込ませることができる、例えば、滅菌ガーゼパッドなどの被覆材、アルギン酸含有被覆材、ポリウレタン被覆材またはカルボキシメチルセルロース被覆材を適用して、創傷を被覆し、続いて乾燥被覆材を適用する。対象の創傷に強い感染性がある場合、その時、Ｓｉｌｖｅｒｌｏｎなどの銀被覆材を適用することができる。注入後の被覆材の選択は、臨床医の決定に基づく。購入可能性、過去の臨床成功歴および患者の耐性は全て、創傷被覆材の選択で考慮される要因である。創傷を例えば滅菌水および石鹸で洗浄するため、被覆材を定期的に、例えば約２４時間後に取り除くことができる。

別の実施形態において、ＡＬＣＳを、投与前に生理学的に不活性および／または吸収性マトリックスまたは足場と組み合わせる。マトリックスまたは足場をヒトへの移植に適した任意の材料から形成することができる。例えば、マトリックスまたは足場はコラーゲン、ヒアルロン酸またはゼラチン、泡状物質あるいはその組み合わせを含む任意の生体適合性材料を含み得る。コラーゲンはヒト組織または他のコラーゲン生成哺乳類動物の組織から調製されたコラーゲンを含む任意の供給源から得られることができる。ＡＬＣＳおよびマトリックス／足場材料の組み合わせは、圧入の手段により、または注入によりヒトへ投与される泡状物質、ゲルまたはパテを形成することができる。これにより、患者に有益となる部位へのＡＬＣＳの徐放性送達が可能になる。泡状物質は、フィブリンシーラントを含み得る。いくつかの実施形態において、ＡＬＣＳおよびマトリックス／足場材料の混合物は、商業的に調製され、ヘルスケア業者に予混合して提供される。他の実施形態において、ヘルスケア業者がＡＬＣＳおよびマトリックス／足場をヒトに投与する前に混合する。

臨床医がさらに投薬が必要であるかを決定すると、ＡＬＣＳを創傷に、例えば、４週間後に１回、または１回以上投薬することができる。考慮され得る要因には、創傷の寸法（幅、長さおよび深さ）の増大、膿、発熱または再治療が必要であるような治療抵抗性の創傷感染を示す任意の他の徴候または症状を含む。再治療に加えて、外科的創面切除のための紹介が、臨床医が適切と思われる任意の時点で示され得る。

ＡＬＣＳを、加温（治療的加熱）、電気刺激、磁力、レーザー光線療法、サイクロイド振動療法および超音波などの任意の他の従来の創傷治療と併用することができる。また、幼虫治療、皮膚代替物、培養角化細胞（エピセル、ジェンザイム・バイオサージェリー）、ヒト皮膚代用品（ダーマグラフト、スミス・アンド・ネフュー社）、死体由来の処理済みの真皮（アロダーム、ライフセル社）、二層の皮膚等価物（アプリグラフ、オルガノジェネシス）、トランスサイト（スミス・アンド・ネフュー社）、成長因子（ＰＤＧＦは現在、局所使用において許可された唯一の成長因子である）およびフィブリンシーラントなどの生物学的療法とともに使用することができる。いくつかの実施形態において、ＡＬＣＳを、ＫＣＩにより製造される市販の創傷療法であるＶＡＣと併用する。ＶＡＣは創傷に陰圧を加えることにより創傷治癒を促進する。これらの実施形態において、ＡＬＣＳは、ＶＡＣ療法の前に創傷に投薬されることが好ましい。さらに他の実施形態において、ＡＬＣＳは、高圧療法と併用する（Thackham, 2008）。例えば、ＡＬＣＳを、患者が受ける高圧療法の直前に創傷に投薬することができる。ＡＬＣＳはまた、低エネルギー衝撃波療法と併用することができる（例えば、創傷長１ｃｍ当たり約０．１ｍＪ／ｍｍ²、５Ｈｚのインパルス）。Dumfarth, et al., Ann. Thorac. Surg. 86:1909-13 (2008)を参照のこと。

治療後、創傷を長さ、幅および高さ測定に対して評価することができる。典型的に、創傷は、これらのパラメーターの測定全てが無視できるほどである場合、治癒したと考えられる。ＡＬＣＳは鎮痛効果も得られることができる。

次に、本発明の（１つまたは複数の）態様を、以下の非限定的実施例に従い説明する。

実施例１−細胞活性化の分析
血清の馴化における本発明の好ましい実施形態に従い作製された活性化白血球組成物を細胞表面マーカー、すなわち、種々の白血球集団（顆粒球、単球およびリンパ球）のＣＤ１１ｂ、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ６９により特徴づけた。

ＣＤ１１ｂはＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）および他のリガンドの接着受容体である。大部分は顆粒球および単球／マクロファージに発現するが、低いレベルでリンパ球にも発現する。細胞表面のＣＤ１１ｂの発現は、白血球が活性化する場合に増加する。さらに、ＣＤ１１ｂは構造を変化させる。ＣＤ１１ｂの活性化形態は、抗体ＣＢＲＭ１／５により認識される。ＣＤ１１ｂの非活性化形態は、異なる抗体（Ｄ１２）により認識される。

ＣＤ６２Ｌは、セレクチンファミリー由来の接着受容体である。ＣＤ６２Ｌは、顆粒球、単球およびリンパ球を含む全ての白血球のクラスで構成的に発現される。活性化すると、白血球はその表面からＣＤ６２Ｌを急速に排出する。

ＣＤ６９はリンパ球活性化抗原である。ＣＤ６９の発現は、活性化するとリンパ球表面で非常に早期に増加する。

白血球を次の３つの時点、すなわち生成プロセスの開始直前（新鮮なバフィーコート（ＦＢＣ））、第１のインキュベーション直後（インキュベーションされたバフィーコート（ＩＢＣ））および活性化プロセスの終わり（ＥＡＰ）（つまり低浸透圧ショック後）で試料採取し、その後血清と共に３７℃にて９０分間の第二のインキュベーションを行った。各時点で、白血球を、対応する活性化マーカーに対して特異的なモノクローナル抗体で標識した後、フローサイトメトリーにより分析した。

抗体染色のために、各時点の細胞をＰＢＳ／０．０２％アジ化ナトリウムで洗浄し、ＦＡＣＳ染色溶液（ＰＢＳ、２％正常マウス血清、０．０２％アジ化ナトリウム）に０．５×１０⁶個／１００μｌにて再懸濁させた。１００μｌの分量の細胞懸濁液を適切なモノクローナル抗体と＋４℃の暗室にて３０分間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞を赤血球溶解緩衝液で処理し、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳキャリバーフローサイトメトリー（ベクトン・ディッキンソン）にて分析した。抗ＣＤ１１ｂ抗体および抗ＣＤ６２Ｌ抗体をフィコエリトリン（ＰＥ）に複合体化させ、ＣＤ６９抗体をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）に複合体化させた。白血球集団間でより区別するため、ＣＤ１１ｂで標識された細胞を、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）に複合体化させた単球マーカーＣＤ１４に対する抗体でも二重標識し、さらにＣＤ６２Ｌ抗体で標識した細胞を顆粒球マーカーＣＤ１５−ＡＰＣでも二重標識した。Ｔリンパ球およびＢリンパ球を識別するため、ＣＤ６９抗体で染色した細胞を、抗ＣＤ３−ＡＰＣ抗体および抗ＣＤ１９−ＡＰＣ抗体でさらに二重染色した。同じ条件下において、無関係であるが、アイソタイプ適合抗体（抗ＣＤ１４抗体もしくは抗ＣＤ１５抗体または抗ＣＤ３／ＣＤ１９抗体と合わせて）で染色した細胞を陰性対照として使用した。高い側方光散乱性（ＳＳＣ）を用いて、単球を明色のＣＤ１４陽性細胞として決定し、顆粒球を暗色のＣＤ１４陽性細胞または明色のＣＤ１５陽性細胞として識別した。Ｔリンパ球をＣＤ３陽性細胞として決定し、Ｂリンパ球をＣＤ１９陽性細胞として決定した。４〜６つの上記の実験の結果を表１、２および３にまとめる。データを、染色細胞の平均蛍光強度±標準偏差として示す。

表１に示されるデータは、一般の抗体（Ｄ１２）および抗活性化形態の抗体（ＣＢＲＭ１／５）の両方により認識されたＣＤ１１ｂの発現レベルが、新鮮なバフィーコート（ＦＢＣ）に比べ全ての白血球集団の活性化プロセスの終わり（ＥＡＰ）にかなり増加したことを示す。ＣＤ１１ｂの活性化形態の上方制御はより明白であった。
表１：白血球活性化を示す白血球集団のＣＤ１１ｂの発現

表２：白血球活性化を示す白血球集団のＣＤ６２Ｌの発現

表３：活性化を示すＴリンパ球およびＢリンパ球のＣＤ６９の発現

生成プロセスの異なる段階でのＣＤ６２Ｌの発現の比較では、すでにインキュベートされたバフィーコートの段階（ＩＢＣ）での全ての白血球集団では劇的にかつ顕著に減少したことが示された。活性化プロセスの終わり（ＥＡＰ）では、ＣＤ６２Ｌのレベルは無視できるほどであった（表２）。

表３に示されるように、ＣＤ１１ｂの上方制御およびＣＤ６２Ｌの下方制御は、特異的リンパ球活性化マーカーＣＤ６９の発現と一致しており、実際上発現しな状態から中等度であるが、かなりのレベルに増加した。

実施例２−血清のインキュベーション中の活性化白血球によるサイトカイン分泌の分析
１０×１０⁶個の細胞を含有する活性化白血球組成物を遠心分離し、本発明の好ましい実施形態に従い、細胞ペレットを５ｍｌの血清に再懸濁させた。ＩＬ−８および他のサイトカインの濃度を、Ｒ＆Ｄシステムズ製の最適化されたＥＬＩＳＡプレートを使用して３７℃にてインキュベーションの種々の時点で測定した。（白血球を含有しない）白血球再懸濁液に使用した血清中のサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍｌ）を並行して測定し、活性化白血球の存在下において生成された値から減算した。ＩＬ−８についての５つの実験結果を表４に平均±標準偏差としてまとめる。種々のサイトカインおよび成長因子（ＧＦ）の追加の実験の結果を表５にまとめる（ｎ＞１０）。
表４：活性化白血球によって血清に放出されたＩＬ−８の濃度（ｐｇ／ｍｌ）

表５：活性化白血球によって血清に放出されたサイトカインおよび成長因子の濃度（ｐｇ／ｍｌ）

表４および表５に示されるデータは、活性化白血球が、創傷治癒に関連するＩＬ−８および他のサイトカインならびに成長因子の上清への持続放出を少なくとも５時間を支援することができることを示す。

実施例３．原材料（新鮮なバフィーコート）から試料採取された白血球と、生成プロセスの中間段階および最終段階から試料採取された白血球の、サイトカインおよび成長因子を放出する能力の比較
白血球を次の３つの時点、すなわち生成プロセスの開始直前（新鮮なバフィーコート（ＦＢＣ））、第１のインキュベーション直後（インキュベーションされたバフィーコート（ＩＢＣ））および活性化プロセスの終わり（ＥＡＰ）（つまり低浸透圧ショック後）において試料採取し、続いて血清と３７℃にて９０分間インキュベーションした。各時点で、１０×１０⁶個の細胞を含有する白血球組成物を遠心分離し、本発明の好ましい実施形態に従い、細胞ペレットを５ｍｌのインキュベーション培地（ＲＰＭＩ）または各試料に対応する元の培地（新鮮なバフィーコートにおいては血漿およびインキュベーションされたバフィーコートおよび最終生成物においては血清）に再懸濁させた。各試料由来の白血球をＲＰＭＩにおいて１時間、血漿／血清において５時間３７℃にてインキュベーションし、これらの時間中に放出された種々のサイトカインの濃度を、Ｒ＆Ｄシステムズ製の最適化されたＥＬＩＳＡプレートを使用して測定した。ＲＰＭＩはサイトカインを含有しなかったが、（白血球を含有しない）白血球再懸濁液に使用した対応する血漿または血清中のサイトカイン濃度（ｐｇ／ｍｌ）を並行して測定し、活性化白血球の存在下において生成された値から減算した。結果を表６に平均±標準偏差としてまとめる（ｎ＝３〜６）。
表６：生成プロセスの異なる段階で試料採取された白血球によるサイトカインおよび成長因子放出の比較

表６に示されたデータは、原材料（バフィーコート）の白血球ではサイトカインを放出する能力が低かったが、白血球からのサイトカイン放出は、生成プロセス中に増加し、生成の終わりでは最大であったことを示す。生成の終わりの活性化白血球を本発明の好ましい実施形態に従い、血清に再懸濁させた場合、サイトカイン放出は、ＲＰＭＩでの放出に比べ２〜３倍高くなった。

実施例４．最終生成物中のサイトカイン含量の分析
創傷治癒に関連する種々のサイトカインおよび成長因子の濃度を、室温にて活性化白血球と１時間、２４時間および４８時間インキュベーションした後、（細胞が遠心分離によりペレット化された後の）最終生成物の液体部分において測定した。アッセイは、イーバイオサイエンス製の最適化されたＥＬＩＳＡプレートを使用して行われた。結果を表７に平均±標準偏差としてまとめる（ｎ＞１０）。
表７：生成の終わりの様々な時間でのサイトカイン含量

表７に示されるデータは、生成の終わりに、ＡＬＣＳが関連のサイトカインおよび成長因子をかなりの量含有することを示す。本発明の好ましい実施形態に従い、活性化白血球と血清のプレインキュベーションの時間を延長した場合、サイトカイン濃度が増加した。活性化白血球により馴化される前に使用された血清中の（抗体−１を除く）各サイトカインおよび成長因子の含量は２〜３倍とかなり低下した。

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特許刊行物および非特許刊行物双方を含む、本明細書に引用されるすべての刊行物は、本発明が関与する当業者の技術レベルを示すものである。全てのこれらの刊行物は、個々の刊行物が具体的かつ個別に、参照により組み込まれたと示されたと同程度に、本明細書に参照により組み込まれる。

本明細書の発明は、特定の実施形態に関して記載されているが、これらの実施形態は、本発明の原理および適用を例示するものにすぎないということが理解される。従って、添付の特許請求の範囲に定義される、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、例示的な実施形態に対する多くの変更が可能であり、他の構成が考案され得ることが理解される。

Claims (62)

1. 以下により作製される、創傷治療のための、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）：
   ａ）活性化白血球を得ること、
   ｂ）前記活性化白血球をインキュベーション培地と接触させ、インキュベーション組成物を作製すること、
   ｃ）前記インキュベーション組成物を、前記インキュベーション組成物中の少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させるのに十分な温度および時間にてインキュベートすること、および
   ｄ）前記インキュベーション組成物から白血球を除去して、実質的に細胞を含まないＡＬＣＳ活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）を作製すること。
2. 組成物が、少なくとも約１０００ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−８、少なくとも約１０〜２０ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６、および少なくとも約２０ｐｇ／ｍＬのヒトＴＮＦαを含む、創傷治療のための、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）。
3. 以下により作製される、創傷治療のための、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）：
   ａ）ヒト白血球を、前記白血球を活性化させる時間および温度の条件下でインキュベートすること、
   ｂ）前記白血球を低浸透圧ショックに付すこと、
   ｃ）ステップｂ）の前記白血球に、等張性を回復する量で塩溶液を添加し、次いで得られた溶液から前記白血球を分離すること、
   ｄ）ステップｃ）の前記白血球を血清と混合して、インキュベーション組成物を作製すること、
   ｅ）前記組成物を、前記インキュベーション組成物中の少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させる時間および温度の条件下でインキュベートすること、および
   ｆ）実質的に細胞を含まないＡＬＣＳを作製するために、ｅ）の前記インキュベーション組成物から、前記白血球および他の細胞物質を分離すること。
4. 前記創傷が、褥瘡性潰瘍、褥瘡性潰瘍、褥瘡、下肢潰瘍、腱炎、胸骨の深創傷、術後創傷、胴部の難治性術後創傷、大伏在静脈採取後の大伏在静脈の創傷、静脈性潰瘍、火傷、戦場での創傷、または裂肛である、請求項１、２、または３のいずれか１項に記載のＡＬＣＳ。
5. 前記下肢潰瘍が、糖尿病患者におけるものである、請求項４に記載のＡＬＣＳ。
6. 前記創傷が、静脈性潰瘍、褥瘡、または術後潰瘍である、請求項４に記載のＡＬＣＳ。
7. 以下により作製される、創傷における感染症発症を阻害するための、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）：
   ａ）活性化白血球を得ること、
   ｂ）前記活性化白血球をインキュベーション培地と接触させ、インキュベーション組成物を作製すること、
   ｃ）前記インキュベーション組成物を、前記インキュベーション組成物中の少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させるのに十分な温度および時間にてインキュベートすること、および
   ｄ）前記インキュベーション組成物から白血球を除去して、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）を作製すること。
8. 少なくとも約１０００ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−８、少なくとも約１０〜２０ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６、および少なくとも約２０ｐｇ／ｍＬのヒトＴＮＦαを含む、創傷における感染症発症を阻害するための、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）。
9. 以下により作製される、創傷における感染症発症を阻害するための、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）：
   ａ）ヒト白血球を、前記白血球を活性化させる時間および温度の条件下でインキュベートすること、
   ｂ）前記白血球を低浸透圧ショックに付すこと、
   ｃ）ステップｂ）の前記白血球に、等張性を回復する量で塩溶液を添加し、次いで得られた溶液から前記白血球を分離すること、
   ｄ）ステップｃ）の前記白血球を血清と混合して、インキュベーション組成物を作製すること、
   ｅ）前記組成物を、前記インキュベーション組成物中の少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させる時間および温度の条件下でインキュベートすること、および
   ｆ）実質的に細胞を含まないＡＬＣＳを作製するために、ｅ）の前記インキュベーション組成物から、前記白血球および他の細胞物質を分離すること。
10. 前記創傷が外傷を原因とする、請求項７、８、または９のいずれか１項に記載のＡＬＣＳ。
11. 前記外傷が手術を原因とする、請求項１０に記載のＡＬＣＳ。
12. 創傷中に注入される、請求項１、２、３、７、８、または９のいずれか１項に記載のＡＬＣＳ。
13. 創傷周囲の組織中に注入される、請求項１、２、３、７、８、または９に記載のＡＬＣＳ。
14. 開放創中に適用される、請求項１、２、３、７、８、または９に記載のＡＬＣＳ。
15. 開放創に被覆材を介して適用される、請求項１４に記載のＡＬＣＳ。
16. 前記被覆材が、乾燥被覆材、バリア被覆材、または生理活性被覆材である、請求項１５に記載のＡＬＣＳ。
17. 自己の血液試料由来である、請求項１、２、３、７、８、または９のいずれか１項に記載のＡＬＣＳ。
18. 同種異系の血液試料由来である、請求項１、２、３、７、８、または９のいずれか１項に記載のＡＬＣＳ。
19. 創傷の治療方法であって、前記方法が、前記創傷に、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）を投与することを含み、前記ＡＬＣＳが以下により作製される、方法：
    ａ）活性化白血球を得ること、
    ｂ）前記活性化白血球をインキュベーション培地と接触させ、インキュベーション組成物を作製すること、
    ｃ）前記インキュベーション組成物を、前記インキュベーション組成物中の少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させるのに十分な温度および時間にてインキュベートすること、および
    ｄ）前記インキュベーション組成物から白血球を除去して、実質的に細胞を含まないＡＬＣＳ活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）を作製すること。
20. 創傷の治療方法であって、前記方法が、前記創傷に、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）を投与することを含み、前記組成物が、少なくとも約１０００ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−８、少なくとも約１０〜２０ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６、および少なくとも約２０ｐｇ／ｍＬのヒトＴＮＦαを含む、方法。
21. 創傷の治療方法であって、前記方法が、前記創傷に、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）を投与することを含み、前記ＡＬＣＳが以下により作製される、方法：
    ａ）ヒト白血球を、前記白血球を活性化させる時間および温度の条件下でインキュベートすること、
    ｂ）前記白血球を低浸透圧ショックに付すこと、
    ｃ）ステップｂ）の前記白血球に、等張性を回復する量で塩溶液を添加し、次いで得られた溶液から前記白血球を分離すること、
    ｄ）ステップｃ）の前記白血球を血清と混合して、インキュベーション組成物を作製すること、
    ｅ）前記組成物を、前記インキュベーション組成物中の少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させる時間および温度の条件下でインキュベートすること、および
    ｆ）実質的に細胞を含まないＡＬＣＳを作製するために、ｅ）の前記インキュベーション組成物から、前記白血球および他の細胞物質を分離すること。
22. 前記創傷が、褥瘡性潰瘍、褥瘡性潰瘍、褥瘡、下肢潰瘍、腱炎、胸骨の深創傷、術後創傷、胴部の難治性術後創傷、大伏在静脈採取後の大伏在静脈の創傷、静脈性潰瘍、火傷、戦場での創傷、または裂肛である、請求項１９、２０、または２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記下肢潰瘍が、糖尿病患者におけるものである、請求項２２に記載の方法。
24. 前記創傷が、静脈性潰瘍、褥瘡、または術後潰瘍である、請求項２２に記載の方法。
25. 創傷における感染症発症を阻害する方法であって、前記方法が、前記創傷に、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）を投与することを含み、前記ＡＬＣＳが以下により作製される、方法：
    ａ）活性化白血球を得ること、
    ｂ）前記活性化白血球をインキュベーション培地と接触させ、インキュベーション組成物を作製すること、
    ｃ）前記インキュベーション組成物を、前記インキュベーション組成物中の少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させるのに十分な温度および時間にてインキュベートすること、および
    ｄ）前記インキュベーション組成物から白血球を除去して、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）を作製すること。
26. 創傷における感染症発症を阻害する方法であって、前記方法が、前記創傷に、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）を投与することを含み、前記ＡＬＣＳが、少なくとも約１０００ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−８、少なくとも約１０−２０ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６、および少なくとも約２０ｐｇ／ｍＬのヒトＴＮＦαを含む、方法。
27. 創傷における感染症発症を阻害する方法であって、前記方法が、前記創傷に、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）を投与することを含み、前記ＡＬＣＳが以下により作製される、方法：
    ａ）ヒト白血球を、前記白血球を活性化させる時間および温度の条件下でインキュベートすること、
    ｂ）前記白血球を低浸透圧ショックに付すこと、
    ｃ）ステップｂ）の前記白血球に、等張性を回復する量で塩溶液を添加し、次いで得られた溶液から前記白血球を分離すること、
    ｄ）ステップｃ）の前記白血球を血清と混合して、インキュベーション組成物を作製すること、
    ｅ）前記組成物を、前記インキュベーション組成物中の少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させる時間および温度の条件下でインキュベートすること、および
    ｆ）実質的に細胞を含まないＡＬＣＳを作製するために、ｅ）の前記インキュベーション組成物から、前記白血球および他の細胞物質を分離すること。
28. 前記創傷が外傷を原因とする、請求項２５、２６、または２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記外傷が手術を原因とする、請求項２８に記載の方法。
30. 前記ＡＬＣＳが創傷中に注入される、請求項１９、２０、２１、２５、２６、または２７のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記ＡＬＣＳが創傷周辺の組織中に注入される、請求項１９、２０、２１、２５、２６、または２７に記載の方法。
32. 前記ＡＬＣＳが開放創中に適用される、請求項１９、２０、２１、２５、２６、または２７に記載の方法。
33. 前記ＡＬＣＳが被覆材を介して開放創に適用される、請求項３２に記載の方法。
34. 前記被覆材が、乾燥被覆材、バリア被覆材、または生理活性被覆材である請求項３３に記載の方法。
35. 前記ＡＬＣＳが自己の血液試料由来である、請求項１９、２０、２１、２５、２６、または２７のいずれか１項に記載の方法。
36. 前記ＡＬＣＳが同種異系の血液試料由来である、請求項１９、２０、２１、２５、２６、または２７のいずれか１項に記載の方法。
37. 以下を含む、実質的に細胞を含まないＡＬＣＳ活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）の作製方法：
    ａ）活性化白血球を得ること、
    ｂ）前記活性化白血球をインキュベーション培地と接触させ、インキュベーション組成物を作製すること、
    ｃ）前記インキュベーション組成物を、前記インキュベーション組成物中の少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させるのに十分な温度および時間にてインキュベートすること、および
    ｄ）前記インキュベーション組成物から白血球を除去して、実質的に細胞を含まないＡＬＣＳ活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）を作製すること。
38. 以下のステップを含む、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清（ＡＬＣＳ）の作製方法：
    ａ）ヒト白血球を、前記白血球を活性化させる時間および温度の条件下でインキュベートすること、
    ｂ）前記白血球を低浸透圧ショックに付すこと、
    ｃ）ステップｂ）の前記白血球に、等張性を回復する量で塩溶液を添加し、次いで得られた溶液から前記白血球を分離すること、
    ｄ）ステップｃ）の前記白血球を血清と混合して、インキュベーション組成物を作製すること、
    ｅ）前記インキュベーション組成物を、前記インキュベーション組成物中の少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させる時間および温度の条件下でインキュベートすること、および
    ｆ）実質的に細胞を含まないＡＬＣＳを作製するために、ｅ）の前記インキュベーション組成物から、前記白血球および他の細胞物質を分離すること。
39. ステップａ）の前記インキュベーションを、約１２℃〜約２８℃の温度で、約８時間〜約２０時間の範囲の時間行う、請求項３８に記載の方法。
40. ステップａ）の前記インキュベーションを、約１８℃〜約２４℃の温度で、約８時間〜約１２時間の範囲の時間行う、請求項３９に記載の方法。
41. ステップａ）の前記インキュベーションを、１２℃〜約２８℃の温度で、約９０分間から２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、または１２時間〜約２０時間の範囲の時間行う、請求項３８に記載の方法。
42. ステップａ）の前記インキュベーションを、最大約３７℃までの温度で、５時間〜約２４時間の範囲の時間行う、請求項３８に記載の方法。
43. ステップａ）を、白血球が接着する容器、および／または白血球アゴニストもしくは接着分子を含む足場を含む容器中で行う、請求項３８に記載の方法。
44. ステップｂ）が、約２５秒〜約４５秒間、前記白血球を水または低張塩溶液に接触させることを含む、請求項３８に記載の方法。
45. ａ）の前記白血球およびｄ）の前記血清が、同一の提供者由来である、請求項３８に記載の方法。
46. ａ）の前記白血球およびｄ）の前記血清が、異なる提供者由来である、請求項３８に記載の方法。
47. ｄ）の前記血清を以下により得る、請求項３８に記載の方法：
    ｇ）別個のヒト血漿試料を凝固剤と接触させることであって、ここで、ａ）の前記血漿および前記白血球は、同一または異なる提供者由来であり得ること、および
    ｈ）凝固した固体を除去することであって、ここで、ｇ）における前記接触は、ａ）のインキュベーションと実質的に同時に行われること。
48. ｇ）の前記血清を、白血球に接触させる前に凍結させる、請求項４７に記載の方法。
49. 前記血漿がＡＢ＋の提供者由来である、請求項４７に記載の方法。
50. 前記凝固剤がＣａＣｌ₂である、請求項４７に記載の方法。
51. 前記インキュベーション組成物を、室温で、約８時間〜約１８時間、最大７２時間までの時間インキュベートする、請求項３７または３８に記載の方法。
52. 前記インキュベーション組成物を、約３７℃で、約１時間〜約５時間インキュベートする、請求項３７または３８に記載の方法。
53. 前記ＡＬＣＳを凍結、凍結乾燥またはフリーズドライすることをさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
54. 以下をさらに含む、請求項３８に記載の方法：
    ｉ）ステップｆ）の前記白血球を第２の血清と混合して、第２のインキュベーション組成物を作製すること、
    ｊ）前記第２のインキュベーション組成物を、前記インキュベーション組成物中の少なくとも１つのサイトカインまたは成長因子の濃度を増加させる時間および温度の条件下でインキュベートし、それにより、前記ＡＬＣＳの第２の試料を作製すること、および
    ｋ）前記実質的に細胞を含まないＡＬＣＳの第２の試料を作製するために、前記白血球および他の細胞物質をｊ）の第２のインキュベーション組成物から分離すること。
55. 請求項３７または請求項３８に記載の方法により作製される、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清。
56. 少なくとも約１０００ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−８、少なくとも約１０〜２０ｐｇ／ｍＬのヒトＩＬ−６、および少なくとも約２０ｐｇ／ｍＬのヒトＴＮＦαを含む、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清。
57. 請求項５５または５６に記載の、実質的に細胞を含まない活性化白血球馴化上清、および被覆材、足場、またはマトリックスを含む製品。
58. 前記被覆材が、ガーゼ、包帯、非癒着性メッシュ、膜、箔、泡、または組織接着剤である、請求項５７に記載の製品。
59. 前記被覆材が、ペースト、クリーム、軟膏、非透過性もしくは半透過性の膜もしくは箔、親水コロイド、ハイドロゲル、またはそれらの組み合わせから選択される保湿性バリアである、請求項５７に記載の製品。
60. 前記被覆材が抗菌性被覆材である、請求項５７に記載の製品。
61. 前記足場またはマトリックスが、移植前に固体である、請求項５７に記載の製品。
62. 前記足場またはマトリックスが、移植後に凝固するゲルである、請求項５７に記載の製品。

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