KR20100087781A - 인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조 방법 - Google Patents
인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20100087781A KR20100087781A KR1020107016499A KR20107016499A KR20100087781A KR 20100087781 A KR20100087781 A KR 20100087781A KR 1020107016499 A KR1020107016499 A KR 1020107016499A KR 20107016499 A KR20107016499 A KR 20107016499A KR 20100087781 A KR20100087781 A KR 20100087781A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cells
- culture
- cell
- medium
- mononuclear
- Prior art date
Links
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 20
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 37
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 title description 6
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims abstract description 44
- 210000002864 mononuclear phagocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 135
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 43
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 39
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 claims description 33
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 26
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 claims description 21
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 claims description 20
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 20
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 20
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 19
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 12
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 11
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 claims description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 9
- 230000028327 secretion Effects 0.000 claims description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 8
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 claims description 7
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 210000004395 cytoplasmic granule Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000007491 morphometric analysis Methods 0.000 claims description 6
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 17
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 abstract description 15
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 abstract description 15
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 abstract description 15
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 abstract description 14
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 abstract description 14
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 6
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 abstract description 6
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 60
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 45
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 38
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 18
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 17
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 17
- 108010031099 Mannose Receptor Proteins 0.000 description 15
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 15
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 12
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 12
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 11
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 10
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 9
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 8
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 8
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 8
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 8
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 210000001428 peripheral nervous system Anatomy 0.000 description 6
- 208000020431 spinal cord injury Diseases 0.000 description 6
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 5
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 5
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 5
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 5
- 238000013190 sterility testing Methods 0.000 description 5
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 4
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 4
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 4
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 3
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 3
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 3
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 3
- 238000011038 discontinuous diafiltration by volume reduction Methods 0.000 description 3
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 3
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 229940071127 thioglycolate Drugs 0.000 description 3
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M thioglycolate(1-) Chemical compound [O-]C(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 2
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 2
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 2
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 2
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000011496 digital image analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 2
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 2
- 230000004217 heart function Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 2
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 2
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 210000003497 sciatic nerve Anatomy 0.000 description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 2
- 230000037152 sensory function Effects 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 2
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 108010059108 CD18 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000016988 Hemorrhagic Stroke Diseases 0.000 description 1
- 101000739876 Homo sapiens Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 1
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000576894 Homo sapiens Macrophage mannose receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- -1 IL-1β Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 102100025354 Macrophage mannose receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000019040 Nuclear Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010051791 Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000010876 biochemical test Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-UHFFFAOYSA-J chembl1640 Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(N=NC3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)N=NC=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005202 decontamination Methods 0.000 description 1
- 230000003588 decontaminative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012997 ficoll-paque Substances 0.000 description 1
- 210000002557 fixed macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000002080 free macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000005003 heart tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000051542 human BDNF Human genes 0.000 description 1
- 102000046699 human CD14 Human genes 0.000 description 1
- 229940077456 human brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 238000013095 identification testing Methods 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 230000008611 intercellular interaction Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 208000020658 intracerebral hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 239000003076 neurotropic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000957 no side effect Toxicity 0.000 description 1
- 230000037311 normal skin Effects 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000012205 qualitative assay Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- 238000009781 safety test method Methods 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035807 sensation Effects 0.000 description 1
- 244000005714 skin microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4614—Monocytes; Macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1323—Adult fibroblasts
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
Abstract
인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조 방법은 개인의 혈액 시료로부터 분리된 단핵세포 및 동일한 개인 유래의 피부를 배양하고, 배양 혼합물로부터 진피를 제거하여 수득한 활성화된 단핵 식세포성 백혈구를 원심분리로 침전하고, 활성화된 식세포성 백혈구를 배지 중에서 세척하고 현탁하며, 인간 투여 적합성에 대해 배양물을 평가하는 것을 포함한다. 세포성 치료 제품은 배양물로부터 수득하며 CNS에서의 축삭 재생촉진, 상처치유 및 심근경색의 치료에 유용하다.
Description
본 발명은 인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조 방법, 이에 의해 수득된 세포의 배양물 및 이의 사용에 관한 것이다.
손상된 조직의 치유는 많은 분자 및 생리적 인자들 사이의 동기성 상호작용에 근거하는 복잡한 자연적 과정이다. 효과적인 염증 반응은 손상된 조직의 재생 및 회복을 유도하는 주된 요소 중의 하나이다. 이는 재생 능력이 있는 조직의 가장 초기의 그리고 가장 중대한 반응 중의 하나이다. 동원되어 그자리(in situ)에서 추가로 활성화되는 대식세포는 효과적인 염증반응의 개시 단계에서 해결의 실마리가 되는 작용제이다. 염증반응은 몸의 모든 조직에 있어 상처치유의 필수 불가결한 부분이다.
축삭(axonal) 손상 후에, 포유류 말초신경계(PNS)의 신경세포는 축삭 재생에 있어서 중추신경계(CNS)보다 더 큰 능력을 가지며, 대식세포가 PNS 축삭 재생에 있어 해결의 실마리가 되는 역할을 하는 것으로 나타났다(Schwartz 등, 1989, FASEB J.,3:2371-2378).
포유류 CNS는 축삭 손상 후의 축삭 재생에 있어서 보잘 것 없는 능력을 나타낸다. CNS 및 PNS에서의 축삭 재생간의 차이는 신경세포 자체라기 보다는 신경세포의 세포환경에 주로 기인하는 것으로 보인다. 신경 손상 후에, PNS 신경세포를 둘러싸고 있는 신경집세포(Schwann cell)는 축삭 재생을 허용 또는 지지하도록 조정되어지나, 반면, CNS 신경세포를 둘러싸고 있는 별아교세포(astrocyte), 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 및 미세아교세포(microglia)는 상기의 조정을 보이지 않으며 축삭 재생을 지지하지 않거나 또는 억제하는 상태로 남아있다.
후-손상 염증 반응에 있어서의 차이는 상기 조정의 결핍과 연관되어 있다. 구체적으로, CNS 손상에 반응한 단핵 식세포의 축적이, PNS에서의 손상에 대한 반응과 비교하여, 지연되며 제한된다.
CNS에서, 염증반응이, 적어도 부분적으로는, 상주하는 조직 대식세포(미세아교세포)의 상대적인 비효율성으로 인해 감소된다. 이러한 결함은 추가로 혈액 유래 단핵세포의 CNS로의 진입 불능 및 상처 치유가 필요한 임의의 다른 손상된 조직에서 통상적으로 활동하듯이 하지 못하는 것에 의해 심해진다.
모두 본 출원의 동일한 출원인에게 허여된 미국 특허 제5,800,812호, 제6,117,424호 및 제6,267,955호에서는, 포유류의 CNS에서, 축삭재생을 촉진하기 위한 동종이형(allogenic) 단핵 식세포의 사용방법 및 조성물을 개시하며, 상기 특허는 모두 제각기 본원에 충분히 개시되며 참조로 도입된다. 상기 특허는 성체 Spargue-Dawley 래트(rat) 유래의 말초혈액으로부터 분리된 단핵세포의 분리 및 배양 방법, 및 상승작용이 있는 래트 좌골신경 또는 시신경 부분과의 공동배양 또는 상승작용이 있는 래트 좌골신경 또는 시신경으로 조건화된 배지에서의 배양에 의한 분리된 단핵세포의 자극 방법을 기술한다. 자극된 단핵세포는 이어서 식세포성 기능 및/또는 산화질소 생산에 대하여 분석되었으며 시신경이 절단된 래트에게 손상 부위로 또는 그 근처로 투여되었다.
인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
상처-치유 표현형을 나타내는 상기의 인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조방법을 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.
상처-치유 표현형을 나타내며, 예를 들면, 척수 손상의 경우에 있어, 축삭 재생의 촉진에 적합한 상기의 인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조 방법을 제공하는 것이 본 발명의 추가의 목적이다.
상처-치료 표현형을 나타내며, 피부상처, 구체적으로는 만성적 피부궤양의 치유에 적합한 상기의 인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.
상처-치료 표현형을 나타내며, 예를 들면 심근경색의 경우에 있어서, 괴사 조직의 부피 감소에 적합한 상기의 인간 단핵 식세포성 대식세포의 제조방법을 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.
상처-치유 표현형을 나타내며, 본 발명의 방법으로 생산된 상기의 인간 단핵 식세포성 백혈구의 특징을 밝히는 방법을 제공하는 것이 본 발명의 또다른 목적이다.
이러한 본 발명의 목적은, 단핵세포를 개인의 혈액으로부터 분리하여, 단핵세포의 배양에 적합한 배지 중에 현탁하여, 조직공학 생산 피부와 또는 동일한 개인으로부터 제거된 피부 조직, 바람직하게는, 진피와 배양한 후, 피부단편을 제거하고, 전에 사용된 것과 동일한 적합한 배지 중에서 단핵세포의 세척 및 수득한 활성화된 단핵 식세포성 백혈구를 재현탁 하는 방법에 의해 제공된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 인간 단핵 식세포성 백혈구는 자가유래이며, 즉 이들은 개인의 말초혈액 단핵세포로부터 준비되어 이들이 투여될 사람과 동일한 개인의 피부 조직으로 활성화된다.
본 발명은 나아가 CNS에서의, 구체적으로는 CNS 손상 후의 축삭재생 촉진용, 상처 치유용 및 심근경색의 괴사조직 감소용 세포성 치료 제제를 제공한다.
도 1A-1B는 각각, 비과립성 단핵세포(배양 전) 및 과립성 단핵 식세포성 백혈구(배양 후)의 사진이다.
식세포는 입자성 물질들 예컨대 포식된 미생물 및 다른 입자성 항원을 소화할 수 있는 세포로 정의되며, 예컨대 대식세포 및 단핵세포와 같은 세포를 포함한다.
단핵세포는 단핵 식세포성 백혈구이다. 전단핵구로부터 골수에서 조혈세포로부터 형성되며, 단핵세포는 혈액으로 들어가 72시간까지 순환하고 이어서 조직 예컨대 허파, 간, 및 질환이 있는 조직 예컨대 악성종양 및 동맥경화 죽상판(artherosclerotic plaque)으로 들어가, 그곳에서 대식세포가 된다. 단핵세포의 대식세포로의 분화는 많은 변화를 포함한다: 형태의 변화, 크기증가, 포식활동 증가, 세포성 표지의 발현, 높은 수준의 용해 효소 및 다양한 가용성 인자의 분비.
대식세포는 몸전체로 퍼진다. 일부는 특정 조직에 상주하여 고정 대식세포가 되며, 반면에 다른 것은 운동성을 유지하며 자유 대식세포로 불린다.
휴식 상태에서도 일반적으로 그렇지만, 대식세포는 면역반응의 과정에서 다양한 자극에 의해 활성화된다. 특정항원의 포식이 초기 활성 자극으로 기능한다. 그러나, 대식세포 활성은 활성화된 T 헬퍼 (TH) 세포에 의해 분비된 시토카인, 예컨대 인터페론 감마에 의해, 염증반응의 매개체에 의해, 그리고 박테리아 세포벽 산물에 의해 추가로 증강된다.
단핵세포가 염증반응에 참가하는 첫 번째 세포 중의 하나이다. 이들은 많은 임무가 있으며 이들의 활성화 정도가 아마도 이들이 임무를 수행할 수 있도록 하는 것이다. 단핵세포의 활성화 과정은 전부 아니면 전무 현상이 아니라, 점진적이며 자극-특이적인 반응이다.
단핵세포/대식세포의 수많은 기능은 이들의 활성화 정도와 직접적으로 연관되어 있으며 면역, 분비, 포식 및 다른 기능을 포함한다. 이들의 활성화 정도에 따라 특징 지워지는, 세개의 상이한 군의 대식세포를 정의하는 것이 통상적이다:
(i) 염증반응의 첫 번째 파수꾼으로 주로 기능하는, 상처치유 대식세포;
(ii) 병원성 유기체 및 악성세포에 대항한 몸의 방어기전에 있어 주로 기능하는, 항미생물성 및 세포독성 대식세포; 및
(iii) 이들의 기능이, 임의의 염증반응에 관여하는 세포, 구체적으로 TH 세포를 보조하는 항원-제시 대식세포.
본 출원에서 사용된 대로, 용어 "단핵 식세포성 백혈구", "단핵 백혈구", "단핵 식세포" 및 "대식세포"는 본 발명의 방법으로 제조된 세포를 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다.
하나의 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조방법을 제공한다:
(i) 개인의 혈액 시료로부터 단핵세포를 분리하여, 적합한 배지(본원에서 "배지") 중에 현탁하는 단계;
(ii) 동일한 개인 유래의 피부단편을 처리하며, 표피를 제거하고, 진피 단편을 항생제가 있는 배지 중에서 초음파처리하고, 초음파처리된 진피 단편을 항생제가 있는 신선한 배지 중에 적심하며, 그리고 항생제가 들어 있지 않은 신선한 배지로 헹구는 단계;
(iii) 단계(i)의 단핵세포를 단계(ii)의 헹군 진피 단편과 공배양하는 단계;
(iv) 배양 혼합물로부터 진피조각을 제거하고, 수득한 활성화된 단핵 식세포성 백혈구를 원심분리로 침전하는 단계;
(v) 활성화된 단핵 식세포성 백혈구를 배지 중에서 세척하고 재현탁하는 단계; 및
(vi) 인간 투여 적합성에 대해 상기 배양물을 평가하는 단계;
단계(i)에서, 인간 단핵세포는 임의의 통상적인 방법에 의해 혈액시료로부터 분리될 수 있다. 하나의 구현예에서, 단핵세포 분리 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 혈액 희석 단계;
(b) 단계 (a)의 희석된 혈액을 Ficoll위에 층을 이루어 올려놓은 후 원심분리로 단핵세포 분획의 분리 단계;
(c) 단계(b)에서 분리된 세포를 세척하고 Percoll 상에서 밀도구배 원심분리에 의해 추가의 분리를 하는 단계; 및
(d) 단계(c)의 분리된 단핵세포-풍부 분획을 세척하고 적합한 배지 중에 이 세포를 현탁하는 단계;
단계(a)의 전혈의 희석 및 상기 단계 (c) 및 (d)에서 세포의 세척은 인산-완충 식염수(PBS)로 수행될 수 있으며, 그리고 상기 단계(d)의 단핵세포-풍부 분획은 적합한 배지 중에 현탁될 수 있다.
본원에서 사용된 대로, 용어 "적합한 배지"는 단핵세포의 배양에 적합한 배지 예컨대, 이에 한정하는 것은 아니며, Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) 및 RPMI 1640을 의미한다. 단핵세포 및 피부단편 처리 모두는 상기의 동일한 적합한 배지에서 수행된다.
인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조방법 단계 (ii) 에서, 인간 피부단편의 처리는 동일한 개인 유래의 피부절편을 냉동하고, 해동하며 적합한 배지, 예를 들면, IMDM 또는 RPMI 및 항생제로 이루어진 세척용액에 피부절편을 적심하고 나서, 표피를 제거하기 전에 단편으로 잘라, 약 0.1 내지 5 cm2, 바람직하게는 0.5 내지 2.0cm2, 또는 이보다 더욱 작은 진피 단편을 수득함으로써 수행될 수 있다. 이어서 진피단편을 항생제, 예컨대, 이로 제한하는 것은 아니며, 오플록소신, 반코마이신 및 겐타마이신을 포함하는 동일한 적합한 배지 중에 잠기도록 하여 무균의 플라스틱 용기에 넣고, 용기를 탈이온수를 포함하는 초음파조에 넣고 초음파처리한다. 초음파처리된 진피단편을 이어 동일한 항생제를 포함하는 신선하고 적합한 배지에 중에 적심하고 상기 항생제가 들어 있지 않은 신선한 배지로 헹군다. 진피단편을 예를 들면, 진동수 35-40kHz로 초음파조에서 초음파처리 할 수 있다.
배양단계 (iii)에서, 진피단편을, 초음파처리 후에, 항생제를 포함하는 신선하고 적합한 배지 중에 적심하고 항생제가 없는 동일한 배지로 헹군 후 5% CO2 대기 중 약 36-38℃에서 38시간 이하로 단핵세포와 배양한다. 이후 상기 진피단편을 배양 혼합물로부터 제거하고, 활성화된 세포를 원심분리로 회수하고, 적합한 배지, 바람직하게는 IMDM 중에서 세척하고 현탁한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 단핵세포의 분리를 위한 혈액시료 및 단핵세포의 활성을 위한 피부 조직 모두는 자가유래로, 다시 말하면, 이들은 활성화된 단핵 식세포성 백혈구가 투여될 환자로부터 유래된 것이다. 그러나, 동종이형(allogenic) 단핵세포 및 피부 조직의 사용도 또한 본 발명에 포함될 수 있지만, 바람직하게는 이들이 동일한 개인에게서 유래하여야만 한다.
본 발명의 또다른 구현예에서, 단계(ii)의 피부조직은 조직공학 생산 피부로 대체될 수 있다. 임의의 사용 가능한 조직공학 생산 피부 또는 조직공학 생산 피부와 동등물 예컨대 살아있는 세포를 포함하거나 또는 살아있는 세포를 포함하지 않는 인조피부가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 조직공학 생산 피부가 살아있는 세포를 포함하지 않는 경우, 항생제로의 처리단계는 수행되지 않는다.
단계(vi)에서, 인간 투여에 적합한 세포의 특징을 밝히기 위해, 하기 시험 전부 또는 일부를 수득한 활성화된 단핵 식세포성 백혈구 회분의 시료에 대해 수행한다:
(a) 무균성 - 세포는 박테리아, 효모 및 곰팡이에 의한 오염이 없어야 한다. 무균성 시험을 위해, 박테리아 및 곰팡이 오염을 검출하기 위해, 21 CFR section 610.12에 따라 세포를 필터하고 시험한다;
(b) 세포 생활도 - 배양물의 생활도(Viability)는 바람직하게는 잘 알려진 트리판 블루 염색 배제법을 사용하여 시험한다;
(c) 박테리아 내독소 시험 - 세포 배양물을 현행 USP에 따라 Limulus Amebocyte Lisate(LAL) 시험을 사용하여 그람-음성 박테리아 내독소에 대해 시험한다;
(d) 그람 염색 - 박테리아의 존재 또는 부재를 그람 염색 기술로 시험한다.
(e) 위상현미경에 의한 형태계량적 분석/ 세포질 과립수 측정 및 진피단편과 배양되기 전의 단핵세포와의 비교 - 위상현미경 하에서 세포의 형태계량적 분석 및 세포질 과립수 측정은 활성화된 대식세포를 위한 매우 중요한 시험이다;
(f) 단핵세포 CD14 세포막 표지를 검출하는 모노클로날 항체를 사용한 흐름세포측정에 의한 세포집단의 순도 분석;
(g) 활성화된 대식세포에 의해 높은 수준으로 분비되는 인터루킨-1β(IL-1β)분석;
(h) 활성화된 대식세포에 의해 높은 수준으로 발현되는, 만노스 수용체에 대한 모노클로날 항체를 사용한 흐름세포측정에 의해 배양 후 세포의 만노스 수용체 발현 분석, 및 이의 배양전 세포와의 비교;
(i) 활성화 후에 세포막 상에 높은 수준으로 발현되는, CD54 항체 표지(ICAM-1) 대한 모노클로날 항체를 사용한 흐름세포측정에 의한 세포막 상의 ICAM-1 발현 분석;
(j) 활성화된 대식세포에 의한 뇌-유래 뉴로트로픽 인자(BDNF) 분비의 분석; 및
(k) 활성화된 대식세포에 의한 IL-6 분비의 분석.
만약 상기 결과가 만족스럽다면, 세포 전체 회분을 개인의 세포성 치료를 위해 사용할 수 있다.
본 발명 방법의 단계 (ii)를 수행하는 동안, 상기 기술된 조건에서 피부조직의 초음파처리가 피부조직의 탈오염으로 이어진다는 것을 발견하였다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 항생제가 들어 있는 적합한 배지 중에서 피부조직을 초음파처리하는 것을 포함하는 피부조직, 바람직하게는 인간 피부조직, 더욱 바람직하게는 인간 진피단편의 오염제거 방법을 제공한다.
상기 방법에 따라서, 인간 피부단편을 처리한 후, 표피를 제거하고, 항생제가 있는 적합한 배지(본원에서 "배지") 중에서 진피단편을 초음파처리하고, 초음파처리된 진피 단편을 항생제가 있는 신선한 배지 중에 적심하고, 항생제가 들어 있지 않은 신선한 배지로 헹굴 수 있다. 인간 피부단편의 처리는 피부절편을 냉동하고, 해동하며 적합한 배지, 바람직하게는, IMDM 및 항생제로 이루어진 세척용액에 피부절편을 적심하고 나서, 표피를 제거하기 전에 단편으로 잘라 약 0.1 내지 5 cm2, 바람직하게는 0.5 내지 2.0cm2, 또는 이보다 작은 진피 단편을 수득함으로써 수행할 수 있다. 초음파처리를 위해, 항생제, 예컨대, 이로 제한하는 것은 아니며, 오플록소신, 반코마이신 및 겐타마이신을 포함하는 적합한 배지, 바람직하게는 IMDM 중에 진피단편을 잠기도록 하여 무균의 플라스틱 용기에 넣고, 용기는 탈이온수를 포함하는 초음파조에 넣고 초음파처리하고, 초음파처리된 진피단편을 이어 동일한 항생제를 포함하는 신선한 배지, 바람직하게는 IMDM 중에 적심하고 상기 항생제가 들어 있지 않은 신선한 배지로 헹군다. 예를 들면, 진피단편을 진동수 35-40kHz로 초음파조에서 초음파처리 할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 수득된 인간 단핵 식세포성 대식세포의 특징을 밝혀내었고, 이들은 신규한 세포집단을 대표하며 이는 본 발명의 또다른 양태를 구성한다.
본 발명의 방법에 따라 수득된 활성화된 인간 단핵 식세포성 백혈구의 가장 중요한 특징은 세포질 과립의 수라는 것이 본 발명에 따라 밝혀졌다. 위상현미경 하에서 상기 과립은, 본원의 도 1B에 나타난 대로, 쉽게 셀 수 있는 푸른빛이 도는 색상의 매우 굴절력이 높은 구로 보인다.
따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 위상 현미경하에서, 25% 이상의 가장 과립성인 세포가 세포 당 4개 이상의 과립을 나타내는 인간 단핵 식세포성 백혈구의 배양물을 제공한다. 하나의 구현예에서, 바람직하게는, 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상의 세포가 CD14+이다. 또다른 구현예에서, 상기 세포에 의해 생산된 IL-1β 수준은 17pg/106 CD14+ 세포 이상이다.
추가의 구현예에서, 본 발명은 하기의 특성 a-k 중에서 적어도 특성 a-g 를 나타내는 본 발명의 활성화된 인간 단핵 식세포성 백혈구의 배양물을 제공한다:
(a) 14 일의 무균성;
(b) 트리판 블루 염색 배제법을 사용하여 80% 이상의 배양물 생활도;
(c) 박테리아 내독소 시험에서 200Eu/ml 미만의 제품 방출 규격;
(d) 그람-염색에서 박테리아의 증거가 없음;
(e) 형태계량적 분석으로, 25% 이상의 가장 과립성인 세포가 세포 당 4개 이상의 과립을 보임;
(f) 세포의 40% 이상, 바람직하게는 60% 이상이 CD14 양성(CD14+ )임;
(g) 세포에 의해 생산된 IL-1β 수준이 17pg/106 CD14+ 세포 이상임;
(h) 활성화된 세포가 이들이 유래한 비활성화된 단핵세포와 비교하여, 만노스 수용체 발현에 있어 통계적으로 유의미한 증가를 나타냄;
(i) 세포는 약 200 이상의 기하평균 형광을 갖는 ICAM-1 수용체를 발현함;
(j) 세포는 10pg/106 CD14+ 세포 보다 더 높은 수준으로 BDNF를 분비함; 및
(k) 활성화된 세포에 의한 IL-6의 분비는 이들이 유래한 비활성화된 단핵세포에 의한 IL-6의 분비와 비교하여 약 4-15 배임.
본 발명의 또다른 양태에서, 5일 이하, 바람직하게는 38시간 이하, 및 더욱 바람직하게는 24시간 이하 동안 피부(또는 단지 진피) 단편과 배양된 인간의 활성화된 단핵 식세포성 백혈구로 이루어지는 세포성 치료 제품이 제조된다. 하나의 바람직한 구현예에서, 개시 단핵세포 및 진피는 자가유래로 최종 제품이 투여될 환자로부터 수집된다.
바람직한 구현예에서, 최종 제품으로서의 사용이 의도된 세포 배양물은 대식세포가 40% 이상, 통상적으로는 50% 를 초과하는 인간의 활성화된 단핵 식세포성 백혈구로 이루어진다. 단핵세포는 환자의 말초혈액으로부터 분리된 후, 손상당한 환자로부터 채취된 자가유래 피부(온전한 두께의 피부 조직으로부터 준비된 진피)와 배양된다. 최종 세포성 치료 제품은 약학적으로 수용 가능한 담체, 예컨대 인산완충식염수(PBS) 중에 또는, 바람직하게는, 배양 배지 예컨대 IMDM 또는 임의의 다른 적합한 세포 배양 배지 예컨대 RPMI 1640 중에 현탁된 백만 내지 천만개의 대식세포를 함유하지만, 다른 적합한 약학적으로 수용 가능한 담체도 기술분야의 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.
본 발명의 활성화된 인간 단핵 식세포성 백혈구는 상처-치유 표현형을 나타내며, 치료에, 그 중에서도 특히, 인간에서 하기 조건의 치료에 이로울 수 있다:
(i) 축삭 손상 예컨대, 이로 한정하는 것은 아니며, 뇌, 척수 또는 시신경의 손상으로 이어지거나 또는 상기 손상이 동반되는 CNS 임의의 부위에 위치한 손상 또는 질병 후의 축삭 재성장을 촉진을 위한 조건. 상기 손상은 척수손상, 둔기 외상, 관통 외상, 뇌의 타격 또는 반충(反衝), 신경외과 수술 또는 다른 절차 동안의 지속적인 외상을 포함하는 외상, 및 허혈성 뇌졸중 또는 출혈성 뇌졸중을 포함하는 뇌졸증을 포함한다.
(ii) 만성 피부궤양의 치유. 상처난 조직에 상주하는 대식세포는 궤양의 가장자리 부분에 있는 피부에 의해서는 적절히 활성화되지 않으며 정상의 피부조직과 비교하여 염증세포를 활성화시키는 능력이 결여되어 있다. 활성화된 대식세포의 상처부위로의 적용은 치유 기회를 향상시킬 것이다.
(iii) 심근경색증의 경우에 있어 괴사 조직의 부피 감소. 상처-치유 표현형을 나타내는 본 발명의 활성화된 대식세포는 심근경색증의 경우에 있어 괴사 조직의 부피 감소에 이로울 것으로 기대된다. 심장근육으로의 혈류의 장기간 중단 또는 상당한 저하는 심장 근육 세포의 죽음으로 이어진다. 심장근육의 죽음은 심장 기능의 감소를 유도한다. 근육세포는 재생 불능이기 때문에, 죽은 심장 조직은 기능을 하지 않는 흉터 조직으로 대체된다. 재생의 관점에서, 근육세포 및 중추신경계 축삭의 재생능력의 결여간에는 강력한 유사성이 있다. CNS의 축삭에 대하여 종전에 예를 들면 US6,117,424에서 나타난 바와 같이, 심장 근육세포의 경우에, 재생불능의 이유는 세포 자체에 내재하는 것이 아니라, 저조하게 활동하는 불충분한 대식세포의 수 때문에 허혈 후 적절한 시기에 경색 부위에서 일어나는, 지체되며, 비효과적인 염증 반응에 있다고 생각되어진다. 경색 과정 중 비교적 초기에 본 발명의 활성화된 대식세포의 그 자리(in situ) 투여는 종양의 부피를 감소시킬 수 있으며 따라서 심장 기능을 구할 수 있다.
활성화된 대식세포는 상처난 그 자리에 또는 경색 부위 또는 CNS 손상 부위에 또는 그 근처에 투여 될 수 있으나, 임의의 다른 적절한 방식의 투여, 구체적으로는 정맥내 투여가 또한 본 발명에 고려된다.
본 발명은 따라서 치료가 필요한 환자에게 축삭 손상으로 이어지거나 또는 축삭 손상이 동반되는 CNS 부상부위로 또는 근처로 본 발명의 인간 단핵 식세포성 백혈구의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 중추신경계의 축삭 재생을 촉진하는 방법을 추가로 제공한다.
바람직한 구현예에서, 활성화된 단핵 식세포성 백혈구는 자가유래이며, 손상은 척수손상이고, 치료는 수술동안 수행되며 환자의 척수 실질(parenchyma)로 환부에 세포의 투여를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 단핵 식세포성 백혈구의 유효량을 치료가 필요한 환자의 상처에 투여하는 것을 포함하는, 상처 치유, 구체적으로는 만성 피부궤양 예컨대 당뇨병성 상처궤양 및 만성다리궤양의 상처치유 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 단핵 식세포성 백혈구의 유효량을 치료가 필요한 환자에게 심장근육 그 자리로(in situ), 바람직하게는 경색과정의 초기에 투여하는 것을 포함하는 심근경색의 경우에 괴사조식의 부피 감소방법을 제공한다.
본 발명은, 이제 제한적이지 않는 하기의 실시예들에서 설명될 것이다.
[실시예]
실시예 1. 환자로부터 조직검체 수집
혈액 및 피부 검체를 최종 세포성 치료 제품의 투여 약 하루 전에 환자로부터 수집한다. 약 200-250ml의 혈액을 항응고제를 포함하는 혈액-수집용 백에 수집한다. 약 15 cm2의 온전한 두께의 피부(표피 및 진피) 단편을 동일한 환자에게서 채취하여 IMDM 및 항생제 (16ug/ml 옥플록소신, 20ug/ml 반코마이신 및 50ug/ml 겐타마이신)로 이루어진 "세척용액" 용기에 넣는다. 혈액 및 피부 검체를 분리되고, 열적으로 고립된 케이스(케이스의 내부 온도: 혈액은 1-10℃, 피부는 38℃ 이하) 중에서 세포 처리 센터로 옮기고, 전용의 무균실험실 시설(모든 절차는 등급 100/ISO 등급 5(미국국가표준 209E/ISO 14644-1)인, 등급 10,000/ISO 등급 7 무균실에 위치한 생물학적 안전 캐비넷에서 수행된다)에서 처리된다.
실시예 2. 단핵세포 분리
전혈을 인산완충용액(PBS)으로 희석한다. 희석된 혈액은 원심분리관에서 Ficoll-Paque PLUS(Amersham-Pharmacia Biotech, Sweden)(밀도: 20℃에서 1.076-1.078 g/ml)위에 층을 이루어 올리고 단핵세포 분획을 수득하기 위해 원심분리한다. 이어서 단핵세포를 PBS로 세번 세척한다. 두 번째 PBS 세척으로부터, 상층액 및 105세포를 포함하는 분취물(aliquot)을 취하여 무균성에 대하여 시험한다. 세척된 세포 분획은 Percoll 구배위에 층을 이루어 올리고, 전과 같이 원심분리하여 준비한다. 단핵세포-풍부 분획을 Percoll 구배를 통한 세포의 원심분리로 수득한다. 상기 분획은 PBS로 세척하고 이어서 배양단계로 진행할 때까지 IMDM 중에 재현탁한다. PBS 세척으로부터, 상층액 및 105세포를 포함하는 분취물을 취하여 무균시험을 한다. 무균시험에 추가하여, 생세포수 측정(트리판 블루 염색 배제법), 및 이하의 베이스라인 시험: 배양물 순도(% CD14+ 세포), 세포막 상의 만노스 수용체(MR) 발현, IL-1β, ICAM-1β 발현 (세가지 모든 시험은 흐름세포측정으로 수행됨)을 포함하는 품질관리 시험, 및 형태학적인 관찰/세포질 과립수 측정을 수행하여 단핵세포 분리과정을 모니터 한다.
실시예 3. 피부조직의 처리
세포 처리센터에 도착하면, 온전한 두께의 피부조직 검체를 포함하는 피부용기를 냉동고(-18℃)에 1시간 이상 넣어둔다. 이 기간 후, 적혈구를 손쉽게 제거 할 수 있도록 피부 용기를 해동하기 위한 배양기(36-38℃)에 넣는다. 해동 후에 피부용기를 등급 100 생물학적 안전 캐비넷으로 옮긴다. 피부 검체를 초기의 용기에서 꺼내 신선한 세척용액(IMDM 및 항생제를 포함, 상기 실시예 1 참조)에 잠시 적심한다. 상기 적심을 새로운 용기의 세척용액 중에서 반복한다. 피부를 이어서 단편으로 자르고, 표피는 제거하여 미생물 확인을 위해 샘플링한다(하기 참조). 하나의 진피 단편을 2 개의 ~2mm2 단편으로 잘라 무균 시험용으로 사용한다. 상기 진피단편을 신선한 세척용액을 함유하는 용기 중에 적심하고 이 용기를 초음파조에 넣고 35-40kHz의 진동으로 약 30-60분 동안 초음파처리한다. 진피조직을 이어서 신선한 세척용액이 들어 있는 새것의 무균 용기로 옮겨 36-38℃에서 4.5 시간 이상 적심한다. 본 절차의 주된 이유는 단핵세포와의 배양동안 박테리아의 오염 위험을 최소화하는 것이다. 단핵세포와의 공배양 전에, 진피단편을 신선한 배지(항생제 들어 있지 않음)로 두 번 세척한다. 두개의 ~2mm2 단편은 무균시험용으로 사용한다.
실시예 4. 분리된 단핵세포의 진피 조직과의 배양
상기 실시예 2 의 단핵세포-풍부 세포 분획을 무균 50ml 관 또는 조직배양 플라스크(용기 당 9-100x106 세포)에 있는 IMDM 중에 넣는다. 각각의 관에 두개의 진피 단편을 넣는다. 4.5 내지 5.5x106세포 및 하나의 진피단편을 포함하는 "병행 배양"관을 준비한다. 모든 관을 38시간 이하, 바람직하게는 24시간 이하("병행 배양"관은 16.5-17.5시간 배양됨)로 고정된 5% CO2의 가습한 배양기에서 36-38℃로 배양한다. 배양 진전의 첫 번째 평가는 약 17 시간 배양 후에 수행한다. 배양된 대식세포 및 진피를 포함하는 "병행 배양"으로 표시된 관을 배양기에서 꺼내 배양을 종료한다. 진피는 버리고 세포 배양물의 배양 순도(흐름세포측정에 의한 % CD14+) 및 생활도(트리판 블루 염색 배제법을 사용함)를 평가한다. 주 배양물을 포함하는 관의 배양기간은 배양 20.5 내지 21.5 시간 후에 종료한다.
배양기간 종료시점에, 진피단편을 무균의 집게로 주배양 관에서 제거하여 버린다. 배양된 세포를 원심분리하여 침전하고, 배양물 상층액 시료를 내독소 및 박테리아 검출을 위한 그람염색에 대해 시험한다. 세포 펠렛을 모아서, 세척하고, IMDM 중에 재현탁한다. 세포수 측정 및 품질관리 시험 예컨대 생활도, 현미경적 형태, 배양 순도(% CD14+ 세포), 만노스 수용체 발현, ICAM-1 발현, 시토카인 분비 및 과립의 형태계량적 분석/수측정을 수행한다. 105개의 배양된 세포를 포함하는 분취물을 무균시험을 위해 배양 상층액 시료에 첨가한다. 상층액 및 5x105 세포를 포함하는 시료 하나를 마이코플라즈마 검출용으로 보낸다. 세포 배양 순도 결과를 받은 후, 세포수를 세고 이어 페놀 레드가 없는 IMDM을 사용하여 다시 세척한다. 세포 펠렛을 이어서 페놀 레드가 없는 IMDM을 사용하여 세포제제의 최종부피로 다시 현탁한다. 환자에게 투여될 최종 세포성 제품의 정량은 품질관리시험 결과의 미리 정해진 규격에의 합치에 근거를 둔다.
실시예 5. 최종 세포성 치료 제품의 제조
최종 세포 치료 제품은 μl당 약 15,000-75,000, 바람직하게는 30,000-40,000, 대식세포의 농도로 페놀 레드가 없는 IMDM 중에 현탁된 세포로 이루어진다. 최종 일회량은 1-10, 바람직하게는 5-7 백만개 대식세포로 이루어지며, 주사기에 충진한다.
실시예 6. 품질관리 방법 및 분석
6a. 원료 물질 및 포장 성분
세포의 생산에 사용된 원료 물질 및 포장 성분은, 제조 공정에서의 사용에 허락되기 전에, 문서화된 표준 작업 절차 (SOPs)에 따른 적절한 품질관리 평가를 거친다.
6b. 공정제어- 생물학적 활성 및 안정 시험
본 실시예는 배양된 인간 대식세포 배양물의 주된 생물학적 및 안전성 특징을 검토한다. 여기에서 제시된 최종 세포성 제품 규격은 지금까지 치료된 환자로부터의 자가유래 조직 및 건강한 대상체로부터의 이종유래 및 자가유래의 혈액 및 피부 조직을 사용하여, 상기 특징들의 결정을 위한 분석에서 수득된 결과에 기본을 둔다. 대식세포는 그의 다양성으로 악명이 높으나, 이의 활성은 아마도 특정 항원과의 상호작용에 의존하지 않으며, 손상의 원인과 관계없이 상처-치유 동안 이들의 임무를 수행한다.
"공정제어 계획"은 생산 방법을 조절하며 최종 세포성 치료 제품의 완전성을 보장하기 위해 수립되었다. 세포 배양물을 제조 공정 동안 여러 단계에 샘플링하여 박테리아 및 곰팡이 오염에 대해 시험한다. 상기 시험은 세포성 치료 제품의 무균성 및 내독소 수준을 평가한다. 추가로, 세포를 형태학적 특성 및 생활도에 대하여 모니터한다. 세포배양물은 면역학적 특징화, 배양물 순도 및 생물학적 활성을 평가하기 위해 샘플링과정을 거친다. 또한 생산 공정의 수율이 모니터되고 기록된다.
최종 세포성 치료 제품은 랏트(lot) 방출 규격을 통과해야만 한다. 각 환자의 세포 제품은 독립적인 랏트이다. 기준은 세포 표면 CD14 표지(흐름세포측정으로 시험됨), 세포 형태(현미경 하의 형태) 및 형태계량적으로 분석된 세포 과립도, IL-1β정량을 위한 ELISA 분석, 배양물 생활도(트리판 블루 염색약 배제법), 내독소 및 그람 염색에 대한 규격을 포함한다. 처리 중인 시료의 중간 무균 결과는 또한 방출 품질관리 시험의 일부이다. 방출 규격에 미치지 못하는 것은 랏트 폐기로 이어진다. 예를 들면, 흐름세포 측정으로 시험된 만노스 수용체 및 ICAM-1 발현, ELISA로 분석된 대식세포에 의해 분비되는 인터루킨(IL-6) 및 마이코플라즈마 검출의 추가의 분석이 수행된다. 방출 기준은 이들 파라미터에 대한 규격은 포함하지 않는다.
제품의 무균성을 평가하기 위해, 생산 과정의 다른 단계에서 분취물을 무균 시험을 위해 채취한다. 무균성-배지 용기 내용물의 매일 조사는 무균성 시험 배양 기간 동안 수행되고, 시료가 무균성이 아니라는 것을 나타내는 어떠한 양성 결과도 의사에게 즉시 보고된다.
미생물 검출 및 동정 시험은 피부 준비 동안 분리된 표피에 수행된다. 이들 배양물은 오염(아마도 정상적인 피부 총세균)을 포함할 것으로 예상되며, 따라서 이는 제품의 불합격 근거가 아니다. 이러한 배양물에서 검출된 미생물은 분리되어, 동정되고 항생제 민감성에 대해 시험된다.
*조직, 상층액 및 세포를 제거하여 하기의 단계에서 무균성에 대해 시험한다: 진피 단편(처리되어 공-배양할 준비가 됨); 단핵세포 분리(Ficoll 분리 후): 상층액 및 세포; 단핵세포-풍부 분획 분리(Percoll 분리 후): 상층액 및 세포; 및 배양된 대식세포 제제(공-배양 후): 상층액 및 세포. 이러한 무균성 시험에 추가하여, 환자 혈액(분리 절차 전)은 마이코플라즈마 검출을 위해 샘플링된다.
실시예 7. 품질 조절 시험의 기술
일상적인 안전 시험
* 7a. 무균성
시료의 유형에 맞추어 직접 전달 방법 또는 필터 방법을 사용하여 21 CFR 610.12[FDA " 일반적인 생물학 제품 기준"] 에 따라 시료를 무균성에 대해 시험한다.
직접 전달 방법에서는, 각각의 시료를 두 부분으로 나눈다. 각각의 부분을 적합한 배지 (대두-카세인 소화물 배지 또는 티오글리콜레이트 액상 배지)가 있는 용기에 넣고, 용기를 닫은 후 적절한 온도(대두-카세인 소화물은 20-25℃, 및 액상 티오글리콜레이트는 30-35℃) 및 시간(14 일)으로 배양한다.
필터 방법에서는, 시료를 캐니스터 상에 장착된 필터 유니트를 통해 필터한다. 시료를 두 부분으로 나누고 각각의 부분을 별개의 필터 유니트를 통해서 필터한다. 각각의 필터를 헹굼 액체로 헹구고, 적합한 배지(대두-카세인 소화물 및 액상 티오글리코레이트)를 추가한다 - 각각의 캐니스터에 한 종류의 배지. 각각의 캐니스터는 밀봉되어 적절한 온도 및 시간(상기 기술한대로 임)으로 배양된다.
무균성(또한 접종물로도 언급됨)에 대해 시험된 본 발명의 시료를 시험 배지(티오글리코레이트 또는 대두-카세인 소화물)를 포함하는 용기에 접종하고, 완전히 혼합하여 적절한 온도(티오글리콜레이트는 30-35℃에서 배양하고, 대두-카세인 소화물은 20-25℃에서 배양함)에서 14 일 동안 배양한다. 단핵세포(+105 세포)의 두 번째 PBS 세척물 시료(및 무균성 시험 배지), 단핵세포-풍부 분획(+105 세포)의 PBS 세척물 시료 및 공-배양전의 처리된 진피를 포함하는 용기를 접종 다음 날에 성장의 징표가 있는지 육안으로 검사한다. 이 단계에 시험 배지의 혼탁 또는 뿌연 정도는 미생물 오염의 증거로 간주되어 제품 불합격으로 이어진다.
모든 시료는 나아가 전체 14일의 배양 기간에 걸쳐 무균성 여부에 대해 매일 검사하여 평가된다. 배양물은 검사 시에 가시적인 혼탁의 징후가 없다면 무균인 것으로 간주된다.
미생물 오염이 없는 것으로 확인된 경우에만 뱃치를 환자에게 투여할 수 있다. 배양 후, 미생물 성장의 징표에 대하여 배양물을 검사한다. 만약 콜로니가 발견되면, 이들을 그람 염색하고, 특정 세균 유형을 동정하기 위해 다양한 생화학적 검사로 시험한다.
7b. 박테리아의 내독소
박테리아의 내독소 시험은 동결건조된 Limulus Amebocyte Lysate(LAL)(Associate of Cape Cod, Catalogue No. G5003 또는 G2003(PYROTELL)), 및/또는 동결건조된 E.coli 대조군 표준 내독소(Associate of Cape Cod, Catalogue No.E005)(실제 수치는 각각의 뱃치에 대해 공급자가 언급함)를 사용하여 수행한다. 제품 방출 규격은 <200Eu/ml이다.
7c. 그람 염색
그람 염색의 결과가 음성인 경우에만 뱃치를 환자에게 투여 할 수 있다.
박테리아 활성 시험
7d. 생세포 수 측정
세포 생활도를 트리판 블루 시약 염색 배제법을 사용하여 결정한다. 이 방법은 살아 있는 세포는 염색약을 취하지 않는 반면, 죽은 세포는 취한다는 원칙에 근거한다. 염색은 또한 세포 형태의 가시화를 수월하게 한다. 트리판 블루 용액 0.4%(w/v)을 세포 현탁액 시료와 혼합하여 혈구계로 옮긴다. 현미경하에서 x 400 확대하여 세포를 센다. 배양물 생활도가 ≥80% 인 경우에만 사용을 위해 뱃치를 방출한다.
7e. 세포 형태 및 세포질 과립 수 측정
세포 형태는 현미경으로 x 400 확대하여 평가되는 정성 분석이다. 관찰되는 파라미터는 배양물 중의 세포의 크기, 과립도 및 불규칙성이다. 단핵세포-풍부 분획의 시료를 Percoll 분리 및 세포 세척(시간 0)후에, 및 공-배양의 종료 후에 현미경 검사를 위해 채취한다. 배양 기간 전 및 후의 세포간의 비교를 한다. 배양 후에, 세포는 비교적 크고, 불규칙하며 과립이 있는 것으로 보여야만 한다.
세포의 과립도는 배양 후 배양물의 매우 특이적인 특징인 것으로 관찰되어 왔다. 위상 현미경하에서, 상기의 과립은 쉽게 셀 수 있는 푸른빛이 도는 색상의 매우 굴절력이 높은 구형 물체로 보인다. 배양전의 세포에서 과립은 드물지만, 배양 후에는 많아지며, 아마도 배양 및 배양물의 조작에 의해 특이적으로 유도된다. 과립 분석의 목적은 배양된 대식세포에서의 세포질 과립 발생의 수적 측정값을 얻기 위한 것이다. 분석은 다른 품질관리 시험 수행 및 제품포장 작업에 필요한 충분한 시간 내에 사용될 수 있는 믿을 만한 결과를 제공한다.
과립을 세는 것은 컴퓨터 영상 분석에 의해 수행한다. 먼저, 과립도 값을 시료 중 세포 당 평균 과립의 수로 나타낸다. 그러나, 많은 수의 뱃치를 분석한 후에, 과립이 세포간에 고르게 분포되어 있지 않으며, 그래서 배양물의 과립도는 25%의 가장 과립성인 세포(상위 사분위수)중의 세포 당 과립수로 가장 잘 대표된다는 것을 발견하였다. 상위 사분위는 평균값 및 다른 사분위들을 고려한 후에 선택하였다. 이중에서, 상위 사분위의 경계값 과립도가 최저의 뱃치간 변동계수를 가지며, 배양 전 대 후의 세포간의 통계학적으로 의미 있는 차이를 나타내는데 있어 가장 민감하다는 것을 발견하였다. 결과는 표 1 에 있다.
상기 결과를 근거로, 상위 사분위에서 세포 당 ≥4 개 과립의 세포 과립도(즉 25%의 가장 과립성인 세포에서 4개 과립 이상)를 환자에게 사용될 최종 제품에 요구되는 파라미터로 사용한다. 상기 방법으로 분석된 모든 임상적 뱃치 및 대부분의 연구용 뱃치는 상위 사분위에서 세포 당 4개 이상의 과립을 포함하였다. 측정된 파라미터로서 상위 사분위 과립도 경계값 및 최소 경계값으로 세포 당 4개 과립의 선택은, 시료 크기로 60개 이상의 세포를 사용하여, 배양 전 및 후의 세포간 차이에 대한 민감도를 극대화 할 필요성에 근거한다. 선택된 파라미터는 많은 뱃치를 검사하여 최저 변동계수를 갖는 파라미터이다. 이는 시료간 실제 차이(예를 들면, 배양 후 대 전의 세포간)에 대한 민감도를 극대화한다.
과립을 세기 위해, 새로 준비된 '단핵세포-풍부' 분획(배양 전) 및 하루 지난 후의 '배양된 세포' 분획(배양 후)으로부터 시료를 채취한다. 각각 분획의 현미경 검사는 신선한 시료로 수행한다. 시료를 현미경 슬라이드 위에 올려놓고 세포가 가라앉도록 15분 이상을 방치하여, 현미경하에서 얻을 수 있는 초점을 향상시킨다. 세포를 x100 대물렌즈 및 위상차를 갖는 현미경으로 검사하고, 디지털 카메라로 영상화한다. 커버 슬립 아래의 시료 부분을 4등분으로 나눈다: 각각의 4등분은 동일한 세포를 두 번 보는 것을 피하기 위해 체계적으로 스캔한다. 각각의 4등분에서 15개 세포의 사진을 찍을 때까지 시야에 세포가 들어오는 대로 세포 사진을 찍는다. 이렇게 하면 각각의 시료에 대해 60개 세포 사진이 생긴다. 사진 찍히는 각각의 영역에서 볼 수 있는 과립수를 극대화하기 위해 초점을 조정한다. 저장 및 뒤이은 분석을 위해 디지털 영상을 컴퓨터로 옮긴다. 세포 사진을 영상분석 소프트웨어로 분석하고 과립도를 평가한다. 과립수를 세는 것은 영상 분석에 의해 컴퓨터 영상분석으로 수행된다.
모든 뱃치에서 세포의 진피와의 배양 후에 과립의 매우 상당한 증가가 있다. 결과는 진피와 배양된 세포 중에서 과립도가 평균적으로 200%를 초과하여 증가하였다는 것을 보여준다.
세포 과립도는 대식세포가 배양 동안 겪는 표현형의 변화를 반영하는 파라미터 중의 하나라고 결론지을 수 있다.
도 1A-1B는 각각, 비과립성 단핵세포(배양 전) 및 과립성 단핵 세포성 백혈구(배양 후)의 사진이다.
7f. 배양물 순도 - 흐름세포측정에 의한 CD14 분석
인간 단핵세포/대식세포에 대해 특이적인 잘 확립된 세포 표면 표지인, 인간 CD14에 대한 모노클로날 항체(mAbs)를 사용한 흐름세포측정으로 세포 배양물 순도를 모니터한다. 세포를 시중의 형광색소-접합된 mAb로 처리하여 표시한 후 PBS로 세척한다. CD14에 대하여 양성인 세포 분획을 배양물 순도의 측정으로 간주한다. 상기 파라미터는 배양 단계 전 및 후 모두에 분석된다. 배양된 대식세포 세포배양물의 순도는 제품 방출 기준으로 제공되며, ≥40%, 바람직하게는, ≥60% 이상의 CD14+ 세포이어야만 한다.
7g. 만노스 수용체 발현 분석
만노스 수용체(MR)는 탄수화물에 결합하는 막 단백질로, 효모 세포의 포식에 관여되어 있다. 세포 표면의 만노스 수용체의 존재는 인간 만노스 수용체에 특이적인 시중의 형광색소-접합된 mAb 를 사용한 흐름세포측정으로 결정한다. 세포를 mAb와 배양하고 상기 기술한 바와 같이 세척한다. 만노스 수용체에 대하여 양성인 세포 분획은 세포의 잠재적 포식 활성 및 세포 성숙을 나타내는 것으로 간주된다. 상기 분석은 세포 배양 전 및 후 모두에 수행된다.
작지만, 그러나 중요한, MR 발현에 있어서 증가의 검출 능력을 증대시키기 위해, "단핵세포-풍부 분획"(진피와의 공배양전)으로부터 수득된 세포를 삼중으로 시험한다. 진피와의 공배양 후에 수득된 세포는 이중으로 시험한다. 이런 식으로 하여, 각각, 삼중 및 이중 측정값의 두개의 독립적인 세트를 통계적으로 분석한다.
21시간(공배양 단계 후)에 두개의 MR 발현 측정값 배치(array)를 0시간에 수행된 세개의 측정값의 배치와 비교한다. t-시험 분석을 수행하고 95-신뢰 수준으로 차이의 유의미성(0시간과 비교된 21시간에서의 증가)을 결정한다. 전-배양 수준과 비교하여 후-배양 세포에서 발생하는 MR발현에 있어 통계적으로 유의미성 증가가 의미 있는 것이며, 이는 세포 배양물이 필요한 특이적 촉발을 거쳤으며 생체 내에서 계속적으로 신경재생 표현형을 발달시킬 것임을 제시한다.
7h. ICAM-발현 분석
세포간 상호작용은 부분적으로는 접착분자 패밀리에 의해 매개된다. 세포간 접착분자(ICAM)는 면역글로불린 수퍼유전자 패밀리의 구조적으로 연관된 일원이며 백혈구 상에 존재하는 β2 인테그린 분자에 대한 리간드이다. ICAM-1은 내피세포 상에 그리고 일부 림프구 및 단핵세포 상에서 일상적으로 발현된다. 이의 발현은 시토카인(TNFα, IL-1β, 및 IFN-γ)의 존재 하에서 상당히 증가하고, 따라서 세포 활성과의 연관성을 나타낸다. 나아가, ICAM-1은 신경 손상 후에 대식세포에 의한 미엘린 흡수(uptake)에 있어 공-자극 신호로서 작용한다고 보고되었다(Vougioukas 등 2000, Involvement of intercellular adhesion molecule-1 in myelin recognition by macrophages. Acta Neuropathol(Berl), 99:673-79).
CD14+세포 상의 ICAM-1 수용체의 발현은 시중의 특이적 mAb를 사용한 세포의 면역표지 및 흐름세포측정 분석으로 측정된다. ICAM-1 수용체의 발현은 피부와의 공배양 후의 세포에서 향상된다.
7i. 인터루킨-1 β분석
IL-1β의 생산은 진피와의 단핵세포 배양의 직접적인 결과이며 이 시토카인은 최종 제품 중의 대식세포에 의해 분비된다. IL-1β 수준을 하기의 절차에 따라 평가한다: 1.4x106개의 공배양된 세포를 무균 시험관에 넣고, 원심분리하고 IMDM 중에 재현탁한다. 세포 현탁액을 가습된 5% C02 배양기에서 36-37℃로 30분간 배양한다. 30분 배양 종료시점에, 시험관을 원심분리하고, 시중의 키트를 사용한 ELISA로 상층액 중의 IL-1β수준을 결정한다. 결과는 백만개 대식세포 당 계산되어, CD14+ 세포로 결정된다. 17pg/106 CD14+ 세포 이상의 결과가 허용되는 값이다.
7j. BDNF 분석
BDNF의 수준은 시중의 키트, 예를 들면 인간 BDNF DuoSet Elisa Development System(R&D catalog No.DY248)을 사용한 ELISA로 세포-조건화된 배지 중에서 결정되었다.
인간 혈액 유래의 단핵세포를 상기 기술한대로 분리하여 진피와 배양하였다. 배양 후, 세포를 원심분리(380xg, 10분, 10℃)하여 취득하였다. 세포-조건화된 배지를 1.4ml의 신선한 IMDM 배지 중에 1.4 백만개의 취득한 세포를 재현탁하고, 가습된 배양기(5% C02)에서 37℃로 30분간 배양하여 준비하였다. 배지를 이어서 산성화(1M HCl 56μL 첨가)하고 5분 후에 56μL의 1M NaOH로 중화하였다. 세포를 원심분리로 침전 후에 따라낸 조건화된 배지를 수집하여, 분석할 때까지 -70℃에 냉동하였다.
다른 뉴로트로핀 예컨대 NT-3 및 NT-4 도 BNDF 키트와 동일한 공급자 유래의 적합한 시중의 ELISA 분석 키트를 사용하여 상기의 시료에서 분석할 수 있다.
7k. IL-6 분석
IL-6 수준을 배양 전 단핵세포 및 수득된 활성화된 대식세포의 상층액에서 시중의 키트를 사용하여 ELISA로 결정하였다. 배양 후의 대식세포에 의한 시토카인 IL-6의 분비는 전-배양된 단핵세포의 수준에 대하여 4-15 배 향상된다.
실시예 8. 활성화된 대식세포는 완전한 척수 손상이 있는 인간에서 부분적인 감각 및 운동 기능의 회복을 촉진한다.
제1상 임상시험에서, 4,000,000개 자가유래 대식세포(상기 실시예에 기술된 대로 진피와의 배양 후)를 척수안으로 환부에 직접 주사하여 완전한 척수 손상(미국 척수 손상 협회에 따라 ASIA A로 분류된)이 있는 8명의 환자를 치료하였다. 이들 중 세명은 운동 및 감각 기능을 회복하여 ASIA C로 재분류되었다. 손상의 유형과 관련된 연령별 성별 데이터는 표 2에 있다. 연구에 등록한 입원 환자(초기) 및 최근의 추적 검진 외래 환자의 운동 및 감각 수치, ASIA 분류는 하기의 표3에 있다. 경촉각, 침통(통증) 및 운동 회복은 초기 검진과 비교하여 % 증가로 표현된다.
현재까지 수득된 임상적 발견에 따르면, 치료와 연관될 수도 있는 부작용은 일어나지 않았다.
임상적 효능의 초기 징후가 관찰되었다. 방광조절도 또한 회복한 환자 #1을 포함하는 세명의 환자에서 상당한 감각 회복 및 어느 정도의 운동 회복이 발견되었다.
상기 결과는 자가유래의 공배양된 인간 대식세포가 시험관내 분석에서 증명된 대로 상처-치유 표현형을 나타낸다는 것을 제시한다. 나아가, 이러한 대식세포는 이들 세포가 다른 조직의 상처치유를 촉진하는 능력의 예로서 인간 CNS의 재생을 촉진하는 것으로 나타났다.
실시예 9. 급성 심근경색 치료로서 배양된 대식세포 투여의 효능
두 그룹의 무게가 300±20 그램[Harlan Laboratories, Israel]나가는 수컷 Sprague-Dawley(SD)래트(rat)에서 활성화된 대식세포의 효과를 시험하기 위해 하기의 프로토콜이 사용된다: 그룹 A(12 래트)래트를 2.5x106 대식세포 및 DCCM1 배지를 포함하는 25μl 현탁액으로 치료하고, 그리고 그룹 B(6 래트)래트는 25μl DCCM1 배지만으로 치료한다.
활성화된 래트 대식세포는 본원에 기술된 절차에 따라서 또는 US특허 제 5,800,812 호, 제 6,117,424호 및 제 6,267,955호에 기술된 방법에 따라 생산되며, 투여전에, 대식세포 배양물을 흐름세포측정으로 활성 및 순도에 대하여 시험한다.
SD 래트에서 관상 동맥을 묶어 심근허혈을 유도한다. 이로 인해 생긴 괴사 조직은 약 50mm3의 부피를 가지며, 이는 통상적으로 다른 실험에서, 5μl DCCM1 배지 중에 현탁된 약 400,000 개의 활성화된 대식세포로 치료하는 척수 절단끝 크기의 약 6배이다.
외과의사가 맹검 방식으로 활성화된 대식세포를 SD 래트에 이식한다. 척수횡절단 후 래트를 치료하기 위해 사용된 약 400,000 개 세포 양과 비교하여 약 6배의 활성화된 대식세포 일회량을 사용한다. 따라서, 25μl DCCM1 배지 중에 현탁된 총 2.5백만개의 추정된 유효 일회량을 5 회분의 일회량으로 나누어 경색 유발 후 즉시 심장근육에 주사한다: 경색의 중앙에 1회의 주사를 놓은 후 경색과 건강한 조직 사이의 경계에 4회의 추가의 주사를 놓는다. 주사는 Hamilton 주사기로 22G 주사바늘 통하여 수행한다. 동물들이 회복하도록 12/12시간 명/암 주기로 동물방에 두며, 먹는 것과 마시는 것을 자유롭게 할 수 있게 한다. 결과의 추적은 6주간 계속된다. 생존율이 본 연구의 실마리가 되는 파라미터이다.
결과 평가는 맹검방식으로 하며, 조직학적 평가는 경색면적, LV 공동 직경, 및 LV 매스 (mass) 부위를 평가하기 위해 Masson 삼색 염색된 슬라이드를 이용하여 좌심실(LV)의 횡단면에 대하여 수행한다. 아폽토시스성(apoptotic) 세포 사멸을 평가하기 위해 TUNEL 염색된 슬라이드를 사용한다. 정상, 경계, 또는 경색된 심장근육내의 대식세포의 존재 및 위치를 평가하기 위해 대식세포에 대한 특이적 염색을 수행한다. 유사분열지수는 증식성 세포 핵 항원(PCNA)에 대해 특이적 모노클로날 항체로 면역조직화학염색을 하여 측정한다. 데이터 분석을 위해, 통계분석을 각 파라미터에 대해 수행한다.
Claims (1)
- 하기로 구성되는 활성화된 인간 단핵 식세포성 백혈구의 배양물의 제조방법:
(i) 개인의 혈액 시료로부터 단핵세포를 분리하여, 세포 배양물에 적합한 배지(본원에서 "배지") 중에 현탁하는 단계;
(ii) 동일한 개인으로부터 수득한 피부 단편을 처리하여, 표피를 제거하고, 수득한 인간 진피 단편을 항생제가 첨가된 단계 (i) 과 동일한 배지 중에서 초음파처리하고, 초음파처리된 진피 단편을 항생제가 첨가된 단계 (i)의 배지와 동일한 신선한 배지 중에 적심하며, 그리고 항생제가 들어 있지 않은 상기 신선한 배지로 진피 단편을 헹구는 단계;
(iii) 단계(i)의 단핵세포를 단계 (ii)의 헹군 진피 단편과 공배양하여, 활성화된 인간 단핵 식세포성 백혈구를 함유하는 배양 혼합물을 수득하는 단계;
(iv) 배양 혼합물로부터 진피 단편을 제거하고, 수득한 활성화된 인간 단핵 식세포성 백혈구를 원심분리로 침전하는 단계;
(v) 단계 (i)의 배지와 동일한 신선한 배지 중에서 활성화된 단핵 식세포성 백혈구를 세척하고 재현탁해서, 활성화된 인간 단핵 식세포성 백혈구를 수득하는 단계; 및
(vi) 활성화된 인간 단핵 식세포성 백혈구의 배양물을 인간 투여 적합성에 대해 적어도 하기의 시험으로 평가하는 단계로서:
(a) 무균성;
(b) 세포 생활도;
(c) 박테리아 내독소 시험;
(d) 그람-염색;
(e) 형태계량적 분석으로 세포질 과립수 측정;
(f) CD14+ 세포의 존재; 및
(g) IL-1β 분비 수준
상기 수득된 활성화된 인간 단핵 식세포성 백혈구(본원에서 "활성화된 세포")가 적어도 하기의 특징을 나타내는 제조 방법:
(a) 14 일의 무균성;
(b) 트리판 블루 염색 배제법을 사용하여 80% 이상의 배양물 생활도;
(c) 박테리아 내독소 시험에서 200Eu/ml 미만;
(d) 그람-염색에서 박테리아의 증거가 없음;
(e) 형태계량적 분석으로, 25% 이상의 가장 과립성인 세포가 세포 당 4개 이상의 과립을 보임;
(f) 세포의 40% 이상이 CD14 양성(CD14+ )임; 및
(g) 세포에 의해 생산된 IL-1β 수준이 17pg/106 CD14+ 세포 이상임.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US33178001P | 2001-11-21 | 2001-11-21 | |
US60/331,780 | 2001-11-21 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020047007695A Division KR101001119B1 (ko) | 2001-11-21 | 2002-11-21 | 인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조 방법 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20100087781A true KR20100087781A (ko) | 2010-08-05 |
Family
ID=23295342
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020047007695A KR101001119B1 (ko) | 2001-11-21 | 2002-11-21 | 인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조 방법 |
KR1020107016499A KR20100087781A (ko) | 2001-11-21 | 2002-11-21 | 인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조 방법 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020047007695A KR101001119B1 (ko) | 2001-11-21 | 2002-11-21 | 인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조 방법 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8377692B2 (ko) |
EP (1) | EP1456355A4 (ko) |
JP (2) | JP2005519585A (ko) |
KR (2) | KR101001119B1 (ko) |
CN (1) | CN1615357A (ko) |
AU (1) | AU2002353465B2 (ko) |
CA (1) | CA2467046C (ko) |
IL (2) | IL162094A0 (ko) |
MX (1) | MXPA04004813A (ko) |
NZ (1) | NZ533033A (ko) |
WO (1) | WO2003044037A2 (ko) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060210543A1 (en) * | 2005-03-21 | 2006-09-21 | Jonathan Leor | Method of treating infarcted myocardium |
US9220813B2 (en) * | 2005-04-18 | 2015-12-29 | Holy Cross Hospital, Inc. | Cell therapy for limiting overzealous inflammatory reactions in tissue healing |
US20110076255A1 (en) | 2005-11-07 | 2011-03-31 | Pecora Andrew L | Compositions and methods for treating progressive myocardial injury due to a vascular insufficiency |
US8637005B2 (en) | 2005-11-07 | 2014-01-28 | Amorcyte, Inc. | Compositions and methods of vascular injury repair |
PT2441461E (pt) * | 2005-11-07 | 2014-08-26 | Amorcyte Inc | Composições e métodos de reparação de lesões vasculares |
JP6105846B2 (ja) * | 2008-09-12 | 2017-03-29 | クライオプラキス クライオバイオロヒア エリテーデーアー. | 虚血組織の細胞療法 |
CN102245189B (zh) * | 2008-12-03 | 2015-06-17 | 阿莫塞特公司 | 改善梗死区灌注的组合物以及血管损伤修复方法 |
MX2011009277A (es) * | 2009-03-05 | 2011-12-16 | Macrocure Ltd | Composicion de leucocito activada. |
US8574902B2 (en) | 2009-03-05 | 2013-11-05 | Macrocure Ltd. | Activated leukocyte composition and uses for wound healing |
EA201390314A1 (ru) | 2010-09-09 | 2013-11-29 | Макрокьюэ, Лтд. | Супернатант, кондиционированный активированными лейкоцитами, и его использование для заживления ран |
JP6148679B2 (ja) * | 2011-12-14 | 2017-06-14 | イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド | 中枢神経系の損傷の治療のためのヒト単球亜集団 |
EP2662085A1 (en) * | 2012-05-11 | 2013-11-13 | Humboldt-Universität zu Berlin | Regulatory Macrophages and Their Uses |
CN102703597B (zh) * | 2012-06-20 | 2013-10-30 | 安徽信灵检验医学科技有限公司 | 血液白细胞分离液及其制作方法、真空采血管 |
CN105377273A (zh) | 2013-05-22 | 2016-03-02 | 耶达研究与发展公司 | 用于治疗眼睛疾病或病症的人类单核细胞亚群 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4086057A (en) * | 1976-07-28 | 1978-04-25 | William Clinton Everett | Ultrasonic disinfection system |
US5292655A (en) * | 1990-01-29 | 1994-03-08 | Wille Jr John J | Method for the formation of a histologically-complete skin substitute |
JP3543869B2 (ja) * | 1995-03-07 | 2004-07-21 | 株式会社メニコン | 培養皮膚およびその製造法 |
US6267955B1 (en) * | 1995-09-15 | 2001-07-31 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Mononuclear phagocytes and their use to promote axonal regeneration |
US5800812A (en) * | 1995-09-15 | 1998-09-01 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of use of mononuclear phagocytes to promote axonal regeneration |
US6060515A (en) * | 1997-01-24 | 2000-05-09 | The Regents Of The University Of California | Treatment of skin conditions by use of PPARα activators |
AU5610398A (en) * | 1997-02-28 | 1998-09-18 | Warner-Lambert Company | Method of treating or preventing septic shock by administering a mek inhibitor |
JP2002509715A (ja) | 1998-03-30 | 2002-04-02 | イ・デ・エム・イミュノ−デジネ・モレキュル | 刺激された単球に由来する細胞、その調製及び用途 |
US6893462B2 (en) * | 2000-01-11 | 2005-05-17 | Regeneration Technologies, Inc. | Soft and calcified tissue implants |
US20030109583A1 (en) * | 2001-07-25 | 2003-06-12 | Raju Bore G. | Administration of negamycin or deoxynegamycin for the treatment of bacterial infections |
-
2002
- 2002-11-21 IL IL16209402A patent/IL162094A0/xx active IP Right Grant
- 2002-11-21 CN CNA028271440A patent/CN1615357A/zh active Pending
- 2002-11-21 US US10/496,352 patent/US8377692B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-11-21 JP JP2003545673A patent/JP2005519585A/ja not_active Withdrawn
- 2002-11-21 KR KR1020047007695A patent/KR101001119B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2002-11-21 EP EP02788490A patent/EP1456355A4/en not_active Ceased
- 2002-11-21 MX MXPA04004813A patent/MXPA04004813A/es active IP Right Grant
- 2002-11-21 CA CA2467046A patent/CA2467046C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-11-21 AU AU2002353465A patent/AU2002353465B2/en not_active Ceased
- 2002-11-21 KR KR1020107016499A patent/KR20100087781A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-11-21 WO PCT/IL2002/000930 patent/WO2003044037A2/en active Application Filing
- 2002-11-21 NZ NZ533033A patent/NZ533033A/en not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-05-20 IL IL162094A patent/IL162094A/en not_active IP Right Cessation
-
2010
- 2010-01-29 JP JP2010018379A patent/JP5087094B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2002353465B2 (en) | 2008-10-16 |
CA2467046C (en) | 2011-07-19 |
CA2467046A1 (en) | 2003-05-30 |
US20050129663A1 (en) | 2005-06-16 |
JP2010100653A (ja) | 2010-05-06 |
NZ533033A (en) | 2006-01-27 |
JP2005519585A (ja) | 2005-07-07 |
US8377692B2 (en) | 2013-02-19 |
EP1456355A4 (en) | 2005-05-25 |
IL162094A0 (en) | 2005-11-20 |
CN1615357A (zh) | 2005-05-11 |
WO2003044037A2 (en) | 2003-05-30 |
AU2002353465A1 (en) | 2003-06-10 |
KR20040076860A (ko) | 2004-09-03 |
EP1456355A2 (en) | 2004-09-15 |
MXPA04004813A (es) | 2004-08-11 |
WO2003044037A3 (en) | 2004-04-08 |
IL162094A (en) | 2011-09-27 |
JP5087094B2 (ja) | 2012-11-28 |
KR101001119B1 (ko) | 2010-12-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5087094B2 (ja) | ヒト単核食作用性白血球の製造法 | |
CN105267240B (zh) | 间充质干细胞来源的外泌体的用途 | |
Newsome et al. | Human massive periretinal proliferation: In vitro characteristics of cellular components | |
JP6309268B2 (ja) | 自己真皮線維芽細胞の投与単位処方物 | |
Stutman et al. | STUDIES ON THYMUS FUNCTION: I. Cooperative Effect of Thymic Function and Lymphohemopoietic Cells in Restoration of Neonatally Thymectomized Mice | |
KR102590455B1 (ko) | 주산기 조직 유래된 중간엽 줄기 세포: 그의 제조 방법 및 용도 | |
US20050014255A1 (en) | Stem cells for clinical and commercial uses | |
CN102281883A (zh) | 用于预防或治疗神经疾病的包括间充质干细胞或间充质干细胞培养液的组合物 | |
EP1789537A2 (en) | Conditioned medium comprissing wnt proteins to promote repair of damaged tissue | |
Pourfath et al. | Monitoring wound healing of burn in rat model using human Wharton’s jelly mesenchymal stem cells containing cGFP integrated by lentiviral vectors | |
CN109893541B (zh) | 经血干细胞来源的外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用 | |
Nanchahal et al. | Cultured composite skin grafts: biological skin equivalents permitting massive expansion | |
Supp et al. | Isolation and feeder-free primary culture of four cell types from a single human skin sample | |
AU2019342877A1 (en) | Biomaterial comprising adipose-derived stem cells and gelatin and method for producing the same | |
Hazlett et al. | Aging alters the phagocytic capability of inflammatory cells induced into cornea | |
Zhang et al. | A modified protocol for isolation of retinal microglia from the pig | |
McIntire et al. | In vitro models for studying human uterine and placental macrophages | |
Chen et al. | Effect of TGF-β2 on the Mechanical Properties of Posterior Scleral Fibroblasts in Experimental Myopia | |
Burleson et al. | Studies on the isolation of lymphocytes active in cell-mediated immune responses: I. Demonstration of an active population of thymus-derived cells in mouse bone marrow | |
Qian et al. | Culture of rat keratinocytes with acellular pig dermis | |
CN107441481A (zh) | 一种治疗单纯皮肤损伤的经血干细胞制剂及其制备方法 | |
CN108273063A (zh) | 用于治疗急性肾脏损伤的医药组合物 | |
CN117757719A (zh) | 一种加快皮肤损伤修复的微组织及其应用 | |
Ngo et al. | Ectopic adipogenesis in response to injury and material implantation in an autoimmune mouse model | |
CN113116743A (zh) | 一种含有细胞活性因子的面部抗衰乳液及其制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A107 | Divisional application of patent | ||
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E601 | Decision to refuse application |