CN109893541B - 经血干细胞来源的外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,尤其涉及一种经血干细胞来源的外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用。经血干细胞经原代分离、培养、传代后,选用3—6代经血干细胞用于外泌体制备。经血干细胞生长至密度80%后,PBS洗涤去掉血清成分,添加无血清DMEM‑F12培养液置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱培养24h。收集上清,GMP条件下超速离心法制备外泌体,无菌PBS收集后储存于-80℃。该细胞存活率高,性状稳定,易获得,易扩增,对宫腔粘连的治疗效果显著。外泌体甚至能完全模拟细胞的生物学功能,达到促进组织修复和治疗疾病的效应。外泌体比其来源的细胞更加安全并且冷冻保存后不会丧失功能,而且可以用于异体移植,量化生产,具有重要的临床应用价值和社会、经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,尤其涉及一种经血干细胞来源的外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用。
背景技术
子宫内膜对维持女性生理特征和生育能力具有举足轻重的意义,它具有高度的再生能力和增殖活性,任何引起子宫内膜破坏的因素都可引起子宫腔粘连。随着频繁的宫腔操作及宫腔镜手术的普及,子宫内膜损伤所致宫腔粘连(intrauterine adhesions,IUA)的发生率和检出率逐年增加,已成为女性继发性不孕的第二大原因。IUA是由于子宫内膜基底层损伤后形成纤维化瘢痕、修复障碍导致的宫腔部分或全部粘连闭塞,从而引起月经量少、闭经、不孕及反复流产等一系列并发症,也被定义为Asherman综合征。
目前治疗IUA的主要手段是采用宫腔镜粘连分解术结合预防粘连复发治疗,包括宫内置节育器、Foley气囊导尿管、透明质酸应用、羊膜植入及配合药物(如雌激素、中药、阿司匹林)治疗,以促进子宫内膜再生,恢复其生理,但效果因人而异,患者生育力恢复情况不甚理想。重度宫腔粘连患者术后,IUA复发率高,现有治疗手段难以完全恢复患者生育力。此外,手术后仍有不孕的发生,这类难治性宫腔粘连导致的不孕不育给患者身心及家庭带来极大痛苦。
近些年来,很多医学领域的研究人员进行IUA的临床研究,努力探索一种可以有效恢复患者子宫内膜再生能力的方法。大量研究表明子宫内膜存在干细胞,深入子宫基底层的损伤,会引起干细胞的丢失或功能异常,最终导致子宫内膜再生失败,因此干细胞移植治疗有望成为宫腔粘连患者更好的选择。目前,国内外已有研究报道应用骨髓干细胞移植治疗患者宫腔粘连或动物模型,患者在接受男性供者的骨髓间充质干细胞移植后,受者的子宫内膜中出现了Y染色体阳性的子宫内膜上皮细胞和基质细胞,提示骨髓间充质干细胞参与内膜的再生过程。但是,骨髓干细胞的主要缺陷是其获得存在侵袭性和创伤性,易引起患者的不适或感染;另外骨髓中直接分离出的干细胞比例较低,通过培养在有限传代次数内获得足够数量的细胞也较困难,这在一定程度上限制了其应用。故亟需寻找更加安全、易获得、易扩增的干细胞才利于推广干细胞在宫腔粘连病症中的移植疗法。
经血干细胞(menstrual blood stromal stem cells, MenSCs)是月经血来源的间充质干细胞,具有间充质干细胞的全部生物学特性,体外增殖能力是骨髓干细胞的两倍,免疫原性极低。相比骨髓和脂肪来源的间充质干细胞,经血干细胞最突出的优点是无创取材,避免了伦理争议,患者通过无创、无痛、无感染的方式即可获取足够的月经血样本;相比于胚胎干细胞和脐带干细胞,由于育龄期女性的周期性月经来潮的特点,经血样本能够周期性获取实现自体移植,避免异体移植潜在的免疫和感染风险。目前,已有报道经血干细胞用于治疗脑中风、下肢缺血、心肌梗死、肌营养不良、肠炎、卵巢早衰、败血症和糖尿病等多种动物模型。移植的MenSCs不同程度地促进了组织损伤修复,提高了动物的生存率或妊娠率。发明人的前期临床应用结果表明经血干细胞能够有效修复宫腔粘连患者的子宫内膜形态,增加子宫内膜血流和内膜厚度,提高妊娠率和活产率。
然而,通过前期临床实践发明人发现自体经血干细胞治疗宫腔粘连仍存在一些潜在的问题。传统治疗手段无法带来满意治疗效果的重度宫腔粘连患者由于子宫内膜严重瘢痕化,可能出现闭经或月经量过少难以采集或单次采集量不足以支持移植的情况,此时难以顺利进行自体经血干细胞移植治疗宫腔粘连。因此,亟待寻找一种新的安全有效的自体干细胞制剂解决以上临床难题。
发明人前期研究发现,经血干细胞移植进入宫腔粘连模型大鼠子宫后具有损伤趋向性,定植于损伤宫腔和腺体周围,但未见明显的增殖和分化现象。结合实验数据和已发表的间充质干细胞治疗相关文献推测经血干细胞可能通过旁分泌作用起到子宫内膜修复的效果。
外泌体是细胞分泌的有效物质之一。间充质干细胞被认为是产生外泌体能力最强的细胞,其外泌体甚至能完全模拟细胞的生物学功能,达到促进组织修复和治疗疾病的效应。外泌体比其来源的细胞更加安全并且冷冻保存后不会丧失功能,其临床应用相较于间充质干细胞更有前景。已报道,MenSCs外泌体显著促进皮质神经元轴突的生长,且能有效缓解肝损伤导致的小鼠死亡。发明人前期动物实验结果表明,向宫腔粘连模型大鼠子宫内移植经血干细胞来源的外泌体后,大鼠子宫内膜纤维化程度显著降低,子宫内膜增厚,子宫内膜腺体数量增加,子宫内膜功能层细胞增殖促进。因此,外泌体是经血干细胞起到治疗作用的关键物质,外泌体能够起到与等量经血干细胞移植相当的治疗效果。基于经血干细胞来源的外泌体的优点,经血干细胞来源的外泌体有望应用于制备治疗宫腔粘连的药物,而至今为止未见相关报道。
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一种经血干细胞来源的外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用。经血干细胞来源的外泌体存活率高,性质稳定,安全,易获得,易扩增,外泌体对宫腔粘连的治疗效果良好,易于制备,能够长期储存,且作为细胞制剂无免疫原性,更有用于异体输注治疗的突出优势。同时,经血干细胞来源的外泌体能够做到工厂化标准化量化生产,作为一种细胞衍生物制剂具有广阔的社会和经济效益。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案。
一种经血干细胞来源的外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用。
一种经血干细胞来源的外泌体的制备方法,具体包括以下步骤。
步骤1、经血干细胞的原代分离、培养:将提取的经血样本用适量PBS稀释吹打冲散经血中的黏液,缓慢滴加于淋巴细胞分离液上层,离心、分离细胞层,弃去上清,细胞沉淀用完全培养液重悬,接种于培养瓶,置于 5% CO2、37℃饱和湿度的培养箱内培养,每2-3 d全量换液一次。
步骤2、经血干细胞的传代:当细胞长满至80-90%,用0.25%胰蛋白酶消化传代,当细胞质回缩,细胞间隙增大后,应立即加入完全培养液2 ml终止消化;反复吹打瓶壁形成细胞悬液;将细胞悬液吸入离心管,离心,弃上清;沉淀用完全培养液调整细胞浓度,接种于培养瓶中;置37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱培养,培养代数2~3代。
步骤3、经血干细胞外泌体的制备:选用3—6代经血干细胞用于外泌体制备,经血干细胞生长至密度80%后,PBS洗涤去掉血清成分,添加无血清DMEM-F12培养液置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱培养24h;收集上清,GMP条件下超速离心法制备外泌体,无菌 PBS收集后储存于-80℃。
所述的经血干细胞为患者经期中的经血,所有患者签署知情同意书,体检合格。
所述的完全培养液含10%患者自体血清的DMEM-F12培养液。若应用于制剂量化生产,则完全培养基中自体血清成分替换为商品化临床级人血白蛋白,外泌体制备过程不变。
本发明具有的有益效果如下。
本发明采用更加适用于内膜再生的干细胞-经血干细胞分泌的外泌体。MenSCs是从女性月经血中分离、培养出来的新型成体干细胞。研究提示,MenSCs包含了脱落的子宫内膜干细胞和循环血液中的骨髓来源间充质干细胞。MenSCs具备间充质干细胞的所有特征,且极易扩增,在体外连续培养保持二倍体核型。外泌体是经血干细胞起治疗作用的主要途径之一。外泌体甚至能完全模拟细胞的生物学功能,达到促进组织修复和治疗疾病的效应。经血干细胞最突出的临床应用优势为无创取材、反复获取、没有伦理争议,外泌体比其来源的细胞更加安全并且冷冻保存后不会丧失功能,其临床应用相较于间充质干细胞更有前景。而且可以用于异体移植,量化生产,具有重要的临床应用价值和社会、经济效益。
附图说明
图1为经血干细胞体外培养及鉴定结果,其中A:光镜下MenSCs的形态(100×):原代(P0)、第一代(P1)、第三代(P3);B:CCK-8检测MenSCs体外增殖情况;C:流式细胞术分析MenSCs的表面标志(同型对照:黑色,特异性抗体:红色);D:条件培养下MenSCs成骨、成脂、成软骨分化;E:免疫荧光检测MenSCs细胞Vimentin及CK18的表达(200×);F:免疫荧光检测MenSCs子宫内膜干细胞特异性筛选标志PDGFR、CD146和SUSD2(200×)。
图2为MenSCs来源外泌体的鉴定。
图3为经血干细胞来源外泌体可被宫腔粘连患者的原代子宫内膜基质细胞内化摄取。
图4为治疗后的大鼠子宫内膜组织HE和Masson染色。
图5为治疗后的大鼠子宫内膜组织腺体数量和内膜厚度变化。
图6为治疗后的大鼠子宫内膜组织Ki67表达。
图7为治疗后的大鼠子宫内膜组织Collagen I和CTGF蛋白表达变化。
具体实施例
下面结合附图和具体实施例对本发明的内容做进一步说明。下述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点,其目的在于让本技术领域的人员了解本发明的内容并局限于此,并不能以此限制本发明的保护范围,凡根据本发明技术方案所作的等效变化,都应覆盖在本法的保护范围之内。
实施例1经血干细胞来源的外泌体的制备。
1.实验设备、材料和试剂。
超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、离心机、超速离心机、恒温水浴箱、B超机、25cm2细胞培养瓶、离心管(50 ml,15 ml)、吸管、5 ml注射器、人工授精导管、采血针、DMEM-F12培养液、0.25%胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液(PBS,Ph=7.4,采购于Biological Industries公司,货号:0044818)。
2.经血干细胞的原代分离、培养。
(1)静脉血收集:月经来潮后第1天来院,采血针取静脉血30 ml,4℃静置过夜,以3000rpm转速室温离心10分钟,取血清,56℃灭活30 min,-20℃保存。
(2)月经血收集:消毒阴道后用5 ml注射器连接人工授精导管抽取月经血2-5 ml。
(3)经血干细胞的分离培养:经血样本用少量PBS稀释混匀后,缓慢滴加于等体积淋巴细胞分离液上层,450 g离心25 min分离细胞层。,450 g离心25 min分离细胞层。离心结束后分为3层,用吸管吸取中间层细胞,加至10 ml PBS中混匀,250 g离心20 min后弃去上清,细胞沉淀用完全培养液(含10%自体血清的DMEM-F12培养液)重悬,接种于培养瓶中置于 5% CO2、37℃饱和湿度的培养箱内培养。每2-3 d全量换液一次。换液后可出现贴壁生长的细胞,呈短棒状或梭形,有较长的突起,有折光性。
3.经血干细胞的传代。
当细胞长满至80-90%,用0.25%胰蛋白酶消化传代。吸除培养瓶内旧培养液;加入2ml PBS,轻轻摇动培养瓶,以洗去残留在瓶内的培养液,吸弃 PBS;培养瓶内加入预热至37℃胰蛋白酶2 ml,轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面;置于37℃培养箱孵育3min。在倒置显微镜下观察,发现细胞质回缩,细胞间隙增大后,应立即加入完全培养液2 ml终止消化;反复吹打瓶壁形成细胞悬液;将细胞悬液吸入离心管,1500rpm离心10 min,弃上清;沉淀用完全培养液调整细胞浓度为1×105/ml,接种于培养瓶中,每瓶5 ml;置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱培养。培养代数2~3代。
4.无菌试验。
在细胞培养第二次换液时,对每一培养瓶中的上清液作无菌试验。收集细胞培养上清,进行病原体检测,见表1。检测结果表明,细胞上清液无不适用于临床应用的病原体及细菌、真菌。
5.经血干细胞的表型鉴定。
对P1经血干细胞进行表型检测。取适量细胞与FITC或PE标记的CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105和SSEA-4抗体4℃孵育30 min,洗去未结合抗体。以相应的同型对照抗体作为阴性对照。用FACS Canto流式细胞仪收集数据,用FACS Diva 软件分析。结果如图1所示,结果显示细胞为CD34、CD45和SSEA-4为阴性,CD38、CD44、CD90和CD105为阳性。
6、MenSCs外泌体制剂制备。
选择P3-P6长满至80-90%的MenSCs细胞,更换为无血清细胞培养基,继续培养24h后收集细胞培养上清。2000rpm/min离心20min,收集上清液。用0.22μm的过滤筛过滤,收集过滤液再次4℃超速离心1h。收集上清液4℃、GMP条件下100000g超速离心4h。用100μl预冷的PBS重悬沉淀后转移到低粘附的离心管中-80℃保存。
7. MenSCs来源外泌体的提取和鉴定。
取2μl的样品用蛋白定量试剂盒检测外泌体的蛋白浓度。取适量样品通过电镜分析外泌体的显微结构如图2所示,直径30-100nm微囊泡;以等量MenSCs细胞为对照组,应用Western blot检测外泌体表面标志分子CD63和CD81的表达,鉴定外泌体分离成功。通过透射电镜(TEM)观察外泌体为圆形囊泡结构如图2所示,纳米颗粒追踪分析技术(NTA)检测其直径在30-150nm之间,外泌体表达相关标记蛋白CD63和CD81,结果证实成功获得MenSCs来源的外泌体。
实施例2经血源性间充质干细胞及其来源外泌体治疗大鼠宫腔粘连的机制研究。
宫腔镜下子宫内膜粘连松解术时获取少量患者子宫内膜(常规手术操作,已签署知情同意书),体外培养粘连部位子宫内膜细胞,红色荧光染料DiI标记经血干细胞来源外泌体,添加至完全培养基中24小时后,发现可被宫腔粘连患者子宫内膜基质细胞内化摄取,如图3所示。
1. 宫腔粘连大鼠模型的建立。
选取8-10周龄雌性SD大鼠,应用机械损伤法,建立双侧子宫内膜损伤模型,损伤后9天颈椎脱臼处死大鼠。取子宫组织,通过H&E染色分析组织病理结构、Masson染色鉴定子宫内膜瘢痕形成鉴定IUA表型。
2. 外泌体治疗。
建模9天后,与双侧子宫内膜下注射经血干细胞来源的外泌体进行治疗,观察治疗效果。等量安慰剂(PBS)为阴性对照,相同数量经血干细胞为阳性对照。HE染色分析治疗后子宫内膜形态改善情况,Masson染色评估纤维增生情况,如图4所示,分别计数各组治疗后子宫内膜厚度及腺体数量(子宫内膜厚度(um):sham 421.1±12.84;MenSCs 553.1±26.65; Exo546±25.61,P<0.01;腺体数量(个):sham 16.82±1.285;MenSCs 26.91±0.9587;Exo 25.45±0.846,P<0.01,如图5所示);Ki-67免疫组化评估各组治疗后子宫内膜增殖情况(Ki67阳性细胞数(个):sham750.5 ± 30.79;MenSCs1494 ± 44.52;Exo1247 ±81.32,P<0.01,如图6所示),Western-blot法评估各组子宫内膜纤维化相关因子Collagen1和Ctgf表达情况,如图7所示。
实验结果表明:MenSCs来源外泌体注射到宫腔粘连的大鼠子宫后,可以显著促进子宫内膜腺体的再生,增加子宫内膜厚度,促进子宫内膜功能层细胞增殖,抑制胶原纤维增生和子宫内膜纤维化。
Claims (1)
1.一种经血干细胞来源的外泌体在制备治疗宫腔粘连的药物中的应用,其特征在于,所述外泌体来自于患者的经血干细胞,所述外泌体通过以下方法制成:
步骤1、静脉血收集:月经来潮后第1天来院,采血针取静脉血30mL,4℃静置过夜,以3000rpm转速室温离心10分钟,取血清,56℃灭活30min,-20℃保存;
步骤2、月经血收集:消毒阴道后无菌操作抽取月经血2-5 mL;
步骤3、经血干细胞的分离培养:经血样本用少量PBS稀释混匀后,缓慢滴加于淋巴细胞分离液上层,离心、分离细胞层,弃去上清,细胞沉淀用含有10%自体血清的完全培养液重悬,接种于培养瓶,置于5%CO2、37℃饱和湿度的培养箱内培养,每2-3d全量换液一次;
步骤4、经血干细胞传代:吸除培养瓶内旧培养液;加入2mL PBS,轻轻摇动培养瓶,以洗去残留在瓶内的培养液,吸弃PBS;培养瓶内加入预热至37℃胰蛋白酶2mL,轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面;置于37℃培养箱孵育3min;在倒置显微镜下观察,发现细胞质回缩,细胞间隙增大后,应立即加入完全培养液2mL终止消化;反复吹打瓶壁形成细胞悬液;将细胞悬液吸入离心管,1500rpm离心10min,弃上清;沉淀用完全培养液调整细胞浓度为1×105/mL,接种于培养瓶中,每瓶5 mL;置37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱培养,培养代数2~3代;
步骤5、无菌试验:在细胞培养第二次换液时,收集每一培养瓶中的细胞培养上清,进行病原体检测,包括:G-脂多糖,巨细胞病毒、EB病毒、梅毒、艾滋病、丙肝、乙肝、沙眼衣原体、生殖支原体、细菌、真菌,放行检验通过的细胞允许继续培养;
步骤6、经血干细胞表型鉴定:取适量细胞与FITC或PE标记的CD34、CD38、CD44、CD45、CD73、CD90、CD105抗体4℃孵育30min,洗去未结合抗体,用FACS Canto流式细胞仪收集数据,用FACS Diva软件分析;
步骤7、MenSCs外泌体制剂制备:选择3-6代的长满至80-90%的MenSCs细胞,更换为无血清细胞培养基,继续培养24h后收集细胞培养上清,2000rpm/min离心20min,收集上清液,用0.22μm的过滤筛过滤,收集过滤液再次4℃、GMP条件下10000g条件下超速离心1h,收集上清液4℃、GMP条件下100000g超速离心4h,用100μL预冷的PBS重悬沉淀后转移到低粘附的离心管中-80℃保存;
步骤8、MenSCs来源外泌体的提取和鉴定:取2μL的样品检测外泌体的蛋白浓度;取适量样品通过电镜分析外泌体的显微结构;直径30-100nm微囊泡;以等量MenSCs细胞为对照组,应用Western blot检测外泌体表面标志分子CD63和CD81的表达,鉴定外泌体分离成功;通过透射电镜观察外泌体为圆形囊泡结构,纳米颗粒追踪分析技术检测其直径在30-150nm之间,外泌体表达相关标记蛋白CD63和CD81,结果证实成功获得MenSCs来源的外泌体。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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