CN106492194A - 一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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王飞
王一飞
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Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用。本发明公开的干细胞外泌体制剂包括：牙髓干细胞外泌体、牙髓干细胞、碱性成纤维细胞生长因子和溶剂；所述牙髓干细胞外泌体为从牙髓干细胞提取的外泌体；每200μL所述制剂中含有从1×106～1×107个所述牙髓干细胞提取的外泌体和1×106～3×106个所述牙髓干细胞；所述碱性成纤维细胞生长因子的含量为5～15ng/mL；所述溶剂为生理盐水。本发明还公开了所述外泌体制剂和所述牙髓干细胞外泌体的制备方法。本发明还公开了所述的外泌体制剂或所述制备方法制得的外泌体制剂在制备治疗胃炎的生物制剂中的应用。本发明公开的干细胞外泌体制剂对胃炎具有良好的疗效。

Description

一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用。
背景技术
外泌体(exosomes)是一种由真核细胞的多泡内涵体(multivesicular bodies，MVBs)与细胞膜融合后释放到细胞外环境中的纳米量级的膜性小囊泡，可由多种类型细胞分泌，其内含有不同种类的蛋白质、脂质、mRNAs、microRNAs、信号分子等具有生物学活性的物质，较易与邻近细胞的细胞膜发生融合，将生物学活性物质选择性地递送至受体细胞，在不同细胞间进行信息传递，调节细胞间的信号传导，发挥多种生物学功能。
胃炎是多种不同病因引起的胃黏膜急性和慢性炎症，常伴有上皮损伤、黏膜炎症反应和上皮再生。慢性胃炎缺乏特异性症状，症状的轻重与胃黏膜的病变程度并非一致。大多数病人常无症状或有程度不同的消化不良症状如上腹隐痛、食欲减退、餐后饱胀、反酸等。慢性萎缩性胃炎患者可有贫血、消瘦、舌炎、腹泻等，个别病人伴黏膜糜烂者上腹痛较明显，并可有出血，如呕血、黑便。症状常常反复发作，无规律性腹痛，疼痛经常出现于进食过程中或餐后，多数位于上腹部、脐周，部分患者部位不固定，轻者间歇性隐痛或钝痛、严重者为剧烈绞痛。活检标本作病理学检查，可判断慢性浅表性胃炎、慢性萎缩性胃炎、肠上皮化生和异型增生，还可进行病理活检组织的快速尿素酶试验来进行辅助诊断。
对胃炎常用药物或手术治疗，治疗效果一般，对病人产生的创伤较大。且目前的治疗方法，只能对胃炎起到缓解作用，并不能从根本上根治疾病。因此，研发一种可用于治疗胃炎的外泌体制剂是本领域技术人员需要解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明公开了一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用。
本发明公开了一种外泌体制剂，包括：牙髓干细胞外泌体、牙髓干细胞、碱性成纤维细胞生长因子和溶剂；
所述牙髓干细胞外泌体为从牙髓干细胞提取的外泌体；
所述牙髓干细胞外泌体的含量为1×106～1×107个细胞所提取的外泌体的量；
每200μL所述制剂中含有从1×106～1×107个所述牙髓干细胞提取的外泌体；
所述牙髓干细胞含量为2×106个/200μL；
所述bFGF含量为10ng/mL；
所述溶剂为生理盐水。
本发明还公开了上述外泌体制剂的制备方法，包括以下步骤：
a)往溶剂中添加bFGF，制成bFGF含量为10ng/mL的生理盐水溶液；
b)然后往步骤a)制备的溶液中添加所述牙髓干细胞外泌体及牙髓干细胞，使每200μL所述制剂中含有1×106～1×107个牙髓干细胞所提取的外泌体和2×106个牙髓干细胞，制得所述外泌体制剂。
作为优选，本发明公开了所述牙髓干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：
a)牙髓干细胞的原代培养：取健康人的智齿，清洗后剪碎牙齿，取出牙髓；将牙髓剪碎后进行消化，离心，弃上清后用培养基重悬后进行接种培养；5天后弃上清，补充新的培养基继续培养，待细胞形成较大的克隆，即可传代；
b)牙髓干细胞的传代培养：取步骤a)得到的原代细胞，弃掉培养液，加入PBS缓冲液冲洗细胞生长面；弃去PBS缓冲液，用胰酶对细胞进行消化，并离心；弃上清，用培养基重悬细胞，对细胞进行传代培养；
c)外泌体的分离：收集步骤b)传代培养的第2～5代牙髓干细胞培养上清，离心去除细胞碎片；取上清以2:1的比例加入外泌体分离试剂，混匀后4℃孵育过夜后离心，弃上清，用4℃预冷的PBS缓冲液重悬制得所述牙髓干细胞外泌体，置-20℃保存。
作为优选，所述培养基为含10％FBS的DMEM培养基。
作为优选，步骤a)所述消化为用I型胶原酶和中性蛋白酶分别消化30min。
作为优选，步骤a)所述离心为1500rpm离心10min。
作为优选，步骤c)所述的分离试剂购于invitrogen公司。
本发明还公开了所述干细胞外泌体制剂或所述的制备方法制得的干细胞外泌体制剂在制备治疗胃炎的生物制剂中的应用。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的体外作用十分强烈，对成纤维细胞、骨细胞、软骨细胞、血管内皮细胞、肾上腺皮质和髓质细胞、神经元和神经胶质细胞等具有很强的促细胞分裂增殖活性。体外细胞培养中能在低浓度(1mg·ml-1)发挥其作用，在体内是重要的促有丝分裂因子，也是形态发生和分化的诱导因子。其主要生物学作用有：(1)作为血管生长因子；(2)促进创伤愈合与组织修复；(3)促进组织再生；(4)参与神经再生等。
本发明首次使用牙髓干细胞、牙髓干细胞外泌体、碱性成纤维细胞生长因子，在特定的的配比下产生意想不到的效果，可以有效治疗胃炎疾病，而且治疗效果十分理想。
在治疗时，将所述牙髓干细胞外泌体直接注射至胃壁，由于胃壁中的血流量低，制剂在胃壁中可直接作用，可避免血液流动而造成外泌体的损失。
具体注射方法为通过胃壁局部注射，在胃壁注射过程中，先将待移植的大鼠用3％戊巴比妥钠麻醉后，用酒精消毒腹部表面皮毛，再用剃毛刀剃掉中上腹部的毛，碘伏擦拭后，切开长约1-2cm的腹部开口，注意此开口不易太大，以免大鼠撕咬影响伤口愈合；向下依次剪开腹肌各层，暴露腹腔后，于左肝叶下找到胃，轻轻将胃提至体表，自胃食管连接部至幽门(腺胃部分)的前后壁各分5点注射，注射完毕后，将胃轻轻还入腹腔中原有位置，注意观察无扭转后，逐层缝合腹部开口。
外泌体可直接修复损失组织，增强未损伤组织的抵抗能力，大大地缩短组织修复的时间。
外泌体不具有免疫原性，可适用任何个体。
异基因细胞在输注后在体内的增殖、分化、寿命以及以此带来的免疫调节功能的变化的认识尚不很明确，临床应用所产生的问题陷入瓶颈期。外泌体的应用较异基因细胞的直接应用更为安全，可以开启非细胞治疗的方法。
外泌体在提取后可长期保存，在应用时制剂制备更为方便，避免了细胞治疗方案需要重新培养细胞等操作。
所述牙髓干细胞可在制备所述牙髓干细胞外泌体的过程中同时制备，无需另外制备，制备过程方便。优选使用P2～P5代的牙髓干细胞作为外泌体制剂的组分。
试验结果显示，本发明公开的干细胞外泌体制剂具有明显的治疗胃炎的功效。
相比于现有技术，本发明具有以下优点：
1、本发明公开的干细胞外泌体制剂对胃炎有良好的疗效；
2、相比于异基因细胞的输注，外泌体制剂的使用更为安全；
3、外泌体在提取后可长期保存，制剂制备更为方便，利于推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为牙髓干细胞外泌体透射电镜图；
图2为牙髓干细胞原代细胞显微镜图；
图3为牙髓干细胞流式鉴定结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种干细胞外泌体制剂及其制备方法和应用，所述干细胞外泌体制剂对胃炎有良好的疗效。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明实施例中所使用到的组分或制剂均为市售或自制来源。
本实施例所用组分及试剂均为自制或市售来源。
外泌体分离试剂购自Invitrogen公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
一、制备牙髓干细胞外泌体
实施例1制备牙髓干细胞外泌体
牙髓干细胞的原代培养：取健康人的智齿，于超净台中进行无菌清洗，清洗后用钳子剪碎牙齿，取出牙髓；用手术剪将牙髓进行剪碎，用I型胶原酶和中性蛋白酶分别消化30min，1500rpm离心10min，弃上清后用DMEM+10％FBS完全培养基重悬后接种至6孔板中，转移至5％CO2、37℃的环境中培养；培养5天后弃上清，补充新的完全培养基继续培养，待细胞形成较大的克隆，即可传代；原代细胞的显微镜图见图2；
牙髓干细胞的传代培养：取可传代的P0代细胞，弃掉皿内原培养液，加入10mL PBS缓冲液轻轻冲洗细胞生长面；弃去PBS洗液，加入2mL 0.25％胰蛋白酶，左右摇晃平皿使胰酶均匀覆盖于皿底，显微镜下观察可见细胞间隙增大，胞质回缩；当长梭形细胞变圆变亮时，立即加入10倍体积的完全培养基终止消化；反复吹打，直至细胞全部脱落成单细胞悬液，将悬液转移至离心管中，室温离心1500rpm/5min；弃上清，加入DMEM+10％FBS完全培养基重悬细胞，按密度为1×105个细胞数进行传代培养，将培养瓶置于37℃、5％CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养。待细胞生长至融合时，重复上述传代步骤对细胞进行扩增培养。流式检测牙髓间充质干细胞8种抗原：CD73、CD90、CD105、HLA-DR、CD45、CD19、CD34和CD11b，流式检测结果见图3。
根据2006年ISCT颁布的《间充质干细胞鉴定的最低标准》，CD73、CD90、CD105三种表面抗原的表达不低于95.0％；CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR的表达不高于2.0％。
对照组是牙髓间充质干细胞8种抗原相应的同型对照，对照组的流式结果见图3(1)。样品组是8种抗原的表达情况，样品组的流式结果如图3(2)所示，样品组的CD73、CD90、CD105表达高于95.0％；样品组的HLA-DR、CD45、CD19、CD34、CD11b表达低于2.0％，符合干细胞的表面抗原特征，说明了牙髓干细胞并没有出现分化的现象，仍维持着干细胞的特点。
外泌体的分离：收集P2～P5代牙髓干细胞培养上清，将培养上清转至高速离心管中，4℃、2000g离心30min，去除细胞碎片；取上清转移至新的高速离心管中，以细胞上清液：试剂＝2:1的比例加入试剂，用涡旋器充分混匀后，置于冰箱中4℃过夜孵育。在4℃环境中1000g离心60min，弃去上清，用100μL4℃的PBS溶液缓冲液重悬即为外泌体悬液，置于-20℃保存。
外泌体的鉴定：取分离纯化外泌体10uL，按体积比＝1:1加入4℃的PBS溶液稀释后滴加于2mm的载样铜网上，于室温静置1min后用滤纸将多余液体轻轻吸去，用3％(w/v)磷钨酸钠溶液(PH6.8)室温负染5分钟，用双蒸水轻轻洗一遍后室温晾干，于透射电镜观察并照相、测量其直径，透射电镜结果见图1。结果显示，在透射电镜下观察：外泌体大小在130nm之下，30nm至120nm不等，呈形态基本一致的圆形或者椭圆形膜性囊炮样。染色后可见囊泡有完整的包膜，内部含有低电子致密物。上述特征均符合外泌体的特征。
二、制备外泌体制剂
实施例2制备外泌体制剂
往生理盐水中添加bFGF，制成bFGF含量为10ng/mL的生理盐水溶液；然后往溶液中添加实施例1制备的牙髓干细胞外泌体及牙髓干细胞，使每200μL生理盐水溶液中含2×106个牙髓干细胞和从5×106个牙髓干细胞所提取的外泌体，制得所述外泌体制剂，置于4℃保存。
实施例3制备外泌体制剂
往生理盐水中添加bFGF，制成bFGF含量为5ng/mL的生理盐水溶液；然后往溶液中添加实施例1制备的牙髓干细胞外泌体及牙髓干细胞，使每200μL生理盐水溶液中含1×106个牙髓干细胞和从1×106个牙髓干细胞所提取的外泌体，制得所述外泌体制剂，置于4℃保存。
实施例4制备外泌体制剂
往生理盐水中添加bFGF，制成bFGF含量为15ng/mL的生理盐水溶液；然后往溶液中添加实施例1制备的牙髓干细胞外泌体及牙髓干细胞，使每200μL生理盐水溶液中含3×106个牙髓干细胞和从1×107个牙髓干细胞所提取的外泌体，制得所述外泌体制剂，置于4℃保存。
实施例5验证试验
采用热盐水灌胃法，建立大鼠萎缩性胃炎动物模型。对大鼠采用热水(55℃蒸馏水，2.5ml/天)灌胃法，造模24周后光镜结果显示：大鼠胃黏膜出现萎缩，电镜下胃黏膜细胞萎缩；32周后光镜下大量上皮细胞脱落，细胞破损，局灶性糜烂，电镜下腺体和腺体细胞萎缩，胞质内细胞器减少。慢性胃炎造模成功。
1.干细胞制剂对胃炎治疗实验
试验分组如下：
组别 注射制剂
对照组 生理盐水+10ng/mLbFGF(200μL)
实施例2 2×106牙髓干细胞+5×106牙髓干细胞分泌的外泌体+10ng/mLbFGF(200μL)
实施例3 2×106牙髓干细胞+1×106牙髓干细胞分泌的外泌体+10ng/mLbFGF(200μL)
实施例4 2×106牙髓干细胞+1×107牙髓干细胞分泌的外泌体+10ng/mLbFGF(200μL)
选取造模成功、体重相近、雌雄各半的大鼠32只，均分为4组，每组8只。空白对照组于胃壁内注射200uL的生理盐水+10ng/mLbFGF；实施例2～4注射200uL制剂。
注射方式：
通过胃壁局部注射，在胃壁注射过程中，先将待移植的大鼠用3％戊巴比妥钠麻醉后，用酒精消毒腹部表面皮毛，再用剃毛刀剃掉中上腹部的毛，碘伏擦拭后，切开长约1-2cm的腹部开口，注意此开口不易太大，以免大鼠撕咬影响伤口愈合；向下依次剪开腹肌各层，暴露腹腔后，于左肝叶下找到胃，轻轻将胃提至体表，自胃食管连接部至幽门(腺胃部分)的前后壁各分5点注射，注射完毕后，将胃轻轻还入腹腔中原有位置，注意观察无扭转后，逐层缝合腹部开口。
移植后2周分别处死各组大鼠。一方面对大鼠进行称重，另一方面将胃组织取材后放于4％多聚甲醛固定48小时后行冰冻切片，观察胃组织萎缩程度等异常表现，结果如下：
观察指标 对照组 实施例2 实施例3 实施例4
例数 8 8 8 8
体重增加(g) 5.46±2.97 13.53±5.69* 8.02±9.56* 17.78±6.42*
胃窦萎缩评分 1.58±0.73 0.71±0.46* 1.06±0.89* 0.45±0.17*
胃窦厚度(um) 296.17±25.44 389.37±31.79* 324.88±21.07 406.51±48.56*
*表示与对照组相比，P<0.05，具有显著性差异。
从表中可知，实施例2、3、4的体重增加分别为13.53±5.69g、8.02±9.56g、17.78±6.42g；胃窦萎缩评分分别为0.71±0.46、1.06±0.89、0.45±0.17，与对照组相比，均具有显著性差异(P<0.05)。
实施例3的胃窦厚度为324.88±21.07um，与对照组相比没有显著性差异；实施例2和实施例4的胃窦厚度分别为389.37±31.79um、406.51±48.56um，与对照组相比，均具有显著性差异(P<0.05)。
从上述数据可知，实施例2～4的治疗效果均优于对照组，本发明的最优方案为每200μL含5×106-1×107个牙髓干细胞提取出来的外泌体和2×106个牙髓干细胞，bFGF含量为10ng/ml。
2.对比试验
试验分组如下：
组别 组成
对照组1 生理盐水+10ng/mLbFGF
对照组2 2×106骨髓干细胞+10ng/mLbFGF
对照组3 2×106牙髓干细胞+10ng/mLbFGF
实施例2 2×106牙髓干细胞+5×106牙髓干细胞分泌的外泌体+10ng/mLbFGF
选取造模成功、体重相近、雌雄各半的大鼠32只，均分为4组，每组8只。空白对照组于胃壁内注射200uL的生理盐水+10ng/mLbFGF；实施例2～4注射200uL的制剂。
移植后2周分别处死各组大鼠，将胃组织取材后放于4％多聚甲醛固定48小时后行冰冻切片，观察胃组织萎缩程度等异常表现，结果如下：
观察指标 对照组1 对照组2 对照组3 实施例2
例数 8 8 8 8
胃窦萎缩评分 1.69±0.55 0.97±0.59* 0.86±0.73* 0.65±0.20#
胃窦厚度(um) 308.26±34.21 353.83±29.67* 337.88±24.05* 386.45±56.48#
*表示与对照组相比，P<0.05，具有显著性差异。
#表示与对照组相比，P<0.01，具有极显著性差异。
从表中可知，对照组2、3的胃窦萎缩评分分别为0.97±0.59、0.86±0.73，两者与对照组1相比，均具有显著性差异(P<0.05)；实施例2的胃窦萎缩评分为0.65±0.20，对照组相比，具有极显著性差异(P<0.01)。说明实施例2制备的外泌体制剂对胃窦萎缩具有良好的疗效。
对照组2、3的胃窦厚度分别为353.83±29.67um、337.88±24.05um，与对照组相比具有显著性差异(P<0.05)；实施例1胃窦厚度分别为386.45±56.48um，与对照组相比，具有极显著性差异(P<0.01)。说明实施例2制备的外泌体制剂能增加胃窦厚度。
用实施例2或3制备的外泌体制剂重复上述对比试验，得到同样的结论。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种干细胞外泌体制剂，其特征在于，包括：牙髓干细胞外泌体、牙髓干细胞、碱性成纤维细胞生长因子和溶剂；
所述牙髓干细胞外泌体为从所述牙髓干细胞提取的外泌体；
每200μL所述制剂中含有从1×106～1×107个所述牙髓干细胞提取的外泌体；
所述牙髓干细胞含量为1×106～3×106个/200μL；
所述碱性成纤维细胞生长因子的含量为5～15ng/mL；
所述溶剂为生理盐水。
2.权利要求1所述外泌体制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)往溶剂中添加碱性成纤维细胞生长因子，制成所述碱性成纤维细胞生长因子含量为10ng/mL的生理盐水溶液；
b)然后往步骤a)制得的溶液中添加所述牙髓干细胞外泌体及所述牙髓干细胞，使每200μL所述制剂中含有1×106～1×107个牙髓干细胞所提取的外泌体和2×106个牙髓干细胞，制得所述外泌体制剂。
3.权利要求1所述牙髓干细胞外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)牙髓干细胞的原代培养：取健康人的智齿，清洗后剪碎牙齿，取出牙髓；将牙髓剪碎后进行消化，离心，弃上清后用培养基重悬后进行接种培养；5天后弃上清，补充新的培养基继续培养，待细胞形成较大的克隆，即可传代；
b)牙髓干细胞的传代培养：取步骤a)得到的原代细胞，弃掉培养液，加入PBS缓冲液冲洗细胞生长面；弃去PBS缓冲液，用胰酶对细胞进行消化，并离心；弃上清，用培养基重悬细胞，对细胞进行传代培养；
c)外泌体的分离：收集步骤b)传代培养的第2～5代牙髓干细胞培养上清，离心去除细胞碎片；取上清以2:1的比例加入外泌体分离试剂，混匀后4℃孵育过夜后离心，弃上清，用4℃预冷的PBS缓冲液重悬制得所述牙髓干细胞外泌体，置-20℃保存。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养基为含10％FBS的DMEM培养基。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述消化为用I型胶原酶和中性蛋白酶分别消化30min。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤a)所述离心为1500rpm离心10min。
7.权利要求1所述的外泌体制剂或权利要求2所述的制备方法制得的外泌体制剂在制备治疗胃炎的生物制剂中的应用。
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