CN101626772A - 间充质干细胞及其用途 - Google Patents

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马克·F.·皮滕格
蒂莫西·瓦尼
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Abstract

通过给药有效量的间充质干细胞至动物而治疗该动物中自身免疫性疾病、变态反应、癌症或炎性疾病、促进伤口愈合、修复上皮损伤和促进动物的器官或组织中血管发生的方法。

Description

间充质干细胞及其用途
相关申请
本专利申请参考2007年3月22日提交的美国专利申请系列号11/726,676、要求对它的优先权和要求来自它的权益。
联邦政府资助性开发研究
本发明以美国海军部(Department of the Navy)所资助在合同号N66001-02-C-8068下的政府支持而进行。美国政府享有本发明中的某些权利。
发明背景
本发明涉及间充质干细胞。更具体地，本发明涉及间充质干细胞的新用途，包括促进多种组织和器官中血管发生、治疗自身免疫性疾病、治疗变态反应、治疗癌症、治疗炎性疾病和病症、促进伤口愈合、治疗炎症和修复上皮损伤。
间充质干细胞(MSC)是能够轻易地分化成株系的多能干细胞，其中所述的株系包括成骨细胞、肌细胞、软骨细胞和脂肪细胞(Pittenger等，科学(Science)，第284卷，第143页(1999)；Haynesworth等，骨(Bone)，第13卷，第69页(1992)；Prockop，Science，第276卷，第71页(1997))。体外研究已经证实MSC分化成肌肉(Wakitani等，肌肉神经(Muscle Nerve)，第18卷，第1417页(1995))、神经元样前体(Woodbury等，神经科学研究(J.Neurosci.Res.)，第69卷，第908页(2002)；Sanchez-Ramos等，实验神经病学(Exp.Neurol.)，第171卷，第109页(2001))、心肌细胞(Toma等，循环(Circulation)，第105卷，第93页(2002)；Fakuda，人工器官(Artif.Organs)，第25卷，第187页(2001))以及其它可能细胞类型的能力。此外，已经证实MSC为扩增(expansion)造血肝细胞和胚胎肝细胞提供有效的饲养层(Eaves等，纽约科学院年报(Ann.N.Y. Acad.Sci.)，第938卷，第63页(2001)；Wagers等，基因治疗(Gene Therapy)，第9卷，第606页(2002))。近来用多种动物模型的研究已经证实MSC可以用于修复或再生受损的骨、软骨、半月板或心肌组织(DeKok等，临床口腔种植学研究(Clin.Oral Implants Res.)，第14卷，第481页(2003))；Wu等，移植(Transplantation)，第75卷，第679页(2003)；Noel等，药物研究最新观点(Curr.Opin.Investiq.Drugs)，第3卷，第1000页(2002)；Ballas等，细胞生物学副刊(J.Cell.Biochem.Suppl.)，第38卷，第20页(2002)；Mackenzie等，血细胞分子研究(Blodd Cells Mol.Dis.)，第27卷(2002))。几位研究员已经将MSC在动物疾病模型中用于移植，获得令人鼓舞的结果，其中所述的动物疾病模型包括成骨不全(Pereira等，国家科学院进展(Proc.Nat.Acad.Sci.)，第95卷，第1142页(1998))、帕金森综合征(Schwartz等，人类基因治疗(Hum.Gene Ther.)，第10卷，第2539页(1999))、脊髓损伤(Chopp等，神经系统报道(Neuroreport)，第11卷，第3001页(2000)；Wu等，神经科学研究杂志(J.Neurosci.Res.)，第72卷，第393页(2003))和心脏病(Tomita等，Circulation，第100卷，第247页(1999).Shake等，胸外科治疗年报(Ann.Thorac.Surq.)，第73卷，第1919页(2002))。重要地是，有希望的结果已经在临床试验中对成骨不全(Horwitz等，血液(Blood)，第97卷，第1227页(2001)；Horowitz等Proc.Nat.Acad.Sci.，第99卷，第8932页(2002))和异源骨髓移植物的增强性移入(Frassoni等，Int.细胞治疗组织(Society for Cell Therapy)，SA006(摘要)(2002)；Koc等，临床肿瘤杂志(J.Clin.Oncol.)，第18卷，第307页(2000))得到了报道。
MSC在其表面上表达主要组织相容性复合物(MHC)I类抗原，但不表达MHC II类(Le Blanc等，血液学实验(Exp.Hematol.)，第31卷，第890页(2003)；Potian等，免疫学杂志(J.Immunol.)，第171卷，第3426页(2003))并且没有B7或CD40共刺激性分子(Majumdar等，生物药科学(J.Biomed.Sci.)，第10卷，第228页(2003))，表明这些细胞具有低免疫原性表型(Tse等，Transplantation，第75卷，第389页(2003))。MSC还以MHC非依赖方式抑制T细胞(1-cell)增殖反应(Bartholomew等，Exp.Hematol.，第30卷，第42页(2002)；Devine等，癌症杂志(Cancer J.)，第7卷，第576页(2001)；DiNicola等，Blood，第99卷，第3838页(2002))。MSC的这些免疫学特性可以增强其移植物移入(engraftment)并限制受者免疫系统在移植后识别并排斥同种异体细胞的能力。MSC产生调节免疫应答并支持血细胞生成的因子，连同MSC在局部刺激下分化成适宜细胞类型的能力，使MSC成为用于细胞移植研究的受欢迎的干细胞(Majumdar等，血液疗法干细胞研究(Hematother.Stem Cell Res.)，第9卷，第841页(2000)；Haynesworth等，细胞生理学杂志(J.Cell.Physiol.)，第166卷，第585页(1996)。
发明内容
申请人现在已经检验了间充质干细胞与分离的免疫细胞群体(包括树突细胞(DC1和DC2)、效应T细胞(Th1和Th2)及NK细胞)的相互作用。基于这类相互作用，申请人发现间充质干细胞可以调节可能调节免疫应答过程中若干步骤的多种因子的产生。因此，间充质干细胞可以用于治疗涉及免疫系统的疾病、状况和病症或涉及炎症、上皮损伤或变态反应的疾病、状况或病症。此类疾病、状况和病症包括，但不限于自身免疫性疾病、变态反应、关节炎、发炎伤口、斑秃(秃顶)、牙周疾病(包括龈炎和牙周炎)和涉及免疫应答的其它疾病、状况或病症。
另外，据信间充质干细胞表达并分泌血管内皮生长因子或VEGF，其通过刺激新血管形成而促进血管发生的。间充质干细胞还刺激外周血单核细胞(PBMC)产生VEGF。
此外，据信间充质干细胞刺激树突细胞(DC)产生干扰素-β(IFN-β)，其促进肿瘤抑制和抗病毒感染免疫。
发明详述
根据本发明的一个方面，提供治疗动物内选自由自身免疫性疾病和移植物抗宿主病所组成的组中疾病的方法。该方法包括以有效治疗动物中该疾病的量给药间充质干细胞至该动物。
虽然本发明的这个方面的范围不限于任何理论性推理，然而据信间充质干细胞籍此抑制自身免疫性疾病和移植物抗宿主病的至少一种机理是因引起白细胞介素-10(IL-10)从调节性T细胞(TReg细胞)和/或树突细胞(DC)中释放。
根据本发明可以治疗的自身免疫性疾病包括，但不限于多发性硬化、I型糖尿病、类风湿性关节炎、色素膜炎、自身免疫性甲状腺病、炎症性肠病、硬皮病、格雷夫斯病、狼疮、克罗恩病(Crohn′s disease)、自身免疫性淋巴增生病(ALPS)、脱髓鞘病、自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性胃炎(AIG)和自身免疫性肾小球病。另外，如上文中提及，移植物抗宿主病可以得到治疗。然而将理解的是本发明的范围不限于治疗本文中提及的具体疾病。
在一个实施方案中，向其给药间充质干细胞的动物是哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类，包括人和非人灵长类。
通常，间充质干细胞(MSC)疗法基于例如以下顺序：收获含有MSC的组织、分离并扩增MSC并且给药MSC至动物，进行或者不进行生物化学操作或遗传操作。
给药的间充质干细胞可以是纯系的组合物(homogeneous composition)或可以是MSC得到富集的混合细胞群体。纯系的间充质干细胞组合物可以通过培养贴壁性骨髓细胞或骨膜细胞而获得，并且间充质干细胞组合物可以通过用独特的单克隆抗体鉴别的特定细胞表面标记而加以识别。在例如美国专利号5,486,359中描述了用于获得间充质干细胞得到富集的细胞群体的方法。间充质干细胞的替代来源包括，但不限于血液、皮肤、脐带血、肌肉、脂肪、骨和软骨膜。
间充质干细胞可以通过多种方法给药。间充质干细胞可以全身性地给药，如通过静脉内、动脉内或腹膜内给药。
间充质干细胞可以来自一系列(spectrum)来源，包括自体性来源、同种异体性来源或异种来源。
间充质干细胞在动物中以有效治疗自身免疫性疾病或移植物抗宿主病的量给药。间充质干细胞可以以约1×105个细胞/kg至约1×107个细胞/kg的量给药。在另一个实施方案中，间充质干细胞以约1×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg的量给药。待给药间充质干细胞的量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别、待治疗的自身免疫性疾病以及其范围和严重性。
间充质干细胞可以与可接受的药用载体一起给药。例如，间充质干细胞可以作为用于注射或局部应用的可药用液体介质或凝胶中的细胞混悬液给药。
根据本发明的另一个方面，提供治疗动物中炎症反应的方法。该方法包括以有效治疗动物中炎症反应的量给药间充质干细胞至该动物。
虽然本发明的这个方面的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞促进T细胞成熟为调节性T细胞(TReg)，因而调控炎症反应。还据信间充质干细胞抑制辅助T细胞1(Th1细胞)，因而减少干扰素-γ(IFN-γ)在某些炎症反应(例如与银屑病有关的那些炎症反应)中的表达。
在一个实施方案中，可以治疗的炎症反应是与银屑病有关的那些炎症反应。
在另一个实施方案中，间充质干细胞可以给药至动物，以至于间充质干细胞接触脑内的小胶质细胞和/或星形胶质细胞以减少炎症，因而间充质干细胞限制了疾病或病症如阿尔茨海默病、帕金森病、中风或脑细胞损伤中由活化的神经胶质细胞造成的神经变性。
在又一个实施方案中，间充质干细胞可以给药至动物，以至于间充质干细胞接触了皮肤表皮内的角质化细胞和朗罕氏细胞以减少如可在银屑病、慢性皮炎和接触性皮炎中存在的炎症。虽然该实施方案将不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞可以接触表皮内的角质化细胞和朗罕氏细胞，并且改变T细胞受体的表达和细胞因子分泌谱，导致肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达减少和调节性T细胞(Treg细胞)群体增加。
在另一个实施方案中，间充质干细胞可以用来减少骨中的炎症，如出现在关节炎和关节炎样病症(包括但不限于骨关节炎和类风湿性关节炎和列于网站www.arthritis.org/conditions/diseases中的其它关节炎性疾病)中的炎症。虽然该实施方案的范围不意图限于任何理论性推理，据信间充质干细胞可以抑制滑膜液中记忆性T细胞分泌白细胞介素-17。
在另一个实施方案中，间充质干细胞可以用来分别限制炎症性肠病和慢性肝炎期间肠道和肝脏中的炎症。虽然本发明的这个方面的范围不意图限于任何理论性推理，据信间充质干细胞促进增加的白细胞介素-10(IL-10)分泌和调节性T细胞(Treg细胞)的生成。
在另一个实施方案中，间充质干细胞可以用来抑制病理学状况如脓毒症和创伤(包括烧伤、手术和移植)中的嗜中性粒细胞及巨噬细胞过度活化。虽然该实施方案的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞促进抑制性细胞因子如IL-10的分泌，并抑制巨噬细胞迁移抑制因子。
在另一个实施方案中，间充质干细胞可以用来控制免疫赦免部分如包括角膜、晶状体、色素上皮和视网膜的眼、脑、脊髓、妊娠子宫和胎盘、卵巢、睾丸、肾上腺皮质、肝脏和毛囊中的炎症。虽然该实施方案的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞促进抑制性细胞因子如IL-10的分泌和Treg细胞的生成。
在又一个实施方案中，间充质干细胞可以用来治疗与透析和/或肾小球肾炎期间的末期肾病(ESRD)感染相关的组织损害。虽然该实施方案的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞可以促进肾修复。间充质干细胞还表达并分泌刺激新血管形成的血管内皮生长因子或VEGF，这应当辅助修复损伤的肾脏组织。
在另一个实施方案中，间充质干细胞可以用来控制病毒感染如流感病毒、丙型肝炎病毒、单纯疱症病毒、痘苗病毒感染和伯斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus)。虽然该实施方案的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞促进干扰素-β(IFN-β)分泌。
在又一个实施方案中，间充质干细胞可以用来控制寄生虫感染如利什曼原虫(Leishmania)感染和螺杆菌(Helicobacter)感染。虽然该实施方案的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞介导由T辅助2(Th2)细胞所致的应答并且因而促进B细胞增加产生免疫球蛋白E(IgE)。
在另一个实施方案中，间充质干细胞可以给药至动物以治疗因肺病或病症产生的炎症。此类肺病或病症包括，但不限于急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、哮喘和肺动脉高血压症。
虽然该实施方案的范围不限于任何理论性推理，然而据信在上述的肺病或病症中的炎症反应包括分泌TNF-α和/或MCP-1。据信间充质干细胞因作为间充质干细胞的化学引诱物的TNF-α和/或MCP-1产生增加而移行至发炎的肺组织。
然而将可以理解的是本发明的这个方面的范围不限于治疗任何具体炎症反应。
如上文中所述，间充质干细胞可以给药至哺乳动物，包括人和非人灵长类。
如上文中所述，间充质干细胞也可以全身性地给药。可选地，在骨关节炎或类风湿性关节炎的情况下，间充质干细胞可以直接给药至有关节炎的关节。
间充质干细胞以有效治疗动物中炎症反应的量给药。间充质干细胞可以以约1×105个细胞/kg至约1×107个细胞/kg的量给药。在另一个实施方案中，间充质干细胞以约1×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg的量给药。待给药间充质干细胞的确切剂量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别、正在治疗的炎症反应以及其范围和严重性。
如上文中所述，间充质干细胞可以与可接受的药用载体一起给药。
根据本发明的另一个方面，提供治疗动物中炎症和/或修复上皮损伤的方法。该方法包括以有效治疗动物中炎症和/或上皮损伤的量给药间充质干细胞至该动物。
虽然本发明的这个方面的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞导致T细胞分泌促炎性细胞因子TNF-α及干扰素-γ的减少和T细胞分泌抗炎性细胞因子白细胞介素-10(IL-10)及白细胞介素-4(IL-4)的增加。还据信间充质干细胞导致天然杀伤(NK)细胞分泌干扰素-γ的减少。
可以根据本发明的这个方面而治疗的炎症和/或上皮损伤包括，但不限于由多种疾病和病症引起的炎症和/或上皮损伤，其中所述的疾病和病症包括，但不限于自身免疫性疾病、移植器官的排异反应、烧伤、切割伤、撕裂伤和溃疡(包括皮肤溃疡和糖尿病性溃疡)。
在一个实施方案中，间充质干细胞给药至动物以便修复因自身免疫性疾病所致的上皮损伤，所述的自身免疫性疾病包括，但不限于类风湿性关节炎、局限性回肠炎、I型糖尿病、多发性硬化、硬皮病、格雷夫斯病、狼疮、炎症性肠病、自身免疫性胃炎(AIG)和自身免疫性肾小球病。间充质干细胞也可以修复因移植物抗宿主病(GVHD)所致的上皮损伤。
本发明的这个方面尤其可应用于修复因移植物抗宿主病所致的上皮损伤，并且更具体地可应用于修复因严重移植物抗宿主病所致的上皮损伤，所述的严重移植物抗宿主病包括影响皮肤和/或胃肠道系统的III和IV级移植物抗宿主病。申请人尤其发现当间充质干细胞给药至患有严重移植物抗宿主病并且尤其患有III和IV级胃肠道性移植物抗宿主病的患者时，间充质干细胞的给药导致修复该患者中的皮肤和/或溃疡肠上皮组织。
在另一个实施方案中，间充质干细胞给药至动物以便修复由已移植器官或组织(包括但不限于肾脏、心脏和肺脏)的排异反应造成的对所述移植器官或组织的上皮损伤。
在又一个实施方案中，间充质干细胞给药至动物以修复由烧伤、切割伤、撕裂伤和溃疡(包括，但不限于皮肤溃疡和糖尿病性溃疡)造成的上皮损伤。
如上文中所述，间充质干细胞可以给药至哺乳动物，包括人和非人灵长类。
如上文中所述，间充质干细胞也可以全身性地给药。
间充质干细胞以有效修复动物中上皮损伤的量给药。间充质干细胞可以以约1×105个细胞/kg至约1×107个细胞/kg的量给药。在另一个实施方案中，间充质干细胞以约1×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg的量给药。待给药间充质干细胞的确切剂量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别、正在修复的上皮损伤的类型以及其范围和严重性。
根据本发明的又一个方面，提供治疗动物中癌症的方法。该方法包括有效治疗动物中癌症的量给药间充质干细胞至该动物。
虽然本发明的这个方面的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞与树突细胞相互作用，这导致IFN-β分泌，这又作为肿瘤抑制物发挥作用。可以治疗的癌症包括但不限于，肝细胞癌、子宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌、纤维肉瘤、髓母细胞瘤和星形细胞瘤。然而将理解的是本发明的范围不限于任何具体类型的癌症。
如上文中所述，动物可以是哺乳动物，包括人和非人灵长类。
间充质干细胞以有效治疗动物中癌症的量给药至该动物。通常，间充质干细胞以约1×105个细胞/kg至约1×107个细胞/kg的量给药。在另一个实施方案中，间充质干细胞以约1×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg的量给药。待给药间充质干细胞的确切量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别、正在治疗的癌症的类型以及其范围和严重性。
如上文中所述，间充质干细胞与可接受的药用载体一起给药并且可以全身性地给药。备选地，间充质干细胞可以直接给药至正在治疗的癌症。
仍根据本发明的又一个方面，提供治疗动物中变应性疾病或病症的方法。该方法包括以有效治疗动物中变应性疾病或病症的量给药间充质干细胞至该动物。
虽然本发明的这个方面的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞在急性变态反应后给药时，提供对肥大细胞活化和脱颗粒的抑制。另外，据信间充质干细胞下调嗜碱性粒细胞活化并且抑制细胞因子如TNF-α、趋化因子如白细胞介素-8和单细胞趋化蛋白或MCP-1、脂质介质如白细胞三烯，并且抑制主要介质如组胺、肝素、硫酸软骨素和组织蛋白酶。
可以治疗的变应性疾病或病症包括，但不限于哮喘、过敏性鼻炎、异位性皮炎和接触性皮炎。然而将理解的是本发明的范围不限于任何具体的变应性疾病或病症。
间充质干细胞以有效治疗动物中变应性疾病或病症的量给药至该动物。动物可以是哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类，包括人和非人灵长类。通常，间充质干细胞以约1×105个细胞/kg至约1×107个细胞/kg的量给药。在另一个实施方案中，间充质干细胞以约1×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg的量给药。确切剂量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别、正在治疗的变应性疾病或病症以及其范围和严重性。
如上文中所述，间充质干细胞可以与可接受的药用载体一起给药。间充质干细胞可以全身性地给药，例如通过静脉内或动脉内给药。
根据本发明的又一个方面，提供促进动物中伤口愈合的方法。该方法包括以有效动物中促进伤口愈合的量给药间充质干细胞至该动物。
虽然本发明的范围将不限于任何理论性推理；据信如本文中提及，间充质干细胞引起Treg细胞和树突细胞释放白细胞介素-10(IL-10)。IL-10限制或控制伤口内的炎症，因而促进伤口愈合。
此外，间充质干细胞可以因诱导其它细胞类型的分泌因子而促进伤口愈合和骨折愈合。例如，间充质干细胞可以诱导由外周血单核细胞(PBMC)所致的前列腺素E2(PGE2)介导性血管内皮生长因子(VEGF)释放，以及PGE2介导性生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3)和内皮缩血管肽-1的释放。
可以愈合的伤口包括，但不限于因切割伤、撕裂伤、烧伤和皮肤溃疡所致的那些伤口。
间充质干细胞以有效促进动物中伤口愈合的量给药至动物。该动物可以是哺乳动物，并且哺乳动物可以是灵长类，包括人和非人灵长类。通常，间充质干细胞以约1×105个细胞/kg至约1×107个细胞/kg的量给药。在另一个实施方案中，间充质干细胞以约1×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg的量给药。待给药间充质干细胞的确切量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别，以及正在治疗的伤口的范围和严重性。
如上文中所述，间充质干细胞可以与接受的药用载体一起给药。如上文中所述，间充质干细胞可以全身性地给药。备选地，间充质干细胞可以直接给药至伤口，如在含有间充质干细胞的敷料或储器上的流体内。
根据本发明的又一个方面，提供治疗或预防动物中纤维化或纤维化病症的方法。该方法包括以有效治疗或预防动物中纤维化或纤维化病症的量给药间充质干细胞至该动物。
间充质干细胞可以给药至动物以便治疗或预防动物中任何类型的纤维化或纤维化病症，包括，但不限于肝硬化、与末期肾病相关的肾脏纤维化和肺纤维化(包括，但不限于急性呼吸窘迫综合征征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、特发性肺纤维化(IPF)、石棉肺和因肺动脉高血压症及哮喘所致的纤维化。将理解的是本发明的范围不限于任何具体类型的纤维化或纤维化病症。
在一个实施方案中，间充质干细胞给药至动物以便改善因造成肺功能不全或肺纤维化的肺病或其它器官中的疾病所致的肺功能。此类疾病具有纤维性组分，并且还可以额外地具有炎性和/或免疫性改变(component)，并且包括但不限于急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、肺动脉高血压症、石棉肺和特发性肺纤维化(IPF)。
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是具有多种病因的致命性肺病，包括但不限于通气道损伤和对胸部的突然钝伤。该疾病的特征是肺实质发炎，造成受损的气体交换和炎性介质的同时表达和分泌。这些炎性介质包括TNF-α、IL-1、IL-8和单核细胞趋化蛋白-1或MCP-1。TNF-α和MCP-1是间充质干细胞的化学引诱物。受损肺中增加的TNF-α和MCP-1表达将促进间充质干细胞募集至肺组织损坏区域。
慢性阻塞性肺病或COPD是世界范围内一个疾病和死亡的主要原因。COPD的特征是因慢性支气管炎或肺气肿所致的气道阻塞。COPD的特征是肺泡壁增厚和炎症，导致肺泡组织的弹性丧失或肺泡组织损伤，以及粘液沉积物阻塞肺支气管。
COPD中的炎症反应包括IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的局部分泌。虽然本发明的范围将不限于任何理论性推理，然而据信间充质干细胞移行至COPD患者中因受损肺内化学引诱物TNF-α和MCP-1的增加产生所致的受损肺组织。
此外，增加的嗜中性粒细胞浸润是COPD的特征，并且嗜中性粒细胞性炎症抵抗现有COPD疗法，如皮质类固醇疗法。虽然本发明的范围将不限于任何理论性推理，据信用间充质干细胞的疗法通过下调起到嗜中性粒细胞的化学引诱物作用的因子而抑制嗜中性粒细胞性炎症。
此外，目前证据表明COPD的炎性改变(inflammatory component)可以扩展至身体内的其它组织(Heaney等，当今医药化学(Current Med.Chem.)第14卷，第7期，第787-796页(2007))。虽然本发明的范围不意图限于任何理论性推理，据信间充质干细胞仍特异性地定居至此类部位，并且参与局部愈合过程。
肺细胞的凋亡性死亡是COPD的另一种结果(Calabrese等，呼吸研究(Respir.Res.)，第6卷，第14页(2005))。间充质干细胞分泌多种生长因子，包括肝细胞生长因子(HFG)和成纤维细胞生长因子(FGF)，已经证明这有益于治疗肺气肿(Shigemura等，Circulation，第111卷，第1407页(2005)；Morino等，胸(Chest)，第128卷，第920页(2005))。
哮喘是慢性或顽固性炎性病症，其中气道发生对多种刺激的增加应答性；其特征在于支气管过度应答性、炎症、粘液产生增加和间断性气道阻塞。
纤维化的证据是明显的，即便在有轻度哮喘的哮喘患者中也是如此(Larsen等，美国呼吸和重症监护医学杂志(Am.J.Respir.Crit.-Care Med.)，第170卷，第1049-1056页(2004))。在严重哮喘患者中，过敏性炎症的反复发作可能导致肺组织的广泛疤痕化和纤维化。
虽然本发明的范围不意图限于任何理论性推理，据信间充质干细胞下调与哮喘相关的炎性反应和免疫反应，并修复与之有关的纤维化组织和疤痕组织。
特发性肺纤维化(IPF)的标志是肺的进行性疤痕化。疤痕化干扰了患者呼吸并获得足够氧气以便重要器官正常发挥功能的能力。受伤的肺上皮细胞随后开始凋亡作用和产生过量TNF-α和MCP-1。间质或环绕气囊的组织随纤维化继续而进行性地变厚和变硬。随着疾病进展，氧气不能有效从气囊进入肺的毛细管。
虽然本发明的范围将限于任何理论性推理，据信TNF-α和MCP-1的表达导致间充质干细胞募集至受损的肺组织。
虽然本发明的范围不意图限于任何理论性推理，据信据信间充质干细胞通过下调促炎细胞因子和趋化因子分泌而抑制炎症反应，导致随后炎性细胞至炎症部位的募集减少，从而在患有肺纤维化的动物中改善肺功能。还据信间充质干细胞在激发免疫应答的那些肺病中抑制免疫应答，因而阻止细胞介导的以及可溶性因子介导的组织细胞杀伤。
间充质干细胞还通过保护组织细胞免于凋亡而促进组织修复，并通过分泌生长因子如肝细胞生长因子(HGF)、VEGF和成纤维细胞生长因子(FGF)而刺激细胞增殖和组织特异性干细胞的动员。此外，间充质干细胞防止肺组织中的病理性重塑和疤痕形成。
更具体地，据信间充质干细胞减少TNF-α的局部分泌，这反过来导致减少肿瘤生长因子β(TGF-β)表达和减少成纤维细胞募集，其中成纤维细胞是对疤痕形成有贡献的主要细胞。此外，间充质干细胞重塑现有肺疤痕组织和/或通过基质金属蛋白酶(MMP)的表达和局部分泌而防止疤痕扩展。MMP的酶活性导致胞外基质蛋白(包括在疤痕组织内含有的那些蛋白质)的降解。
间充质干细胞以有效治疗或预防动物中纤维化或纤维化病症的的量给药至动物。该动物可以是哺乳动物，并且哺乳动物可以是灵长类，包括人和非人灵长类。通常，间充质干细胞以约1×105个细胞/kg至约1×107个细胞/kg的量给药。在另一个实施方案中，间充质干细胞以约1×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg的量给药。待给药间充质干细胞的确切量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别，以及正在治疗或预防的纤维化或纤维化病症的范围和严重性。
如上文中所述，间充质干细胞可以与可接受的药用载体一起给药。还如上文中所述，间充质干细胞可以全身性地给药。
本发明的另一个目标是促进动物的组织或器官中血管发生，其中该组织或器官需要血管发生。
因此，根据本发明的又一个方面，提供促进动物的器官或组织中血管发生的方法。该方法包括以有效促进动物器官或组织中血管发生的量给药间充质干细胞至该动物。
血管发生是从预先存在的微血管床中形成新血管。
血管发生的诱导可以用来治疗冠脉和外周动脉机能不全，并且因此可以是治疗冠状动脉疾病、缺血性心脏病和外周动脉疾病的非侵入及治愈性方法。血管发生可以在治疗除心脏之外的组织和器官中的疾病和病症内，以及在发育和/或维持除心脏之外的器官中发挥作用。血管发生可以在内伤和外伤以及皮肤溃疡的治疗中发挥作用。血管发生还在胚胎植入和胎盘生长以及发胚胎脉管系统育中发挥作用。血管发生也对软骨再吸收与骨形成的偶联是必需的，并且对正确的生长面形态发生重要。
此外，血管发生对成功设计和维护高代谢性器官如肝脏是必需的，在所述的器官中需要稠密的血管网以提供充分的营养物和气体输送。
间充质干细胞可以通过多种方法给药至需要血管发生的组织或器官。间充质干细胞可以全身性地给药，如通过静脉内、动脉内或腹膜内给药，或间充质干细胞可以直接给药至需要血管发生的组织或器官，如通过直接注射至需要血管发生的组织或器官。
间充质干细胞可以来自一系列来源包括自体性来源、同种异体性来源或异种来源。
虽然本发明的范围不限于任何理论性推理，据信间充质干细胞在给药至动物时刺激了外周血单核细胞(PBMC)产生血管内皮生长因子或VEGF，这刺激新血管形成。
在一个实施方案中，动物是哺乳动物。哺乳动物可以是灵长类，包括人和非人灵长类。
根据本发明，间充质干细胞可以用于治疗、缓解或预防可因血管发生而缓解、治疗或预防的任何疾病或病症。因此，例如间充质干细胞可以给药至动物以便治疗阻塞的动脉，包括在肢端即臂、腿、手和足以及颈内或者多种器官中那些阻塞的动脉。例如，间充质干细胞可以用来治疗供应脑的阻塞的动脉，因而治疗或预防中风。另外，间充质干细胞可以用来治疗胚角膜和新生后角膜中的血管并且可以用来提供肾小管构筑作用(structuring)。在另一个实施方案中，间充质干细胞可以用于治疗内伤和外伤，以及治疗在足、手、腿或臂中存在的皮肤溃疡，包括，但不限于由疾病如糖尿病和镰状细胞贫血引起的皮肤溃疡。
此外，因为血管发生参与胚胎植入和胎盘形成，间充质肝细胞可以用于促进胚胎植入和防止流产。
另外，间充质干细胞可以给药至未出生动物，包括人，以促进未出生动物中血管的发育。
在另一个实施方案中，间充质干细胞可以给药至出生或未出生的动物以促进软骨再吸收和骨形成，以及促进正确的生长面形态发生。
间充质干细胞以促进动物中血管发生的量给药。间充质干细胞可以以约1×105个细胞/kg至约1×107个细胞/kg的量给药。在另一个实施方案中，间充质干细胞以约1×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg的量给药。待给药间充质干细胞的量取决于多种因素，包括患者年龄、重量和性别、待治疗、缓解或预防的疾病或病症以及其范围和严重性。
间充质干细胞可以与可接受的药用载体一起给药。例如，间充质干细胞可以作为用于注射的可药用液体介质中的细胞混悬液而给药。注射可以是局部的，即直接进入需要血管发生的组织或器官内，或是全身性的。
间充质干细胞可以用一种或多种编码治疗药的多核苷酸进行基因改造。所述多核苷酸可以通过适宜的表达载体送递至间充质干细胞。可以用来以基因方式改造间充质细胞的表达载体包括，但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺联病毒载体。
选择编码治疗药的适宜的多核苷酸取决于多种因素，包括正在治疗的疾病或病症以及其范围和严重性。编码治疗药的多核苷酸和适宜的表达载体在美国专利号6,355,239中进一步描述。
理解的是间充质干细胞在以上提及的疗法和治疗中使用时，可以与本领域技术人员已知的其它治疗药(包括，但不限于生长因子、细胞因子、药物如抗炎药)以及除间充质干细胞之外的细胞如树突细胞而组合地使用，并且根据需要，可以与用于细胞的可溶性载体如透明质酸一起给药或与固体基质如胶原、明胶或者其它生物相容性聚合物而组合地给药。
将理解的是本文中所述的方法可以按照多种方式并且以其在本领域众所周知的多种变型及置换而实施。也可以理解如对细胞类型间作用模式或相互作用模式描述的任何理论不应当以任何方式解释为限制本发明，而仅提出以至于可以更充分地理解本发明的方法。
附图说明
本发明现在将参照附图而描述，其中：
图1MSC调节树突细胞功能。(A)使用抗HLA-DR和CD11c抗体对成熟单核细胞性DC1细胞的流式细胞术分析和使用抗HLA-DR和CD123(IL-3受体)抗体对类浆细胞性DC2细胞的流式细胞术分析。(---)：同种型对照；(—)FITC/PE结合抗体。(B)MSC抑制TNF-α分泌(主要y-轴)并分别增加来自活化DC1和DC2中的IL-10分泌(次要y-轴)。(C)当单独与MSC或DC相比时，与成熟DC 1细胞培养的MSC抑制T细胞的IFN-γ分泌(主要y-轴)并且增加IL-4水平(次要y-轴)。在MSC存在下促炎性IFN-γ产生减少和抗炎性IL-4产生增加显示T细胞群体向抗炎性表型移动；
图2MSC抑制促炎性效应T细胞功能。(A)通过用FITC结合CD4(x-轴)和PE结合CD25(y-轴)抗体染色MSC+PBMC培养物中的PBMC或非贴壁部分的TReg细胞数目(单位％)(in％)的流式细胞术分析。门值(Gate)基于同种型对照抗体作为背景而设置。曲线图是5个独立实验的代表。(B)在细胞培养上清液中，在MSC存在下所产生的TH1细胞分泌降低水平的IFN-γ(主要y-轴)并且在MSC存在下所产生的TH2细胞分泌增加量的IL-4(次要y-轴)。(C)MSC抑制来自24孔平板内培养0小时、24小时或48小时的纯化NK细胞中的IFN-γ分泌。所示数据是在一个实验中的均值±SD细胞因子分泌并且是3个独立实验的代表；
图3MSC导致TReg细胞群体数目增加和GITR表达增加。(A)使用2步骤磁性分离法分离来自PBMC或MSC+PBMC(MSC与PBMC比例1∶10)培养物(在无任何其它刺激时培养3日)的CD4+CD25+TReg细胞群体。这些细胞受到照射(以阻断任何进一步增殖)并且用作混合淋巴细胞反应(MLR)中的刺激物，其中反应者是在植物血凝素(PHA)(2.5mg/ml)存在下的同种异体PBMC(刺激物与反应者比例1∶100)。将细胞培养48小时，随后添加3H胸苷，并且掺入的放射性在24小时后计数。结果显示在MSC存在下产生的TReg群体(泳道3)功能性地类似于在MSC不存在下产生的TReg细胞(泳道2)。(B)将PBMC在MSC不存在(上图)或存在下(MSC与PBMC比例1∶10)(下图)培养，随后收获非贴壁部分并且用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的GITR及藻红蛋白(PE)标记的CD4作免疫染色。结果显示在MSC存在下培养的细胞中存在大于2倍的GITR表达增加；
图4MSC产生PGE2并且阻断PGE2逆转了MSC介导的免疫调节作用。(A)从MSC中获得的培养上清液中的PGE2分泌(均值±SD)，其中所述的MSC在多种浓度的PGE2阻滞剂NS-398或吲哚美辛(Indometh.)存在或不存在下培养。抑制物浓度是μM并且所呈现数据是在24小时培养后获得的值。(B)使用实时RT-PCR测得在MSC和PBMC中的COX-1和COX-2表达。与PBMC相比，MSC表达显著较高水平的COX-2，并且在PBMC存在下培养MSC时，COX-2的表达在MSC中增加大于3倍。显示了来自3个独立实验之一的代表性数据。在trans-well室平板(chamber plate)中建立MSC+PBMC培养物，其中MSC在底室上铺板而PBMC在顶室上铺板。(C)当与对照相比，PGE2阻滞剂-吲哚美辛(Ind.)或NS-398的存在增加了来自活化DC(□)的TNF-α分泌和来自TH1细胞(□)的IFN-γ分泌。数据从不存MSC和PGE2抑制物下所产生的培养物中计算作为变化％。(C)在MSC-PBMC共培养(1∶10)期间PGE2阻滞剂-吲哚美辛(Indo)和NS-398的存在逆转了MSC介导对PHA处理的PBMC的抗增殖作用。所示数据来自一个实验并且是3个独立实验的代表；
图5组成型MSC细胞因子分泌在同种异体PBMC存在下升高。使用先前表征的人MSC，分析了在PBMC存在(阴影柱)(MSC与PBMC比例1∶10)或不存在(空心柱)下培养24小时的MSC的培养上清液中细胞因子IL-6和VEGF、脂质介质、PGE2和基质金属蛋白酶1(原-MMP-1)(pro-MMP-1)的水平。MSC组成性地产生IL-6、VEGF和前列腺素E2(PGE2)，并且这些因子的水平在与PBMC共培养时增加，因而提示MSC可能在炎症环境下调节免疫功能中发挥作用；
图6MSC以剂量依赖方式抑制促分裂原诱导的T细胞增殖。数目增加的同种异体PBMC与铺板在96-孔平板上的恒定数目的MSC(2,000个细胞/孔)在PHA(2.5mg/ml)存在或不存在下温育72小时，并且测定掺入的3H胸苷(每分钟计数或cpm)。在MSC存在下存在对PHA所处理PBMC的增殖的剂量依赖性抑制。显示来自3个独立实验之一的代表性数据。类似结果由LeBlanc等，斯堪的那维亚免疫学杂志(Scand J.Immunol.)，第57卷，第11页(2003)报道；
图7建议的MSC作用机理示意图。MSC通过影响来自天然免疫系统(DC-途径2-4和NK-途径6)和适应性(T-途径1和5和B-途径7)免疫系统的细胞而介导它们的免疫调节作用。在应答于侵入的病原体时，不成熟的DC移行至潜在进入(potential entry)部位、成熟并获得激发天然T细胞(通过抗原特异性信号和共刺激信号)的能力，旨在变成保护性效应T细胞(细胞介导的TH1或体液TH2免疫)。在MSC-DC相互作用期间，通过直接的细胞-细胞接触或经分泌性因子，MSC可以通过限制DC细胞发动细胞介导性应答(途径2)的能力或通过促进发动体液应答的能力(途径4)而改变免疫应答结果。另外，当成熟的效应T细胞存在时，MSC可以与它们相互作用以使TH1(途径1)反应向TH2反应(途径5)以及可能向增加的IgE产生性B细胞活性(途径7)倾斜，这是抑制GvHD和自身免疫病症状希望的结果。MSC在它们引起增加生成TReg群体的能力(途径3)方面可以产生耐受表型并且可以通过在其局部微环境中减弱旁观者炎症而帮助受体宿主。虚线(----)代表提出的机理；
图8与接受安慰剂的患者相比，MSC治疗在用MSC治疗的患者中提供预测的在一秒内用力呼气量百分数(Pred.FEV1％)的改善；
图9跑台上行走六分钟的距离的测量。与接受安慰剂的患者相比，用MSC治疗的患者显示行走距离增加；
图10接受跑台试验的患者中的心率恢复。与用安慰剂治疗的那些患者相比，更多百分数的接受跑台试验的患者显示在15分钟或更短时间内相对于基线值的心率恢复。
实施例
本发明现在将参考以下实施例进行描述。然而将可以理解的是本发明的范围不因而受限制。
实施例1
材料和方法人MSC的培养
人MSC如Pittenger等，Science，第284卷，第143页(1999)所述进行培养。简而言之，骨髓样品由Poietics Technologies、Div of Cambrex Biosciences从告知同意后的匿名供体的髂嵴中收集。MSC在含有1％抗生素-抗霉菌药溶液(英杰，卡尔斯拜德，加利福尼亚(Invitrogen，Carlsbad，California))和10％胎牛血清(FBS，JRH生物科学，列涅萨，堪萨斯(JRH BioSciences，Lenexa，Kansas))的完全Dulbecco′s改良Eagle′s低葡萄糖培养基(生活科技学，卡尔斯巴德，加利福尼亚(Life Technologies，Carlsbad，California))中培养。MSC长成汇合单层并且用胰蛋白酶/EDTA(0.05％胰蛋白酶在37℃持续3分钟)分离。所用全部MSC先前对多系潜能进行表征并且保留分化成间充质系(软骨性、生脂性和成骨性)(Pittenger等，Science，第284卷，第143页(1999))的能力。
树突细胞的分离
外周血单核细胞(PBMC)从由泊易提斯技术(Poietics Technologies)，康伯司生物科学室(Div of Cambrex Biosciences)(Walkersville，MD)获得。使用根据Dzionek等，免疫学杂志(J.Immunol.)，第165卷，第6037页(2000)的2步骤分离法，从PBMC中正向地选择单核细胞系的树突细胞(DC)的前体(CD1c+)。简而言之，使用磁珠使表达CD1c的B细胞磁性地耗尽CD19+细胞，随后用生物素-标记CD1c(BDCA1+)和抗生物素抗体标记了耗尽B细胞的部分，并且使用磁柱，根据制造商说明书((美天旎生物技术有限公司，奥本，加利福尼亚(Miltenyi Biotech，Auburn，California))将它们与未标记细胞部分分开。类浆细胞系的DC前体从PBMC中通过免疫-磁分选阳性标记抗体包被细胞(BDCA2+)而分离(美天旎生物技术有限公司，奥本，加利福尼亚(Miltenyi Biotech，Auburn，Cali fornia))。
MSC-DC培养
在大部分实验中，人MSC和DC以相等数目培养持续多个时间段，并且收集细胞培养上清液并贮存在-80℃直至进一步评估。在选择的实验中，MSC与成熟的DC1或DC2细胞(MSC∶DC比例1∶1)培养3日，并且随后照射合并的培养物(MSC和DC)以防止任何增殖。其次，抗体纯化的原初的同种异体的T细胞(CD4+、CD45RA+)添加至照射的MSC/DC并培养另外6日。将不贴壁的细胞部分(纯化的T细胞)随后从培养物中收集、洗涤两次并用PHA再刺激另外24小时，随后收集细胞培养上清液并通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析分泌的IFN-γ和IL-4。
NK细胞的分离
纯化的NK细胞群体通过耗尽非NK细胞而获得，其中所述的非NK细胞用生物素结合的单克隆抗体(抗CD3、抗CD14、抗CD19、抗CD36和抗IgE抗体)混合物作为一级试剂以及与磁珠结合的抗生物素单克隆抗体作为第二标记试剂进行磁性标记。磁性标记的非NK细胞在磁场中被滞留于MACS(Miltenyi Biotech，Auburn，California)柱内，而NK细胞则穿过并得到收集。
TReg细胞群体的分离
TReg细胞群体使用一个2步骤分离法予以分离。首先，非CD4+T细胞间接地以磁性方式用生物素标记抗体混合物和抗生物素微珠标记。标记的细胞随后通过在MACS柱(Miltenyi Biotech，Auburn，California)上分离而被耗尽。其次，CD4+CD25+细胞直接用CD25微珠标记并通过正选择从预先富集的CD4+T细胞部分中分离。磁性标记的CD4+CD25+T细胞被滞留在柱上并且在该柱从磁场中移出后被洗脱。
为确定在MSC存在下产生的增加的CD4+CD25+群体是否在本质上为抑制性的，使用一个2步骤磁性分离法从PBMC或MSC+PBMC(MSC与PBMC比例1∶10)培养物(无任何其他刺激下培养3日)中分离CD4+CD25+TReg细胞群体。将这些细胞照射以阻断任何进一步增殖并且将它们用作混合淋巴细胞反应(MLR)中的刺激物，其中反应者是在PHA(2.5μg/ml)存在下的同种异体PBMC(刺激物与反应者比例1∶100)。培养进行48小时，随后添加3H胸苷。掺入的放射性在24小时后计数。
PBMC在MSC不存在或存在下(MSC与PBMC比例1∶10)进行培养，随后收获非贴壁部分并且将其用FITC标记的糖皮质激素诱导的TNF受体、或GITR和PE标记的CD4进行免疫染色。
TH1/TH2细胞的产生
外周血单核细胞(PBMC)以2×106个细胞/ml在37℃铺板持续45分钟以除去单核细胞。非贴壁部分在平板结合的抗CD3(5μg/ml)抗体及抗CD28(1μg/ml)抗体存在下，在TH1(IL-2(4ng/ml)+IL-12(5ng/ml)+抗IL-4(1μg/ml))或TH2(IL-2(4ng/ml)+IL-4(4ng/ml)+抗IFN-γ(1μg/ml))条件下，在MSC存在或不存在下温育3日。将细胞洗涤并且随后用PHA(2.5μg/ml)再刺激另外24或48小时，随后通过ELISA(R&D系统，明尼阿波利斯，明尼苏达州(R&DSystems，Minneapolis，Minnesota))测量培养上清液中的IFN-γ和IL-4水平。
MSC的培养上清液中VEGF、PGE2和原-MMP-1水平的分析
使用先前表征的人MSC，分析了在PBMC存在或不存在下(MSC与PBMC比例1∶10)培养24小时的MSC的培养上清液中白细胞介素-6(IL-6)、VEGF、脂质介质、前列腺素E2(PGE2)和基质金属蛋白酶1(原-MMP-1)的水平。
PBMC的增殖
纯化的PBMC通过离心在聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)((淋巴细胞分离剂，奥斯陆，挪威(Lymphoprep，Oslo，Norway))上的白细胞层(leukopack)(康伯司，沃克斯维尔，马里兰(Cambrex，Walkersville，Maryland))而制备。分离的细胞在MSC(在添加PBMC前3-4小时铺板以允许MCS定居)存在或不存在下，在促分裂原PHA(西格玛化学制品，圣路易斯，密苏里州(SigmaChemicals，St.Louis，Missouri))存在下培养(一式三份)48小时。在选择的实验中，PBMC在含有PGE2抑制物-吲哚美辛(Sigma Chemicals，St.Louis，Missouri)或NS-938(鳄鱼化学制品，安娜堡，密歇根州(Cayman Chemicals，Ann Arbor，Michigan))的培养基内重悬。添加(3H)-胸苷(在200μl培养物中的20μl)并且细胞在培养额外23小时后使用自动收获仪收获。MSC或PGE2阻滞剂的作用计算为在PHA存在下对照应答(100％)的百分数。
定量RT-PCR
来自细胞沉淀的总RNA使用市售试剂盒(奇尔根，巴伦西亚，加利福尼亚(Qiagen，Valencia，California))并根据制造商说明书而制备。使用DNA-free试剂盒(生命单元，奥斯汀，德克萨斯州(Ambion，Austin，Texas))除去污染性基因组DNA。定量RT-PCR在MJ Research Opticon检测系统(南圣弗朗西斯科，加利福尼亚(South San Francisco，California))上，使用QuantiTect SYBRGreen RT-PCR试剂盒(Qiagen，Valencia，California)用浓度0.5M的引物实施。使用β-肌动蛋白作为内对照，通过Ct值(交叉点)的差异计算表达水平在不同条件下培养的细胞中的相对改变。COX-1和COX-2特异性引物的序列是：COX-1：5′-CCG GAT GCC AGT CAG GAT GAT G-3′(正向)，5′-CTA GACAGC CAG ATG CTG ACA G-3′(反向)；COX-2：5′-ATC TAC CCT CCT CAAGTC CC-3′(正向)，5′-TAC CAG AAG GGC AGG ATA CAG-3′(反向)。
增加数目的同种异体PBMC与铺板在96-孔平板上恒定数目的MSC(2,000个细胞/孔)在PHA(2.5μg/ml)存在下温育72小时，并且测定掺入的3H胸苷(每分钟计数，cpm)。PBMC和MSC以MSC∶PBMC比例1∶1、1∶3、1∶10、1∶30和1∶81进行培养。
结果
在本研究中，检验了人MSC与分离的免疫细胞群体(包括树突细胞(DC1和DC2)、效应T细胞(TH1和TH2)和NK细胞)的相互作用。MSC与每种免疫细胞类型的相互作用具有特异性结果，表明MSC可以调节免疫应答过程中的几个步骤。评估了调节并可能是MSC免疫调节作用原因的分泌因子的产生并且前列腺素合成是有作用的。
髓样(DC1)和类浆细胞性(DC2)前体树突细胞分别通过免疫磁性分选BDCA1+和BDCA2+细细胞而分离，并且对于DC1细胞而言，通过与GM-CSF和IL-4(分别是1×103IU/mI和1×103IU/ml)温育，或对DC2细胞而言，与IL-3(10ng/ml)温育而成熟。使用流式细胞术，DC1细胞呈HLA-DR+和CD11c+，而DC2细胞呈HLA-DR+和CD123+(图1A)。在致炎试剂细菌脂多糖(LPS，1ng/ml)存在下，DC1细胞产生中等水平的TNF-α，当MSC存在(检验的比例1∶1和1∶10)时，存在＞50％的TNF-α分泌减少(图1B)。另一方面，DC2细胞在LPS存在下产生IL-10并且IL-10的水平在MSC∶DC2共培养(1∶1)时增加大于2倍(图1B)。因此，MSC调节在培养下的活化DC的细胞因子谱指向更为耐受(tolerogenic)的表型。另外，与MSC一起培养时，活化的DC能够降低原初CD4+T细胞分泌的IFN-γ水平并增加原初CD4+T细胞分泌的IL-4水平(图IC)，显示了MSC介导的从促炎性至抗炎性T细胞表型的转变。
由于增加的IL-10分泌在调节性细胞的产生中发挥作用(Kingsley等，J.Immunol.，第168卷，第1080页(2002))，故调节性T细胞(TReg)通过流式细胞术在PBMC与MSC的共培养中进行定量。当PBMC与MSC培养3-5日时，存在TReg细胞数目的增加，如通过用抗CD4和抗CD25抗体对PBMC染色而确定(图2A)，这进一步支持MSC诱导的耐受性应答。在MSC存在下产生的CD4+CD25+TReg细胞群体表达增加水平的糖皮质诱导性TNF受体(GITR)(一种在TReg细胞表面上表达的细胞表面受体)，并且在本质上是异质性的，因为它抑制同种异体T细胞增殖(图3A、图3B)。其次，研究MSC直接影响T细胞分化的能力。使用抗体选择的纯化T细胞(CD4+Th细胞)，在MSC存在或不存在下产生了IFN-γ生产性TH1细胞和IL-4生产性TH2细胞。当MSC在分化期间出现时，TH1细胞减少IFN-γ分泌而TH2细胞增加IL-4分泌(图2B)。当将MSC在Th细胞已经分化(在3日)成效应TH1或TH2类型(数据未显示)后添加至培养物时，未见IFN-γ或IL-4水平的显著改变。这些实验表明MSC可以直接影响效应T细胞分化并且改变T细胞细胞因子分泌指向体液表型。
类似地，当MSC与纯化的NK细胞(CD3-、CD14-、CD19-、CD36-)以比例1∶1培养持续不同时间段(0-48小时)时，IFN-γ分泌在培养上清液中减少(图2C)，因而表明MSC也可以调节NK细胞功能。
先前工作已经表明MSC通过可溶性因子调节T细胞功能(LeBlanc等，Exp.Hematol.，第31卷，第890页(2003)；Tse等，Transplantation，第75卷，第389页(2003)。观察到MSC组成性地分泌几种因子，包括IL-6、前列腺素E2、VEGF和原MMP-1)，并且每种因子的水平在与PBMC一起培养时增加(图5)。为了研究导致对DC产生TNF-α的抑制和增加DC产生IL-10的MSC衍生性因子，研究了前列腺素E2的潜在作用，因为已经证实前列腺素E2抑制活化的DC产生TNF-α(Vassiliou等，Cell.Immunol.，第223卷，第120页(2003))。来自MSC培养物(0.5×106个细胞/ml的24小时培养物)的条件培养基含有大约1000pg/ml的PGE2(图4A)。培养上清液中不存在可检测的已知PGE2分泌诱导物例如TNF-α、IFN-γ或IL-16(数据未显示)，显示MSC的PGE2组成型分泌。由hMSC分泌的PGE2在PGE2产生的已知抑制物NS-398(5μM)和吲哚美辛(4μM)存在下被抑制60-90％(图4A)。由于PGE2分泌的释放因组成型活性的环加氧酶1(COX-1)和诱导型环加氧酶2(COX-2)的酶活性而出现(Harris等，免疫学趋势(Trends Immunol.)，第23卷，第144页(2002))，使用trans-well培养系统分析MSC和PBMC中的COX-1和COX-2的mRNA表达。如与PBMC相比，MSC表达显著较高水平的COX-2并且表达水平在MSC与PBMCs(MSC与PBMC比例1∶10)共培养24小时下增加大于3倍(图4B)。观察到COX-1水平的适度改变，表明当MSC-PBMC共培养(图5)时，PGE2分泌的增加由COX-2上调作用介导。为了研究MSC对DC和T细胞的免疫调节作用是否由PGE2介导，MSC与活化的树突细胞(DC1)或TH1细胞一起在PGE2抑制物NS-398或吲哚美辛存在下培养。NS-398或吲哚美辛的存在分别增加DC1的TNF-α分泌以及来自TH1细胞的IFN-γ分泌(图4C)，表明MSC对免疫细胞类型的作用可以由分泌的PGE2介导。近来研究已经证实MSC抑制由多种刺激物诱导的T细胞增殖(DeNicola等，Blood，第99卷，第3838页(2002)；LeBlanc等，Scand.J.Immunol.，第57卷，第11页(2003))。还观察到MSC以剂量依赖方式抑制促分裂原诱导的T细胞增殖(图6)并且当PGE2抑制物NS-398(5μM)或吲哚美辛(4μM)存在时，在含有MSC的培养物中由PHA处理的PBMC掺入(3H)胸苷增加大于70％，如与无抑制物下的对照相比(图4D)。
总之，提出了MSC与免疫细胞类型相互作用的模式(图7)。当成熟的T细胞出现时，MSC可以与它们直接相互作用并抑制促炎性IFN-γ产生(途径1)，并且可以促进调节性T细胞表型(途径3)及抗炎性TH2细胞(途径5)。此外，MSC可以借助DC通过分泌PGE、抑制促炎性DC1细胞(途径2)和促进抗炎性DC2细胞(途径4)或调节性DC(途径3)而改变T细胞免疫应答的结果。朝TH2免疫的转变反过来表明B细胞活性朝着增加生成IgE/IgG1亚型抗体(途径7)的变化。MSC通过抑制来自NK细胞的IFN-γ分泌的能力而同样调节NK细胞功能(途径6)。这种MSC：免疫细胞相互作用模型与几个其它实验室中进行的实验(LeBlanc等，Exp.Hematol.，第31卷，第890页(2003)；Tse等，Transplantation，第75卷，第389页(2003)；DiNicola等，Blood，第99卷，第3838页(2002))相一致。对所提出机理的进一步检验正在进行并且现在需要动物研究以检验MSC给药的体内作用。
实施例2
将间充质干细胞给予患有严重IV级胃肠道性移植物抗宿主病(GVHD)的33岁女性患者。该患者抗拒全部其它GVHD治疗。患者结肠的内窥镜观察显示了治疗前的溃疡及炎症区域。该患者结肠的组织学显示移植物抗宿主病在治疗前已经摧毁该患者的绝大部分肠隐窝。
以3×106个细胞每千克体重的量对该患者静脉内输注在50ml的勃脉力A(Plasma Lyte A)(百特(Baxter))中的同种异体间充质干细胞。
该患者在输注2周后进行评估。在输注两周后，患者结肠的内窥镜观察显示消除了治疗前可见的溃疡及炎症区域。此外，患者结肠的活组织检查显示肠隐窝明显再生。对该患者使用给药间充质干细胞导致胃肠道性移植物抗宿主病的炎性改变显著减少，并导致再生新的功能性肠组织。
实施例3
通过静脉内输注在Plasma Lyte A(Baxter)中的间充质干细胞的混悬液，9位患者接受0.5×106个间充质干细胞每千克体重，10位患者接受1.6×106个间充质干细胞每千克体重并且15位患者接受5.0×106个间充质干细胞每千克体重，其中间充质干细胞以2.5×106个细胞/ml浓度存在于混悬液中。因此给予的间充质干细胞混悬液的总体积取决于细胞的剂量和患者的重量。
19位患者接受Plasma Lyte A的安慰剂剂量。安慰剂剂量以低、中和高剂量正比例于给予患者的间充质干细胞混悬液的体积，其中所述的患者用间充质干细胞治疗。安慰剂患者中，5位患者给予低剂量的混悬液，4位患者给予中等剂量的混悬液并且10位患者给予高剂量的混悬液。
FEV1肺量测定试验在6个月时间上进行以检测与治疗相关的可能变化。该试验根据美国胸科学会指南(American Thoracic Society guideline)(Miller等，欧洲呼吸杂志(Eur.Respir.J.)，第26卷，第319-338页(2005))进行。
用力呼气量或FEV1是距离完全吸气位置而在用力呼气的第一秒中呼出的气体的最大体积，表述以升、体温(37℃)、环境压力、以水蒸气饱和(BTPS)。基于年龄、性别、高度和人种对每位患者计算预测的FEV1值。预测的FEV1对男性计算如下(Crapo等，美国呼吸病评论(Am.Rev.Respir.Dis.)，第123卷，第659-664页(1981)：
预测的FEV1＝0.0414×高度(cm)-0.0244×年龄(岁)-2.190
预测的FEV1对女性计算如下(Crapo，1981)：
预测的FEV1＝0.0342×高度(cm)-0.0255×年龄(岁)-1.578
以上值对除非裔美国人背景之外的男性和女性计算。对于非裔美国人背景的男性和女性，以上值乘以校正系数0.88。
也考虑了每位患者的体重。虽然不把体重计入FEV1值的测定，然而肥胖可能降低所测量的肺体积，并且体重的改变可能导致肺功能的细小变化。
使用与插入患者嘴巴的咬口或管连接的肺活量计对全部患者测量FEV1值。测量每位患者的身高和体重，将鼻夹置于每位患者上。指令每位患者彻底而迅速地吸气，在总肺容积上停留小于1秒，并最大程度地呼气直至没有排除更多气体。该方法重复三次，并且对每位患者测量FEV1值。从FEV1值，计算预测的FEV1(预测的FEV1％)值的百分数。预测的FEV1(预测的FEV1％)值的百分数对每位患者计算如下：
预测的FEV1％＝100.0×观察的FEV1
预测的FEV1
在多个时间间隔上计算患者的预测FEV1％值改进的百分数直至治疗后6个月(180日)。对MSC治疗组和安慰剂治疗组的结果示于图8。这些结果显示对全部MSC治疗患者的预测FEV1％值的平均百分数和对接受安慰剂的全部患者的预测FEV1％值的平均百分数。
与患者对照组相比，用MSC治疗的患者从输注后三日至6个月显出相对于基线(治疗前)值的更大的预测FEV1％值改进。在输注后10日和30日，对治疗患者和安慰剂患者观察到的预测FEV1％值的差异是统计显著的(p＜0.05)。
MSC治疗患者和安慰剂患者还接受其中患者在跑台上行走的跑台(treadmill)试验，其中以六分钟间隔测量每位患者行走的距离。距离测量在治疗后立即进行(基线)，并且在治疗后一个月、三个月和六个月进行。该试验根据ATS(美国胸科学会)指南(Am.J.Respir.Crit.Care Med.，第166卷，第111页(2002))进行。
与基线距离比较的全部MSC治疗患者和全部安慰剂治疗患者所行走距离的平均变化百分数示于图9。在三个月和六个月时间点上，MSC治疗患者行走的距离与接受安慰剂的患者相比显示增加。
在治疗后立即给予和在治疗后一个月、三个月和六个月给予患者的6分钟跑台试验后，测量患者的心率恢复。
心率恢复结果示于图10。如图10中所示，在治疗后6个月，与接受安慰剂的患者相比，接受MSC治疗的在停止跑台行走后15分钟范围内显示心率恢复至基线值的患者百分数的差异是统计显著的。
在预测FEV1％、行走距离和心率恢复方面改善的以上结果显示用间充质干细胞治疗的患者具有与安慰剂组相比而改善的肺功能。以上结果表明纤维化肺病或病症可以用间充质干细胞治疗，因而间充质干细胞改善了肺功能、减少肺内的现有疤痕组织和/或防止肺内进一步的疤痕扩展。
全部专利公开、出版物，包括出版的专利申请、保藏登录号和数据库登录号因而完整地通过参考而相同程度地援引以至于每一专利、出版物、保藏登录号和数据库登录号通过参考而具体和分别地加以援引。
然而将理解的是本发明的范围不限于以上所述的具体实施方案。本发明可以按照除具体所述之外的方式实施并且仍然处于以下权利要求书的范围内。
序列表
<110>奥西里斯治疗公司
<120>间充质干细胞及其用途
<130>PIUS0811031
<140>US 11/726,676
<141>2007-03-22
<150>US11/541,853
<151>2006-10-02
<150>US 11/080,298
<151>2005-03-15
<150>US 60/555,118
<151>2004-03-22
<160>4
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成序列并且是得自人COX-1的用于PCR的引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223>COX-1正向引物
<400>1
ccggatgcca gtcaggatga tg                     22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成序列并且是得自人COX-1的用于PCR的引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(22)
<223>COX-1反向引物
<400>2
ctagacagcc agatgctgac ag                 22
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>合成序列并且是得自人COX-2的用于PCR的引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(20)
<223>COX-2正向引物
<400>3
atctaccctc ctcaagtccc                    20
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>得自人COX-2的用于PCR的引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(21)
<223>COX-2反向引物
<400>4
taccagaagg gcaggataca g                  21

Claims (42)

1.促进动物除心脏外的器官或组织中血管发生的方法，其包括：
以有效促进所述动物除心脏之外的器官或组织中血管发生的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述的哺乳动物是灵长类。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述的灵长类是人。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的间充质干细胞以约1×105个细胞/kg至约1×107个细胞/kg的量给药。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述的间充质干细胞以约1×106个细胞/kg至约5×106个细胞/kg的量给药。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述的间充质干细胞全身性给药。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述的间充质干细胞静脉内给药。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，通过向所述动物的除心脏之外的所述器官或组织直接注射来给药所述的间充质干细胞。
10.治疗动物中选自由自身免疫性疾病和移植物抗宿主病所组成的组中的疾病的方法，包括：
以有效治疗所述动物中所述疾病的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。
13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述的疾病是多发性硬化。
14.治疗动物中炎症反应的方法，其包括：
以有效治疗所述动物中所述炎症反应的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。
17.根据权利要求14所述的方法，其中，所述的炎症反应与银屑病相关。
18.治疗动物中癌症的方法，其包括：
以有效治疗所述动物中癌症的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。
21.治疗动物中变应性疾病或病症的方法，其包括：
以有效治疗所述动物中所述变应性疾病或病症的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。
24.根据权利要求14所述的方法，其中，所述的变应性疾病或病症是关节炎。
25.促进动物中伤口愈合的方法，其包括：
以有效促进所述动物中伤口愈合的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。
28.治疗或预防动物中纤维化病症的方法，其包括：
以有效治疗或预防所述动物中纤维化病症的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述的纤维化病症是急性呼吸窘迫综合征。
30.根据权利要求28所述的方法，其中，所述的纤维化病症是慢性阻塞性肺病。
31.根据权利要求28所述的方法，其中，所述的纤维化病症是特发性肺纤维化。
32.修复动物中上皮损伤的方法，其包括：
以有效修复所述动物中上皮损伤的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述的动物是哺乳动物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。
35.根据权利要求32所述的方法，其中，所述的上皮损伤是移植物抗宿主病的结果。
36.治疗动物中肺病的方法，其包括：
以有效修复所述动物中肺病的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述的肺病具有纤维化改变和炎性改变。
38.根据权利要求36所述的方法，其中，所述的肺病是慢性阻塞性肺病。
39.改善动物中肺功能的方法，其包括：
以有效改善所述动物中肺功能的量，将间充质干细胞给药至所述动物。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述的间充质干细胞以约0.5×106细胞/每千克体重至约5×106个细胞/每千克体重的量给药。
41.根据权利要求39所述的方法，其中，所述的间充质干细胞以有效改善所述患者中用力呼气量的量给药。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述的间充质干细胞以有效改善所述患者中用力呼气量达至少10％的量给药。
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