MX2011001992A

MX2011001992A - Metodos y composiciones para el tratamiento de defectos oseos con poblaciones de celulas placentarias.

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Publication number: MX2011001992A
Application number: MX2011001992A
Authority: MX
Inventors: Kristen Labazzo; Sascha Dawn Abramson; Mohammad A Heidaran; Marian Guelakis; Shmuel Yaccoby
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Priority date: 2008-08-22
Filing date: 2009-08-24
Publication date: 2011-03-29
Also published as: ES2426241T3; EP2331109B1; US20100047214A1; WO2010021756A1; EP2633861A1; CA2965883C; PE20110358A1; CA2965883A1; HRP20130812T1; HK1187252A1; JP2012500792A; CA2734446A1; RU2011110736A; NZ591293A; US20160151425A1; US20140322177A1; AU2009283161A1; MX339068B; CA2734446C; CN102176919A

Abstract

Se proporcionan aquí células adherentes placentarias osteogénicas aisladas (OPACs), métodos para usar OPACs y poblaciones de OPACs, y métodos para cultivasr, proliferar, expandir o diferenciar las OPACs. Además se proporcionan aquí los métodos para usar las OPACs para formular composiciones implantables o inyectables adecuadas para la administración a un sujeto. También se proporcionan aquí los métodos para el tratamiento de defectos de los huesos con OPACs y las coposiciones que comprenden OPAC5. También se proporcionan aquí los métodos para usar OPACs en el tratamiento y manejo de mieloma múltiple, por ejemplo reduciendo la progresión de, detener la progresión de, o mejorar uno o más síntomas del mieloma múltiple en un individuo que tiene mieloma múltiple, que comprende administrar una pluralidad de OPACs al individuo.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA EL TRATAMIENTO DE DEFECTOS ÓSEOS CON POBLACIONES DE CÉLULAS PLACENTARIAS Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. 61/090,898, presentada el 22 de Agosto de 2008, y la Solicitud de Patente Provisional Norteamericana No. 61/090,897, presentada el 22 de Agosto de 2008, las divulgaciones de las cuales se incorporan por este medio como referencia en sus totalidades. 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan aqui métodos de uso de poblaciones aisladas de células placenterías adherentes osteogénicas (OPACs) , y métodos de uso de las OPACs, por ejemplo, en el tratamiento de mieloma múltiple, y para reducir, detener, o revertir la pérdida ósea asociada con o causada por el mieloma múltiple. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El mieloma múltiple (también conocido como MM, mieloma, mieloma de las células plasmáticas, o padecimiento de Kahler) es un tipo de cáncer de las células plasmáticas, las cuales son células del sistema inmunologico que producen anticuerpos. Los síntomas del mieloma múltiple incluyen dolor de huesos, infección, falla renal, anemia, y lesiones óseas. El padecimiento se considera incurable, y sólo algunos tratamientos, tales como la lenalidomida (REVLI ID®) están disponibles y son prometedores. Como tal, existe una necesidad por nuevos tratamientos para el mieloma múltiple. 3. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN ¦ Se proporcionan aqui células adherentes placentarias osteogénicas aisladas (OPACs) , poblaciones de OPACs, y poblaciones de células que comprenden OPACs, en donde las OPACs están presentes en, y - se aislan a partir del corion (membrana embriónica exterior, altamente vascular) . En ciertas modalidades, las OPACs no se aislan a partir de la falda coriónica (laeve) . Las OPACs exhiben una o más características de células madre o células multipotentes (por ejemplo, inhiben marcadores asociados con las células madre o células multipotentes, se reproducen al menos 10-20 veces en el cultivo en un estado no diferenciado, se diferencian en células adultas representativas de al menos una de las tres capas del germen, etcétera.), y se pueden adherir a un sustrato del cultivo de tejidos (por ejemplo, el plástico del cultivo de tejidos tal como la superficie de una placa de cultivo de tejidos o una placa con múltiples pozos) . Adicionalmente se proporcionan aquí métodos de uso de las OPACs en el tratamiento de defectos óseos, y en el tratamiento de cánceres relacionados a los huesos, por ejemplo, mieloma múltiple, y métodos de uso de las OPACs para reducir, detener, o revertir la pérdida ósea asociada con o causada por el mieloma múltiple.

En un aspecto, se proporciona aquí una OPAC aislada, es decir, una célula adherente placentaria osteogénica aislada que es adherente al plástico del cultivo de tejidos, osteogénica, y aislada a partir del corion, excluyendo la falda coriónica (laeve) . Las OPACs no son trofoblastos , citotrofoblastos , células madre embrionicas, o células germinales embrionicas ya que aquellas células son conocidas y comprendidas en el arte.

En una modalidad, una OPAC es una célula aislada CD200" o CD200dlfuso, por ejemplo, una que se aisla a partir del corion, pero no a partir de la falda coriónica (laeve) . -En una modalidad especifica, una OPAC es osteogénica. En una modalidad especifica, una OPAC es positiva para la secreción de osteoprotegerina (OPG) , por ejemplo, según se detecta mediante citometria de flujo. La osteoprotegerina es un receptor señuelo secretado por los osteoblastos que específicamente se enlaza al factor de diferenciación de los osteoclastos (ODF) e inhibe la maduración de los osteoclastos . De esta manera, las OPACs promueven la formación ósea y reducen la pérdida ósea mediada por los osteoclastos. En otra modalidad específica, una OPAC no expresa el RANKL (Ligando del Activador del Receptor del Factor Nuclear ? B; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. AAB86811.1), por ejemplo, según se detecta mediante RT-PCR cuantitativa. El RANKL es una proteína que activa los osteoclastos, los cuales están involucrados en la resorción ósea. De esta manera, las OPACs no promueven la resorción ósea. En otra modalidad específica, una OPAC es CD200" o CD200difusa, y CD105+. En otra modalidad específica, una OPAC es negativa para la expresión de a actina de músculo liso (vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NP_001604), negativa para el RANKL, o positiva para la expresión de NG2 (proteoglicano de condroitin sulfato celular neuro-glial 2), por ejemplo, según se determina mediante tinción de anticuerpos. En ciertas modalidades, la tinción para dicho NG2 en las OPACs es difusa, en comparación a las células madre placentarias adherentes al plástico del cultivo de tejidos CD200+ (no difusa), en las cuales se enfoca la tinción NG2. En otra modalidad específica, una OPAC es negativa para la expresión de a actina de músculo liso, negativa para el RANKL, positiva para la expresión de NG2 y positiva para la secreción de osteoprotegerina . En otra modalidad específica, una OPAC exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible, por ejemplo, según se determina mediante un ensayo colorimétrico . En una modalidad más específica, una OPAC es CD200" o CD200di usa, CD105+, según se detecta mediante citometría de flujo, y es negativa para la expresión de actina de músculo liso, negativa para el RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En otra modalidad más específica, una OPAC es CD200" o CD200difuso, CD105+, y es negativa para la expresión de actina de músculo liso, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina, y exhibe actividad de fosfatase alcalina inducible.

En otra modalidad especifica, una OPAC es SSEA3+ o SSEA4+. En una modalidad más especifica, una OPAC es SSEA3+ y SSEA4+. En otra modalidad más especifica, una OPAC es CD200", CD105+, SSEA3+, y también es negativa para la expresión de o¡ actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En otra modalidad más especifica, una OPAC es CD200", CD105+, SSEA4'+, y también es negativa para la expresión de actina de músculo liso, negativa para el RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En una modalidad más especifica, una OPAC es CD200" , CD105+, SSEA3+, SSEA4+ , y también es negativa para la expresión de a actina de músculo liso, negativa para el RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible .

En ciertas modalidades, la OPAC, la población de OPACs, o la población de células que comprende las OPACs facilita la formación de una matriz mineralizada en una población de células placentarias cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de una matriz mineralizada .

También se proporcionan aquí poblaciones de células que comprenden las OPACs, en donde la población de células es CD200" o CD200difusa. De esta manera, en una modalidad, se proporciona aquí una población aislada de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células no se aisla a partir de la falda coriónica (laeve), y en donde dicha población de células es CD200" o CD200difusa. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs. En una modalidad especifica, dicha población de células es osteogénica. En otra modalidad especifica, dicha población de células es CD200" y CD105+ según se detecta mediante citometría de flujo. En otra modalidad especifica, dicha población de células es CD200difusa y CD105+ según se detecta mediante citometría de flujo. En otra modalidad específica, dicha población de células es negativa para la expresión de a actina de músculo liso, positiva para la expresión de NG2, o positiva para la secreción de osteoprotegerina . En ciertas modalidades, la tinción para dicho NG2 en las OPACs es difusa, en comparación a las células madre placentarias adherentes al plástico del cultivo de tejidos CD200+ (no difusa), en las cuales se enfoca la tinción NG2. En otra modalidad, dicha población de células es negativa para la expresión del RANKL, por ejemplo, según se detecta mediante RT-PCR cuantitativa. En otra modalidad, dicha población de células es negativa para la expresión de a actina de músculo liso, positiva para la expresión de NG2 y positiva para la secreción de osteoprotegerina . En otra modalidad especifica, dicha población de células exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En una modalidad más especifica, dicha población es CD200", CD105+ o CD200difusa, CD1054 y también es uno o más de negativa para la expresión de a actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En una modalidad más especifica, dicha población de células es CD200", CD105+ o CD200difusa, CD105+; es negativa para la expresión de a actina de músculo liso, negativa para el RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina; y exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible.

En otra modalidad especifica, dicha población de células es SSEA3+ o SSEA4+. En aún otra modalidad, dicha población de células es SSEA3+ y SSEA4+ . En aún otra modalidad, dicha población de células es CD200", CD105+ o CD200difusa, CD105+, SSEA3+, y también negativa para la expresión de a actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina indueible. En otra modalidad más específica, dicha población de células es CD200" o CD200difus , es CD105+ y SSEA4+, y también es negativa para la expresión de a actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina indueible. En otra modalidad más específica, dicha población de células es CD200" o CD200difusa; es CD105+, SSEA3+, SSEA4+, negativa para la expresión de OÍ actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina, y/o exhibe actividad de fosfatasa alcalina indueible .

En otra modalidad específica, la población de células que comprende las OPACs expresa metalopeptidasa de matriz 9 (MMP9) en un nivel detectablemente más alto en medio osteogénico que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otras modalidades específicas, la población de células que comprende las OPACs expresa unos o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de B P3 (proteína morfogenética ósea 3), CDH11 (caderina tipo 11), COL10A1 (colágeno tipo X, alfa 1), COL14A1 (colágeno, tipo XIV, alfa 1), COL15A1 (colágeno, tipo XV, alfa 1), DMP1 (fosfoproteina ácida de la matriz de dentina 1) , DSPP (sialofósfoproteina de dentina) , ENAM (enamelina) , FGFR2 (receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos) , MP10 (metaloproteasa de matriz 10 (estromelisina 2)), TGFB3 (factor de crecimiento transformante, ß3) , y/o TGFBRl (receptor 1 del factor de crecimiento transformante ß) cuando una OPAC y dicha célula madre placentaria CD200+ se cultivan en medio de crecimiento, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica, la población de células que comprende las OPACs expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de AMBN (ameloblastina (proteina de matriz de esmalte) ) , BMP2 (proteina morfogenética ósea 2), CALCR (receptor de calcitonina) , CDH11, COL11A1 (colágeno, tipo XI, alfa 1), C0L14A1, C0L15A1, C0L2A1 (colágeno, tipo II, alfa 1), CSF2 (factor 2 de estimulación de la colonia (granulocito-macrófago) ) , CSF3 (factor 3 de estimulación de la colonia (granulocito) ) , DMP1, DSPP, ENAM, FGF3 (factor 3 de crecimiento de fibroblastos), GDF10 (factor 10 de diferenciación de crecimiento), IGFl (factor 1 de crecimiento similar a la insulina), ITGAl (integrina, alfa 1 (CD49)), ITGA2 (integrina, alfa 2 (CD49B) ) , M P8 (metaloproteasa de matriz 8 (colagenasa de neutrófilo) ) , MP9 (metalopeptidasa de matriz 9 (gelatinasa B, gelatinasa de 92 kDa, colagenasa tipo IV de 92 kDa)), MMP10, PDGFA (factor A de crecimiento derivado de plaquetas), SMAD1 (miembro 1 de la familia SMAD) , TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2 (receptor 2 del factor de crecimiento transformante beta) cuando las OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica, la población de células que comprende las OPACs expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de CDH11, C0L14A1, COL15A1, DMP1, DSPP, ENAM, MMP10, TGFB3 y/o TGFBR1 independientemente de si las OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica, la población de células que comprende las OPACs expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de AHSG (alfa-2-HS-glicoproteina) , ALPL (fosfatasa alcalina del higado/hueso/riñon) , EGF (factor de crecimiento epidérmico), FLT1 (tirosina cinasa 1 relacionada a fms (factor de crecimiento endotelial vascular/receptor del factor de permeabilidad vascular)), IGF2, ITGA2, ITGAM (integrina, alfa M (subunidad del receptor 3 del componente 3 del complemento) ) , SCARB1 (receptor del depurador clase B, miembro 1) , S0X9 ( SRY (región Y determinante del sexo) -cuadro 9), TNF (factor de necrosis tumoral) , TWIST1 (homólogo 1 de Twist; anteriormente blefarofimosis , epicanto inverso y ptosis 3, acrocefalosindactilia 3), VCAM1 (molécula 1 de adhesión celular vascular) y/o VDR (receptor de vitamina D (1,25-dihidroxivitamina D3)) cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real En otra modalidad especifica, la población de células que comprende las OPACs expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no débil o no difusa, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BGN (biglicano) , C0L11A1, COMP (proteina oligomérica de la matriz del cartílago), FGF1 y/o VCAM1 cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica,! la población de células que comprende las OPACs expresa VCAM1 en un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, independientemente de si dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real En otra modalidad especifica, la población de células que comprende las OPACs expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BMP , CALCR, CD36, CDH11, C0L12A1, C0L14A1, C0L15A1, C0L3A1, C0L5A1, DMP1, DSPP, FLT1, MSX1, PDGFA, TGFB3, TGFBR1 y/o TUFT1 (Tuftelina 1), cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real; En otra modalidad especifica, la población de células que comprende las OPACs expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de AMBN, CALCR, C0L14A1, C0L15A1, CSF3, DMP1, DSPP, ITGA1, ITGA2 , MMP10, MMP9, SX1, PDGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2, cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica, la población de células que comprende las OPACs expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de CALCR, C0L14A1; C0L15A1, DMP1, DSPP, MSXl, PDGFA, TGFB3 y/o TGFBR1 independientemente de si dichas OPACs y dichas células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica, la población de células que comprende las OPACs expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de ALPL, BGLAP (proteina (gla) gamma-carboxiglutamato del hueso), IGF2, ITGA2, ITGA , SCARB1 y/o S0X1, cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica, la población de células que comprende las OPACs expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de AHSG, ALPL, BGLAP, BGN, BMP3, BMP5, CD36, COL10A1, C0L11A1, C0L12A1, C0L2A1, COL4A3, COMP, EGF, FGF1, FGFR2, IGF2, MMP8, PHEX (homólogo de endopeptidasa que regula el fosfato, X-enlazado) , RUNX2 (factor de transcripción 2 relacionado con runt o rechazo), SCARB1, S0X1, VCAM1 y/o VEGFB, cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica, la población de células que comprende las OPACs expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de ALPL, BGLAP, IGF2, SCARB1 y/o S0X9, independientemente de si dichas OPACs y dichas células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad más especifica de cada una de las modalidades anteriormente mencionadas, las OPACs y dichas células madre placentarias CD200+ o células madre mesenquimales han experimentado un número equivalente de pasos o duplicaciones de las células.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, por ejemplo, una población de OPACs, en donde una metalopeptidasa de matriz 9 (MMP9) que codifica el gen se induce en dichas OPACs en medio osteogénico, según se compara a la expresión de MMP9 en medio de crecimiento, al menos 2, 3, 4 o 5 órdenes de magnitud mayor que lo que dicha MMP9 se induce en las células madre placentarias, por ejemplo, las células placentarias multipotentes adherentes al cultivo de tejidos CD34", CD10+, CD105+, en dicho medio osteogénico, según se compara a la expresión de MMP9 en dicho medio de crecimiento, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, por ejemplo, una población de OPACs, en donde una metalopeptidasa de matriz 9 (MMP9) que codifica el gen se induce en dichas OPACs en medio osteogénico, según se compara a la expresión de MMP9 en medio de crecimiento, al menos 2, 3, 4 o 5 órdenes de magnitud mayor que lo que dicha MMP9 se induce en las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (MSCs) en dicho medio osteogénico, según se compara a la expresión de MMP9 en dicho medio de crecimiento, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, por ejemplo, una población de OPACs, en donde una metalopeptidasa de matriz 9 (MMP9) que codifica el gen se induce en dichas OPACs en medio osteogénico, según se compara a la expresión de MMP9 en medio de crecimiento, al menos 2 , 3, 4 o 5 órdenes de magnitud mayor que lo que dicha MMP9 se induce en los fibroblastos en dicho medio osteogénico, según se compara a la expresión de MMP9 en dicho medio de crecimiento, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En modalidades específicas, al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las células en la población de células que comprende las OPACs son CD200" y/o CD200difuso. En otras modalidades específicas, al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las OPACs en la población de células que comprende las OPACs son CD200" y/o CD200difuso.

Adicionalmente se proporciona aquí una población aislada de OPACs, en donde dicha población se produce aislando tejido coriónico de una placenta, en donde dicho tejido coriónico no es tejido de la falda coriónica (laeve) ; digiriendo el tejido coriónico aislado con una enzima que rompe el tejido para obtener una población de células del corion que comprende las OPACs; y aislando dichas OPACs de dichas células del corion.

En una modalidad especifica, la enzima que rompe el tejido es tripsina, dispasa o colagenasa. En varias modalidades, las OPACs, contenidas dentro de una población de células obtenida a partir de la digestión de tejido coriónico, son al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99.5% de dicha población de células coriónicas .

Las OPACs, y las poblaciones de células que comprenden las OPACs aqui provistas, incluyen OPACs y poblaciones de células que contienen las OPACs que se han cultivado, por ejemplo, durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más pasos, o durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 duplicaciones de la población. Las poblaciones de OPACs también incluyen poblaciones de, por ejemplo, dos o más, OPACs en cultivo, y una población en un recipiente, por ejemplo, una bolsa .

En otro aspecto, se proporciona aqui un método para producir células osteogénicas con la habilidad para mineralizar la matriz, que comprende cultivar una pluralidad de OPACs aqui provistas o una población de OPACs aisladas aqui provista, bajo condiciones en las cuales dichas OPACs se diferencian en células osteogénicas, dicho cultivo siendo durante un tiempo suficiente para que dichas células osteogénicas produzcan, o faciliten la producción de, cantidades detectadles de matriz mineralizada que comprende calcio y/o fosfato. En ciertas modalidades, las OPACs producen, o facilitan la producción de hueso.

En otro aspecto, se proporciona aquí una composición, por ejemplo, una composición implantable, que comprende las OPACs. En una modalidad especifica, la composición implantable comprende una matriz. En una modalidad más especifica, dicha matriz es un soporte tridimensional. En otra modalidad más especifica, dicha matriz comprende colágeno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina, o vitronectina . En otra modalidad más especifica, la matriz es una membrana amniótica o un biomaterial derivado de la membrana amniótica. En otra modalidad más específica, dicha matriz comprende una proteína de la membrana extracelular . En otra modalidad más específica, dicha matriz comprende un compuesto sintético. En otra modalidad más específica, dicha matriz comprende un compuesto bioactivo. En otra modalidad más específica, dicho compuesto bioactivo es un factor de crecimiento, citocina, anticuerpo, o molécula orgánica de menos de 5,000 daltons. En ciertas modalidades, la matriz es un polímero sintético degradable tal como, por ejemplo, ácido poliláctico o ácido poliglicólico . En ciertas modalidades, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de ß trifosfato de calcio, un sustrato de colágeno-ß fosfato de tricalcio, un sustrato de colágeno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustrato de colágeno placentario humano mineralizado, un sustrato de ácido hialurónico, o un sustrato cerámico. En ciertas modalidades, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de ß trifosfato de calcio. En ciertas modalidades, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de colágeno-ß fosfato de tricalcio. En ciertas modalidades, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de colágeno. En ciertas modalidades, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de fosfato de calcio. En ciertas modalidades, el sustrato de soporte implantable es un sustrato de colágeno placentario humano mineralizado.

En otro aspecto, se proporciona aquí un método para tratar defectos óseos en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición implantable o inyectable que comprende una población de OPACs aquí provista, tratando por consiguiente el defecto óseo en el sujeto. En ciertas modalidades, el defecto óseo es una lesión osteolitica asociada con un cáncer, una fractura de hueso, o una columna vertebral, por ejemplo, en neces.idad de fusión. En ciertas modalidades, la lesión osteolitica se asocia con mieloma múltiple, cáncer óseo, o cáncer metastático. En ciertas modalidades, la fractura de hueso es una fractura de falta de unión de los fragmentos de los huesos fracturados. En ciertas modalidades, una composición implantable se implanta quirúrgicamente, por ejemplo, en el sitio del defecto óseo. En ciertas modalidades, una composición inyectable se administra quirúrgicamente a la región del defecto óseo. En ciertas modalidades, la composición inyectable se administra sistémicamente .

En otro aspecto, se proporciona aquí un método para producir células osteogénicas que comprende cultivar una pluralidad de OPACs o una población de OPACs aisladas bajo condiciones en las cuales dichas OPACs se diferencian en células osteogénicas, dicho cultivo siendo durante un tiempo suficiente para que dichas OPACs produzcan, o faciliten la producción de cantidades detectables de calcio mineralizado, tejido óseo, o hueso.

En ciertas modalidades, se proporciona aquí un método para formular una composición inyectable, que comprende combinar una población de OPACs con colágeno o ácido hialurónico inyectable. En ciertas modalidades, la composición comprende ácido hialurónico inyectable. En ciertas modalidades, la composición comprende colágeno inyectable. También se proporcionan aqui composiciones que comprenden una población de OPACs y colágeno o ácido hialurónico inyectable.

En otro aspecto, se proporcionan aqui métodos para tratar individuos que tienen un cáncer relacionado a los huesos, por ejemplo, mieloma múltiple, cáncer de hueso, cáncer de mama, cáncer pulmonar, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de E ing, condrosarcoma, cordoma, histiocitoma fibroso maligno óseo, fibrosarcoma de hueso, cáncer metastático, mieloma múltiple, y cualquier forma de cáncer metastático caracterizado por metástasis ósea. En una modalidad, se proporciona aquí un método para tratar un individuo que tiene un cáncer relacionado a los huesos, que comprende administrar a dicho individuo las OPACs aisladas, por ejemplo, una población aislada de células que comprende las OPACs, en donde dichas OPACs se obtienen a partir del corion, y son adherentes al plástico del cultivo de tejidos, y en donde dichas OPACs son negativas para CD200 o son CD200dlfuso, y positivas para CD105, y en donde dicha administración reduce detectablemente la progresión de, detiene la progresión de, o mejora, uno o más síntomas de dicho mieloma múltiple. En una modalidad específica, dichas OPACs son SSEA3+ o SSEA4+. En otra modalidad específica, dichas OPACs son SSEA3+ y SSEA4+. En otra modalidad específica, las OPACs son CD200", CD105+, SSEA3+, y también son negativas para la expresión de OÍ actina de músculo liso, negativas para la expresión del RANKL, positivas para la expresión de NG2, positivas para la expresión de osteoprotegerina o exhiben actividad de fosfatasa alcalina inducible. En otra modalidad más específica, las OPACs son CD200" y/o CD200difuso, CD105+, SSEA4+, y también son negativas para la expresión de actina de músculo liso, negativas para el RANKL, positivas para la expresión de NG2, positivas para la expresión de osteoprotegerina o exhiben actividad de fosfatase alcalina inducible. En una modalidad más específica, las OPACs son CD200" y/o CD200difuso, CD105+, SSEA3+, SSEA4+, y también son negativas para la expresión de a actina de músculo liso, negativas para el RANKL, positivas para la expresión de NG2, positivas para la expresión de osteoprotegerina o exhiben actividad de fosfatasa alcalina inducible. En otras modalidades específicas, las OPACs comprenden cualquiera de las características, o combinaciones de características, recitadas en la Sección 5.1, debajo.

En otra modalidad específica del método de tratamiento, dichas OPACs expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BMP3, CDH11, COL10A1, C0L14A1, C0L15A1, DMP1, DSPP, ENAM, FGFR2, MMP10, TGFB3, y/o TGFBR1, cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias CD200+ se cultivan en medio de crecimiento, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad específica del método de tratamiento, dichas OPACs expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no débiles o no difusas, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de A BN, BMP2, CALCR, CDH11, C0L11A1, C0L14A1, C0L15A1, C0L2A1, CSF2, CSF3 , DMP1, DSPP, ENA , FGF3, GDF10 , IGF1, ITGA1, ITGA2, MMP10, MMP8, MMP9, PDGFA, SMAD1 , TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2 cuando dichas OPACs 'y dichas células madre placentarias se cultivan en medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichas OPACs expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de CDH11, C0L14A1, C0L15A1, DMP1, DSPP, ENAM, MMP10, TGFB3 y/o TGFBR1 independientemente de si dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichas OPACs expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de AHSG, ALPL, EGF, FLT1, IGF2, ITGA2, ITGAM, SCARB1, SOX9, TNF, TWIST1, VCAM1 o VDR cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichas OPACs expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BGN, C0L11A1, COMP, FGF1 y/o VCAM1 cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichas OPACs expresan VCAM1 en un nivel detectablemente más bajo jque un número equivalente de células madre placentarias adher'entes CD200+, no difusa, independientemente de si dichas OPACsi y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichas OPACs expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madrej mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BMP4, CALCR CD36, CDH11, C0L12A1, C0L14A1, C0L15A1, C0L3A1, C0L5A1, DMP1, ¡ DSPP, FLT1, MSX1, PDGFA, TGFB3, TGFBRl y/o TUFT1, cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichas OPACs expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de AMBN, CALCR, C0L14A1, C0L15A1, CSF3, DMP1, DSPP, ITGA1, ITGA2, MMP10, M P9, MSX1, PDGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2 , cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichas OPACs expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de CALCR, C0L14A1, C0L15A1, DMP1, DSPP, MSX1, PDGFA, TGFB3 y/o TGFBR1 independientemente de si dichas OPACs y dichas células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichas OPACs expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de ALPL, BGLAP (proteina (gla) gamma-carboxiglutamato del hueso), IGF2, ITGA2, ITGAM, SCARBl y/o S0X1, cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichas OPACs expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de AHSG, ALPL, BGLAP, BGN, BMP3, BMP5, CD36, COL10A1, COL11A1, COL12A1, C0L2A1, COL4A3, COMP, EGF, FGF1 , FGFR2, IGF2, M P8, PHEX, RUNX2, SCARBl, S0X1, VCAM1 y/o VEGFB, cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichas OPACs expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de ALPL, BGLAP, IGF2, SCARBl y/o SOX9, independientemente de si dichas OPACs y dichas células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad especifica del método para el tratamiento del mieloma múltiple, dichas OPACs : expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más de B P4 , BMP6, CD36, CDH11, COL14A1, C0L15A1, C0L1A1, C0L3A1, C0L5A1, CSF2 , CTSK, FGF2, FGFR1, FLT1, ITGA1, MINPPl, MMP9, MSX1, PDGFA, SERPINHl, TGFB3 y TGFBR1, en donde dichas OPACs y dichas células madre mesenquimales han experimentado un número equivalente de pasos o duplicaciones de las células; o expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células del fibroblasto, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más de BMP4, B P6, CDH11, COL14A1, COL15A1, C0L1A1, COL3A1, COL5A1, FLT1, IGF1R, ITGA1, MINPPl, PDGFA, SERPINHl, SMAD3, TGFB1, TGFB2 , TGFB3, TGFBR1, TNF, TUFT1, VCAM1 y VEGFA, y en donde dichas células del fibroblasto han experimentado un número equivalente de pasos o duplicaciones de las células.

En otra modalidad especifica del método para tratar un individuo que tiene mieloma múltiple, dichas OPACs secretan uno o más de las proteínas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, Proteína 1 de enlace a TGF-beta Latente (LTBP) , NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 o TI P-2. En una modalidad más especifica, dichas OPACs secretan las proteínas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, Proteína 1 de enlace a TGF-beta Latente (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 y TIMP-2.

En otra modalidad específica del método de tratamiento, dichos uno o más síntomas de mieloma múltiple son dolor de huesos, lesiones osteocíticas (por ejemplo, visibles mediante rayos X o formación de imágenes por medio de resonancia magnética (MRI)), osteoporosis, anemia, hipercalcemia o un síntoma debido a la hipercalcemia, o falla renal. En otra modalidad específica, dicha administración causa un incremento detectable en, o disminución de la reducción de, la densidad mineral ósea o el contenido mineral óseo en dicho individuo. En otra modalidad específica, dicha administración comprende administrar al menos 1 x 108 OPACs/kg a dicho individuo. En otras modalidades específicas, dicho individuo nunca ha sido tratado por mieloma múltiple; dicho individuo ha sido tratado por mieloma múltiple y responde a la terapia sin OPACs; dicho individuo ha sido tratado por mieloma múltiple y no ha respondido a la terapia sin OPACs, pero el curso del mieloma múltiple en dicho individuo no ha progresado; o dicho individuo tiene mieloma múltiple progresivo.

En aún otro aspecto, se proporciona aquí un método para tratar defectos óseos en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición implantable o inyectable que comprende una población de OPACs, tratando por consiguiente el defecto óseo en el sujeto. En ciertas modalidades, el defecto óseo es (a) una lesión osteolitica asociada con un cáncer, (b) una fractura de hueso, (c) una columna vertebral en necesidad de fusión, (d) una fractura de falta de unión de los fragmentos de los huesos fracturados, o (e) osteoporosis . En ciertas modalidades, la lesión osteolitica se asocia con mieloma múltiple, cáncer de hueso, o cáncer metastático. En ciertas modalidades, la fractura de hueso es una fractura de falta de unión de los fragmentos de los huesos fracturados. En ciertas modalidades, una composición implantable que comprende una población de OPACs se administra al sujeto. En ciertas modalidades, la composición implantable se implanta quirúrgicamente. En ciertas modalidades, una composición inyectable que comprende una población de OPACs se administra al sujeto. En ciertas modalidades, la composición inyectable se administra quirúrgicamente a la región del defecto óseo. En ciertas modalidades, la composición inyectable se administra sistémicamente .

En aún otro aspecto, se proporciona aquí un método para tratar defectos óseos en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición implantable o inyectable que comprende una población de OPACs, en donde dichas OPACs causan o facilitan la formación de hueso o tejido óseo en el sujeto, y tratar por consiguiente el defecto óseo en el sujeto. En ciertas modalidades, el defecto óseo es (a) una lesión osteolitica asociada con un cáncer, (b) una fractura de hueso, (c) una columna vertebral en necesidad de fusión, (d) una fractura de falta de unión de los fragmentos de los huesos fracturados, o (e) osteoporosis . En ciertas modalidades, la lesión osteolitica se asocia con mieloma múltiple, cáncer de hueso, o cáncer metastático. En ciertas modalidades, la fractura de hueso es una fractura de falta de unión de los fragmentos de los huesos fracturados. En ciertas modalidades, una composición implantable que comprende una población de OPACs se administra al sujeto. En ciertas modalidades, la composición implantable se implanta quirúrgicamente. En ciertas modalidades, una composición inyectable que comprende una población de OPACs se administra al sujeto. En ciertas modalidades, la composición inyectable se administra quirúrgicamente a la región del defecto óseo. En ciertas modalidades, la composición inyectable se administra sistémicamente . 3.1 DEFINICIONES Como se utiliza aquí, "que consiste esencialmente de", en el contexto de una población de células que comprende las OPACs, significa que la población de células es, por ejemplo, al menos 95%, al ' menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o al menos 95.5% OPACs.

Como se utiliza aqui, los términos "OPAC" y OPACs" se refieren a las células descritas en la Sección 5.1, debajo.

Como se utiliza aqui, "CD200difuso", al referirse a una célula, significa que la célula exhibe intensidad de fluorescencia para CD200 en citometria de flujo que es no más que 20-30% arriba del control del isotipo. Como se utiliza aqui, una población de células es CD200dlfusa si al menos 60% de las células en la población ya sea no expresan CD200 o son CD200difusa, y la población de células, como un todo, en un ensayo de citometria de flujo, exhibe una intensidad de fluorescencia para CD200 que es no más que 40-60% arriba del control del isotipo. Se nota que una población de CD200dlfusa puede comprender células CD200+ (no difusa) .

Como se utiliza aqui, el término "SH2" se refiere a un anticuerpo que enlaza un epítopo en el marcador CD105. De esta manera, las células que se refieren como SH2+ son CD105+.

Como se utiliza aqui, los términos "SH3" y "SH " se refieren a los anticuerpos que enlazan los epitopos presentes en el marcador CD73. De esta manera, las células que se refieren como SH3+ y/o S 4+ son CD73+.

Como se utiliza aqui, el término "OPAC aislada" significa una OPAC que está sustancialmente separada de otra no OPAC del tejido, por ejemplo, el corion, a partir del cual se derivan las OPACs. Una OPAC está "aislada" si al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o al menos 99% de las no OPACs con las cuales están naturalmente asociadas las OPACs se remueven de las OPACs, por ejemplo, durante la colección y/o el cultivo de las OPACs.

Como se utiliza aquí, el término "población de células aisladas" significa una población de células que está sustancialmente separada de otras células del tejido, por ejemplo, la placenta, a partir de la cual se deriva la población de células. Una población de OPACs está "aislada" si al menos aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o al menos 99% de las células con las cuales está naturalmente asociada la población de OPACs, o células a partir de las cuales se deriva la población de OPACs, se remueven de la población de OPACs, por ejemplo, durante la colección y/o el cultivo .

Como se utiliza aquí, el término "célula madre placentaria" se refiere a una célula madre o célula progenitora que se deriva a partir de una placenta de mamífero, independientemente de la morfología, los marcadores de la superficie celular, o el número de pasos después de un cultivo primario. El término "célula madre placentaria" como se utiliza aquí, sin embargo, no se refiere a un trofoblasto. Una célula se considera una "célula madre" si la célula retiene al menos un atributo de una célula madre, por ejemplo, un perfil de expresión del gen o marcador asociado con uno o más tipos de células madre; la habilidad para duplicarse al menos 10-40 veces en el cultivo, la habilidad para diferenciarse en células de todas las tres capas del germen; la falta de características de células adultas (es decir, diferenciadas), o similares. Los términos "célula madre placentaria" y "célula madre derivada de la placenta" se pueden utilizar de forma intercambiable.

Como se utiliza aquí, una célula es "positiva" para un marcador particular cuando ese marcador es detectable. Por ejemplo, una OPAC es positiva para, por ejemplo, CD105 debido a que el CD105 es detectable en las células madre placentarias en una cantidad detectablemente mayor que el fondo (en comparación con, por ejemplo, un control del isotipo) . Una célula también es positiva para un marcador cuando ese marcador se puede utilizar para distinguir la célula de al menos otro tipo de célula, o se puede utilizar para seleccionar o aislar la célula cuando está presente o se expresa por la célula. De modo semejante, una población de células es positiva para un marcador cuando, por ejemplo, al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de las células en la población expresan el marcador.

Como se utiliza aquí, una "célula osteogénica" es una célula que es capaz de ya sea depositar hidroxiapatita, el componente principal del hueso, o diferenciarse en una célula que es capaz de depositar hidroxiapatita . Una "célula osteogénica" se contempla específicamente como que comprende una célula ordinariamente referida como un osteoblasto o un osteocito. Vea la Sección 5.1.6 debajo para condiciones ejemplares bajo las cuales una célula adherente placentaria osteogénica se puede diferenciar en una célula que puede depositar hidroxiapatita.

Como se utiliza aquí, una "matriz" se refiere a una sustancia tridimensional que se caracteriza por poros dispersos en toda la sustancia. Los poros son adecuados, por ejemplo, para el crecimiento de células, por ejemplo, células madre, OPACs, y/o células osteogénicas, dentro de la matriz. Los matrices ejemplares incluyen, pero no se limitan a, un sustrato de ß trifosfato de calcio, un sustrato de colágeno-ß fosfato de tricalcio, un sustrato de colágeno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustrato de colágeno placentario humano mineralizado, un sustrato de ácido hialurónico, y un sustrato cerámico. Preferiblemente, la matriz se puede mineralizar mediante una célula osteogénica presente en los poros de la matriz. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGXJRAS FIGURA 1: Expresión del gen de las OPACs obtenidas mediante adhesión selectiva. Eje Y: logio de la cuantificación relativa de la expresión del gen de fosfatasa alcalina. Eje X: Condiciones experimentales.

FIGURA 2: Inmunofenotipo de las OPACs obtenidas mediante adhesión selectiva con respecto a CD34, CD105 y CD200. LN: laminina. VN : vitronectina . FN: fibronectina . COL: colágeno, 10: suero bovino fetal al 10%, 20: suero bovino fetal al 20%, Ctrl: cultivo de OPACs sobre el recubrimiento de la superficie indicado durante 6 días.

FIGURA 3: Inmunofenotipo de los marcadores osteogénicos de las OPACs obtenidas mediante adhesión selectiva. LN : laminina. VN : vitronectina. FN: fibronectina . COL: colágeno, 10: suero bovino fetal al 10%, 20: suero bovino fetal al 20%, Ctrl: cultivo de OPACs sobre el recubrimiento de la superficie indicado durante 6 dias. Asteriscos: diferencia significativa en comparación al control de células madre placentarias CD10+, CD34-, CD105+ (linea horizontal) .

FIGURA 4: Inmunofenotipo de los marcadores de células madre embriónicas de las OPACs obtenidas mediante adhesión selectiva. LN : laminina. VN : vitronectina. FN: fibronectina . COL: colágeno, 10: suero bovino fetal al 10%, 20: suero bovino fetal al 20%, Ctrl: cultivo de OPACs sobre el recubrimiento de la superficie indicado durante 6 dias. Linea horizontal superior: expresión de células madre placentarias CD10+, CD34", CD105+ de SSEA-3; línea horizontal inferior: expresión de células madre placentarias CD10+, CD34", CD105+ de SSEA-4.

FIGURA 5: Actividad de la Fosfatasa Alcalina (AP) de las OPACs obtenidas mediante adhesión selectiva.

FIGURA 6: Inmunofenotipo de las OPACs expandidas en cultivo .

FIGURA 7: Actividad de la fosfatasa alcalina de las OPACs expandidas en cultivo. Basal: medio de crecimiento. OS: medio osteogénico, mi: medio 1 - FBS al 20% (Hyclone) /OÍ- E que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM. m2 : medio 2 - Medio de Crecimiento de Células Madre Mesenquimales (MSCGM; Lonza) . m3: medio 3 - FBS al 10% (FBS Calificado para Células Madre Mesenquimales, Stem Cell Technologies ) /a-MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina y L-glutamina 2 mM.

FIG. 8: Inmunofenotipo (CD200, CD105) de las OPACs después de la clasificación de las células activada magnéticamente. LN : laminina. VN: vitronectina . FN : fibronectina . mi: medio 1 - FBS al 20% (Hyclone) /a-MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 vq/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM. m3 : medio 3 - FBS al 10% (FBS Calificado para Células Madre Mesenquimales, Stem Cell Technologies ) /a-MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 g/mL de estreptomicina y L-glutamina 2 mM.

FIG. 9: Actividad de la fosfatasa alcalina de una población de CD200+ y una fracción de alimentación directa (que comprende células CD200+) después de la clasificación de las células activada magnéticamente. LN : laminina. VN: vitronectina . FN: fibronectina . ml : medio 1 - FBS al 20% (Hyclone) / -MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM. m3 : medio 3 -FBS al 10% (FBS Calificado para Células Madre Mesenquimales , Stem Cell Technologies ) /a-MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 g/mL de estreptomicina y L-glutamina 2 mM. Basal: Expresión de AP en medio de crecimiento. Inducida: Expresión de AP en medio osteogénico.

FIG. 10: Actividad de la unidad de formación de colonia -fosfatasa alcalina (CFU-AP) de poblaciones de células madre derivadas del corion después de la clasificación de las células activada magnéticamente. LN: laminina. VN: vitronectina. F : fibronectina . ml : medio 1 - FBS al 20% (Hyclone) /a-MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM. m3 : medio 3 -FBS al 10% (FBS Calificado para Células Madre Mesenquimales, Stem Cell Technologies ) /a-MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 µg/ de estreptomicina y L-glutamina 2 mM. La condición de CD200+ es sustancialmente cero para la expresión de AP.

FIG. 11: Formación de la colonia total de fracciones de OPACs después de la clasificación de las células activada magnéticamente. FN: fibronectina . ml : medio 1 - FBS al 20% (Hyclone) /a-MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 g/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM. m3 : medio 3 -FBS al 10% (FBS Calificado para Células Madre Mesenquimales , Stem Cell Technologies) /a-MEM que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 yg/mL de estreptomicina y L-glutamina 2 mM. PDAC: Células multipotentes placentarias adherentes al plástico del cultivo de tejidos CD10+, CD34", CD105+, CD200+.

FIG. 12: Secreción de osteoprotegerina inducible mediante las OPACs después de la estimulación osteogénica.

FIG. 13: Lista de proteínas secretadas identificadas en las OPACs, PDACs™, MSCs, y fibroblastos utilizando el arreglo de anticuerpos basado en la etiqueta de Biotina RayBio® de proteína RayBiotech 507. La expresión de la proteína se clasifica como + (baja) , ++ (media) , y +++ (alta) en comparación a un control positivo interno. Se indica la implicación de la proteína en la formación de hueso († ) o en la resorción ósea (i) .

FIGURA 14: Cantidad promedio de formación de tejido óseo por grupo de tratamiento; registrada como 0-4, con 4 como la cantidad más grande.

FIGURA 15: Densidad mineral ósea del sitio del defecto craneal por grupo de tratamiento.

FIGURA 16: Distribución de animales con finalización del defecto > 50% según se determina mediante la medición del defecto residual a partir de exploraciones con rayos X al momento del sacrificio.

FIGURA 17: Efectos de las OPACs y las SCs sobre la diferenciación osteoclástica . OC: osteoclasto. control: osteoclastos sin OPACs o MSCs.

FIGURA 18: Efecto de las OPACs y las MSCs sobre la proliferación de células de mieloma múltiple. OB: osteoblastos o células similares a osteoblastos obtenidas a partir de las MSCs o las PDACs bajo condiciones osteogénicas . MTT OD: densidad óptica en el ensayo MTT; valores más altos indican un mayor grado de supervivencia de las células de mieloma múltiple. Con MM: Células de mieloma múltiple de 27 pacientes humanos de mieloma múltiple.

FIGURA 19: Efecto de las OPACs sobre la densidad mineral ósea en ratones SCID-rab mielomatosos primarios. Control: sólo PBS. Pre-Rx: densidad mineral ósea (BMD) antes de la administración de las OPACs. Final: Densidad mineral ósea después de 8-16 semanas post-inyección . Los cambios en la densidad mineral ósea (BMD) de los huesos implantados se determinaron utilizando un PIXImus DEXA (GE Medical Systems LUNAR, Madison, WI) .

FIGURA 20: Efecto de las OPACs sobre los niveles de inmunoglobulina humana (hlg) en ratones mielomatosos primarios. Ig: Inmunoglobulina humana en suero de ratón.

FIGURA 21: Efecto de las OPACs sobre la masa ósea en ratones SCID-rab mielomatosos primarios. BMD: Densidad mineral ósea. BMC: contenido mineral ósea. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA 5.1 CÉLULAS ADHERENTES PLACENTARIAS OSTEOGÉNICAS (OPACS) 5.1.1 Características 5.1.1.1 Características Físicas y Morfológicas Las células adherentes placentarias osteogénicas (OPACs) aquí provistas, cuando se cultivan en cultivos primarios o en cultivo celular, se adhieren al sustrato del cultivo de tejidos, por ejemplo, la superficie del recipiente del cultivo de tejidos (por ejemplo, el plástico del cultivo de tejidos). Las OPACs en el cultivo asumen una apariencia generalmente estrellada, fibroblastoidea, con un número de procesos citoplásmicos extendiéndose desde el cuerpo celular central. Las OPACs, sin embargo, son morfológicamente distinguibles de los fibroblastos cultivados bajo las mismas condiciones, ya que las OPACs generalmente exhiben un mayor número de tales procesos que los fibroblastos. Morfológicamente, las OPACs también son distinguibles de las células madre hematopoyéticas, las cuales generalmente asumen una morfología más redondeada, o adoquinada, en el cultivo. 5.1.1.2 Marcadores de la Superficie Celular, Moleculares y Genéticos En una modalidad, se proporciona aquí una OPAC aislada (célula adherente placentaria osteogénica) , es decir, una célula aislada que es adherente, osteogénica, y aislada a partir del corion. En una modalidad, las OPACs no se aislan a partir de la falda coriónica (laeve) . Las OPACs aquí provistas, y las poblaciones de OPACs, expresan una pluralidad de marcadores celulares y genéticos que se pueden utilizar para identificar y/o aislar las OPACs, o poblaciones de células que comprenden las OPACs. Las OPACs, y las poblaciones de células que comprenden las OPACs aquí provistas, incluyen las OPACs y las poblaciones de células que contienen las OPACs obtenidas directamente del corion, por ejemplo, los cultivos primarios. Las poblaciones de OPACs también incluyen poblaciones de, por ejemplo, dos o más, OPACs en cultivo, OPACs en suspensión unicelular, y una población en un recipiente, por ejemplo, una bolsa. En una modalidad específica, una población de OPACs es una pluralidad de OPACs en cultivo celular. Las OPACs no son trofoblastos , citotrofoblastos , células madre embriónicas, o células germinales embriónicas ya que aquellas células son conocidas y comprendidas en el arte Se proporciona aquí una OPAC aislada, donde la OPAC es CD200" o CD200difusa. En una modalidad específica, una OPAC es osteogénica. En una modalidad específica, una OPAC es positiva para la secreción de osteoprotegerina (OPG; vea, por ejemplo, el Acceso al Banco de Genes No. AAB53709) . La osteoprotegerina es un receptor señuelo secretado por los osteoblastos que específicamente se enlaza al factor de diferenciación de los osteoclastos e inhibe la maduración de los osteoclastos . De esta manera, las OPACs promueven la formación ósea y reducen la pérdida ósea mediada por los osteoclastos. En otra modalidad especifica, una OPAC es negativa para la expresión del RANKL (Activador del Receptor del Factor Nuclear ?) . El RANKL es una proteina que activa los osteoclastos, los cuales están involucrados en la resorción ósea. De esta manera, las OPACs no promueven la. resorción ósea. En otra modalidad especifica, una OPAC es CD200" o CD200difusa, y CD105+. En otra modalidad especifica, una OPAC es negativa para la expresión de OÍ actina de músculo liso, por ejemplo, según se determina mediante tinción por inmunofluorescencia . Se nota que otras poblaciones de células a partir de la placenta, por ejemplo, las células descritas en la Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2005/0058631, son positivas para la o¡ actina de músculo liso. En otra modalidad especifica, una OPAC es uno o más de negativa para la expresión de a actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, o positiva para la expresión de NG2 (proteoglicano de condroitin sulfato celular neuro-glial 2) . En otra modalidad especifica, una OPAC es negativa para la expresión de o¡ actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, y positiva para la secreción de osteoprotegerina . En otra modalidad especifica, una OPAC exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En una modalidad más especifica, una OPAC es CD200" o CD200dlfusa, y CD105+, y es uno o más de negativa para la expresión de a actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina, o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En otra modalidad más especifica, una OPAC es CD200" o CD200difusa, y CD105+, y también negativa para la expresión de OÍ actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina, y exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. La falta de expresión, o la baja expresión, de CD200 por las OPACs distingue a las OPACs de otras células multipotentes derivadas de la placenta adherentes al plástico del cultivo de tejidos, por ejemplo, las PDACs™, por ejemplo, las células multipotentes placentarias descritas en Edinger et al., Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana No. 2007/0275362.

En otra modalidad especifica, una OPAC es SSEA3+ o SSEA4+. En una modalidad más especifica, una OPAC es SSEA3+ y SSEA4+. En otra modalidad más especifica, una OPAC es CD200" o CD200difusa, y CD105+, SSEA3+, y también negativa para la expresión de a actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina, y/o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En otra modalidad más especifica, una OPAC es CD200" o CD200difusa, y CD105+, SSEA4+, y también es negativa para la expresión de a actina de músculo liso, negativa para la expresión del RAN L, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En una modalidad más especifica, una OPAC es CD200" o CD200difusa, CD105+, SSEA3+, SSEA4+, y también es negativa para la expresión de OÍ actina de músculo ' liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. La expresión de SSEA3 y SSEA4 por las OPACs sirve para distinguir las OPACs de otras células derivadas de la placenta, por ejemplo, las células madre placentarias adherente al plástico del cultivo de tejidos, descritas en Hariri, Patente Norteamericana No. 7, 68, 276.

En ciertas modalidades, una OPAC facilita la formación de una matriz mineralizada en una población de células placentarias cuando dicha población se cultiva bajo condiciones que permiten la formación de una matriz mineralizada .

También se proporcionan aqui poblaciones de células que comprenden las OPACs, en donde la población de células es CD200" o CD200difusa. De esta manera, en una modalidad, se proporciona aquí una población aislada de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células no se aisla a partir de la falda coriónica (laeve) , y en donde dicha población de células es CD200" o CD200difusa. En una modalidad específica, la población de células consiste esencialmente de OPACs. En una modalidad específica, dicha población de células es osteogénica. En otra modalidad específica, dicha población de células es CD200" y CD105+ según se detecta mediante citometría de flujo. En otra modalidad específica, dicha población de células es CD200difusa y CD105+ según se detecta mediante citometría de flujo. En otra modalidad específica, dicha población de células es negativa para la expresión de OÍ actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, y/o positiva para la secreción de osteoprotegerina . En otra modalidad, dicha población de células es negativa para la expresión de actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, y positiva para la secreción de osteoprotegerina. En otra modalidad específica, dicha población de células exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En una modalidad más específica, dicha población es CD200", CD105+ o CD200difusa, CD105+ y también es uno o más de negativa para la expresión de a actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En una modalidad más especifica, dicha población de células es CD200", CD105+ o CD200difusa, CD105+; es negativa para la expresión de a actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina; y exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible.

En otra modalidad especifica, dicha población de células es SSEA34 o SSEA4+. En aún otra modalidad, dicha población de células es SSEA3+ y SSEA4+. En aún otra modalidad, dicha población de células es CD200" y/o CD200difusa, CD105+, CD105+, SSEA3+, y también negativa para la expresión de o¡ actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En otra modalidad más especifica, dicha población de células es CD200" o CD200difusa, es CD105+ y SSEA4 +, y también es negativa para la expresión de a actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible. En otra modalidad más especifica, dicha población de células es CD200" o CD200difusa; es CD105+, SSEA3+, SSEA4+ , negativa para la expresión de actina de músculo liso, negativa para la expresión del RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de osteoprotegerina, y/o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible .

En modalidades especificas, al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las células en la población son CD200".

Adicionalmente se proporciona aquí una población aislada de OPACs, en donde dicha población se produce aislando tejido coriónico de una placenta, en donde dicho tejido coriónico no es tejido de la falda coriónica (laeve) ; digiriendo el tejido coriónico aislado con una enzima que rompe el tejido para obtener una población de células del corion que comprende las OPACs; y aislando dichas OPACs de dichas células del corion. En una modalidad especifica, la enzima que rompe el tejido es tripsina, dispasa o colagenasa. En varias modalidades, las células madre coriónicas, contenidas dentro de una población de células obtenida a partir de la digestión de tejido coriónico, son al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99.5% de dicha población de células coriónicas.

Las poblaciones aisladas de células que comprenden las OPACs, por ejemplo, las poblaciones de OPACs, son distinguibles de otras células, por ejemplo, las células adherentes derivadas de la placenta CD200+, no difusa, (referidas aqui como PDAC™s), como se describe, por ejemplo, en las Patentes Norteamericanas Nos. 7,468,276 y 7,255,879, y en la Publicación de Patente Norteamericana No. 2007/02753621, las divulgaciones de las cuales se incorporan por este medio por referencia en sus totalidades, por ejemplo, como se muestra mediante el trazado del perfil del gen. Las PDACs™ se identifican, por ejemplo, como células CD10+, CD34", CD105+, CD200+, no difusa, de placenta o cordón umbilical, las cuales son adherentes a las superficies del cultivo de tejidos, por ejemplo, el plástico del cultivo de tejidos. Las PDACs™ se pueden caracterizar adicionalmente como siendo células CD10+, CD34", CD45", CD90+, CD105+, y CD200+ de placenta o cordón umbilical, las cuales son adherentes a las superficies del cultivo de tejidos, por ejemplo, el plástico del cultivo de tejidos. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

Las OPACs aquí descritas se pueden distinguir de las PDACs™ con base en la expresión de uno o más genes, la expresión de los cuales, o el grado de expresión de los cuales, es específico para las OPACs en comparación a las PDACs. En una modalidad, por ejemplo, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más alto (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más alto) que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, que no son trofoblastos o citotrofoblastos (PDACs™), en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BMP6 (proteína morfogenética ósea 6; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_001718), CDH11 (caderina 11, tipo 2, caderina de osteoblasto; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_001797) , COL10A1 (colágeno, tipo X, alfa 1; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. N _000 93) , C0L14A1 (colágeno, tipo XIV, alfa 1; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_0211 10), COL15A1 (colágeno, tipo XV, alfa 1; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_001855) , COL1A1 (colágeno, tipo I, alfa 1; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_000088), COL1A2 (colágeno, tipo I, alfa 2; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. N _000089) , C0L3A1 (colágeno, tipo III, alfa 1; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_000090), COL4A3 (colágeno, tipo IV, alfa 3; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_000091) , COL5A1 (colágeno, tipo V, alfa 1; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_000093) , CSF3 (factor 3 de estimulación de la colonia (granulocito) ; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_000759) , CTSK (catepsina ; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_000396) , IGF1R (receptor del factor 1 de crecimiento similar a la insulina; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. N _000875) , MINPPl (múltiple inositol polifosfato histidina fosfatasa 1; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_004897) , M P2 (metaloproteasa de matriz 2 (también conocida como gelatinasa A, gelatinasa de 72 kDa, colagenasa tipo IV de 72 kDa) ; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_004530), MMP9 (metalopeptidasa de matriz 9 (también conocida como gelatinasa B, gelatinasa de 92kDa, colagenasa tipo IV de 92kDa) ; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_004994), MSX1 (caja horneo de msh 1; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. N _002448) , SMAD1 (miembro 1 de la familia SMAD vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_001003688 ) , S AD3 (miembro 3 de la familia SMAD; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_005902 ) , TGFB3 (factor de crecimiento transformante, beta 3; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_003239) , TGFBR1 (factor de crecimiento transformante, receptor beta 1; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_004612) y VEGFB (factor B de crecimiento endotelial vascular; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. XM_001128909) , cuando las OPACs y las células madre placentarias se hacen crecer bajo condiciones equivalentes, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más alto (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más alto) que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, que no son trofoblastos o citotrofoblastos , en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BMP3 (proteina morfogenética ósea 3; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. N _001201 ) , CDH11, COL10A1, C0L14A1, C0L15A1, DMP1 ( fosfoproteína ácida de la matriz de dentina 1; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NG_008988), DSPP ( sialofosfoproteína de dentina; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. N _014208 ) , ENAM (enamelina; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_031889), FGFR2 (receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_000141), M P10 (metaloproteasa de matriz 10 (estromelisina 2); vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_002425) , TGFB3, y/o TGFBR1 cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad específica, dicho medio de crecimiento es a???/Suero Bovino Fetal al 20% que contiene 100 unidades/mL de penicilina, 100 g/mL de estreptomicina y L-glutamina 2 mM. En una modalidad específica, la población de células consiste esencialmente de OPACs .

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células, por ejemplo, las OPACs, expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más alto) que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, que no son trofoblastos o citotrofoblastos , en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de AMBN (ameloblastina (proteina de matriz de esmalte); vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_031889) , BMP2 (proteina morfogenética ósea 2; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_001200) , CALCR (receptor de calcitonina ; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_001742), CDH11, C0L11A1 (colágeno tipo XI, alfa 1; NM_001854 ) , C0L14A1, COL15A1, COL2A1 (colágeno ,tipo II, alfa 1; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_001844), CSF2 (factor 2 de estimulación de la colonia; NM_000758), CSF3, DMPl, DSPP, ' ENAM, FGF3, GDF10 (factor 10 de diferenciación de crecimiento; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_004962) , IGFl (factor 1 de crecimiento similar a la insulina; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_000618), ITGA1 (integrina, alfa 1 (CD49) ; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_181501), ITGA2 (integrina, alfa 2 (CD49B); vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. N _002203) , MMP10, MMP8 (metaloproteasa de matriz 8 (colagenasa de neutrófilo) ; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. N _002424 ) , P9, PDGFA (factor A de crecimiento derivado de plaquetas; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. XM_001126441) , SMAD1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2 (receptor 2 del factor de crecimiento transformante beta; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_001024847) cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio osteogénico, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad especifica, dicho medio osteogénico es aMEM/Suero Bovino Fetal al 20% que contiene 100 unidades/mL de penicilina, ¦ 100 µg/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, 50 g/mL de ácido ascórbico, y dexametasona 100 nM. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células, por ejemplo, las OPACs, expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más alto) que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, que no son trofoblastos o citotrofoblastos , en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de CDH11, COL14A1, COL15A1, DMP1, DSPP, ENAM, MMP10, TGFB3 y/o TGFBRl independientemente de si dichas OPACs y dichas células madre placenterías se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad específica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células, por ejemplo, las OPACs, expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más bajo) que un número equivalente de células madre placenterías adherentes CD200+, no difusa, que no son trofoblastos o citotrofoblastos, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de AHSG (alfa-2-HS-glicoproteína; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_001622 ) , ALPL (fosfatasa alcalina del hígado/hueso/riñon; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_000478 ) , EGF (factor de crecimiento epidérmico; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. N _001963) , FLTl (tirosina cinasa 1 relacionada a fms (factor de crecimiento endotelial vascular/receptor del factor de permeabilidad vascular) ; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_002019) , IGF2, ITGA2, ITGAM (integrina, alfa M (subunidad del receptor 3 del componente 3 del complemento) ; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_000632), SCARB1 (receptor del depurador clase B, miembro 1; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_005505), S0X9 (SRY (región Y determinante del sexo) -cuadro 9; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_000346), TNF, T IST1 (homólogo 1 de Twist; anteriormente blefarofimosis , epicanto inverso y ptosis 3, acrocefalosindactilia 3; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. N _00047 ) , VCAM1 (molécula 1 de adhesión celular vascular; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_001078) y/o VDR cuando dichas OPACs y dichas células madre placenterías se cultivan en medio de crecimiento, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad específica, dicho medio de crecimiento es medio osteogénico es aMEM/Suero Bovino Fetal al 20% que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina y L-glutamina 2 mM. En una modalidad específica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células, por ejemplo, las OPACs, expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más bajo) que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, que no son trofoblastos o citotrofoblastos , en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BGN, COL11A1, COMP (proteína oligomérica de la matriz del cartílago) , FGF1 y/o VCAM1 cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio osteogénico, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad especifica, dicho medio osteogénico es a?? /Suero Bovino Fetal al 20% que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, 50 yg/mL de ácido ascórbico, y dexametasona 100 nM. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células, por ejemplo, las OPACs, expresan VCAM1 en un nivel detectablemente más bajo (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más bajo) que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, que no son trofoblastos o citotrofoblastos , independientemente de si dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

El trazado de perfil del gen también muestra que las poblaciones aisladas de células que comprenden las OPACs, por ejemplo, las poblaciones de OPACs, son distinguibles de las células madre mesenquimales , por ejemplo, las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea. En una modalidad, por ejemplo, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células, por ejemplo, las OPACs, expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más alto) que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BMP4, BMP6, CD36, CDH11, C0L14A1, C0L15A1, C0L1A1, C0L3A1, C0L5A1, CSF2, CTSK, FGF2, FGFRl, FLT1, ITGA1, MINPPl, MMP9, MSXl, PDGFA, SERPINH1, TGFB3 y TGFBR1, cuando las OPACs y las células madre se hacen crecer bajo condiciones equivalentes, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células, por ejemplo, las OPACs, expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más alto) que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BMP4, CALCR, CD36, CDH11, COL12A1, COL14A1, COL15A1, COL3A1, C0L5A1, DMP1, DSPP, FLT1, MSXl, PDGFA, TGFB3, TGFBRl y/o TUFTl, cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad especifica, dicho medio de crecimiento es medio osteogénico es a???/Suero Bovino Fetal al 20% que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 g/mL de estreptomicina y L-glutamina 2 mM. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células, por ejemplo, las OPACs, expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más alto) que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de AMBN, CALCR, COL14A1, COL15A1, CSF3, DMP1, DSPP, ITGA1, ITGA2, M P10, MMP9, MSX1, PDGFA, TGFB1 , TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2, cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio osteogénico, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad especifica, dicho medio osteogénico es ???/Suero Bovino Fetal al 20% que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 µ?/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, 50 µg/mL de ácido ascórbico, y dexametasona 100 nM. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células, por ejemplo, las OPACs, expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más alto (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más alto) que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de CALCR, C0L14A1, C0L15A1, DMP1, DSPP, MSX1, PDGFA, TGFB3 y/o TGFBR1 independientemente de si dichas OPACs y dichas células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En otra modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células, por ejemplo, las OPACs, expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más bajo) que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de ALPL, BGLAP, IGF2, ITGA2, ITGAM, SCARB1 y/o S0X1, cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad especifica, dicho medio de crecimiento es medio osteogénico es a???/Suero Bovino Fetal al 20% que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 g/mL de estreptomicina y L-glutamina 2 mM. En otra modalidad, se proporciona aqui una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más bajo) que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de AHSG, ALPL, BGLAP, BGN, B P3, BMP5, CD36, COL10A1, COL11A1, COL12A1, COL2A1, COL4A3, COMP, EGF, FGF1, FGFR2, IGF2, MMP8, PHEX, RUNX2 (factor de transcripción 2 relacionado con runt; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_001015051 ) , SCARB1, SOX1, VCAM1 y/o VEGFB, cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio osteogénico, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad especifica, dicho medio osteogénico es oíMEM/Suero Bovino Fetal al 20% que comprende 100 unidades/mL de penicilina, 100 g/mL de estreptomicina, L-glutamina 2 mM, 50 g/mL de ácido ascórbico, y dexametasona 100 nM. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células, por ejemplo, las OPACs, expresan uno o más genes en un nivel detectablemente más bajo (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más bajo) que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de ALPL, BGLAP, IGF2, SCARB1 y/o S0X9, independientemente de si dichas OPACs y dichas células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En otra modalidad específica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células, por ejemplo, las OPACs, expresan, uno o más genes en un nivel detectablemente más alto (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más alto) que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, y un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de C0L14A1, COL14A2, DMP, DSPP, TGFB3 y/o TGFBR1, independientemente de si dichas OPACs, células madre placentarias, y células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En otra modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs .

El trazado del perfil del gen también confirma que las poblaciones aisladas de células que comprenden las OPACs, por ejemplo, las poblaciones de OPACs, son distinguibles de las células de los fibroblastos dérmicos humanos. En una modalidad, por ejemplo, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde dicha población de células expresa uno o más genes en un nivel detectablemente más alto (por ejemplo, al menos un nivel dos veces más alto) que un número equivalente de células de los fibroblastos dérmicos, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BMP4, BMP6, CDHll, C0L14A1, C0L15A1, C0L1A1, C0L3A1, C0L5A1, FLT1 , IGF1R, ITGAl, MINPP1, PDGFA, SERPINH1, SMAD3, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBRl, TNF, TUFT1, VCA l y VEGFA, en donde la expresión de estos genes es mayor en las OPACs que en las células de los fibroblastos, cuando las OPACs y los fibroblastos se hacen crecer bajo condiciones equivalentes, por ejemplo, según se evalúa mediante los valores Ct a partir de la PCR cuantitativa en tiempo real. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs .

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde un incremento en la expresión en dicha población de células, por ejemplo, en las OPACs, de uno o más genes en medio osteogénico, según se compara al medio de crecimiento, es al menos diez veces mayor que un incremento en dichos uno o más de dichos genes en medio osteogénico, según se compara al medio de crecimiento, en un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, en donde dichas células madre placentarias adherentes CD200+ no son trofoblastos o citotrofoblastos , y en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BMP2, CSF3, ITGA2, MP9, MMP10, y/o TGFB2. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs .

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde un incremento en la expresión en dicha población de células, por ejemplo, en las OPACs, de 'uno o más genes en medio osteogénico, según se compara al medio de crecimiento, es al menos diez veces menor que un incremento en dichos uno o más de dichos genes en medio osteogénico, según se compara al medio de crecimiento, en un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, en donde dichas células madre placentarias adherentes CD200+, no difusa, no son trofoblastos o citotrofoblastos, y en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de C0L1A1, C0L11A1, COL4A3, C0L5A1, COMP (proteína oligomérica de la matriz del cartílago; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_000095) , CTSK, FGF1 (factor de crecimiento de fibroblastos 1; vea, por ejemplo, Acceso al Banco de Genes No. NM_000800), y/o FGFR2. En una modalidad específica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde un incremento en la expresión en dicha población de células, por ejemplo, en las OPACs, de uno o más genes en medio osteogénico, según se compara al medio de crecimiento, es al menos diez veces mayor que un incremento en dichos uno o más de dichos genes en medio osteogénico, según se compara al medio de crecimiento, en un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, y en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de CSF3, IGF2, ITGA2, ITGA3, MMP9, MMP10, y/o TGFB2. En una modalidad específica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde un incremento en la expresión en dicha población de células, por ejemplo, en las OPACs, de uno o más genes en medio osteogénico, según se compara al medio de crecimiento, es al menos diez veces menor que un incremento en dichos uno o más de dichos genes en medio osteogénico, según se compara al medio de crecimiento, en un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, y en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de ALPL (fosfatasa alcalina, hígado/hueso/riñón) , CD36, COL10A1, C0L11A1, C0L12A1, C0L1A1, COL4A3, COMP, CTSK, FGF1, y/o FGFR2. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde un incremento en la expresión en dicha población de células, por ejemplo, en las OPACs, de uno o más genes en medio osteogénico, según se compara al medio de crecimiento, es al menos diez veces mayor que un incremento en dichos uno o más de dichos genes en medio osteogénico, según se compara al medio de crecimiento, en un número equivalente de células del fibroblasto, y en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BMP2, CSF2, CSF3, IGF1, ITGA2, MMP9 y/o M P10. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, se proporciona aquí una población de células que comprende las OPACs, en donde un incremento en la expresión en dicha población de células, por ejemplo, en las OPACs, de uno o más genes en medio osteogénico, según se compara al medio de crecimiento, es al menos diez veces menor que un incremento en dichos uno o más de dichos genes en medio psteogénico, según se compara al medio de crecimiento, en un número equivalente de células del fibroblasto, y en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de BMP4, C0L12A1, COMP, FGF1, y/o MMP8. En una modalidad especifica, la población de células consiste esencialmente de OPACs.

En otra modalidad, aquí se proporciona una población de células que comprende OPACs, por ejemplo, una población de OPACs, en donde un gen que codifica la metalopeptidasa de matriz 9 (MMP9) se induce en dichas OPACs en medio osteogénico, cuando se compara con la expresión de la MMP9 en el medio de cultivo, al menos 2, 3, 4 o 5 ordenes de magnitud mayor de lo que dicha MMP9 se induce en dicho medio osteogénico, cuando se compara con la expresión de la MP9 en dicho medio de cultivo, por ejemplo, cuando se evalúa por los valores de Ct de PCR cuantitativa en tiempo real.

En otra modalidad, aquí se proporciona una población de células que comprenden OPACs, por ejemplo, una población de OPACs, en donde dicha población comprende uno o más genes al menos diez veces mayor que un número equivalente de células madre placentarias , no difusas, CD200+, adherentes, en donde dichos uno o más genes son CHRD (cordina; véase, por ejemplo, Acceso al GenBank No. NM_003741), GDF7 (factor de diferenciación del crecimiento 7; véase, por ejemplo, Acceso al GenBank no. NM_182828), IGFBP3 (proteina de enlace del factor de crecimiento similar a insulina 3; véase, por ejemplo, Acceso al GenBank No. N _000598) y/o INHA (inhibina alfa; véase, por ejemplo, Acceso al GenBank No. NM_002191) . En otra modalidad, aqui se proporciona una población de células que comprenden OPACs, por ejemplo, una población de OPACs, en donde dicha población expresa TGFB2 a un nivel al menos diez veces menor que un número equivalente de células madre placentarias (no difusas), CD200+, adherentes . En otras modalidades, aqui se proporciona una población de células que comprende OPACs, por ejemplo, una población de OPACs, en donde las OPACs expresan a-actina de músculo liso, detectable por tinción inmunofluorescente, y en donde dichas células expresan un gen de fibronectina 1 (FN1) y/o el gen de TGF- 2 (TGFB2) aproximadamente al mismo nivel que, o a un nivel aumentado en comparación con un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de médula ósea.

El nivel de expresión de estos genes puede ser usado para confirmar la identidad de una población de OPACs, para identificar una población de células que comprenden al menos, una pluralidad de OPACs, o las similares. La población de OPACs puede ser clónica, por ejemplo, una población de OPACs expandidas a partir de un tipo único de OPACs, o una población mezclada de OPACs, por ejemplo, una población de células que comprende solamente OPACs que se expanden a partir de varios tipos de OPACs, o una población de células que comprende OPACs y al menos otro tipo de células.

El nivel de expresión de estos genes puede ser usado para seleccionar poblaciones de OPACs. Por ejemplo, una población de células, por ejemplo, células expandidas clónicamente, puede ser seleccionada si la expresión de uno o más de estos genes es significativamente mayor en una muestra de la población de células que en una población equivalente de células madre mesenquimales . Tal selección puede ser de una población de una pluralidad de células madre placentarias o poblaciones de células madre coriónicas, de entre una pluralidad de poblaciones de célula, la identidad de las cuales no se conoce, etc.

Las OPACs, y las poblaciones de células que comprenden las OPACs, pueden ser seleccionadas sobre la base del nivel de expresión de uno o más de tales genes en comparación con el nivel de expresión en dichos uno o más genes en un control de células madre mesenquimales. En una modalidad, el nivel de expresión de dichos uno o más genes en una muestra que comprende un número equivalente de células madre mesenquimales se usa como un control. En otra modalidad, el control, para las OPACs evaluadas bajo ciertas condiciones, en un valor numérico que representa el nivel de expresión de dichos uno o más genes en las células madre mesenquimales bajo dichas condiciones.

Las OPCAs y las poblaciones de células que comprenden las OPCAs, también pueden ser seleccionadas sobre la base de la expresión de una o más proteínas segregadas, en comparación con el nivel de expresión en un control, por ejemplo, células madre placentarias , células madre mesenquimales o fibroblastos. En una modalidad, las OPACs pueden ser distinguidas de las células madre placentarias, las células madre mesenquimales o los fibroblastos sobre la base de la secreción de una o más de decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2R alfa, IL-17RV, IL-27 proteína de enlace a TGF beta 1 (LTBP) , NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 y TIMP-2, las cuales son únicas para las OPACs en compararon con las células madre placentarias (no difusas), CD200+, adherentes, las células madre mesenquimales o los fibroblastos. En otra modalidad, las proteínas segregadas por las OPACs pero no por las PDACs™ incluyen una o más del Factor Tisular, proteína similar a Folistatina 1, IGF-IIR, sFRP-4 y TSG-6.

Las poblaciones aisladas de OPACs descritas anteriormente, y las poblaciones de OPACs en general, pueden comprender aproximadamente, al menos, o más de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 105, 5 x 106, 1 x 107' 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011, o más OPACs. 5.1.1.3 Crecimiento en Cultivo El crecimiento de las OPACs, como para cualquier tipo de células de mamífero, depende en parte del medio particular seleccionado para el crecimiento. Bajo las condiciones óptimas, las OPACs típicamente se duplican en 1-3 días.

Durante el cultivo, las OPACs proporcionadas aqui se adhieren a un sustrajo en el cultivo, por ejemplo, la superficie de un recipiente de cultivo de tejidos (por ejemplo, el plástico de una caja de cultivo de tejidos, plástico revestido con fibronectina, y los similares) y forman una monocapa. 5.1.2 MÉTODOS PARA OBTENER OPACs 5.1.2.1 Composición de Recolección de Células Aquí se proporcionan además métodos para recolectar y aislar OPACs. En general las OPACs se obtienen del corion usando una solución aceptable fisiológicamente, por ejemplo, una composición de recolección de células. Una composición de recolección de células se describe en detalle en la Publicación de la solicitud Norteamericana No. 2007-0190042, la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

La composición de recolección de células puede comprender una solución aceptable fisiológicamente adecuada para la recolección y/o el cultivo de células, por ejemplo, OPACs, por ejemplo, una solución salina (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato, solución de Kreb, solución de Kreb modificada, solución de Tagle, NaCl al 0.9%, etc.) un medio de cultivo (por ejemplo, D EM, H.DMEM, etc.) y las similares.

La composición de recolección de células puede comprender uno o más componentes que tienden a preservar las OPACs, es decir, evitar que las OPAC mueran, o retarda la muerte de las OPACs, reduce el número de OPACs que mueren en una población de células, o los similares, desde el momento de la recolección al momento del cultivo. Tales componentes pueden ser por ejemplo, un inhibidor de apoptosis (por ejemplo, un inhibidor de caspasa y un inhibidor de JNK) ; un vasodilatador (por ejemplo, sulfato de magnesio, un fármaco antihipertensivo, péptido natriurético atrial (ANP) , adrenocorticotropina, hormona de liberación de corticotropina, nitroprusiato de sodio, adenosin trifosfato, adenosina, indometazona o sulfato de magnesio, un inhibidor de fosfodiesterasa , etc.); un inhibidor de necrosis (por ejemplo, 2- ( lH-Indol-3-il ) -3-pentilamino-maleimida, pirrolidina, ditiocarbamato, o clonazepam) ; un inhibidor de TNF-OÍ; y/o un perfluorocarbono que transporta oxigeno (por ejemplo, bromuro de perfluorooctilo . Bromuro de perfluorodecilo, etc.).

La composición de recolección de células puede comprender una o más enzimas de degradación de tejidos, por ejemplo, una metaloproteasa, una serina proteasa, una proteasa neutra, una ARNasa, o una ADNasa, o las similares. Tales enzimas incluyen, pero no se limitan a, colagenasas (por ejemplo, colagenasa I, II, III o IV, una colagenasa de Clostridium histolyticum, etc.); dispasa, termolisina, elastasa, tripsina, LIBERASE, hialuronidasa, y las similares.

La composición de recolección de células puede comprenden una cantidad bacteriocidamente o bacterioestáticamente de un antibiótico. En ciertas modalidades no limitantes, el antibiótico se un macrólido (por ejemplo, tobramicina) , una cefalosporina (por ejemplo, cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, ceflacor, cefixima o cefadroxil) , una claritromicina, una eritromicina, una penicilina (por ejemplo, penicilina V) o una quinolona (por ejemplo, ofloxacina, ciprofloxacina o norfloxacina ) , una tetraciclina, una estreptomicina, etc. en una modalidad particular, el antibiótico es activo contra bacterias Gram(+) y/o Gram(-), por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, y las similares.

La composición de recolección de células también puede comprender uno o más de los siguientes compuestos: adenosina (aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM) ; D-glucosa (aproximadamente 20 M a aproximadamente 100 mM) , iones de magnesio (aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM) ; macromoléculas de mayor peso molecular que 20,000 daltons, en una modalidad, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para mantenerla integridad endotelial y la viabilidad celular (por ejemplo, un coloide sintético o de formación natural, un polisacárido tal como dextrano o un polietilenglicol presente a aproximadamente 25 g/1 a aproximadamente 100 g/1, o aproximadamente 40 g/1 aproximadamente 60 g/1) ; un antioxidante (por ejemplo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutationa, vitamina C o vitamina E presente a aproximadamente de 15 µ? a aproximadamente 100 µ?) ; un agente reductor (por ejemplo, N-acetilcisteina presente aproximadamente 0.1 mM a aproximadamente 5 mM) ; un agente que evita la entrada de calcio en las células (por ejemplo, verapramilo, presente a aproximadamente 2 mM a aproximadamente 25 µ?) ; nitroglicerina (por ejemplo, aproximadamente 0.05 g/L a aproximadamente 0.2 g/L) ; un anticoagulante, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para ayudar a prevenir la coagulación de la sangre residual (por ejemplo heparina o hirudina presente a una concentración de aproximadamente 1000 unidades/1 a aproximadamente 100,000 unidades/1); o un compuesto que contiene amilorida (por ejemplo, amilorida, etil isopropil amilorida, hexametilenamilorida, dimetilamilorida o isobutilamilorida, presente a aproximadamente 1.0 µ? a aproximadamente µ?) . 5.1.2.2 Recolección y Manejo de la Placenta En general, las placentas humanas se recuperan poco después de su expulsión después del nacimiento. En una modalidad preferida, la placenta se recupera de un paciente después del consentimiento informado y después que se toma un historial médico completo del paciente y se asocia con la placenta. Preferiblemente, el historial médico continúa después del alumbramiento. Tal historial médico puede ser usado para coordinar el uso posterior del corion o de las OPACs aisladas de la misma. Por ejemplo, las OPACs pueden ser usadas, a la luz del historial médico, para medicina personalizada para el infante asociado con la placenta de la cual se obtiene el corion, o para los padres, hermanos u otros parientes del infante.

En ciertas modalidades, antes de la OPACs, se extrae la sangre del cordón umbilical y la sangre de la placenta, de la placenta de la cual se debe extraer el corion. En ciertas modalidades, después del alumbramiento, se recupera la sangre del cordón en la placenta. La placenta puede ser sometida a un proceso convencional de recuperación de sangre del cordón. Típicamente se usa una aguja o una cánula, con la ayuda de la gravedad, para exanguinar la placenta (véase, por ejemplo, Anderson, Patente Norteamericana No. 5,372,581; Hessel et al., Patente Norteamericana No. 5,415,665). La aguja o la cánula usualmente se colocan en la vena umbilical y la placenta puede ser masajeada suavemente para ayudar en el drenado de la sangre del cordón desde la placenta. Tal recuperación de la sangre del cordón puede ser realizada comercialmente, por ejemplo, LifeBank USA, Cedar Knolls, N.J., ViaCord, Cord Blood Registry y Cryocell. Preferiblemente, la placenta se drena por gravedad sin manipulación adicional, para minimizar la desintegración del tejido durante la recuperación de la sangre del cordón.

Típicamente, una placenta se transporta desde la sala de partos o alumbramiento a otra ubicación, por ejemplo, un laboratorio, para la recuperación de la sangre del cordón y la recolección de las células. La placenta se transporta preferiblemente en un dispositivo de transporte estéril, aislado térmicamente (que mantiene la temperatura de la placenta entre 20-28°C) , por ejemplo, colocando la placenta, con el cordón umbilical engrapado en el extremo próximo, en una bolsa plástica con cierre de guia a presión estéril, la cual se coloca entonces en un recipiente aislado. En otra modalidad, la placenta se transporta en un equipo de recolección de sangre del cordón substancialmente como se describe en la Solicitud de Patente Norteamericana en tramite no. 11/230,760, presentada el 19 de septiembre de 2005. Preferiblemente, la placenta se entrega al laboratorio veinticuatro horas enseguida del alumbramiento. En ciertas modalidades, el extremo próximo del cordón umbilical se engrapa, preferiblemente en un intervalo de 4-5 cm (centímetros) de la inserción en el disco placentario antes de la recuperación de la sangre del cordón. En otras modalidades, el extremo próximo del cordón se engrapa después de la recuperación de la sangre del cordón pero antes del procesamiento posterior de la placenta.

La placenta, antes de la recolección de las células, puede ser almacenada bajo condiciones estériles y ya sea a la temperatura ambiente o a una temperatura de 5 a 25°C (centígrados) . La placenta puede ser almacenada por un periodo mayor a cuarenta y ocho horas, y preferiblemente por un periodo de cuatro a veinticuatro horas antes de la perfusión de la placenta para extraer toda la sangre residual. La placenta se almacena preferiblemente en una solución anticoagulante a una temperatura de 5 a 25°C (centígrados) . Las soluciones anticoagulantes adecuadas son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, puede ser usada una solución de heparina o warfarina sódica. En una modalidad preferida, la solución anticoagulante comprende una solución de heparina (por ejemplo, 1% p/p en solución 1:1000). La placenta exanguinada se almacena preferiblemente por no más de 36 horas antes que se recolecten las OPACs. 5.1.2.3 Desintegración Física y Digestión Enzimática del Tejido del Corion En una modalidad, las OPACs se recolectan de una placenta de mamífero mediante desintegración física, por ejemplo, digestión enzimática, del órgano. Por ejemplo, el corion o una porción del mismo puede ser, por ejemplo, triturado, cortado, picado, macerado o los similares, mientras está en contacto con la composición de recolección de células proporcionado aquí, y el tejido resultante se digiere posteriormente con una o más enzimas. El corion o una porción del mismo, pueden ser desintegrados o digeridos físicamente con una o más enzimas, y el material resultante se sumerge en, o se mezcla en, la composición de recolección de células. Se puede usar cualquier método para la desintegración física, siempre que el método de desintegración deje viables una pluralidad, más preferiblemente la mayoría, y más preferiblemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 98% o 99% de las células en dicho órgano, cuando se determina por ejemplo, mediante exclusión de azul de tripano. Típicamente, las OPACs pueden ser obtenidas mediante la desintegración de un bloque pequeño del corion, por ejemplo, un bloque de tejido placentario que tenga aproximadamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 20, 20, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o aproximadamente 100 milímetros cúbicos de volumen.

Una composición de recolección de células preferida comprende una o más enzimas de desintegración de tejidos. La digestión del corion preferiblemente usa una combinación de enzimas, por ejemplo, una combinación de metaloproteasa de matriz y una proteasa neutra, por ejemplo, una combinación de colagenasa y dispasa. En otra modalidad, la digestión enzimática del tejido coriónico usa una combinación de una metaloproteasa de matriz, una proteasa neutra, y una enzima mucolítica, para la digestión del ácido hilaurónico, tal como una combinación de colagenasa, dispara, de hualuronidasa, o una combinación de LIBERASE (Boheringer Manheim Corp, Indianápolis, Ins.) de hialuronidasa . Otras enzimas que pueden ser usadas para desintegrar el tejido coriónico incluyen papaina, desoxiribinucleasa, serina proteasas, tales como tripsina, quimoripsina , o elastasa. Las serina proteasas pueden ser inhibidas por la alfa 2 microglobulina en suero y por lo tanto, el medio usado para la digestión usualmente está libre de suero. La EDTA y la DNasa se usan comúnmente en los procedimientos de digestión por enzimas para aumentar la eficiencia de la recuperación de células. El digerido (el tejido y las células que resultan de la digestión enzimática) se diluye preferiblemente para evitar el atropamiento de las OPCAs en el digerido viscoso.

Las concentraciones típicas para las enzimas de digestión de tejidos incluyen, por ejemplo, 50-200 U/mL, para la colagenasa I y la colagenasa IV, 1-10 U/mL para la dispara, y 0-100 U/mL para la elastasa. Las proteasa pueden ser usadas en combinación, es decir, dos o más proteasas en la misma reacción de digestión, o pueden ser usadas secuencialmente para liberar las OPACs. Por ejemplo, en una modalidad, el tejido coriónico se digiere primero con una cantidad apropiada de colagenasa I a 2 mg/mL por 30 minutos, seguido por la digestión con tripsina, 0.25% por 10 minutos, a 37°C. Las serina proteasas se usan preferiblemente de manera consecutiva enseguida del uso de otras enzimas.

En una modalidad específica, las OPCAs se obtienen por la separación del amnios del tejido coriónico; picado del tejido coriónico, por ejemplo, en fragmentos de aproximadamente 1 mm3; digestión del tejido en dispasa II, por ejemplo, en aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 U/mL, por ejemplo, 2.4 U/mL por un tiempo suficiente, por ejemplo, aproximadamente 1 hora; digestión con colagenasa II en aproximadamente 100, 200, 300, 400 o 500 U/mL, por ejemplo, aproximadamente 270 U/mL por un tiempo suficiente, por ejemplo, aproximadamente 1 hora, seguido por neutralización de la enzima, recolección de las células individuales, y cultivo de las células coriónicas en un medio adecuado, por ejemplo, 20% de FBS/aMEM.

En otra modalidad, el tejido puede ser desintegrado adicionalmente mediante la adición de un quemador, por ejemplo, ácido etilenglicol bis (2-aminoetil éter ) -N, N, N' N' -tetracetico (ECGTA) o ácido etilendiamintetracetico (EDTA) a la composición de recolección de células que contiene las células madre, o a una solución en al cual se desintegra y/o se digiere el tejido antes del aislamiento de las células madre con la composición de recolección de células.

Se apreciará que cuando se recolecta un corion completo o la porción del corion que comprende tanto células fetales como maternas, las OPACs recolectadas pueden comprender una mezcla de OPACs derivadas tanto de fuentes fetales y maternas. Cuando se recolecta una porción del corion que no comprende, o que tiene un número despreciable de células maternas (por ejemplo, el amnión) , las OPACs recolectadas comprenderán casi exclusivamente células placentarias fetales.

En una modalidad, las OPCAs se aislad del tejido coriónico como sigue. El tejido coriónico se obtiene y se corta; por ejemplo, en fragmentos de aproximadamente 1-2 mm3. El tejido cortado se digiere con dispara II a una concentración de, por ejemplo, aproximadamente 1 U/mL a aproximadamente U/mL, por ejemplo, 2.4 U/mL, hasta que la digestión está completa, por ejemplo, 1 hora a 37°C. El tejido digerido se digiere entonces con colagenasa II, por ejemplo, aproximadamente 100 U/mL a aproximadamente 1000 U/mL, por ejemplo, aproximadamente 27 U/mL, hasta que la digestión está completa, por ejemplo durante aproximadamente 1 hora a 37 °C. Las células se recolectan por centrifugación, se lavan, y se cultivan en recipientes de cultivo revestidos con vitronectina o revestidos con laminina, y se cultivan en 10% FBS/DMEM o 20% FSB/aMRM durante aproximadamente 6 días. A los 6 dias del cultivo, las células no adherentes se extraen y a las células adherentes se les permite proliferar. Cuando las células alcanzan aproximadamente 80% a 90% de confluencia, las células se extraen, por ejemplo, usando tripsina, y se transfieren a recipientes de cultivo revestidas con vitronectina o laminina. Cuando las células se cultivan inicialmente en recipientes revestidos con laminina, se prefiere la transferencia a recipientes de cultivo revestidos con laminina; de manera similar, cuando las células de cultivan inicialmente en recipientes revestidos con vitronectina, se prefiere al transferencia a recipientes de cultivo revestidos con vitronectina . Las células se criopreservan opcionalmente antes de la transferencia a las segundas cajas. Las células se analizan, por ejemplo, mediante citometria de flujo y se determina si son, por ejemplo, CD34 , CD105+, CD200+, y/o CD200dlfusa, positivas para fosfatasa alcalina (AP) , actina OÍ de músculo liso (a-S A) y osteoprotegerina (OP) .

Por lo tanto, en un aspecto, aquí se proporciona un método para aislar células placentarias adherentes, osteogénicas , aisladas (OPACs) , que comprende digerir en serie el tejido del corion con dispara II, después con colagenasa II, para producir una población de células; cultivar dicha población de células en una primera superficie revestida con vitronectina o revestida con laminina durante aproximadamente seis días, en donde dicha población de células comprende células adherentes y células no adherentes; extraer las células no adherentes; y transferir las células no adherentes a una segunda superficie revestida con vitronectina o una superficie revestida con laminina, en donde dichas células adherentes son OPACs. En modalidades específicas, dichas OPACs son uno o más de CD34~, CD105+, CD200difusa, AP+, -SMA+ y OP+. En otras modalidades, las OPACs tienen cualquiera de las características célulares o genéticas descritas en otra parte de este documento. 5.1.3 Cultivo de las OPACs 5.1.3.1 Medios de Cultivo Las OPACs aisladas, o las poblaciones de OPACs pueden ser usadas para iniciar, o sembrar, cultivos celulares. Las células se transfieren por lo general a recipientes estériles de cultivo de tejidos. Los recipientes se revisten preferiblemente con vitronectina , fibronectina , o ambas. En ciertas otras modalidades, los recipientes de cultivo de tejidos están ya sea no revestidos o revestidos con matriz extracelular o ligandos tales como laminina, colágeno (por ejemplo, nativos o desnaturalizados), gelatina, ornitina, y/o proteína de membrana extracelular (por ejemplo, MATRIGEL (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)) .

Preferiblemente, las OPACs se obtienen como sigue. Las células coriónicas que comprenden OPACs obtenidas por digestión del tejido coriónico, por ejemplo, con dispasa II y colagenasa II como se describe anteriormente, se cultivan inicialmente sobre una superficie de cultivo de tejidos revestida con colágeno, vitronectina, o laminina, por ejemplo durante aproximadamente 1-6 días en 20% FBS/a???, seguido por, o acompañado por, la extracción de las célula son adherentes, las células no adherentes pueden ser extraídas varias veces, por ejemplo, después de 3 horas, 1 día y 6 días del cultivo, o una vez, por ejemplo, después del 6 días de cultivo. Enseguida de la adhesión selectiva, las OPACs se seleccionan mediante la extracción de las células CD200+ (no difusas) , por ejemplo, usando un anticuerpo para CD200, dejando una población de células CD200difusa/CD200_.

Las OPACs pueden ser cultivadas en cualquier medio, y bajo cualquiera de las condiciones, reconocidas en la técnica como aceptables para el cultivo de las células madre. Preferiblemente, el medio de cultivo comprende suero. Las OPACs pueden ser cultivadas por ejemplo en, DMEM-LG (Medio Esencial Modificado de Dulbecco, con bajo contenido de glucosa) MCDB 201 (medio basal de fibroblastos de pollo) conteniendo ITS (insulina-transferrina, selenio) , LA+BSA (ácido linoleico-albúmina de suero de bovino, dextrosa, ácido L-ascórbico, PDGF, IGF-1, y penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (con alto contenido de glucosa) que comprende 10% de suero fetal de bovino (FBS); DMEM-HG que comprende 15% de FBS; IMDM (medio de Dulbecco modificado de Iscove) que comprende 10% de FBS, 10% de suero de caballo , e hidrocortisona; M199 que comprende 10% de FBS, EGF y heparina; -MEM (medio esencial mínimo) que comprende 10% de DFBS, GLUTAMAX™ y gentamicina; DMEM que comprende 10% de FBS, GLUTAMAX™ y gentamicina, etc. Un medio preferido es DMEM que comprende 10% de FBS, GLUTAMAX™ y gentamicina, etc. Un medio preferido es DMEM-LG/MCDB-201 que comprende 2% de FBS, ITS, LA+BSA, dextrosa, ácido L-ascórbico, PDGF, EGF, y penicilina/estreptomicina.

Otros medios que pueden ser usados para cultivar las OPACs incluyen DMEM (con alto o bajo contenido de glucosa), medio basal de Tagle, medio FIO de Ham, Medio F-12 de Ham (F12), medio de Dulbecco modificado de Iscove, Medio de Cultivo de Células Madre Mesenquimales (MSCGM) , medio L15 de Liebovitz, MCDB, DMEM/F12, RPMI 1640, DMEM avanzado (Gibco) , DMEM/MCDB201 (Sigma) , y CELL-GRO FREE.

El medio de cultivo puede ser suplementado con uno o más componentes que incluyen, por ejemplo, suero (por ejemplo, suero fetal de bovino (FBS), preferiblemente aproximadamente 2-15% (v/v) ; suero de equino (caballo) (ES) , suero de humano (HS) ) ; beta-mercaptoetanol (BME) , preferiblemente aproximadamente 0.001% (v/v); uno o más factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), fáctor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) , factor de crecimiento similar a insulina 1 (IGF-1), factor inhibidor de leucemia (LIF) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , y eritropoyetina (EPO) aminoácidos, incluyendo L-valina; y uno o más agentes antibióticos y/o antimicóticos para controlar la contaminación bacteriana, tales como, por ejemplo, penicilina Gr sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina, y nistatina, ya sea individualmente o en combinación .

Las OPACs pueden ser cultivadas en condiciones de cultivo de tejidos, por ejemplo, en cajas de cultivo de tejidos o placas de pozos múltiples. Las OPACs también se pueden cultivar usando un método de gota colgante. En este método, las OPACs se suspenden a aproximadamente lxlO4 células por mL en aproximadamente 5 mL de medio, y una o más gotas del medio se colocan sobre el interior de la tapa de un recipiente de cultivo de tejidos, por ejemplo, cajas de Petri de 100 mL. Las gotas pueden ser por ejemplo, gotas individuales, o múltiples gotas de, por ejemplo, un pipeteador de canales múltiples. La tapa se invierte cuidadosamente y se coloca sobre la parte superior del fondo de la caja, la cual contiene un volumen de liquido, por ejemplo, PBS estéril suficiente para mantener el contenido de humedad en la atmósfera de la caja, y las células se cultivan. 5.1.3.2 Expansión y Proliferación de las OPACs Una vez que se aislan las OPAC, o la población aislada de OPACs (por ejemplo, se obtienen las OPAC o la población de OPACs separada de al menos aproximadamente 50% de las células criónicas con las cuales las OPAC o la población de OPACs se asocia normalmente in vivo) , las OPAC o la población de OPACs pueden ser proliferadas y expandidas in vitro. Por ejemplo, una población de OPACs puede ser cultivada en recipientes de cultivo de tejidos, por ejemplo, cajas, frascos, placas de pozos múltiples, o los similares, por un tiempo suficiente para que las células proliferen a 70-90% de confluencia, es decir, hasta que las células y sus descendientes ocupan 70-90% del área de la superficie de cultivo del recipiente cultivo.

Las OPACs pueden ser sembradas en los recipientes de cultivo a una densidad que permita el crecimiento de las células. Por ejemplo, las células pueden ser sembradas a una densidad baja (por ejemplo, aproximadamente 1,000 a aproximadamente 5,000 células/cm2) a alta densidad (por ejemplo, aproximadamente 50,000 o más células/cm2) . En una modalidad preferida, las células se cultivan a aproximadamente 0 a 5 por ciento en volumen de CO2 en aire. En algunas modalidades preferidas, las células se cultivan a aproximadamente 2 a aproximadamente 25 por ciento de O2 en aire, preferiblemente a aproximadamente 5 a aproximadamente 20 por ciento de 02 en aire. Las células preferiblemente se cultivan a aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente 37°C. Las células se cultivan preferiblemente en un incubador. El medio de cultivo puede ser estático o agitado, por ejémplo, usando un biorreactor. Las OPACs se cultivan preferiblemente bajo estrés oxidativo bajo (por ejemplo, con la adición de glutationa, ácido ascórbico, catalasa, tocoferol, N-acetilcisteina, o los similares) .

Una vez que se obtiene 70%-90% de confluencia, las células pueden ser transferidas. Por ejemplo, las células pueden ser tratadas enzimáticamente, por ejemplo, tripsinizadas, usando las técnicas bien conocidas en la técnica, para separarlas de la superficie de cultivo de tejidos. Después de extraer las células con una pipeta y contabilizar las células, aproximadamente 20,000-1000,000 células, preferiblemente aproximadamente 50,000 células se transfieren a un nuevo recipiente de cultivo que contiene medio de cultivo fresco. Típicamente, el nuevo medio es del mismo tipo que el medio de cultivo del cual se extrajeron las células. aquí se proporcionan poblaciones de células placentarias que han sido transferidas al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, o 20 veces o más. 5.1.3.3 Poblaciones de OPAC Además, aquí se proporcionan poblaciones de OPACs. Las OPACs pueden ser aisladas directamente de los coriones de una o más placentas. Las OPACs aisladas proporcionadas aquí también pueden ser cultivadas y expandidas para producir poblaciones de OPACs. Las poblaciones de células criónicas que comprenden OPACs también pueden ser cultivadas y expandidas para producir poblaciones de OPACs.

Las poblaciones de OPACs proporcionadas aquí comprenden OPACs, por ejemplo, las OPACs que se describen aquí. En varias modalidades, al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 405, 505, 60%, 705, 80%, 90%, 95%, o 99% de las células en una poblaciones de células aisladas son OPACs. Es decir, una población de OPACs puede comprender, por ejemplo, tantas como 1%, 105, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, células no OPAC.

Aquí se proporcionan métodos para producir poblaciones de OPACs aisladas, por ejemplo, mediante selección de las células del corion que expresan marcadores particulares y/o características particulares de cultivo o morfológicas. En una modalidad, por ejemplo, aquí se proporciona un método para producir una población de células que comprende seleccionar células criónicas que se adhieren a un sustrato, y expresan CD105 pero que no expresan CD200; y aislar dichas células de las otras células coriónicas para formar una población de células, por ejemplo, una población de OPACs. En una modalidad específica las células coriónicas CD105+, CD200+ que también son NG2+, osteoprotegerina+, actina alfa de músculo liso negativo, y/o que exhibe actividad de fosfatasa alcalina, se aislan de las otras células coriónicas.

En las modalidades anteriores, el sustrato puede ser cualquier superficie sobre la cual se pueda lograr un cultivo y/o selección de células, por ejemplo, las OPACs. Típicamente, el sustrato es plástico, por ejemplo, cajas de cultivo de tejidos o placas de pozos múltiples de plástico. El plástico de cultivo de tejidos puede estar revestido con una biomolecula, por ejemplo, laminina, vitronectina, colágeno o fibronectina .

Las OPACs, y las poblaciones de OPACs, pueden ser seccionadas por cualquier medio conocido en la técnica de selección de células. Por ejemplo, las células pueden ser seleccionadas usando un anticuerpos o anticuerpos para uno o más de los marcadores de la superficie células, por ejemplo, en citometria de flujo o FACS. La selección puede ser lograda usando anticuerpos en conjunción con perlas magnéticas. Los anticuerpos que son específicos para ciertos marcadores relacionados con las células madre se conocen en la técnica. Por ejemplo, CD200 (Abcam) , o CD105 (Abcam; Biodesign Internacional, Saco, ME), etc., pueden ser usados para seleccionar las OPACs o las poblaciones de OPACs.

Las poblaciones de OPACs pueden comprender células coriónicas que no son OPACs, o células que no son células coriónicas u OPACs.

Las poblaciones de OPAC aisladas pueden ser combinadas con una o más poblaciones de células no OPAC o células no coriónicas. Por ejemplo, una población aislada de OPACs puede ser combinada con sangre (por ejemplo, sangre de la placenta o sangre del cordón umbilical), células madre derivadas de la sangre (por ejemplo, células madre derivadas de la sangre de la placenta o sangre del cordón umbilical) , poblaciones de células enucleadas derivadas de la sangre, células mesenquimales derivadas de la médula ósea, poblaciones de células madre derivadas de la médula ósea, médula ósea cruda, células madre adultas (somáticas), poblaciones de células madre contenidas dentro del tejido, células madre cultivadas, poblaciones de células completamente diferenciadas (por ejemplo, condorcitos, fibroblastos, células amnióticas, osteoblastos, células musculares, células cardiacas, etc.) y las similares, las células en una población de OPAC aisladas pueden ser combinadas con una pluralidad de células de otro tipo en proporciones de 100,000,000:1, 50,000,000:1, 20,000,000:1, 10,000,000:1, 5,000,000:1, 2,000,000:1, 1,000,000:1, 500,000:1, 200,000:1, 100,000:1, 50,000:1, 20,000:1 10,000:1, 5,000:1, 2,000:1, 1,000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2; 1:5, 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1,000; 1;2,000; 1:5,000; 1:10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1:500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1;5,000,000; 1 ; 10 , 000 , 000 ; 1:20,000,000; 1:50,000,000; o aproximadamente 1:100,000,000, números comparables de células enucleadas totales en cada población. Las células en una población de OPAC aislada pueden ser combinadas con una pluralidad de células de una pluralidad de tipos de células también.

En una modalidad, una población aislada de OPACs se combina con una pluralidad de células madre hematopoyéticas . Tales células madre hematopoyéticas pueden estar, por ejemplo, combinadas en la sangre de la placenta, la sangre del cordón umbilical o la sangre periférica; el las células enucleadas totales de la sangre de la placenta, la sangre del cordón umbilical o la sangre periférica; en una población aislada de células CD34+ de la sangre de la placenta, la sangre del cordón umbilical o la sangre periférica; en la médula ósea no procesada; en las células enucleadas totales de la médula ósea; en una población aislada de células CD34+ de la médula ósea, o las similares. 5.4.1 Combinaciones de OPACs y Perfusado de la Placenta o Células de Perfusado de Placenta Aquí se proporcionan combinaciones de pefusado de la placenta con células aisladas de perfusado de placenta y/o las OPACs proporcionadas aquí. En una modalidad, por ejemplo, aquí se proporciona un volumen de perfusado de placenta suplementado con una pluralidad de células de perfusado de placenta y/o una pluralidad de OPACs. En modalidades especificas, por ejemplo, cada mililitro de perfusado de placenta se suplementa con aproximadamente 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106 células de perfusado u OPACs. En otra modalidad, una pluralidad de células de perfusado de placenta se suplementa con perfusado de placenta y/u OPACs. En otra modalidad, una pluralidad de OPACs se suplementa con perfusado de placenta y/o una pluralidad de células de perfusado de placenta. En ciertas modalidades, cuando el perfusado se usa para la suplementación, el volumen de perfusado es aproximadamente, mayor que aproximadamente, o menor que aproximadamente 50%, 45%, 40%, 35%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2%, o 1 % del volumen total de células (en solución) más el perfusado. Cuando se usa el perfusado de placenta para suplementar una pluralidad de OPACs, las celias del perfusado de placenta comprenden por lo general aproximadamente, más que aproximadamente, o menos que aproximadamente, 50%, 455, 405, 35%, 305, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% o 1% del número total de células del perfusado de placenta más las OPACs. De manera similar, cuando las OPACs se usan para suplementar una pluralidad de células de perfusado de placenta, las OPACs por lo general comprenden aproximadamente, más que aproximadamente, o menos que aproximadamente 50%, 45%, 405, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% o 1% del número total de células del perfusado de placenta más las OPACs. Cuando las OPACs o las células de perfusado de placenta se usan para suplementar el perfusado de placenta, el volumen de la solución (por ejemplo, la solución salina, el medio de cultivo o los similares) en la cual se suspenden las células, comprende aproximadamente, más que aproximadamente, o menos que aproximadamente 505, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 6%, 4%, 2% o 1% del volumen total del perfusado más las células, cuando las OPACs se suspenden a aproximadamente 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o más células por mililitro, antes de la suplementacíón.

Además, aquí se proporciona el perfusado de placenta agrupado que se obtiene de dos o más fuentes, por ejemplo, dos o más placentas, y se combinan, por ejemplo, se agrupan. Tal perfusado reunido puede comprender volúmenes aproximadamente iguales de perfusado de cada fuente, o puede comprender diferentes volúmenes de cada fuente. Los volúmenes relativos de cada fuente pueden ser seleccionados al azar, o se pueden basar, por ejemplo, en una concentración o la cantidad de uno o más factores celulares, por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento, hormonas o lo similares; el número de células placentarias en el perfusado de cada fuente; y otras características del perfusado de cada fuente. Los perfusados de múltiples perfusiones de la misma placeta pueden ser reunidos de forma similar.

Igualmente, aquí se proporcionan células de perfusado de placenta, y OPACs que se obtienen de los o más fuentes, por ejemplo, dos o más placentas y/o coriones, y se agrupan. Tales células agrupadas pueden comprender aproximadamente números iguales de células de las dos o más fuentes, o números diferentes de uno o más de las fuentes. Los números relativos de células de cada fuente pueden ser seleccionados con base, por ejemplo, en el número de uno o más tipos específicos de células a ser agrupadas, por ejemplo, el número de células madre CD34 , etc.

Las agrupaciones pueden comprender, por ejemplo, perfusado de placenta suplementado con células de perfusado de placenta; perfusado de placenta suplementado con OPACs; perfusado de placenta suplementado tanto con células de perfusado de placenta y OPACs; células de perfusado de placentas suplementadas con perfusado de placenta; células de perfusado de placenta suplemetadas con OPACs; células de perfusado de placenta suplementadas tanto con persuado de placenta y OPACs; OPACs suplemetadas con perfusado de placenta; OPACs suplemetadas con células de perfusado de placenta;, y OPACs suplementadas tanto con células de perfusado de placenta y perfusado de placenta.

En ciertas modalidades, el persuado de placenta, las células de perfusado de placenta, y las OPACs se proporcionan como unidades grado farmacéutico que se pueden administrar. Tales unidades pueden ser proporcionadas en volúmenes discretos, por ejemplo, 100 mL, 150 mL, 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 400 mL, 500 mL, o los similares. Tales unidades pueden ser proporcionadas para contener un número especifico, por ejemplo, células de perfusado de placeta, células asesinas naturales intermediarias derivadas de perfusado de placenta, o ambas, por ejemplo, 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o más células por mililitro o 1 x 104, 5 x 104, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108 o más células por unidad. Tales unidades pueden ser proporcionadas para contener números específicos de dos cualesquiera, o de todas los tres de perfusado de placenta, células de perfusado de placenta, y/o OPACs.

En las combinaciones anteriores de perfusado de placenta, células de persuado de placenta y/o OPACs, cualquiera, cualesquiera dos de, todos los tres de persuado de placenta, células de perfusado de placenta y/o OPACs pueden ser autólogos, para un receptor (es decir, obtenido del receptor) , u homólogos para un receptor (es decir, obtenidos al menos de otro individuo de dicho receptor) .

También se proporciona aqui composiciones que comprenden OPACs en combinación con células de perfusado de placenta y/o perfusado de placenta. Por lo tanto, en un aspecto, aqui se proporciona una composición que comprende OPACs aisladas, en donde dichas célula madre placentarias se aislan del perfusado de placenta, y en donde dichas OPACs comprenden al menos 50% de células en la composición. En una modalidad específica, dichas OPACs comprenden al menos aproximadamente 80% de células en la composición. En otra modalidad específica, la composición comprende perfusado de placenta aislado. En una modalidad más específica, dicho perfusado de placenta es del mismo individuo que dichas OPACs. En otra modalidad más específica, dicho perfusado de placenta comprende perfusado de placenta de un individuo diferente a dichas OPACs. En otra modalidad específica, la composición comprende células de persuado de placenta, en una modalidad más específica, dichas células de perfusado de placenta son del mismo individuo que las OPACs. En otra modalidad más específica, dichas células de perfusado de placenta son de un individuo diferente a dichas OPACs. En otra modalidad específica, la composición comprende adicionalmente perfusado de placenta aislado y células aislada de perfusado de placenta, en donde ducho perfusado aislado y dichas células aisladas de perfusado de placenta son de diferentes individuos. En otra modalidad especifica de cualquiera de las modalidades anteriores que comprenden perfusado de placenta, dicho perfusado de placenta comprende perfusado de placenta de al menos dos individuos . En otra modalidad específica de cualquiera de las modalidades anteriores que comprenden células de perfusado de placenta, dichas células aisladas de perfusado de placenta son de al menos dos individuos. 5.1.5 Producción de un Banco de Células OPAC Las OPACs del corion posparto pueden ser cultivadas en un número de modos diferentes, para producir un conjunto de lotes, por ejemplo, un conjunto de dosis que se pueden administrar individualmentye . Los conjuntos de lotes de OPACs, obtenidas de una pluralidad de coriones, pueden ser alojadas en un banco de OPACs, por ejemplo, un depósito a largo plazo. Por lo general, las OPACs se obtienen de un cultivo inicial de material coriónico para formar un cultivo seminal, el cual se expande bajo condiciones controladas para formar poblaciones de células de aproximadamente números equivalentes de duplicaciones. Los lotes se derivan preferiblemente el tejido coriónico de una placenta individual, pero pueden ser derivados del tejido de una pluralidad de placentas.

En una modalidad, los lotes de OPACs se obtienen como sigue. El tejido coriónico se desintegra primero, por ejemplo mediante maceración, se digiere con una enzima adecuada, por ejemplo, dispara o dispara y colagenasa (véase la Sección 5.2.3, anteriormente) . El tejido coriónico preferiblemente comprende, por ejemplo, el corion completo de una placenta individual, pero puede comprender solo una parte del corion. El tejido digerido se cultiva, por ejemplo, por aproximadamente 1-3 semanas, preferiblemente aproximadamente 2 semanas. Después de la extracción de las células no adherentes, se forman las colonicas de alta densidad que se forman, por ejemplo, por tripsinización . Estas células se recolectan y se resuspenden en un volumen conveniente de medio de cultivo, y se definen como células de Transferencia 0.

Las células de transferencia 0 se usan entonces para sembrar los cultivos de expansión. Los cultivos de expansión pueden ser cualquier arreglo de aparatos de cultivo de células separados, por ejemplo, un Cell Factory de NUNC™. Las células en el cultivo de la Transferencia 0, pueden ser subdivididas a cualquier grado para sembrar cultivos de expansión con, por ejemplo, 1 x 103, 2 x 103, 3 x 103, 4 x 103, 5 x 103, 6 x 103, 7 x 103, 8 x 103, 9 x 103, 1 x 104, 2 x 1?\ 3 x 1?\ 5 x 1?\ 6 x 10\ 7 x 10\ 8 x 104, 9 x 10\ o 10 x 104 células, preferiblemente, aproximadamente 2 x 104 a aproximadamente 3 x 104 células de Transferencia 0 se usan para sembrar cada cultivo de expansión. El número de cultivos de expansión depende del número de células de Transferencia 0, y puede ser mayores o menores en número dependiendo del corion particular del cuales de obtienen las OPACs .

Los cultivos de expansión se cultivan hasta que la densidad en el cultivo alcanza un cierto valor, por ejemplo, aproximadamente 1 x 105 células/cm2. Las células pueden ser ya sea recolectadas y criopreservadas en este punto, por transferidas a nuevos cultivos de expansión como se describe anteriormente. Las células pueden ser transferidas por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 10, o 20 veces antes del ser usadas. Preferiblemente se mantienen un registro del número acumulativo de duplicaciones de la población durante el o los cultivos de expansión. Las células del cultivo de la Transferencia 0 pueden ser expandidos por 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 256, 28, 39, 32, 34, 36, 38 o 40 duplicaciones, o hasta 60 duplicaciones. Preferiblemente sin embargo, el número de duplicaciones de la población, antes de dividir la población de las células en dosis individuales, entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30, preferiblemente aproximadamente 20 duplicaciones. Las células pueden ser cultivadas continuamente a través del proceso de expansión, o pueden ser . congeladas en uno o más puntos durante al expansión.

Las células a ser usadas para las dosis individuales pueden ser congeladas, por ejemplo, criopreservadas par uso posterior. Las dosis individuales pueden comprender por ejemplo, aproximadamente 1 millos de células por mL, y pueden comprender entre aproximadamente 106 y aproximadamente 109 células en total.

En una modalidad especifica del método, las células de la Transferencia 0 se cultivan por aproximadamente 4 duplicaciones, después se congelan en un primer banco de células. Las células del primer banco de células se congelan y se usan para sembrar un segundo banco de células, las células del cual se expanden por ocho duplicaciones. Las células en esta etapa se recolectan y se congelan, y se usan para sembrar nuevos cultivos de expansión a los que se les permite proceder por aproximadamente ocho duplicaciones adicionales, poniendo el número acumulativo de duplicaciones a aproximadamente 20. Las células en los puntos intermedios en la transferencia pueden ser unidades congeladazas de aproximadamente 100,000 a aproximadamente 10 millones de células por mL, preferiblemente aproximadamente 1 millón de células por mL para ser usadas en el cultivo de expansión posterior. Las células en aproximadamente 20 duplicaciones pueden ser congeladas en dosis individuales de entre aproximadamente 1 millón a aproximadamente 100 millones de células por mL, para la administración o uso en la preparación de una composición que contiene OPAC.

En una modalidad preferida, el donador del cual se obtiene la placenta (por ejemplo, la madre) se analizan por al menos un patógeno. Si la madre resulta positiva por un patógeno analizado, el lote completo de la placenta se desecha. Tal análisis puede ser realizado en cualquier momento durante la producción de los lotes de células OPACs, incluyendo antes o después del establecimiento de las células de Transferencia 0, o durante el cultivo de expansión. Los patógenos para los cuales se evalúa la presencia pueden incluir, sin limitación, hepatitis A, hepatitis b, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, virus de inmunodeficiencia humana (tipos I y II), citomegalovirus , herpesvirus, y los similares. 5.1.6 Diferenciación de las OPACs Se puede inducir la diferenciación de las, OPACs, por ejemplo, bajo una via osteogénica. La diferenciación osteogénica de las OPACs puede ser inducida, por ejemplo, colocan do las OPACs en condiciones de cultivo de tejidos que induce la diferenciación en células osteogénicas . Un medio osteogénico preferido comprende MSCGM (Cambrex) o DME suplementado con 15% se suero de sangre del cordón, seguido por Medio de Inducción Osteogénica (Cambrex) que contiene dexametasona 0.1 µ?, 2- fosfato de ácido ascórbico 0.05 mM, beta glicerofosfato 10 mM. En otra modalidad, las OPACs se cultivan en medio (por ejemplo, DMEM de bajo contenido de glucosa) que contiene dexametasona aproximadamente 10" a aproximadamente 109 M, sales de ascorbato fosfato aproximadamente 10-50 µ? (por ejemplo, ascorbato-2-fosfato) y ß-glicerofosfato aproximadamente 10 nm a aproximadamente 10 mM. El medio osteogénico también incluye uno o más agentes antibióticos/antimicóticos , factor de crecimiento transformante beta (por ejemplo, TGF-ß?), y/o proteina morfogénica del hueso (por ejemplo, BMP-2, B P-4, o una combinación de los mismos).

La diferenciación puede ser analizada usando un tinte especifico del calcio, por ejemplo, tinción de von Kossa, y detección por RT/PCR de, por ejemplo, la expresión del gen de fosfatasa alcalina, osteocalcina , sialoproteina de hueso y/o osteopontina . 5.1.7 Preservación de las OPACs Las OPACs pueden ser preservadas es decir, colocadas bajo las condiciones que permitan el almacenamiento a largo plazo, o las condiciones que inhiban la muerte celular, por ejemplo, la apoptosis o la necrosis.

Las OPACs pueden ser preservadas usando, por ejemplo, una composición que comprende un inhibidor de apoptosis, un inhibidor de necrosis, y/o un perfluorocarbono que transporta oxigeno, como se describe en la solicitud Provisional Relacionada no. 60/754,969, titulada "Improved Médium for Collecting Placental Stem Cell and Preserving Organs" presentada el 25 de diciembre de 2005. en una modalidad, aquí se proporciona un método para preservar una población de OPACs que comprende poner en contacto dicha población de OPACs con una composición de recolección de células que comprende un inhibidor de la apoptosis y un perfluorocarbono que transporta oxigeno, en donde dicho inhibidor de la apoptosis está presente en una cantidad y por un tiempo suficientes para reducir o evitar la apoptosis en la población de OPACs, en comparación con una población de OPACs que no esta en contacto con el inhibidor de la apoptosis. En una modalidad, especifica, dicho inhibidor de la apoptosis es un inhibidor de caspasa. En otra modalidad especifica dicho inhibidor de la apoptosis es un inhibidor de JNK. En una modalidad más especifica, dicho inhibidor de JNK no modula la diferenciación o la proliferación de dichas OPACs. En otra modalidad, dicha composición de recolección de células comprende dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono que transporta oxigeno en fases separadas. En otra modalidad, dicha composición de recolección de células comprende dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono que transporta oxigeno en una emulsión. En otra modalidad la composición de recolección de células comprende adicionalmente un emulgente, por ejemplo, lecitina. En. otra modalidad, dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono están entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 25°C en el momento de ponerse en contacto con las OPACs. En otra modalidad más especifica, dicho inhibidor de la apoptosis y dicho perfluorocarbono están entre aproximadamente 2°C y 10°C, o entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 5°C en el momento de ponerse en contacto con las OPACs. En otras modalidades especificas, dicho contacto se realiza durante el transporte de dicha población de OPACs. En otra modalidad más especifica, dicho contacto se realiza durante la congelación y la descongelación de dicha población de OPACs.

En otra modalidad, aquí se proporciona un método para preservar una población de OPACs que comprende poner en contacto ducha población de OPACs con un inhibidor de la apoptosis y un compuesto de preservación de órganos en donde dicho inhibidor de la apoptosis está presente en una cantidad de y por un tiempo suficiente para reducir la apoptosis en la población de OPACs, en comparación con una población de OPACs que no se ha puesto en contacto con el inhibidor de la apoptosis. En una modalidad especifica. El compuesto de preservación de órganos es solución de UW (descrita en la Patente Norteamericana No. 4,798,824; conocida también como ViaSpan, véase también Southard et al, Transplantation 49 (2) :251-257 (1990)) o una solución descrita en Stern et al, Patente Norteamericana No. 5,552,267. En otra modalidad, dicho compuesto de preservación de órganos es hidroxietil almidón, ácido lactobiónico, rafinosa, o una combinación de los mismos.

En otra modalidad, la composición de recolección de células comprende adicionalmente un perfluorocarbono que transporta oxigeno, ya sea en dos fases o como una emulsión.

En otra modalidad del método, las OPACs se ponen en contacto con una composición de recolección de células que comprende un inhibidor de apoptosis y un perfluorocarbono que transporta oxigeno, un compuesto de preservación de órganos, o una combinación de los mismos, durante la perfusión. En otra modalidad, dichas OPACs se ponen en contacto durante un proceso de desintegración del tejido, por ejemplo, digestión enzimática. En otra modalidad, las OPACs se ponen en contacto con dicho compuesto de recolección de células después de la recolección por perfusión, o después de la recolección por desintegración del tejido, por ejemplo, digestión enzimática.

Típicamente, durante la recolección, enriquecimiento y aislamiento de las células, es preferible minimizar o eliminar el estrés de las células debido a la hipoxia y el estrés mecánico. En otra modalidad del método, por lo tanto, las OPACs, se exponen a una condición hipóxica durante la recolección, enriquecimiento o el aislamiento por menos de seis horas durante dicha preservación, en donde una condición hipóxica es una concentración de oxígeno que es menor que la concentración de oxígeno normal de la sangre. En una modalidad más específica, dichas OPACs se exponen a dicha condición hipóxica por menos de dos horas durante dicha preservación. En otra modalidad más especifica, las OPACs se exponen a dicha condición hipóxica por menos de una hora, o menos de treinta minutos, o no se exponen a una condición epóxica, durante la recolección, enriquecimiento, o asilamiento. En otra modalidad especifica, dichas OPACs no se exponen a esfuerzos cortantes durante la recolección, enriquecimiento o el aislamiento.

Las OPACs proporcionadas aquí pueden ser criopreservadas , por ejemplo, en medio de criopreservación en recipientes pequeños, por ejemplo, ampolletas. El medio de criopreservación adecuado incluye, pero no se limita a, medio de cultivo que incluye, por ejemplo, medio de cultivo, o medio de congelación de células, por ejemplo medio de congelación de células disponible comercialmente, por ejemplo, CD2695, C2639 o c6039 (Sigma) . El medio de criopreservación preferiblemente comprende DMSO (dimetilsulfóxido) , a una concentración de, por ejemplo, aproximadamente 10% (v/v) . el medio de criopreservación puede comprender agentes adicionales, por ejemplo, metilcelulosa, y/o glicerol. Las OPACs se tendrían preferiblemente a aproximadamente l°C/min durante la criopreservación. Una temperatura de criopreservación preferida es de aproximadamente -80°C a aproximadamente -180°C, preferiblemente de -125°C a aproximadamente -140°C. Las células criopreservadas pueden ser transferidas a nitrógeno líquido antes de la descongelación para su uso. En algunas modalidades, por ejemplo, una vez que la ampolletas han alcanzado aproximadamente -90°C, estas se transfieren a un área de depósito de nitrógeno liquido. Las células criopreservadas preferiblemente se descongelan a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente a una temperatura de aproximadamente 37 °C. 5.1.8 Composiciones que Comprenden OPACs Aquí se proporcionan composiciones que comprenden OPACs o biomoléculas de las mismas. Las OPACs proporcionadas aquí pueden se combinadas con cualquier compuesto aceptable fisiológicamente o aceptable médicamente, composición o dispositivo de uso en, por ejemplo, la investigación de terapéuticos . 5.1.8.1 OPACs Criopreservadas Las poblaciones de OPACs proporcionadas aquí pueden ser preservadas por ejemplo, criopreservadas para uso posterior. Los métodos para la criopreservación de células, tales como OPACs, son bien conocidos en la técnica. Las poblaciones de OPACs pueden ser preparadas en una forma que sea fácilmente administrable a un individuo. Por ejemplo, aquí se proporciona una población de OPACs que están contenidos en un recipiente que es adecuado para uso médico. Tal recipiente puede ser, por ejemplo, una bolsa estéril de plástico, un frasco, botella, y otros recipientes de los cuales se pueda surtir fácilmente la población de OPACs. Por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de sangre, y otras bolsas de plástico aceptables médicamente, adecuadas para la administración intravenosa de un liquido a un receptor. El recipiente es preferiblemente uno que permita la criopreservación de la población combinada de células .

La población de OPACs criopreservada puede comprender OPACs derivadas de un donador único, o de múltiples donadores. La población de OPACs puede ser completamente compatible con HLA de un receptor pretendido, o parcialmente o completamente incompatible con la HLA.

Por lo tanto, en una modalidad, aqui se proporciona una composición que comprende una población de OPACs en un recipiente. En una modalidad especifica, la población se criopreserva . En otra modalidad especifica, el recipiente es una bolsa, frasco o bote. En una modalidad más especifica, dicha bolsa es una bolsa estéril de plástico. En una modalidad más especifica, dicha bolsa es adecuada para, permite o facilita la administración intravenosa de una población de OPAC. Las bolsa puede comprender múltiples cavidades o compartimientos que se interconectan para permitir el mezclado de las OPACs y una más de otras soluciones, por ejemplo, un fármaco, antes de, o durante la administración. En otra modalidad especifica, la composición comprende uno o más compuestos que facilitan la criopreservación de la población de célula. En otra modalidad específica, dicha población de OPACs está contenida en solución acuosa aceptable fisiológicamente. En una modalidad más especifica, dicha solución acuosa aceptable fisiológicamente es una solución de NaCl al 0.9%. En otra modalidad especifica, dicha población de OPACs comprende células placentarias que son compatibles con HLA para un receptor de dicha población. En otra modalidad dicha población de OPACs comprende células que son al menos parcialmente incompatibles con HLA para un receptor de dicha población. En otra modalidad especifica, dichas OPACs se derivan de una pluralidad de donadores. 5.1.8.2 Composiciones Farmacéuticas Las poblaciones de OPACs, o las poblaciones de células que comprenden OPACs, pueden ser formuladas en composiciones farmacéuticas para ser usadas in vivo. Tales composiciones farmacéuticas comprenden una población de OPACs, una población de células que comprenden OPACs, en un portador aceptable farmacéuticamente, por ejemplo, una solución salina y otra solución aceptable fisiológicamente para la administración in vivo. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas aqui pueden comprender cualquiera de las poblaciones de OPAC descritas en otra parte de este documento. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender OPACs fetales, maternas o tanto fetales y maternas. Las composiciones farmacéuticas proporcionadas aqui pueden comprender adicionalmente OPACs obtenidas de un individuo o corion, único, o de una pluralidad de individuos o coriones.

Las composiciones farmacéuticas proporcionadas aqui pueden comprende cualquier número útil terapéuticamente de las OPACs. Por ejemplo, una dosis unitaria de OPACs puede comprender, en varias modalidades, aproximadamente al menos, o no más de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 1 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o más OPACs.

Las composiciones farmacéuticas proporcionadas aqui pueden comprender poblaciones de células que comprenden 505 de células viables o no más (es decir, al menos aproximadamente 505 de las células en la población sin funcionales o están vivas). Preferiblemente, al menos aproximadamente 60% de las células en la población sin viables. Más preferiblemente, al menos aproximadamente 705, 80%, 905, 95% o 99% de las células en la población en la composición farmacéutica son viables.

Las composiciones farmacéuticas proporcionadas aqui pueden comprender uno o más compuestos, que, por ejemplo, facilitan el injerto (por ejemplo, los anticuerpos del receptor de células T, un inmunosupresor , o los similares) ; estabilizadores, tales como albúmina, dextrano 40, gelatina, hidroxietil almidón, y los similares. 5.1.8.3 Medio Acondicionado con OPAC Las OPAC proporcionadas aquí pueden ser usadas para producir medio acondicionado, es decir, medio que comprende una o más biomoléculas segregadas o excretadas por las células. en varias modalidades, el medio acondicionado comprende medio en el cual las OPACs se han cultivado por al meno 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más días. En otras modalidades, el medio acondicionado comprende medio en el cual las OPACs han sido cultivadas a al menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de confluencia. Tal medio acondicionado puede ser usado para sustentar el cultivo de una población separada de OPACs, o células madre de otro tipo. En otra modalidad, el medio acondicionado comprende medio en el cual las células OPACs han sido diferenciadas en un tipo de células diferenciadas terminalmente, o células que tienen una o más características de células diferenciadas terminalmente. En otra modalidad, el medio acondicionado proporcionado aquí comprende medio en el cual han sido cultivadas las OPACs y no OPACs. 5.1.8.4 Matrices que comprenden OPACs Además, aquí se proporciona matrices, hidrogeles, andamios, y los similares que comprenden OPACs, o una población de OPACs. En ciertas modalidades, al matriz puede ser cualquier sustrato conocido por una persona conocida en la técnica para ser útil para tratar los defectos óseos. Por ejemplo, la matriz puede ser un sustrato de ß-fosfato de tricalcio, un sustrato de ß-fosfato de tricalcio-colágeno, un sustrato de colágeno, un sustrato de bifosfato de calcio, un sustrato de colágeno mineralizado, y un sustrato de ácido hilaurónico. En algunas modalidades, el colágeno en la matriz puede ser colágeno placentario. Los métodos y las composiciones para aislar y preparar el colágeno placentario se describen extensivamente, por ejemplo, en la Publicación de la solicitud de Patente Norteamericana No. 2007/, la descripción de la cual se incorpora aqui como referencia en su totalidad .

Las OPACs pueden ser sembradas sobre la matriz para tratar el hueso antes o después de un paso de diferenciación. Por ejemplo, las OPACs pueden ser cultivadas, por ejemplo, medio osteogénico, por ejemplo, durante aproximadamente 1-20 días, después se siembran sobre la matriz. Alternativamente, las OPACs pueden ser aisladas y sembradas sobre la matriz, entonces se cultivan en medio osteogénico como se describe aquí, por ejemplo durante aproximadamente 1-20 días. En otra modalidad, las OPACs se cultivan, por ejemplo, en medio osteogénico, por ejemplo, aproximadamente 1-20 días, después se siembran sobre la matriz, entonces se cultivan en medio osteogénico como se describe aquí, por ejemplo, aproximadamente 1-20 días.

Las OPACs pueden ser sembradas sobre una matriz natural, por ejemplo, un biomaterial placentario tal como un material de la membrana amniótica. Tal material de la membrana amniótica, puede ser, por ejemplo, la membrana amniótica extirpada directamente de una placenta de mamífero; membrana amniótica fija o tratada por calor, membrana amniótica sustancialmente seca (es decir, <20% de H20) , membrana coriónica, membrana coriónica sustancialmente seca, membrana amniótica o coriónica sustancialmente seca, y las similares. Los biomateriales placentarios preferido sobre los cuales se pueden sembrar las OPACs se describen en Hariri, Publicación de Solicitud Norteamericana No. 2004/0048796.

Las OPACs como se proporcionan aquí, pueden ser suspendidas en una solución de hidrogel adecuada por ejemplo para inyección. Los hidrogeles adecuados para tales composiciones incluyen péptidos de auto ensamblaje, tales como RAD16. En una modalidad, se puede permitir que una solución de hidrogel que comprende las células se endurezca, por ejemplo, en un molde, para formar una matriz que tenga células dispersa en la misma, para implantación. Las OPACs en tal matriz se pueden cultivar de modo tal que las células sean expandidas mitóticamente antes de la implantación. El hidrogel es, por ejemplo, un polímero orgánico (natural o sintético) que se retículo vía enlaces covalentes, iónicos, o de hidrógeno, para crear una estructura de retícula abierta tridimensional, que atrapa moléculas de agua para formar un gel. Los materiales de formación de hidrogel incluyen polisacáridos , tales como alginato, y sales del mismo, péptidos, polifosfazinas , y poliacrilatos , los cuales se reticulan iónicamente, o polímeros de bloque tales como copolímeros de óxido de polietileno-polipropilenglicol, los cuales se reticulan por temperatura o pH, respectivamente. En algunas modalidades, el hidrogel o la matriz son biodegradables .

En algunas modalidades, la formulación comprende un gel polimerizable in situ (véase, por ejemplo, la Publicación de solicitud de Patente Norteamericana No. 2002/0022676; Amseth et al, J. Control Reléase, 78(1-3); 199-209 (2002; Wang et al, Biomaterials, 24 (22) : 3969-80 (2003) .

En algunas modalidades, los polímeros son al menos parcialmente en soluciones acuosas, tales como agua, soluciones salinas amortiguadas, o soluciones acuosas de alcoholes, que tienen grupos laterales cargados, o una sal iónica monovalente de los mismos, los ejemplos de polímeros que tienen gripos laterales ácidos que pueden hacerse reaccionar con cationes son poli ( fosfacenos ) , poli (ácidos acrílicos), poli (ácidos metacrílieos ) , copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, poli (acetato de vinilo) , y poliedros sulfonados, tales como poliestireno sulfonado. Los copolímeros que tienen grupos laterales ácidos formados por la reacción de ácido acrílico o metacrílico y monómeros o polímeros de vinil éter también pueden ser usados. Los ejemplos de grupos ácidos son gripos ácido carboxílico, lo se gripos ácido sulfónico, grupos alcohol halogenados (preferiblemente fluorados) , grupos OH fenólicos, y grupos OH ácidos.

Las OPACs o las poblaciones de las mismas pueden ser sembradas sobre una estructura o andamio tridimensional y se implantan in vivo. Tal estructura puede ser implementada en combinación con uno o más factores de crecimiento, células, fármacos, y otros componentes que estimulan la formación de tejidos, o que aumentan o mejoran de otra manera la reparación de tejidos.

Los ejemplos de andamios que pueden ser usados incluyen esteras no tejidas, espumas porosas, o péptidos de auto ensamblaje. Las esteras no tejidas pueden ser formadas usando fibras comprendidas de un copolimero sintético adsorbible de ácidos glicólico y láctico (por ejemplo, PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, N.J.), las espumas, compuestas de, por ejemplo, copolimero de poli (e-caprolactona) /poli (ácido glicólico) (PCL/PGA) , formada mediante los proceso tales como secado por congelación, o liofilización (véase, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,335,699), también pueden ser usados como andamios .

Las OPACs proporcionadas aquí también pueden ser sembradas sobre, o se ponen en contacto con, un material cerámico aceptable fisiológicamente, incluyendo, pero no limitados a fosfato de mono, di, tri, alfa-tri, beta-tri, y tetra calcio, hidroxiapatita, fluoroapatitas , sulfatos de calcio, fluoruros de calcio, óxidos de calcio, carbonatos de calcio, fosfatos de magnesio y calcio, vidrios activos biológicamente, tales como BIOGLASS , y mezclas de los mismos. Los materiales cerámicos biocompatibles, porosos actualmente disponibles comercialmente incluyen SURGIBONE® (CanMedica Corp, Canadá) , ENDOBON® (Merck Biomaterial Francés, Francia) , CEROS® (Mathys, AG, Bettlach, Suiza) , y productos de injerto de hueso de colágeno mineralizado tales como HEALOS™ (DePuy, Inc, Raynham, MA) y VITOSS®, RHAKOSS™, y CORTOSS® (Orthovita, Malvern, Pa.). La estructura puede ser una mezcla, combinación o compuesto de materiales naturales y/o sintéticos.

En otra modalidad, las OPACs pueden ser sembradas sobre, o se ponen en contacto con, un fieltro, el cual puede ser, por ejemplo, compuesto de un hilo de filamentos múltiples fabricado de un material bioadsorbible tales como copolimeros de PGA, PLA, PCL o combinaciones, o ácido hilaurónico.

En otra modalidad las OPACs proporcionadas aquí, pueden ser sembradas sobre andamios de espuma, que pueden ser estructuras compuestas. Tales andamios de espuma pueden ser moldeados en una forma útil, tal como aquella de una porción de una estructura específica en el cuerpo a ser reparada, reemplazada o aumentada. En algunas modalidades, la estructura se trata, por ejemplo con ácido acético O.M seguido por incubación en polilisina, PBS y/o colágeno, antes de la inoculación de las OPACs, con el fin de aumentar la adhesión celular, las superficies externas de una matriz pueden ser modificadas para aumentar la adhesión o el crecimiento de las células y la diferenciación el tejido, por ejemplo mediante revestimiento de plasma de la matriz, o la adición de una o más proteínas (por ejemplo, colágeno, fibras elásticas, fibras reticulares), glicoproteína, glicosaminoglicanos (por ejemplo, heparina, sulfato, condroitin-4-sulfato, condroitin-6-sulfato, sulfato de dermatan, sulfato de queratina, etc. ) , una matriz celular y/u otros materiales tales como, pero no limitados a, gelatina, alginatos, agar, azarosa, y gomas vegetales, y las similares .

En algunas modalidades, el andamio comprende, o se trata con, materiales que proporcionan no trombogénico . Estos tratamientos y materiales también puede promover y sustentar el crecimiento endotelial, la migración, y la deposición de la matriz extracelular . Los ejemplos de estos materiales y tratamientos incluyen, pero no se limitan a materiales naturales tales como proteínas de membrana de basamento tales como laminina y colágeno Tipo IV, materiales sintéticos tales como EPTFE, y poliuretanourea siliconas segmentadas, tales como PURSPAN™ (The Polymer Technology Group, Inc, Berkeley, Calif, ) . El andamio también puede comprender agentes antitrombóticos tales como heparina; los andamios también pueden ser tratados para alterar la carga superficial (por ejemplo, mediante revestimiento con plasma) antes del sembrado con las OPACs. El andamio puede comprender además agentes que estimulan el crecimiento el hueso y/o inhibir la resorción del hueso. Por ejemplo, el andamio puede comprender proteínas morfogénicas de hueso, por ejemplo, B P-2 y/o BMP-7, inhibidores de WNT, y los similares. 5.1.9 Lineas de Células OPAC Inmortalizadas Las OPACs pueden ser inmortalizadas condicionalmente por transfección con cualquier vector que contenga un gen de promoción del crecimiento, es decir, un gen que codifica una proteína que, bajo las condiciones apropiadas, promueve el crecimiento de las células transíectadas , de modo tal que la producción y/o la actividad de la proteína de promoción del crecimiento puede ser regulada por un factor externo. En una modalidad preferida, el gen de promoción del crecimiento es un encogen, tal como, pero no limitado a v-myc, N-myc, c-myc, p53, antígeno T grande de SV40, antígeno T grande de polioma, adenovirus Ela o proteína E7 de papilomavirus humano.

La regulación externa de la proteína de promoción del crecimiento puede ser lograda colocando el gen de promoción del crecimiento bajo el control de un promotor regulable externamente, por ejemplo, un promotor, la actividad de la cual puede ser controlada por ejemplo, modificando la temperatura de las células transfectadas o la composición del medio en contacto con las células. En una modalidad, puede ser empleado un sistema de expresión de genes controlado por tetraciclina (tet) (Grossen et al, Proc. Nati. Acad. Sci, EUA 89:5547-5551, 1992; Hoshimaru, et al, Proc. Nati. Acad. Sci.

EUA 93: 1518-1523, 1996). En ausencia de tet, un transactivador controlado por tet (tTA) dentro de este vector, activa fuertemente la transcripción de PHCMV*-I' un promotor mínimo del citomegalovirus humano fusionado a secuencias del operador tet. La tTa es una proteina de fusión del represor (tetR) del operon de resistencia a tet derivado del transposon 10 de Escherichia coli y el dominio ácido de VP16 del virus de herpes simple. Las concentraciones bajas, no toxicas de tet (por ejemplo, 0.01-1.0 g/mL) abolen casi completamente la transactivación por tTA.

En una modalidad, el vector contiene además un gen que codifica un marcador seleccionable, por ejemplo, una proteína que confiere resistencia a fármacos. El gen de resistencia a neomicina bacteriana (neoR) es uno de tales marcadores que puede ser empleado como se describe aquí. Las células que contiene neoR pueden ser seleccionadas por los medios conocidos por aquellas personas con experiencia ordinaria en la técnica, tales como la adición de, por ejemplo, 100-200 g/mL de G418 al medio de cultivo.

La transfección puede ser lograda mediante cualquiera de una variedad de medios conocidos por aquellas personas con experiencia ordinaria en la técnica, incluyen do, pero no limitadas a, infección retroviral. En general un cultivo de células puede ser transfectado por incubación con una mezcla de medio acondicionado recolectado de la línea de células productoras para el vector y DMEM/F12 conteniendo suplementos N2. Por ejemplo, un cultivo de células placentarias preparado como se describe anteriormente puede se infectado después, por ejemplo, de cinco días in vitro, por la incubación durante aproximadamente 20 horas en un volumen de medio acondicionado y dos volúmenes de DMEM/F12 conteniendo suplementos N2. Las células transíectadas que contienen un marcador seleccionable pueden ser seleccionadas entonces como se describe anteriormente .

Enseguida de la transíección, los cultivos se transfieren a una superficie que permita la proliferación, por ejemplo, que permita que al menos aproximadamente 30% de las células se dupliquen en un periodo de 124 horas. Preferiblemente, el sustrato es un sustrato de poliornitina/laminina, que consiste de plástico de cultivo de tejidos revestido con poliornitiona (10 µg/mL) y/o laminina (10 pg/mL) , un sustrato de polilisina/laminina o una superficie tratada con fibronectina . Los cultivos de alimentan por 3-4 días con medio de crecimiento, el cual puede no estar suplementado con uno o más factores de aumento de la proliferación. Los factores de aumento de la proliferación pueden ser agregados al medio de crecimiento cuando los cultivos son menos que 50% confluentes.

Las lineas celulares OPAC inmortalizadas condicionalmente pueden ser transferidos usando las técnicas estándar, tales como por tripsinización, cuando son 80-95% confluentes. Hasta aproximadamente la vigésima transferencia, es, en algunas modalidades, benéfico mantener la selección (por ejemplo mediante la adición de G418 para las células que contienen un gen de resistencia a neomicina) . Las células pueden ser congeladas también en nitrógeno liquido para el almacenamiento a largo plazo.

Las líneas celulares clónicas pueden ser aisladas de una línea de células OPAC inmortalizadas condicionalmente preparadas como se describe anteriormente. En general tales células clónicas pueden ser aisladas usando las técnicas estándar, tales como mediante dilución limitada o usando anillos de clonación, y expandidas. Las líneas celulares clónicas, pueden ser alimentadas y trasferidas en general como se describe anteriormente.

Las líneas de células OPAC humanas inmortalizadas condicionalmente, las cuales pueden, pero no es necesario que, sean clónicas, pueden ser inducidas a diferenciarse en general mediante la supresión de la producción y/o la actividad de la proteína de promoción del crecimiento bajo las condiciones de cultivo que faciliten la diferenciación. Por ejemplo, si el gen que codifica la proteína de promoción del crecimiento está bajo el control de un promotor regulable externamente, las condiciones, por ejemplo, la temperatura o la composición del medio, pueden ser modificadas para suprimir la trascripción del gen de promoción del crecimiento. Para de sistema de expresión genética controlada por tetraciclina discutido anteriormente la diferenciación se puede lograr mediante la adición de tetraciclina, la transcripción por supresión del gen de promoción del crecimiento. En general 1 g/mL de tetraciclina por 4-5 dias es suficiente para iniciar la diferenciación. Para promover la diferenciación adicional, se pueden incluir agentes adicionales en el medio de cultivo. 5.1.10 Ensayos Las OPACs proporcionadas aquí pueden ser usadas en ensayos para determinar la influencia de las condiciones de cultivo, los factores ambientales, las moléculas (por ejemplo, las biomoléculas, las moléculas inorgánicas pequeñas, etc.) y las similares sobre la proliferación de OPACs, y/o la diferenciación, en comparación con las OPACs no expuestas a tales condiciones.

En una modalidad preferida, las OPACs proporcionadas aqui se analizan por los cambios en la proliferación, la expansión, o la diferenciación tras el contacto con un tipo de moléculas. Por ejemplo, la diferenciación osteogénica puede ser analizada monitoreando la actividad de la fosfatasa alcalina y/o la mineralización del calcio.

En una modalidad, por ejemplo, aqui se proporciona un método para identificar un compuesto que modula la proliferación de una pluralidad de OPACs, que comprende poner en contacto dicha pluralidad de OPACs con dicho compuesto, bajo las condiciones que permitan la proliferación, en donde, si dicho compuesto provoca un cambio detectable en la proliferación de dicha pluralidad de OPACs en comparación con una pluralidad de OPACs que no se ponen en contacto con dicho compuesto, dicho compuesto se identifica como un compuesto que modula la proliferación de las OPACs. En una modalidad especifica, dicho compuesto se identifica como un inhibidor de la proliferación. En otra modalidad especifica, dicho compuesto se identifica como un mejorador de la proliferación.

En otra modalidad, aquí se proporciona un método para identificar un compuesto que modula la expansión de una pluralidad de OPACs, que comprende poner en contacto dicha pluralidad de OPACs, con dicho compuesto, bajo las dicciones que permitan la expansión, en donde, si dicho compuesto provoca un cambio detectable en la expansión de dicha pluralidad de OPACs, en comparación con una pluralidad de OPACs que no se han puesto en contacto con dicho compuesto, dicho compuesto se identifica como un compuesto que modula la expansión de las OPACs. En una modalidad especifica, dicho compuesto se identifica como un inhibidor de la expansión. En otra modalidad especifica, dicho compuesto se identifica como un mejorador de la expansión.

En otra modalidad, aquí se proporciona un método para identificar un compuesto que modula la diferenciación de las OPACs, que comprende poner en contacto dichas OPACs con dicho compuesto bajo las condiciones que permitan la diferenciación, en donde, si dicho compuesto provoca un cambio detectable en la diferenciación de dichas OPACs, en compararon con las OPACs que no han sido puestas en contacto con dicho compuesto, dicho compuesto se identifica como un compuesto que modula la proliferación de las OPACs. En una modalidad especifica, dicho compuesto se identifica como un inhibidor de la proliferación. En otra modalidad especifica, dicho compuesto se identifica como un mejorador de la proliferación. 5.2 Uso de las OPACs 5.2.1 Tratamiento de los Canceres Relacionados con los Huesos Usando OPACs Aquí se proporcionan método para el tratamiento de los individuos con un cáncer relacionado con los huesos, que comprende administrar al individuo una cantidad efectiva terapéuticamente de las OPACs. Los canceres relacionados con los huesos incluyen, sin limitación, mieloma múltiple, cáncer de huesos, cáncer de mama, cáncer de pulmón, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Swing, condrosarcoma, cordoma, histiocitoma fibroso maligno de los huesos, fibrosarcoma de los huesos, cáncer metastásico, mieloma múltiple, y cualquier forma de cáncer metastásico caracterizado por metástasis de los huesos. En ciertas modalidades, la administración de las OPACs es efectiva terapéuticamente para reducir, aliviar o invertir uno o más de los síntomas asociados con el cáncer relacionado con los huesos, por ejemplo, un síntoma provocado o relacionado con un efecto del cáncer sobre uno o más huesos en el individuo. Como reconocerá una persona experimentada en la técnica, el tratamiento de los defectos óseos provocados por el cáncer puede no necesariamente abatir el cáncer en si. El tratamiento de los defectos óseos relacionados con el cáncer como se proporcionan aquí, pueden ocurrir antes, después, o concurrentemente con las terapias adicionales del cáncer, como se discute a continuación. Por consiguiente, en una modalidad los defectos óseos son tratados antes de tratar el cáncer con una terapia anticancerígena. En otra modalidad, los defectos óseos son tratados al mismo o casi al mismo tiempo que se trata el cáncer con una terapia anticancerígena. En otra modalidad, los defectos óseos son tratados después que se trata el cáncer con una terapia anticancerígena En ciertas modalidades, el tratamientos de los canceres relacionados con el hueso, por ejemplo, mieloma múltiple, comprende administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de OPACs a un individuo que tiene células cancerosas relacionadas con los huesos, por ejemplo, células de mieloma múltiple, en donde al menos algunas de dichas OPACs se ponen en contacto directamente al menos con algunas células de mieloma múltiple, por ejemplo, hay un contacto directa célula a célula entre al menos algunas de dic has OPACs y algunas de dichas células cancerosas relacionadas con los huesos. En ciertas otras modalidades, el tratamiento de los canceres relacionados con los huesos, por ejemplo, mieloma múltiple, comprende administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de las OPACs a un individuo, que tiene células cancerosas relacionadas con los huesos, por ejemplo, células de mieloma múltiple, en donde ninguna, o sustancialmente ninguna de dichas OPACs, se pone en contacto directamente con las células de mieloma múltiple, por ejemplo, no hay o sustancialmente sin contacto directo célula a célula entre al menos algunas de dichas OPACs y las células cancerosas relacionadas con el cáncer.

En ciertas modalidades, las OPACs se administran intralesionalmente, por ejemplo, directamente en, o junto a (por ejemplo, en un intervalo de 1-5 cm de) una o más de las lesiones del hueso, provocadas por el cáncer. En ciertas modalidades, las OPACs se administran en combinación con una matriz, por ejemplo, una matriz inyectable.

En ciertas otras modalidades, las OPACs se administran a un individuo que tiene un cáncer relacionado con los huesos en combinación con una matriz sólida, por ejemplo, un sustituto del hueso, una matriz o sustituto de hueso descrito en la Sección 5.2.2, a continuación.

En ciertas otras modalidades, las OPACs se administran intravenosamente al individuo. Las OPACs pueden ser administradas desde cualquier recipiente, o mediante cualquier sistema de administración, adecuados médicamente para la administración de fluidos, por ejemplo, fluidos que comprenden células, a un individuo. Tales recipientes pueden ser, por ejemplo, una bolsa, frasco o botella estéril de plástico, y otros recipientes desde los cuales se surte fácilmente la probación de OPACs. Por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de sangre y otras bolsas de plástico aceptables médicamente para la administración intravenosa de un liquido a un receptor.

La administración intravenosa o intravenosa puede comprender, por ejemplo, al menos, no o más de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 101, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o más OPACs en una dosis individual. Las OPACs pueden ser administradas una vez, o más de una vez, durante el curso de una terapia. Preferiblemente, las OPACs administradas comprenden 50% de células viables o más (es decir, al menos aproximadamente 50% de las células en la población son funcionales o están vivas) . Preferiblemente, al menos aproximadamente 60% de las células en la población son viables. Más preferiblemente al menos aproximadamente 705, 805, 905, 955, 0 99% de las células en la población en la composición farmacéutica son viables. 5.2.1.1 Tratamiento de Mieloma Múltiple Aquí se proporcionan métodos para tratar a un individuo que tenga mieloma múltiple, que comprende administrar a dicho individuo una pluralidad de OPACs, en donde dichas OPACs tienen cualquier combinación de, o todas, las características descritas en la Sección 5.1, anteriormente. En una modalidad específica, dicha pluralidad de OPACs es CD105+, y CD200difusa o CD105+ y CD200 . Los métodos de tratamiento proporcionados aquí abarcan el uso de cualquiera de las OPACs, poblaciones de OPACs, o poblaciones de células que comprenden OPACs, descritas en la Sección 5.1, anteriormente.

El mieloma múltiple es un cáncer de. las células plasmáticas, las cuales son células que producen los anticuerpos del sistema inmunológico . La enfermedad típicamente presenta cuatro características principales: calcio elevado, falla renal, anemia, y lesiones de los huesos. Estos síntomas y otros se discuten a continuación.

Dolor de huesos - Las células de mieloma seqregan IL-6, conocida también como factor de activación de osteoblastos (OAF) , la cual es una citosina que activa la desintegración del hueso por los osteoclastos , creando lesiones óseas dolorosas. Estas lesiones óseas son de naturaleza lítica y son visibles en radiografías, las cuales pueden mostrar lesiones de resorción "perforadas". El dolor de hueso por mieloma involucra la espina doras, y las costillas, y empeora con la actividad. Se puede presentar dolor localizado persistente, y puede indicar una fractura de hueso patológica. La participación de las vértebras puede llevar a compresión de la médula espinal. La desintegración de los huesos también lleva a liberaron del calcio de los huesos, llevando a hipercalcemia, y los síntomas relacionados.

Las áreas de desintegración del hueso, cuando se visualizan en un examen del esqueleto, típicamente aparecen como una o más lesiones líticas sobre el hueso, es decir, regiones en las cuales el hueso aparece ausente o "perforado".

Infección - Otro de los síntomas comunes del mieloma múltiple son las infecciones, ya que el sistema inmunológico se altera. El riesgo aumentado de infecciones se debe a la deficiencia inmunológica que resulta de la hipogammaglobulinemia difusa, la cual se debe a la producción reducida y la destrucción aumentada de los anticuerpos normales. Las infecciones más comunes son neumonías y pielonefritis . Los patógenos de la neumonía común que provocan la enfermedad en múltiples pacientes de mieloma incluyen Strptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, y Klebsiella pneumoniae, en tanto que los patógenos comunes que provocan pielonefritis incluyen Escherichia coli, Tibiamente, las infecciones ocurren en los meses iniciales después del inicio de la quimioterapia.

Falla Renal- El mieloma múltiple también tiende a resultar en falla renal, la cual se puede desarrollar tanto de forma aguda y crónica. La falla renal en el mieloma múltiple se puede atribuir de manera importante a la hipercalcemia, la cual se desarrolla como desmantelamiento osteclástico que sale del hueso. La falla renal también se provocada por el daño tubular por la excreción de cadenas ligera, también llamadas Proteínas de Bence Jones, las cuales se pueden manifestar como el síndrome de Fanconi (acidosis tubular renal tipo II) . Otras causas incluyen la deposición glomerular de amiloides, hiperucemia, infecciones recurrentes (por ejemplo, pielonefritis ) , e infiltración local de células tumorales. La falla renal puede estar asociada con niveles elevados de creatinina sérica.

Anemia, La anemia encontrada en el mieloma es usualmente normocítica y normocrómica, y resulta del reemplazo de la médula ósea por infiltración de células tumorales y la inhibición de la producción normal de glóbulos rojos (hematopoyesis) por las citocinas.

Síntomas neurológicos - Los síntomas del mieloma múltiple incluyen un espectro de condiciones neurológicas , incluyendo debilidad, confusión y fatiga debidas a dolor de cabeza hipercalcémico, cambios visuales y retinopatía, los cuales pueden ser el resultado de la hiperviscosidad de la sangre dependiendo de las propiedades de la paraproteína (véase a continuación) . Otros síntomas neurológicos incluyen dolor radicular pérdida de control de los intestinos o la vejiga (por ejemplo, debido a la participación de la médula espinal que lleva a compresión de la médula) , y síndrome del túnel carpiano y otras neuropatías (por ejemplo, debido a la infiltraron de los nervios periféricos por amilodes). El mieloma múltiple puede dar lugar a paraplejia en los casos que se presentan tardíamente.

Presencia de Paraproteína- Un síntoma de diagnóstico del mieloma múltiple es la presencia de paraproteína en la sangre y/o la orina, la cual es una proteína monoclonal (proteína M) , por ejemplo, una cadena ligera de inmunoglobulina que se produce por la proliferación clonal de células de plasma, o fragmentos de inmunoglobulina.

El mieloma múltiple sintomático se diagnóstica típicamente cuando están presentes los siguientes síntomas o signos: células clónales de plasma que constituyen más del 10% de las células en una biopsia de la médula ósea o en cualquier cantidad en una biopsia de otros tejidos (por ejemplo, plasmacitoma) ; paraproteína ya sea en el suero o la orina; evidencia de daño a los órganos finales (deterioro de órganos o tejidos relacionados), por ejemplo, hipercalcemia (por ejemplo, calcio corregido >2.75 mmol/L en al sangre), insuficiencia renal atribuible al mieloma, anemia definida como hemoglobina <10 g/dL de sangre, lesiones de hueso (por ejemplo, lesiones líticas y osteoporosis con fracturas por compresión, infecciones severas (>2 al año) , amiloidosis (la deposición de proteína amiloide) de otros órganos y síndrome de hiperviscosidad (aumento en la viscosidad de la sangre) .

Los individuos que tienen mieloma múltiple están en uno de los siguientes grupos, en un a modalidad, los individuos que tienen mieloma múltiple nunca han sido tratados por la enfermedad. En otra modalidad, el individuo tiene mieloma responsivo; es decir, mieloma múltiple que está respondiendo a la terapia. En una modalidad especifica, tales individuos exhiben un aumento en la proteina M (paraproteina) de al menos 50% como resultado del tratamiento. En otra modalidad especifica, los individuos exhiben una reducción en 1 proteina M de entre 255 %y 50% como resultado del tratamiento. En otra modalidad, el individuo tiene mieloma múltiple estable, la cual se conoce como mielina que no ha respondido al tratamiento (por ejemplo, la reducción en la proteina M no ha alcanzado el 50%), pero no ha progresado o empeorado. En otra modalidad, el individuo tiene mieloma múltiple progresivo, el cual se refiere a mieloma activo que está empeorando (por ejemplo, aumento en la proteina M y empeoramiento del deterioro de órganos y tejidos y daño terminal a los órganos) . En otra modalidad, el individuo tiene mieloma múltiple reincidente, lo cual se refiere a la enfermedad de mieloma que responde inicialmente a la terapia pero que ha comenzado a progresar otra vez. En modalidades especificas, el individuo ha recaído después de la terapia inicial o ha recaído después de la terapia posterior. En otra modalidad, el individuo tiene mieloma múltiple refractario. En una modalidad específica, el mieloma múltiple refractario es mieloma múltiple que no ha respondido a la terapia inicial. En otra modalidad especifica, el mieloma múltiple refractario es muelota múltiple reincidente que no ha respondido al tratamiento posterior. En otra modalidad especifica, el mieloma múltiple refractario es una enfermedad refractaria, progresiva, que no ha respondido, la cual se refiere a una enfermedad refractaria que está progresando. En otra modalidad especifica, el mieloma múltiple refractario es una enfermedad refractaria no progresiva, no responsiva, la cual se refiere a una enfermedad que no está empeorando .

Por lo tanto, en una modalidad, aquí se proporciona un método para tratar a un individuo que tiene mieloma múltiple, que comprende administrar al individuo OPACs, una población de OPACs o una población de células que comprende OPACs, en donde dicha administración resulta en la reducción detectable de la progresión, la detención detectable del empeoramiento y/o la mejoría detectable de uno o más síntomas del mieloma múltiple. En modalidades específicas, dichos uno o más síntomas comprende calcio elevado en la sangre o la orina en comparación con lo normal, la presencia de lesiones óseas, anemia, o falla renal. En una modalidad más específica, dichos uno o más síntomas comprenden células de plasma clónales que constituyen más del 105 de las células en un a biopsia de médula ósea, o en cualquier cantidad en una biopsia de otros tejidos (por ejemplo, plasmacitoma) ; paraproteina ya sea en el suero o la orina; y/o evidencia de daño terminal de órganos. En una modalidad más especifica dichos uno o más síntomas es una concentración de calcio en la sangre mayor a 2.75 mmol/L, insuficiencia renal, menos de lOg de hemoglobina por decilitro de sangre, la presencia de lesiones óseas, o amiloidosis de uno o más órganos distintos a la médula.

En otra modalidad especifica, dicho síntoma es un síntoma neurológico .· En modalidades más específicas, dichos síntomas son debilidad, confusión, fatiga, dolor de cabeza, cambios visuales, retinopatía, dolor radicular, pérdida de control de los intestinos y la vejiga, síndrome del túnel carpiano, y/o paraplej ia .

En una modalidad específica, aquí se proporciona un método para tratar aun individuo que tenga mieloma múltiple, que comprende administrar al individuo OPACs, una población de OPACs o una población de células que comprenden OPACs, en donde dicha administración resulta en la reducción detectable en un número de células de mieloma múltiple, por ejemplo, células clónales de mieloma múltiple, en uno o más órganos del individuo .

En una modalidad específica, aquí se proporciona un método para tratar aun individuo que tiene mieloma múltiple, que comprende administrar al individuo OPACs, una población de OPACs o una poblaron de células que comprende OPACs, en donde dicha administración resulta en el aumento detectable en la hemoglobina en la sangre del individuo, por ejemplo, un aumento a un nivel dentro de los limites normales. Los niveles normales de hemoglobina varían por la edad el sexo del individuo, como se muestra en al Tabla 1, a continuación: Tabla 1 Por lo tanto, en una modalidad más especifica, aquí se proporciona y método para tratar a un dividuo que tiene mieloma múltiple, que comprende administrar al individuo OPACs, una población de OPACs, o una población de células que comprende OPACs, en donde dicha administración resulta en el r aumento de los niveles de hemoglobina en dicho individuo a un nivel entre 11 g/dL de sangre y 20 g/dL de sangre. En una modalidad más especifica, dicha administración resulta en el aumento de los niveles de hemoglobina en dicho individuo a un nivel entre 11 g/dL de sangre y 13 g/dL de sangre. En otra modalidad especifica, dicha administración resulta en el aumento de los niveles de hemoglobina de la sangre en dicho individuo a niveles entre 12 g/dL de sangre y 16 g/dL de sangre. En una modalidad más especifica, dicha administración resulta en el aumento de los niveles de hemoglobina en dicho individuo a un nivel entre 14 g/dL de sangre y 18 g/dL de sangre .

En otra modalidad, aquí se proporciona un método para tratar a un individuo que tiene mieloma múltiple, que comprende administrar al individuo OPACs, una población de OPACs, o una población de células que comprende OPACs, en donde dicha administraron resulta en una reducción detectable en el nivel de paraproteina en la sangre o la orina de dicho individuo. En una modalidad especifica, dicha administración resulta en la reducción de la paraproteina en al sangre y la orina de dicho individuo a un nivel indetectable .

En otra modalidad, aquí se proporciona un método para tratar a un individuo que tiene mieloma múltiple, que comprende administrar al individuo OPACs una población de OPACs o una población de células que comprende OPACs, en donde dicha administración resulta en la reducción detectable en la severidad y/o el número de lesiones ósea por mieloma múltiple en dicho individuo, cuando se determina por exploración ósea o radiografías. En otra modalidades, aquí se proporciona un método para el tratamiento de un individuo que tiene mieloma múltiple, que comprende administrar al individuo OPACs, una población de OPACs o una población de células que comprende OPACs, en donde dicha administración resulta en la reducción detectable en la pérdida de masa ósea o contenido mineral óseo, la detención en al pérdida de masa ósea o el contenido mineral óseo, o el aumento en la masa ósea o el contenido mineral óseo en dicho individuo.

En otra modalidad especifica del método de tratamiento, dichos no o más síntomas del mieloma múltiple son dolor de huesos, lesiones osteocíticas (por ejemplo, visibles por rayos X o formación de imágenes por resonancia magnética (MRI) ) , osteoporosis , anemia, hipercalcemia, o un síntoma debido a la hipercalcemia, o falla renal. En otras modalidades específicas, dicho individuo nunca ha sido tratado por mieloma múltiple; dicho individuo ha sido tratado por mieloma múltiple y responde a la terapia sin OPAC; dicho individuo ha sido tratado por mieloma múltiple y no ha respondido a la terapia sin OPAC, pero el curso del mieloma múltiple en dicho individuo no ha progresado; o dicho individuo tiene mieloma múltiple progresivo.

En otro aspecto, aquí se proporciona un método para suprimir la proliferación de las células de mieloma múltiple, que comprende poner en contacto dichas células de mieloma múltiple con una pluralidad de OPACs, de modo que la proliferación de dichas células de mieloma múltiple se suprimir de manera detectable. En ciertas modalidades, aquí se promociona un método para suprimir la proliferación de las células de mieloma múltiple in vivo, que comprende administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de OPACs a un individuo que comprende células de mieloma múltiple. En una modalidad especifica, dicha administración reduce (o mejora) de manera detectable uno o más sin tomas o signos del mieloma múltiple, o reduce el empeoramiento de dichos uno o más síntomas o signos del mieloma múltiple.

Las OPACs útiles en los métodos proporcionados aquí, son células osteogénicas , adherentes, del corion (pero no de la falda coriónica (laeve)) que pueden ser identificados y seleccionados por las características morfológicas, marcadores, y de cultivo discutidas al menos en la Sección 5.1, anteriormente. 5.2.1.2 Terapias de Combinación El tratamiento el cáncer relacionado con los huesos, por ejemplo, mieloma múltiple, puede comprender la administración de las OPACs, en combinación con otra terapia, a los individuos que tienen el cáncer.

Por lo tanto, en otro aspecto, aquí se proporciona un método para tratar a un individuo que tiene un cáncer relacionado con los huesos, por ejemplo, mieloma múltiple, que comprende administrar al individuo OPACs, una población de OPACs o una población de células que comprende OPACs, en combinación con una o más terapias anticáncer, por ejemplo, una o más quimioterapias o compuestos quimioterapéuticos . Tales otras terapias anticáncer pueden ser administradas al mismo tiempo que, durante o en el mismo curso de tratamiento que, o separado de, dicha administración de las OPACs. En una modalidad especifica, la administraron de dichas otras terapias anticáncer se administra secuencialmente con la administración de dichas OPACs. En una más especifica, dicha otra terapia anticáncer o terapias anticáncer se administran a dicho . individuo antes de la administración de dichas OPACs, por ejemplo, un curso de tales otras terapias anticáncer se administra al individuo, y se completa, antes de la administración al individuo de las OPACs. En otra modalidad más especifica, dichas OPACs se administran al individuo antes de la administración de dichas otras terapias anticáncer, por ejemplo, un curso de las OPACs se administra a dicho individuo antes de la administración de dichas otras terapias anticáncer, y se completa antes de la administración al individuo de dicha otra terapia anticáncer o terapias anticáncer .

En una modalidad especifica, el agente anticáncer es melfalan (conocida también como L-fenilalanina mostaza o L-PAM; nombre comercial Alteran) . Por lo tanto, en una modalidad, el método para tratar a un individuo que tiene mieloma múltiple comprende administra a dicho individuo melfalan, por ejemplo, una o varias dosis efectivas terapéuticamente de melfalan. La administración es típicamente oral o intravenosa. En otra modalidad específica, el agente anticáncer es talidomina. En otra modalidad específica, el agente anticáncer es pomalidomida (vendida bajo el nombre comercial ACTI ID®) ; lenalidomida (vendida bajo el nombre comercial REVLIMID®) ; o lenalidomida en combinación con dexametasona . En otra modalidad especifica, el tratamiento anticáncer comprende una combinación de dexametasona. En otra modalidad especifica, el agente anticáncer comprende es bortezomib (VELCADE®) . En otra modalidad especifica, el agente anticáncer comprende una combinación de melfalab, prednisona, y talidomida (administrados por separado o juntos) . En otra modalidad específica, el agente anticáncer es bortezomib, melfalan, y prednisona (administrados por separado o juntos) .

Otros agentes anticáncer son bien conocidos en la técnica. Por lo tanto, en otras modalidades específicas, los agentes anticáncer incluyen, pero no se limitan a: acivicina; aclarubicina ; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina ; aldesleucina ; altretamina; ambomicina; acetato de ametantrona ; amsacrina; anastrozol; antramicina; asparagina; asperlina; azacitidina; azetepa azotomicina ; batimastato; benzodepa; bicalutamida ; clorhidrato de bisantreno; dimesilato de bisnafida; bizelesina; sulfato de bleomicina; brequinar sódico, bropirimida ; busulfano; cactinomicina ; calusterona ; caraceida; carbetimero; carboplastina, carmustina, clorhidrato de carubicina; carzelesina; cdefingol; celecoxib (inhibidor de COX-2); clorambucilo; cirolemicina; cisplatina; cladribina; mesilato de crisnatol; ciclofosfamida; citarabina; dacarbazna; dactinomicina ; clorhidrato de daunorubicina ; decitabina; dexormaplatina; dezaguanina; mesilato de dezaguanina; docetazol, doxorubicina; clorhidrato de doxorubicina; droloxifeno; citrato de droloxifeno; propionato de dromostanolona; duazomicina; edatrexato; clorhidrato de eflomitina; elsaraitrucina; enloplatina ; enpromato; epipropidina ; clorhidrato de epirubicina; erbuzol; clorhidrato de esorubicina; estramustina ; fosfato sódico de estramustona; etanidazol; etoposida; fosfato de etoposida; etoprida; clorhidrato de fadrozol; fazarabina; fenretinida ; floxuridina; fludarabina ; fluorouracilo; flurocitabina; fosquidona; fostriecina sódica; gemcitabina; clorhidrato de gemcitabina; hidroxiurea; clorhidrato de idarubicina; ifosfamida; ilmofosina; oproplatina; irinotecano; clorhidrato de irinitecano; acetato de lanreotida; acetato de leuprolida; clorhidrato de liároslo; lometrexol sódico; lomustina; clorhidrato de losoxantrona ; masoprocol; maitansina; clorhidrato de mecloretamina ; acetato de megestrol; acetato de melengestrol ; melfalan; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sódico; metoprina; meuredepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina; mitomicina; mitosper; mitotano; clorhidrato de mitoxantrona ; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina ; ormaplatina; oxisurano; paclitaxol; pegapargasa; peliomicina; pentamustina; sulfato de peplomicina ; perfosfamida ; pipobromano; piposulfano; clorhidrato de piroxantrona; plicamicina; plomestano; porfimero sódico; porfiromicina ; pernimustina; clorhidrato de procarbazina; puromicina; clorhidrato de puromicina; pirazofurina; riboprina; sanfingol; clorhidrato de afingol; semustina; simtrazeno; esparfosato sódico; esparsomicina ; clorhidrato de espirogermanio; espiromustina; espiroplatina; estreptonigrina; estreptozocina ; solufenur; talisomicina; tecpgalano sódico; texotero; tegafur; clorhidrato de teloxantrona; temoporfina; teniposida; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina; citrato de toremifeno; acetato de trestolona; fosfato de triciribina; trimetrexato; glucoronato de trimetrexato triptorelina; clorhidrato de tubolozol; mostaza de uracilo; uredepa; vapreotida; verteporfina ; sulfato de vinblastina; vindesina; sulfato de vindesina; sulfato de vinepidina; sulfato de vinglicinato; sulfato de vinleurosina ; tartrato de vinorelbina; sulfato de vinrosidina; sulfato de vinzolidina; vorozol; zeniplatina; zinostatina; y clorhidrato de zorubicina.

Otros fármacos anticáncer incluyen, pero no se limitan a 20-epi-l , 25-dihdroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona; aclarubicina; acilfulveno; adecilpenol; adozelesina; aldesleucina; antagonistas de ALL-TK; altretamina; ambamustina; amidox; amifostina; ácido aminolevulinico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolida; inibidores de angiogénesis ; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteína morfogenética anti-dorsalizante; antiandrógeno, carcinoma prostético; antiestrógeno; antineoplaston; oligonucleótidos antisetido; glicinato de afidicolina; moduladores genéticos de apoptosis; reguladores de apoptosis; ácido apurinico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina desaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetrona; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastato; antagonistas de BCR/ABL; benzoclorinas ; benzolestaurosporina ; derivados de beta lactama; beta-aletina; betaclamicina B; ácido betulínico; inhibidor de bFGF; bicalutamida; bisantreno; bisaziridinilespermina ; bisnafida; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotol; alfostina C; derivados de canptotecina ; capecitabina ; arboxamida-amino-triazol ; carboxiamidotriazol ; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado del cartílago; carzelesina; inibidores de ' caseína cinasa (ICOS); castanoespermina; cecropina B; cetrorelix; chlorlns; clooquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina ; cladribina; análogos de clomifeno; clotrimazol; colismicina A; colismicina B; combretastatina A4 ; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas ; cicloplatama; cipemicina; ocfosfato de citarabina; factor citolitico; citostatina; dacliximab; decitabina; deshidrodidenmina B; deslorelina; dexametasona; dexifosfamida; dexrazoxano; dexverapamil ; diazicuona; didemnina B; didox; dietilnorespermina; dihidro-5-azacitidina; dihidrotaxol, 9-; dioxamicina ; difenil espiromustina ; docetaxol; docosanol; dolasetrona; doxifluridina ; doxorubicina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebseleno; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflomitina; elemeno; emitefur; epirubicina; epristerida; análogo de estramustina ; agonistas de estrógeno; antagonistas de estrógeno; etanidazol; etoposida fosfato; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finasterida; flavopiridol ; flezelastina; fluasterona; fludarabina; clorhidrato de fluorodaunorunicina; forfenimex; formestano; fostriecina ; fotemustina; gadolinio texafirina; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabin; inhibidores de glutationa; hepsulfam; heregulina; hexametileno bisacetamida; hipericina; ácido ibandrónico; idarubicina; idoxifeno; idramantona; ilmofosina; ilomastato; imatinib (por ejemplo, GLEEVEC®) , imiquimod; péptidos inmunoestimulantes; inhibidor del receptor de factor de crecimiento similar a insulina 1; agonistas de interferona; interferonas ; interleucinas ; yobenguano; yododoxorubicina; ipomeanol, 4-; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetrona; j asplacinolida; kahalalida F; triacetato de lamelarina-N; lanreotida; leinamicina; lenograstim; sulfato de lentinan; leptolstatina ; letrozol; factor inhibidor de leucemia; interferona alfa de leucocitos; leuprolido + estrógeno + progesterona ; leuprorelina ; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido de disacárido lipofilico; compuestos lipofilicos de platino; lisoclinamida 7; lobaplatina; lombricina; lometrexol; lonidamina ; losoxantrona; loxoribina; lurtotecano; lutecio texafirina; lisofilina; péptidos Uticos; maitansinae; manoestatina A; marimastato; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inibidores de metaloproteasa de matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristona; miltefosina; mirimostim; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafida; saporina de factor de crecimiento de fibroblastos de mitotoxina; mitoxantrona; mofaroteno; molgramostim; Erbitux, gonadotropina coriónica humana; monofosforilipido A+ sk. de pared celular de miobacterium; mopidamol; agente anticancerígeno de mostaza; micaperoxido B; extracto de pared celular de micobacterias; miriaporona; N-acetildinalina; benzamidas N-sustituidas; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatina; nemorubicina; ácido neridronico; nilutamida; nisamicina; moduladores de óxido nítrico; nitróxido antioxidante; nitrulina; oblimersen (GENASENSE®) ; O6-bencilguanina ; octreotida; ocicenona; oligonucleótidos ; onapristona ondansetrona; ondansetrona ; oracina; inductor oral de citocina; ormaplatina osaterona; oxaliplatina ; oxaunomicina ; paclitaxol; análogos de paclitaxol; derivados de paclitaxol; palauamina; palmitoilrhizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa ; peldesina; pentosan polisulfato sódico; pentostatina ; pentrozol; perflubrona; perfosfamida ; alcohol perililico; fenazinomicina ; fenilacetato; inhibidores de fosfatasa; picibanil; clorhidrato de pilocarpina; pirarubicina ; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidor del activador plasminógeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo de platino-triamina ; porfimero sódico; porfiromicina; prednisona; propil bis-acridona; prostaglandina J2; inhibidores de proteasoma; modulador inmunológico basado en proteina A; inhibidor de proteina cinasa C; inhibidores de proteina cinasa C, microalgas; inhibidores de tirosina fosfatasa de · proteina; inhibidores de purina nucleósido fosforilasa; purpurinas; pirazoloacridina; conjugado de hemoglobina polioxietileno piridoxilado; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetrona; inhibidores de ras farnesil proteina transferasa; inhibidores de ras; inhibidor de ras-GAP; reteliptina desmetilada; renio Re 186 etidronato; rizoxina; ribozimas; RII retinamida; rohitucina; romurtida; roquinimex; rubiginona Bl; ruboxilo; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidor derivado de senescencia 1; oligonucleótidos de sentido; inhibidores de transducción de señales; sizofirano; sobuzoxano; borocaptato de sodio; fenilacetato de sodio; solverol; proteína de enlace a somatomedina; sonermina; ácido esparfosico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina ; espongistatina 1; esqualamina; estipiamida; inhibidores de estromelisina ; sulfinosina; antagonista de péptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramina; swainsonina; talimustina ; metyoduro de tamoxifeno; tauromustina ; tazaroteno; tecogalan sódico; tegafur; telurapirilio; inhibidores de telomerasa; temoporfina; teniposida; tetraclorodecaoxido; tetra zomina; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; mimético de trombopoyet ina; timalfasina; agonista de receptor de timopoyetina; timotrinano; hormona estimulante de tiroides; estaño etil etiopurpurina; tirapazamina ; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno; inhibidores de traducción; tretinoina; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato; triptorelina ; tropisetrona; turosterida; inhibidores de tirosina cinasa; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; inhibidor del factor de crecimiento derivado del seno urogenital; antagonistas del receptor de urocinasa; vapreotida; variolina B; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatina ; zilascorb; y zinostatina estimalamero .

En otras modalidades, la terapia de combinación comprende la administración de las OPACs a un individuo en combinación con un inhibidor de ostoclastos. En una modalidad especifica, el inhibidor de osteoclastos es un inhibidor de RANKL, por ejemplo, Denosumab. En otra modalidad especifica, el inhibidor de osteoclastos es una integrina o inhibidor de catepsina K.

En otra modalidad la terapia de combinación comprende la administración de las OPACs en combinación con bisfosfonatos . En modalidades especificas, los bisfosfonatos son clodronato y/o pamidronato. 5.2.2 Tratamiento de Defectos del Hueso Usando OPACs Las poblaciones de OPACs pueden ser usadas para tratar los defectos óseos, por ejemplo, los defectos óseos que surgen de traumatismos, o de enfermedades, por ejemplo, enfermedades distintas al cáncer relacionado con los huesos. Las OPACs también pueden ser usadas para tratar cualquier enfermedad o condición que resulta en, o se relaciona con, la pérdida ósea. Como se usa aquí, "tratar" abarca la cura de, la remediación de, la mejora de, la reducción de la severidad de, o la reducción en el curso de tiempo de, una enfermedad, trastorno o condición, o cualquier parámetro o síntoma de los mismos.

Las poblaciones aisladas de OPACs también pueden ser usadas para tratar fracturas de huesos, por ejemplo, fracturas de huesos no articulares. Las poblaciones aisladas de OPACs también pueden ser usadas para fusionar vértebras con el fin de, por ejemplo, completar una fusión espinal en un sujeto en necesidad de la misma. Las poblaciones de OPACs aisladas, en combinación con células madre o progenitoras , también pueden ser usadas para tratar lo anterior.

Las OPACs pueden ser combinadas con un sustrato, por ejemplo, una matriz, para formar una composición implantadle. Por ejemplo, aqui se proporciona una composición, por ejemplo, una composición implantable que comprende OPACs. En una modalidad especifica, la composición implantable comprende una matriz. En una modalidad más específica, dicha matriz es un andamio tridimensional. En otra modalidad específica, dicha matriz comprende colágeno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina o vitronectina . En otra modalidad específica, dicha matriz comprende hidroxiapatita . En una modalidad más específica, dicha matriz comprende tanto colágeno e hidroxiapatita, por ejemplo, la matriz es HEALOS®. En otra modalidad más específica, la matriz es una membrana amniótica o un biomaterial derivado de la membrana amniótica. En otra modalidad específica, dicha matriz comprende una proteína de membrana extracelular . En otra modalidad más específica, dicha matriz comprende un compuesto sintético. En otra modalidad más específica, dicha matriz comprende un compuesto bioactivo. En otra modalidad específica, dicho compuesto bioactivo es un factor de crecimiento, citosina, anticuerpo, o moléculas orgánicas de menos de 5,000 daltons. En ciertas modalidades, la matriz es un polímero sintético degradable, tal como, por ejemplo, ácido poliláctico. En ciertas modalidades, el sustrato de andamiaje implantable es un sustrato de fosfato de ß-tricalcio, un sustrato de sustrato de fosfato de ß-tricalcio-colágeno, un sustrato de colágeno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustrato de colágeno de placenta humana mineralizada, un sustrato de ácido hilaurónico, o un sustrato de cerámica. En ciertas modalidades, el sustrato de andamiaje implantable es un sustrato de fosfato de ß-tricalcio. En ciertas modalidades, el sustrato de andamiaje implantable es un sustrato de fosfato de ß-tricalcio, colágeno. En ciertas modalidades, el sustrato de andamiaje implantable es un sustrato de colágeno. En ciertas modalidades, el sustrato de andamiaje implantable es un sustraído de fosfato de calcio. En ciertas modalidades, el sustrato de andamiaje implantable es un sustrato de colágeno de placenta humana mineralizada.

Las OPACs y las poblaciones de OPACs, también pueden ser inducidas a diferenciarse en un tipo particular de células, ya sea ex vio o in vivo, en preparación para la administración a un individuo en necesidad de tales células, o las células diferenciadas a partir de tales células. Por ejemplo, las OPACs puede ser inyectadas en un órgano lesionado, por ejemplo un hueso lesionado, para la neogénesis y la reparación de la lesión in vivo. Tal lesión se puede deber a tales condiciones y trastornos que incluyen, pero no se limitan a, defectos óseos, incluyendo lesiones que resultan de osteoporosis , cáncer, fracturas, y condiciones de la espina dorsal, que pueden ser tratadas con, por ejemplo, fusión de la espina dorsal. Las OPACs pueden ser inyectadas en el hueso dañado únicamente o pueden ser introducidas con un sustrato implantable como se describe aquí.

Cuando las, OPACs se administran como una suspensión o liquido inyectable, las células pueden ser administradas intravenosamente, o preferiblemente, en el sito del defecto óseo, por ejemplo, la fractura.

En ciertos aspectos, aquí se proporciona un método para tratar defectos óseos en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una composición implantable o inyectable que comprende una poblaron de OPACs proporcionada aquí, tratando por ello el defeco óseo en el sujeto. En ciertas modalidades, el defecto óseo es una lesión osteolitica asociada con un cáncer, una fractura ósea, o una espina dorsal, por ejemplo, en necesidad de fusión. En ciertas modalidades, la lesión osteolitica se asocia con mieloma múltiple, cáncer de hueso, o cáncer metastático. En ciertas modalidades, la fractura ósea, es una fractura no uniforme. En ciertas modalidades, una composición implantable se implanta quirúrgicamente, por ejemplo, en el sitio del defecto óseo. En ciertas modalidades, una composición inyectable se administra quirúrgicamente a la región del defecto óseo. En ciertas modalidades, la composición inyectable se administra sistémicamente .

En una modalidad específica, la composición implantable que comprende las OPACs comprende una matriz, en una modalidad más específica, dicha matriz es un andamio tridimensional. En otra modalidad más específica, dicha matriz comprende colágeno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina, o vitronectina . En otra modalidad específica, la matriz es una membrana amniótica o un biomaterial derivado de membrana amniótica. En otra modalidad específica, dicha matriz comprende una proteína de membrana extracelular . En otra modalidad más específica, dicha matiz comprende un compuesto sintético. En otra modalidad más específica, dicha matriz comprende un compuesto bioactivo. En otra modalidad más específica, dicho compuesto bioactivo es un factor de crecimiento, citosina, anticuerpo, o moléculas orgánicas de menos de 5,000 daltons. En ciertas modalidades, la matriz es un polímero sintético degradable, tal como, por ejemplo, ácido poliláctico o ácido poliglicólico . En ciertas modalidades, el substrato de andamiaje implantable se selecciona del grupo que consiste de un sustrato de fosfato de ß-tricalcio, un substrato de sustrato de fosfato de ß-tricalcio-colágeno, un sustrato de colágeno, un sustrato de fosfato de calcio, un sustraído e colágeno de placenta humana mineralizada, un sustrato de ácido hilaurónico, y un sustrato de cerámica. En ciertas modalidades, el sustrato de andamiaje implantable es un sustrato de fosfato de ß-tricalcio. En ciertas modalidades, el sustrato de andamiaje implantable es un sustrato de sustrato de fosfato de ß-tricalcio-colágeno . En ciertas modalidades, el sustrato implantable de andamiaje es un sustrato de colágeno. En ciertas modalidades, el sustrato de andamiaje implantable es un sustrato de fosfato. En ciertas modalidades, el sustrato de andamiaje implantable es un sustrato de colágeno de placenta humana mineralizada.

En otro aspecto, aquí se proporciona un método para la formulación de una composición inyectable que comprende una población de OPACs con ácido hilaurónico o colágeno. En otro aspecto, aquí se proporciona una composición inyectable que comprende OPACS y ácido hilaurónico o colágeno.

Las OPACs pueden ser administradas sin ser cultivadas bajo las condiciones que hacen que las OPACs se diferencien. Alternativamente, las OPACs pueden ser cultivadas, por ejemplo, en medio osteogénico, por ejemplo, aproximadamente 1-20 días antes de la administración. Alternativamente, las OPACs pueden ser aisladas y seleccionadas sobre una matriz. Después cultivadas en medio osteogénico, por ejemplo, por aproximadamente 1-20. En otra modalidad, las OPACs pueden ser cultivadas, por ejemplo en medio osteogénico, durante por ejemplo, aproximadamente 1-20 días, después se siembran sobre una matriz, después se cultivan en medio osteogénico como se describe aquí, por ejemplo, durante aproximadamente 1-20 días.

En otras modalidades, las poblaciones aisladas de OPACs pueden ser usadas en terapias o protocolos de regeneración o reemplazo autólogo o heterólogo de tejidos, incluyendo, pero no limitados al tratamiento de defectos epiteliales corneales, reparación de cartílagos, dermoabrasión facial, membranas mucosas, membranas timpánicas, revestimientos intestinales, estructuras neurológicas , (por ejemplo, la retina, las neuronas auditivas en la membrana basilar, las neuronas olfativas en el epitelio olfativo) , reparación de quemaduras y heridas para lesiones traumáticas de la piel, p para la reconstrucción de otros órganos o tejidos lesionados u enfermos .

En ciertas modalidades, una población aislada de OPACs se usa en la reconstitución hematopoyética en un individuo que ha sufrido una pérdida parcial o total de células madre hematopoyéticas, por ejemplo, individuos expuestos a dosis letales o sub-letales de radiación (ya sea industrial, médica o militar) ; los individuos que han experimentado mieloablación como parte, por ejemplo, de terapia contra el cáncer, y los similares. Las poblaciones asiladas de OPACs pueden ser usadas en lugar de, o para complementar, la medula ósea o poblaciones de células madre derivadas de medula ósea. Típicamente, aproximadamente 1 x 104 a 2 x 108 células mononucleares de medula ósea por kilogramo de peso del paciente se infunden para el injerto en un transplante de médula ósea (es decir, aproximadamente 70 mL de médula ósea para un domador de 70 kg) . Para obtener 70 mL requiere una donación intensiva y una pérdida significativa de sangre del donador en el proceso de donación. Una población aislada de OPACs para la reconstitución hematopoyética puede comprender, en varias modalidades, aproximadamente, al menos, o no más de 1 x 105, 5 x 1205, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o más OPACs.

Las OPACs proporcionadas aquí, individualmente o en combinación con otras células madre, o poblaciones de células progenitoras , pueden ser usadas en la fabricación de un tejido y órgano un vivo. Los métodos proporcionados aquí abarcan usar las OPACs para sembrar una matriz y para ser cultivadas bajo las condiciones apropiadas para permitir que las células se diferencien y pueblen la matriz. Los tejidos y los órganos obtenidos por los métodos proporcionados aquí pueden ser usados para una variedad de propósitos, incluyendo propósitos de investigación y terapéuticos.

En una modalidad preferida, las OPAC como se proporcionan aquí, y las poblaciones de OPACs, pueden ser usadas para transplantes autólogos y alogénicos, incluyendo transplantes hematopoyéticos tipo compatible de incompatible con la HLA. En una modalidad del uso de las OPACs como transplantes hematopoyéticos alogénicos, los anfitriones se tratan para reducir el rechazo inmunológico de las células del donador, o para crear inmunotolerancia (véase, por ejemplo, las Patente Norteamericana No. 5,800,539 y 5,806,539). En otra modalidad, el anfitrión se trata para reducir el rechazo inmunológico o para crear inmunotolerancia. 6. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos tienen la intención de ilustrar las modalidades presentes y no se deben considerar como limitantes de ningún modo. Todas las referencia ya sea referencias de patentes, referencias de literatura, y otras, citadas aquí, se incorporan aquí como referencia en su totalidad para todo propósito. 6.1 EJEMPLO: AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE OPACS 6.1.1 Materiales y Métodos Aislamiento de OPACs: Se recolectó la placenta a término de madres donadoras saludables después de que se obtuvo un consentimiento informado. El tejido coriónico se separó manualmente del amnios, y se extirparon 12 g de tejido coriónico y se picó en trozos de 1 mm3. El tejido picado se transfirió entonces a una solución de 240 mL de dispasa II a una concentración de 2.4 U/mL; el tejido se incubó con dispasa II durante 1 hora (hr) a 37C con agitación a 80 RPM. Después de la incubación con dispasa, los tejidos digeridos se distribuyeron en porciones alícuotas en tubos de 50 mL para permitir la centrifugación; la muestra de tejido digerido se centrifugó a 220 g durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT) . Después de decantar cuidadosamente los sobrenadantes, los tejidos comprimidos o aglomerados se re-suspendieron y combinaron en una solución de colagenasa II caliente (270 U/mL en un volumen de 240 mL) y se incubaron durante 1 hr a 37C con agitación a 80 RPM. Los digestatos se distribuyeron en porciones alícuotas en tubos de 50 mL para permitir la centrifugación; la muestra de tejido digerido se centrifugó a 220 g durante 5 minutos a RT. La enzima presente en los tejidos digeridos se neutralizó con un lavado de FBS al 5%/PBS. Las muestras se sometieron de nuevo a centrifugación (220 g durante 5 minutos a RT) . Los comprimidos o aglomerados (gue contienen células liberadas así como tejido) se re-suspendieron entonces en FBS al 20% (Hyclone) /oc-MEM (Invitrogen) que contiene penicilina-estreptomicina IX y 1-glutamina IX ó medios de FBS al 10% (Hyclone) /DMEM (Invitrogen) que también contienen penicilina-estreptomicina IX y 1-glutamina IX.

Aislamiento por Adhesión Selectiva de OPACs Como parte de la estrategia de adhesión selectiva, se agregaron suspensiones de células (obtenidas como se describe anteriormente) a matraces que han sido pre-recubiertos con fibronectina (FN, Sigma) , colágeno (COL, StemCell Technologies) , vitronectina (VN, Sigma) , y laminina (LN, Sigma) . Los matraces se recubrieron incubando los matraces con soluciones de 10 µg/mL de cada proteina durante 1 hr a temperatura ambiente para la fibronectina y colágeno, 1 hr a 37 °C para la vitronectina, y 2 horas a 37C para laminina; después de estas incubaciones los matraces se lavaron 2X con PBS.

Tres horas, 24 horas, y 6 días después del sembrado de suspensiones de células en matraces recubiertos, se removieron las células no adherentes/tej idos de los cultivos de establecimiento. Las células que quedan en los matraces de cultivo de tejido se dejaron proliferar entonces. Una vez que los cultivos alcanzaron una confluencia de aproximadamente 80-90%, las células se criopreservaron .

Las células adherentes derivadas del corion (OPACs) se separaron en base a la expresión de la superficie celular de CD200 utilizando la técnica de selección celular inmunomagnética (MACs) utilizando el anticuerpo CD200-PE anti-humano (BD Biosciences, cat 552475) , microperlas anti-PE (Miltentyi, cat# 130-048-801), y columnas MACs (Miltenyi) de acuerdo al protocolo de la columna MACs de Miltenyi.

Cultivo de OPACs Las condiciones de la estrategia de adhesión selectiva que exhibieron los niveles más altos de inducción de fosfatasa alcalina (AP) (recubrimientos LN o VN, FBS al 20%/OÍ-ME , adhesión de establecimiento de 6 días) , se expandieron además en condiciones que fomentaron la funcionalidad osteogénica. Estas condiciones incluyeron el subcultivo en superficies recubiertas con fibronectina, utilizando medios de células madre mesenquimatosas , comercialmente disponibles, o utilizando suero bovino, fetal, adaptado con células madre mesenquimatosas. Dos lineas celulares de la matriz original de adhesión selectiva se subcultivaron de acuerdo a la siguiente matriz en superficies recubiertas con LN, VN, o FN, y con los tres medios representados en la Tabla 2.

Tabla 2: Recubrimiento de establecimiento LN VN 1. FBS Hyclone/aMEM 2. Medios de MSC Lonza 3. FBS adaptado con MSC (Stem Cell Tech) /a??? Las células obtenidas utilizando la matriz de adhesión selectiva mostrada en la Tabla 2 se analizaron entonces mediante citometria de flujo y para la actividad de fosfatasa alcalina. Las células se caracterizaron utilizando los siguientes ensayos: citometria de flujo, análisis de expresión genética, y actividad con fosfatasa alcalina (AP) , y secreción de proteina.

Expresión Genética Las células se tripsinaron y se realizaron conteos de células nucleadas para determinar un mínimo de 1 x 106 a 1 x 107 células. Las células se lisaron entonces utilizando un protocolo para lisis de kit Qiagen RNEasy; los lisados se pasaron entonces a través de una trituradora QIA para maximizar la lisis celular. Se realizó un aislamiento de ARN utilizando un kit Qiagen RNEasy.

La cantidad de ARN se determinó utilizando el espectrofotómetro Nanodrop ND1000; se analizó un mínimo de 28 ng/µ? de ARN mediante Nanodrop ND1000. La calidad de ARN se midió por medio de un bioanalizador' Agilent 2100; se utilizó una relación de ARNr (ARN ribosómico) 28S/18S de 2.0 como una determinante de ARN de buena calidad. Se generaron reacciones del ADNc del ARN utilizando el protocolo del kit o equipo High capacity cDNA archive. Se realizaron reacciones PCR en tiempo real utilizando una mezcla máster de PCR TAQMAN® universal de Applied Biosystems. La reacción PCR utiliza la actividad 5' de la polimerasa de Amplitaq Gold DNA para escindir un sonda TAQMAN® durante la PCR. La sonda TAQMAN® contiene un tinte indicador en el extremo 5" y un tinte extinguidor en el extremo 3" de la sonda. La acumulación de los productos PCR se detecta monitoreando directamente el incremento en la fluorescencia del tinte indicador.

El ARN se aisló de las OPACs, células madre, placentarias, células madre mesenquimatosas (ScienCell Research Labs., Carlsbad, California), y fibroblastos dérmicos humanos (ScienCell Research Labs., Carlsbad, California) para el súper-arreglo de osteogénesis , y de las OPACs y células madre, placentarias (para el arreglo TGF-BMP) . Las células se cultivaron en medios básales (condiciones de crecimiento para cada respectivo tipo de célula) durante 3 días y se cultivaron en medios osteogénicos (condiciones osteogénicas ) durante una semana. Las muestras se aislaron por cuadruplicado utilizando el Mini Kit RNeasy Plus de Qiagen. Todo el aislamiento del ARN fue de buena calidad y se logró correr suficiente rendimiento (que se mide con Nanodrop para la concentración y con el microchip Agilent para pureza) . Los arreglos se corrieron de acuerdo al protocolo del fabricante y los resultados se cuantificaron en un ABI 7900.

Actividad de Fosfatasa Alcalina Para inducir la osteogénesis, las células se sembraron en un medio de crecimiento a 5 x 103 células/cm2 durante aproximadamente 3 días, y luego se mantuvieron en medio de crecimiento o se indujeron con un medio OS (FBS al 10%/DMEM) que contenia ácido ascórbico (50 µ?/p?) , dexametasona (0.1 µ?) , y oí-glicerofosfato (10 m ) por hasta 2 semanas; las células se alimentaron bisemanalmente con medio osteogénico o medio de crecimiento recién hecho.

La actividad de la fosfatasa alcalina (AP) en los Usados celulares se determinó utilizando un ensayo colorimétrico (Cell Biolabs, San Diego, CA) , el cual mide la formación del producto de p-nitrofenol; la actividad AP se normalizó a pg de ADN (para explicar cualquier diferencia en el número de células) utilizando el ensayo fluorescente de ADNds (ADN de doble cadena) PicoGreen. La cantidad del p-nitrofenol formado por los Usados celulares, se determinó mediante un análisis de regresión lineal a partir de una curva estándar generada utilizando cantidades conocidas de p-nitrofenol (provisto por el kit) . La actividad de fosfatasa alcalina también se evaluó histoquimicamente según las instrucciones del fabricante utilizando un kit (#85) de Sigma.

Ensayo con Unidad Formadora de Colonias - Actividad de Fosfatasa Alcalina Se pre-clasificaron las OPACs que contienen una mezcla de células CD200" y CD200+, poblaciones CD200+, y se sembraron fracciones de flujo continuo (que contenían una concentración relativamente alta de poblaciones negativas/débiles de CD200) en medios de diferenciación osteogénica (FBS al 10%/DME /ácido ascórbico 50 g/ml/dexametasona 0.1 µ ) a 22.5 células/cm2 en platillos cuadriculados de 35 mm. Las células se alimentaron bisemanalmente con medios osteogénicos , y después de 10 días se evaluó histoquimicamente la actividad de fosfatasa alcalina de las células según las instrucciones del fabricante utilizando un kit (#85) de Sigma. El número de colonias positivas a la fosfatasa alcalina se cuantificó visualmente utilizando un microscopio estereoscópico.

Tinción inmunofluorescente Las células se cultivaron en portaobjetos Labtek a 5000 células/cm2 y se cultivaron durante 2-3 días. Las células se fijaron con formaldehído al 3.7% durante 9 minutos, luego se lavaron 3X con PBS. Después de bloquear durante 20 minutos a temperatura ambiente con amortiguador de bloqueo (suero de cabra al 10%, caseína 2X, tritón al 0.3%), las células se tiñeron para NG2 (sulfato de condroitina) y a-actina del músculo liso utilizando anticuerpos NG2 anti-humanos de conejo (Chemicon, dilución 1:150), a-actina del músculo liso antihumana de ratón (Dako, dilución 1:30); las células se incubaron con anticuerpos primarios durante toda la noche a 4C. A continuación las muestras se lavaron entonces con PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios etiquetados fluorescentemente, ya sea anti-conejo AlexaFluor488 (Invitrogen, dilución 1:400) ó anti-ratón AlexaFluor488 (Invítrogen, dilución 1:400); las células se incubaron con anticuerpos secundarios durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación las células se lavaron 3X con PBS y se montaron utilizando medios de montura que contenían DAPI con el fin de contra-teñir los núcleos. Las células se procesaron gráficamente utilizando un microscopio de epifluorescencia .

Ensayo Luminex Los factores secretados en muestras de medio acondicionado de las células se analizaron utilizando el panel 1B-Ilplex de hueso humano (cat # HBN1B-51K-11 ) de Millipore, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Arreglos de Anticuerpos Se cultivaron OPACs, células madre mesenquimatosas , células madre, placentarias , y fibroblastos en medios básales (condiciones de crecimiento) durante 3 días y luego se trasladaron a medios libres de suero durante 24 horas. Se corrieron muestras de los medios en Arreglo RayBiotech RAYBIO® Biotin Label-base Antibody según las instrucciones del fabricante. Los arreglos de quimioluminiscencia se procesaron en imágenes y se analizaron los tamaños de manchas utilizando un GelLogic 2200 Imaging System y un programa de procesamiento de imágenes Kodak MI, respectivamente. 6.1.2 Resultados Adhesión Selectiva y Expresión Genética Todas las condiciones de adhesión de 6 días, produjeron suficientes cifras de células para el análisis, sin embargo las condiciones de adhesión de 3 hr y 24 hr en FBS al 10%/DMEM no proliferaron lo suficiente para producir suficientes células para el análisis. Los genes elegidos para el análisis de expresión de ARNra incluyeron: fosfatasa alcalina (AP) , DLX5 (factor de transcripción) , sialoproteina ósea RUNX2 (factor de transcripción), colagenasa III, osterix (factor de transcripción), y osteocalcina . De estos genes, las células derivadas de los medios de FBS al 20%/ MEM, adhesión de 6 días, y recubrimiento con LN, VN, y COL mostraron expresión incrementada en niveles de ARNm de AP en comparación con las células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea (Figura 1) . Todos los otros genes analizados demostraron niveles más bajo de expresión genética en células placentarias recién aisladas en comparación con las células madre mesenquimatosas.

Los resultados de inmunofenotipificación mostraron incrementos significativos en las poblaciones CD200dim/CD200" en las condiciones de adhesión de 6 días en comparación con las células madre, placentarias, aunque se detectaron incrementos más altos en las condiciones de recubrimiento con LN, VN, COL en FBS al 20%/aMEM. (Figura 2) . La citometria de flujo también confirmó que las OPACs son CD34" y CD105+ (Figura 2) .

Las permutaciones de cultivo, particularmente las condiciones con recubrimiento LN, VN, COL en FBS al 20%/aMEM, que produjeron las poblaciones incrementadas de CD200dln7CD200~, también demostraron incrementos significativos en poblaciones AP+ y Stro-l+ mediante citometria de flujo (Figura 3); estas condiciones también exhibieron niveles altos de expresión genética con AP vs. controles con MSC. Estas mismas condiciones también demostraron incrementos significativos en poblaciones positivas SSEA3 y SSEA4 (Figura 4) .

Un análisis funcional, que se determinó mediante actividad AP, demostró actividad AP inducible bajo condiciones de diferenciación osteogénica (inducción de 10 días) en los substratos recubiertos con FN, LN, VN, COL en condiciones de FBS al 20%/OÍMEM, aunque la condición con recubrimiento FN demostró una inducción más moderada (Figura 5) .

Caracterización de células cultivadas La inmunofenotipificación de las células resultantes de la propagación en varias condiciones de crecimiento demostró que, en las poblaciones CD200+, entre 40-60% de las células fueron CD200+, vs ~100 para células madre, placenterías, (PDAC™s) descritas, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud Norteamericana No. 2007/0275362. También hubo un modesto incremento en el porcentaje de células positivas AP en relación a las PDAC™s, mientras que el porcentaje de células positivas CD105 permaneció igual al de las PDAC™s (Figura 6) .

Para definir mejor las células derivadas del corion (OPACs) , se realizó tinción por inmunofluorescencia para teñir los marcadores asociados con las células que exhiben actividad osteogénica. Los pericitos, que son células asociadas con la vasculatura y conocidas por albergar positivamente la tinción de la actividad osteogénica para NG2 y a-actina del músculo liso. Por lo tanto se realizaron estudios de inmunotinción por inmunofluorescencia para estos marcadores. Las OPACs exhibieron dos diferencias en la tinción en comparación con las PDAC™s: (1) una falta de tinción para la Oí-actina del músculo liso en comparación con las PDAC™s positivas a la o¡-actina del músculo liso, y (2) localización celular difusa de NG2 en comparación con la tinción con NG2 localizado con adhesión focal para PDAC™s estándar; localización de NG2 en estructuras subcelulares tal como las adhesiones focales que acarrean consecuencias en la actividad de NG2 (datos no mostrados ) .

Después de una inducción de 10 días bajo condiciones de diferenciación osteogénicas , las condiciones del medio LN-LN 1 y medio VN-VN 1, que se muestran en la Figura 7, mostraron una inducción más alta (osteogénica/basal ) de actividad AP (flecha negra) , mientras que el medio LN-LN 3 y medio VN-FN 1 demostraron una actividad AP total más alta (flecha abierta) .

Para determinar si la actividad funcional, tal como la actividad osteogénica y la supresión de células T, se deriva de la fracción ba a/negativa CD200 ó en la fracción CD200+ de estas preparaciones de células de adhesión selectiva, se utilizó MACS (separación celular inmunomagnética ) utilizando un anticuerpo CD200 anti-humano para separar estas 2 poblaciones de células. Las 4 líneas celulares identificadas anteriormente por tener ya sea una inducción de AP más alta o una actividad de AP total, más alta, se procesaron para separación magnética en base a la expresión del CD200 y se analizaron mediante citometría de flujo, actividad AP, y formación de unidad formadora de colonias positivas a AP.

La inmunofenotipificación exhibió poblaciones CD200+ >85% puras para 2 de 4 muestras y que la fracción de flujo continuo todavía contenía células CD200+ (Figura 8).

Las células resultantes de la separación se indujeron con medios osteogénicos durante 10 días y se analizó la actividad de AP. Los resultados mostraron que la fracción CD200+ tuvo una expresión inducible de AP disminuida en comparación con las fracciones CD200dim/CD200" (Figura 9).

Los ensayos CFU (ensayo con unidad formadora de colonias) miden las células progenitoras en una población; por ejemplo, comúnmente se utilizan ensayos CFQ-F para medir el número de progenitores en aspirado de médula ósea. El ensayo CFU-AP estima el número de precursores osteoblásticos potenciales en una población. Las fracciones CD200 se sembraron en platillos cuadriculados de 35 mm durante 10 días en medios osteogénicos y se tiñeron para fosfatasas alcalinas. El número de colonias por platillo y el número de colonias positivas al AP se cuantificaron . Las fracciones CD200+ no mostraron CFU-AP y la actividad de CFU total, más baja, mientras que la pre-clasificación, que contiene, que contiene las poblaciones más altas de CD200 débiles/negativas mostró el número más grande de actividad de CFU y CFU positiva al AP. Comparativamente, las poblaciones CD200+ tuvieron niveles mucho más bajos de actividad CFU-AP y CFU total (Figuras 10 y 11) .

Se realizó un ensayo Luminex 11-plex para proteínas secretadas relacionadas con los huesos en muestras de medios acondicionados de OPACs, células madre, placentarias CD200+ (PDAC™s) y células madre mesenquimatosas (MSCs) . Las células se cultivaron durante 3 días en sus respectivos medios, luego se incubaron con DMEM libre de suero durante 24 horas. Para constatar el comportamiento de las células bajo condiciones osteogénicas , las células se cultivaron durante 3 días en condiciones de crecimiento, sometidas a medios de diferenciación osteogénica (medios suplementados con ácido ascórbico y dexametasona) durante 7 días, luego se incubaron con DMEM libre de suero durante toda la noche. Los resultados mostraron que de los 3 tipos de células, las OPACs constitutivamente secretaron los niveles más altos de niveles de osteoprotegerina . Además, cuando los tres tipos de células se cultivaron bajo condiciones de diferenciación osteogénica, solamente las OPACs exhibieron una regulación por incremento de secreción de osteoprotegerina, mientras que las MSCs y PDAC™s mostraron osteoprotegerina regulada por disminución.

Esto implica que en un microambiente óseo, las OPACs pueden adecuarse mejor para inhibir la actividad de osteoclastos a través de la liberación de niveles altos de osteoprotegerina.

Se realizó un análisis de expresión de 84 genes relacionado con la osteogénesis en OPACs, PDAC™s, MSC, y fibroblastos cultivados en medio de crecimiento y en medio osteogénico utilizando una Osteogénesis Humana con Arreglo PCR SuperArray RT2 Profiler ( SABiosciences , Frederick, aryland) . El medio de crecimiento utilizado en el experimento fue o¡MEM/Suero de Bovino Fetal al 20% que comprende penicilina-estreptomicina IX, y L-glutamina IX, y el medio osteogénico utilizado en el experimento fue medio osteogénico que es Amem/Suero Bovino Fetal al 20% que comprende penicilina-estreptomicina IX, L-glutamina IX, ácido ascórbico 50 g/mL, y dexametasona 100 n . La expresión de los genes relacionados con la osteogénesis, se midió en las OPACs, PDAC™s, MSCs, y fibroblastos cultivados bajo condiciones de crecimiento y condiciones de diferenciación osteogénica.

Se encontró expresión genética (que se midió mediante el valor Ct, el ciclo PCR en el cual se detectó primero un incremento significativo de señal de fluorescencia) para la mayoría de los genes osteogénicos medidos en todos los tipos de células. Las OPACs mostraron un único perfil de expresión genética al compararse con las PDAC™s, MSCs, y fibroblastos (Tablas 3A-3C, respectivamente, y un único perfil de inducción de expresión genética, cuando las células se trasladaron del medio crecimiento al medio osteogénico, al compararse con las PDAC™s, MSCs, y fibroblastos (Tablas 3D-3F, respectivamente) . Los valores Ct (Tablas 3A-3C) son números o cifras obtenidas directamente del variador PCR y reportados como un rango; como tal, estos valores se convirtieron en una, dos, tres o cuatro signos más como se explica más adelante. Para calcular el cambio múltiplo en la expresión genética en el medio de crecimiento en comparación con el medio osteogénico, se aplican factores de corrección a los valores Ct en base a la expresión de genes de mantenimiento. Este factor de corrección normaliza las ligeras diferencias en la cantidad de ARN utilizado en la PCR.

Tablas 3A-3C: Expresión genética osteogénica (valores Ct) de OPACS vs PDACs™ (Tabla 3A) , OPACs vs . MSCs (Tabla 3B) y OPACs vs . fibroblastos (Tabla 3C) en medios de crecimiento u osteogénicos, como se define anteriormente (n=2) . El nivel de expresión de los genes se clasificó como ++++ (muy alto, Ct<20), +++ (alto, 20<Ct<25), ++ (medio, 25<Ct<30) , + (bajo, 30<Ct<35), - (bajo, 35<Ct<40) o en blanco (signo no detectado) .

Tabla 3A: OPAC PDAC™ Símbolo G 0 6 0 AHSG — + ALP + + ++ + AMBN + AMELY + + + + ANXA5 ++++ ++++ ++++ ++++ BGLAP ++ ++ ++ ++ BGN +++ ++ +++ +++ BMP1 +++ +++ +++ +++ BMP2 ++ ++ ++ BMP3 + BMP4 +++ +++ +++ +++ BMP5 + + BMP6 ++ ++ ++ ++ CALCR + ++ + + CD36 ++ + ++ + CDH11 ++++ ++++ +++ +++ COL10A1 ++ + + + COL11A1 ++ ++ ++ +++ COL12A1 ++++ +++ ++++ +++ COL14A1 +++ ++++ ++ +++ COL15A1 ++++ ++++ ++ ++ C0L1A1 ++++ ++++ ++++ ++++ COL1A2 ++++ ++++ ++++ ++++ COL2A1 + + + COL3A1 ++++ ++++ ++++ ++++ COL4A3 + + + + COL5A1 ++++ ++++ ++++ ++++ COMP + ++ + +++ CSF2 + + + CSF3 + ++ + — CTSK +++ ++++ +++ ++++ DMP1 — DSPP + + EGF + + ++ + EGFR +++ +++ +++ +++ ENAM + + FGF1 ++ + ++ ++ FGF2 +++ +++ +++ +++ FGF3 + FGFR1 ++ ++ ++ ++ FGFR2 ++ + + + FLT1 ++ ++ +++ ++ FN1 ++++ ++++ ++++ ++++ GDF10 — ICAM1 +++ +++ +++ +++ IGF1 + ++ + + IGF1R +++ +++ +++ +++ IGF2 + ++ ++ ++ ITGA1 +++ ++++ +++ +++ ITGA2 ++ +++ +++ ++ ITGA3 +++ +++ +++ +++ ITGAM + ITGB1 ++++ ++++ ++++ ++++ MINPP1 +++ +++ +++ +++ MMP10 + ++ — + MMP2 ++++ ++++ ++++ ++++ MMP8 + — + MP9 + ++++ + + SX1 ++ ++ ++ ++ NFKB1 +++ +++ +++ +++ PDGFA +++ +++ +++ ++ PHEX + + + + RUNX2 +++ ++ +++ ++ SCARBl ++ ++ +++ ++ SERPINHl ++++ ++++ ++++ ++++ SMAD1 +++ +++ +++ ++ SMAD2 +++ +++ +++ +++ SMAD3 +++ +++ +++ +++ SMAD4 +++ +++ +++ +++ S0X9 + + ++ + STATH + + + + TFIP11 +++ +++ +++ +++ TGFB1 +++ ++++ +++ +++ TGFB2 +++ +++ +++ +++ TGFB3 +++ ++++ ++ +++ TGFBR1 +++ +++ ++ ++ TGFBR2 ++ ++ ++ + TNF + + ++ + TUFT1 +++ ++ +++ ++ T IST1 +++ +++ ++++ +++ VCAM1 +++ ++ ++++ +++ VDR ++ +++ +++ ++ VEGFA +++ +++ +++ +++ VEGFB +++ +++ +++ +++ G: Expresión relativa vs . control en medio de crecimiento. O: Expresión relativa v. control en medio osteogénico.

Tabla 3B: OPAC MSC Símbolo 6 0 G 0 AHSG — — ++ ALPL + + ++ +++ AMBN + AMELY + + + + ????5 ++++ ++++ ++++ ++++ BGLAP ++ ++ +++ +++ BGN +++ ++ +++ ++++ B P1 +++ +++ +++ +++ BMP2 ++ ++ ++ ++ BMP3 + + + BMP4 +++ +++ ++ +++ BMP5 + + + BMP6 ++ ++ ++ ++ CALCR + ++ — + CD36 ++ + + ++ CDH11 ++++ ++++ +++ ++++ COL10A1 ++ + ++ +++ COL11A1 ++ ++ +++ ++++ COL12A1 ++++ +++ +++ ++++ COL14A1 +++ ++++ ++ +++ COL15A1 ++++ ++++ ++ ++ COL1A1 ++++ ++++ ++++ ++++ COL1A2 ++++ ++++ ++++ ++++ COL2A1 + + + COL3A1 ++++ ++++ +++ ++++ COL4A3 + + + ++ COL5A1 ++++ ++++ +++ ++++ COMP + ++ + +++ ITGB1 ++++ ++++ ++++ ++++ INPPl +++ +++ +++ +++ MMP10 + ++ + + MMP2 ++++ ++++ ++++ ++++ MMP8 + — + + MP9 + ++++ + MSX1 ++ ++ + + NF B1 +++ +++ +++ +++ PDGFA +++ +++ ++ ++ PHEX + + + ++ RUNX2 +++ ++ +++ +++ SCARB1 ++ ++ +++ +++ SERPINHl ++++ ++++ ++++ ++++ SMAD1 +++ +++ +++ +++ SMAD2 +++ +++ +++ +++ SMAD3 +++ +++ +++ +++ SMAD4 +++ +++ +++ +++ SOX9 + + ++ +++ STATH + + + + TFIP11 +++ +++ +++ +++ TGFB1 +++ ++++ +++ +++ TGFB2 +++ +++ +++ +++ TGFB3 +++ ++++ ++ +++ TGFBRl +++ +++ ++ ++ TGFBR2 ++ ++ ++ + TNF + + + + TUFT1 +++ ++ ++ ++ TWIST1 +++ +++ +++ +++ VCAM1 +++ ++ +++ +++ VDR ++ +++ ++ +++ VEGFA +++ +++ +++ +++ VEGFB +++ +++ +++ ++++ G: Expresión relativa vs . control en medio de crecimiento O: Expresión relativa v. control en medio osteogénico. Tabla 3C: OPAC Fibroblasto Símbolo G 0 6 O AHSG — — ALPL + + ++ ++ AMBN + AMELY + + + + ANXA5 ++++ ++++ ++++ ++++ BGLAP ++ ++ ++ ++ BGN +++ ++ +++ +++ BMP1 +++ +++ +++ +++ BMP2 ++ ++ + + BMP3 + — BMP4 +++ +++ + ++ BMP5 + + BMP6 ++ ++ + ++ CALCR + ++ — + CD36 ++ + ++ ++ CDH11 ++++ ++++ +++ ++++ COL10A1 ++ + ++ +++ C0L11A1 ++ ++ ++ +++ COL12A1 ++++ +++ +++ ++++ COL14A1 +++ ++++ + ++ COL15A1 ++++ ++++ + ++ COL1A1 ++++ ++++ +++ ++++ COL1A2 ++++ ++++ ++++ ++++ COL2A1 + + + COL3A1 ++++ ++++ +++ ++++ COL4A3 + + + ++ COL5A1 ++++ ++++ +++ +++ COMP + ++ + +++ CSF2 + + + + CSF3 + ++ ++ + CTSK +++ ++++ ++++ ++++ DMP1 - DSPP + + EGF + + + + EGFR +++ +++ +++ +++ ENAM + + + + FGF1 ++ + +++ +++ FGF2 +++ +++ +++ +++ FGF3 + FGFR1 ++ ++ ++ ++ FGFR2 ++ + + FLT1 ++ ++ ++ ++ FN1 ++++ ++++ ++++ ++++ GDF10 — ICAM1 +++ +++ +++ +++ IGF1 + ++ + IGF1R +++ +++ ++ +++ IGF2 + ++ + ++ ITGA1 +++ ++++ +++ +++ ITGA2 ++ +++ ++ ++ ITGA3 +++ +++ +++ +++ ITGA + + ITGB1 ++++ ++++ ++++ ++++ MINPPl +++ +++ ++ +++ MMP10 + ++ — + M P2 ++++ ++++ +++ ++++ MMP8 + — + ++ MMP9 + ++++ + + MSX1 ++ ++ ++ ++ NFKB1 +++ +++ +++ +++ PDGFA +++ +++ ++ ++ PHEX + + + ++ RUNX2 +++ ++ ++ +++ SCARB1 ++ ++ ++ ++ SERPINHl ++++ ++++ ++++ ++++ SMAD1 +++ +++ ++ ++ SMAD2 +++ +++ +++ +++ SMAD3 +++ +++ ++ +++ SMAD4 +++ +++ +++ +++ S0X9 + + + + STATH + + + + TFIP11 +++ +++ +++ +++ TGFB1 +++ ++++ +++ +++ TGFB2 +++ +++ ++ +++ TGFB3 +++ ++++ ++ +++ TGFBRl +++ +++ ++ ++ TGFBR2 ++ ++ + ++ TNF + + + + TUFT1 +++ ++ ++ ++ TWIST1 +++ +++ +++ ++++ VCAM1 +++ ++ + + VDR ++ +++ +++ +++ VEGFA +++ +++ ++ +++ VEGFB +++ +++ +++ +++ G: Expresión relativa vs. control en medio de crecimiento. 0: Expresión relativa v. control en medio osteogénico.

Tablas 3D-3F: La diferencia de múltiplos en la expresión de OPACs, PDACs™, MSCs y fibroblastos de genes seleccionados en medio de crecimiento en comparación con el medio osteogénico. Una diferencia de múltiplos de 10 para un gen particular, por ejemplo, indica que el gen se induce 10 veces en medio osteogénico en comparación con el medio de crecimiento. Solamente se muestran los resultados en los cuales una inducción de múltiplos en el medio osteogénico en OPACs es al menos diez veces más alta o más baja que la inducción de múltiplos en PDACs™ (Tabla 3D) , MSCs (Tabla 3E) o fibroblastos (Tabla 3F) (a los resultados en blanco se les asignó un valor de 0 para la selección) .

Tabla 3D OPAC PDAC™ Símbolo Diferencia de múltiplo Diferencia de múltiplo BMP2 11.65 C0L11A1 3.64 84.86 C0L1A1 0.38 ' 9.31 COL4A3 1.26 12.91 C0L5A1 0.99 6.84 COMP 17.90 4095.78 CSF3 59.08 CTSK 6.88 79.18 FGF1 0.12 1.81 FGFR2 0.27 76.81 MP10 279.30 MMP9 7079936.55 12.25 TGFB2 15.77 0.72 Diferencia de múltiplo: La diferencia entre la expresión en medio de crecimiento y medio osteogénico.

Blanco: La diferencia de múltiplo no pudo calcularse debido que la fluorescencia de un tipo de célula fue demasiado baja Tabla 3E: CTSK 6.88 148.38 FGF1 0.12 1.93 FGFR2 0.27 88.30 IGF1R 4.21 1.53 IGF2 53.38 0.60 ITGA2 8.10 0.16 ITGA3 2.70 0.24 MMP10 279.30 1.44 MMP9 7079936.55 TGFB2 15.77 0.64 Diferencia de múltiplo: La diferencia entre la expresión en medio de crecimiento y medio osteogénico.

Blanco: La diferencia de múltiplo no pudo calcularse debido que la fluorescencia de un tipo de célula fue demasiado baja. Tabla 3F: OPAC Fibroblasto Símbolo Diferencia de múltiplo Diferencia de múltiplo BMP2 11.65 0.95 BMP4 0.23 72.12 COL12A1 0.42 6.55 COMP 17.90 431.41 CSF2 2.16 0.12 CSF3 59.08 0.10 FGF1 0.12 3.26 IGF1 31.46 ITGA2 8.10 0.54 MMP10 279.30 MMP8 38.76 MMP9 7079936.55 0.40 Diferencia de múltiplo: La diferencia entre la expresión en el medio de crecimiento y medio osteogénico.

Blanco: La diferencia de múltiplo no pudo calcularse debido a que la fluorescencia de un tipo de célula fue demasiado baja.

Cuando las OPACs y PDAC™s cultivadas en condiciones de crecimiento se compararon utilizando un conjunto de 84 genes en la superfamilia TGFp/BMP, las OPACs generalmente mostraron una expresión más alta de genes relacionados con la formación ósea (Tabla 4) . Las OPACs tuvieron una expresión más grande de genes que están relacionados con el soporte trófico de formación ósea incluyendo BMPs (especialmente BMP-2) y TGF-Ps. Las OPACs también tuvieron una mayor expresión de genes la cual no pudo relacionarse con el soporte trófico de la inhibición de formación ósea o resorción ósea incluyendo las inhibinas y TGF~ s (el TGF-ß está implicado tanto en la formación como la resorción ósea) . La superfamilia TGF /BMP representa un sistema de retroalimentación complejo de regulación de múltiples sistemas de órganos diferentes. El hecho de que los genes de esta superfamilia se expresen en las OPACs a niveles mayores que en las PDAC™s indica que las OPACs tienen una capacidad mayor para regular el metabolismo ósea que las PDAC™s.

Tabla 4: Regulación por incremento/disminución: Diferencia de múltiplo OPAC/PDAC™ Tabla 4: Expresión genética de los miembros de la superfamilia TGF /B P (valores Ct) de OPACS, PDACs™, SCs y fibroblastos en medios de crecimiento (n=3) . El nivel de expresión de los genes se clasifica como ++++ (muy alto, Ct<20), +++ (alto, 20<Ct<25), ++ (medio, 25<Ct<30) , + (bajo, 30<Ct<35) , - (bajo, 35<Ct<40) o en blanco (signo no detectado) . La diferencia de múltiplo representa la diferencia en el nivel de expresión cuando las OPACs se compararon con las PDACs™. Solamente se muestran genes para los cuales la expresión en OPACs excedió la expresión en las PDACs™, o para los cuales la expresión en las PDACs™ excedió la expresión en OPACs .

Además de la expresión genética, también se realizaron análisis de secreción de proteínas (Arreglo Biotin Label-base Antibody RayBio® de RayBiotech) de OPACs, PDAC™s, MSCs, y crecimiento de fibroblastos bajo condiciones de crecimiento (Figura 13) . Se identificaron un total de 46 proteínas secretadas entre los 4 tipos de células. Las proteínas secretadas por las OPACs, pero no por las PDAC™s, incluyeron el factor I I de coagulación/factor de tejido, decorina, epiregulina, similar a folistatina 1, IGFBP6 , IGF-IIR, I L-2ROÍ (receptor a de interleucina 2), I L-12Rß2 (subunidad ß2 del receptor de la interleucina 12), IL-17RC (receptor C de interleucina), IL-27 (interleucina 27), proteína 1 de unión TGF-beta latente, NCAM-1/CD56 (molécula 1 de adhesión celular neural) , sFRP-4 (proteína 4 relacionada con la familia de proteínas Frizzled, secretada), SMAD4, espinesina, TFPI (inhibidor de la vía del factor de tejido), TGF-ß RI/ALK5 (beta receptor 1 del factor de crecimiento de transformación) , TIMP-2 (inhibidor de tejido de metaloproteasas 2), y TSG-6 (gen 6 estimulado por el factor de necrosis tumoral (TNF) ) . Las proteínas secretadas por las OPACs pero no por las MSCs incluyen la decorina, epiregulina, FGF-7/KGF, IGFBP-3, IL-2Ra (receptor alfa de la interleucina 2), IL-3R (receptor alfa de la interleucina 3) , I L-5R (receptor alfa de la interleucina 5), IL-17RC, IL-27, NCAM-1/CD56, SMAD4, TFPI, TGF- Rl/ALK-5 , TGF- RIII (beta receptor 3 del factor de crecimiento de transformación), y TIMP2. Las proteínas, la expresión de las cuales fue única para las OPACs en comparación con las PDACs™ y MSCs, fueron la decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27, proteína 1 de enlace TGF-beta latente (LTBP) , NCAM-1, Smad , TFPI, TGF-beta R1/ALK5 y TIMP-2. De estas la decorina, IGFBP-6, e IL-27 están implicadas en la regulación ósea. De estas, la similar a la folistatina 1, sFRP-4, y TSG-6 están implicadas en la regulación ósea.

Las OPACs, en un experimento separado, tampoco mostraron expresar RANKL, cuando se evaluaron mediante RT-PCR cuantitativa; las MSCs derivadas de médula ósea, sin embargo, produjeron cantidades significativas de ARN para RANKL. 6.2 EJEMPLO 2: CAPACIDAD DE FORMACIÓN ÓSEA IN VIVO DE LAS OPACS Para evaluar la capacidad de formación ósea in vivo de las OPACs, se realizó un estudio in vivo utilizando un modelo de defecto craneal de reparación ósea. Experimentalmente, se utilizaron cuarenta y ocho (48) ratas macho atímicas Hsd:RH-Foxnlrnu (Harían Laboratories, Indianapolis , Indiana) , de aproximadamente 6 semanas de edad al comienzo del estudio. Todas las ratas tuvieron un defecto de 3 mm x 5 mm creado en cada lado de la cúpula del cráneo. El defecto izquierdo de cada una se trató con un control negativo (reemplazo de injerto óseo HEALOS®, solo) y el defecto derecho de cada una se trató ya sea con un control positivo (HEALOS® + BMP-2), un control negativo (defecto vacio; el hueso se remueve y no se reemplaza con nada), o células (PDAC™s u OPACs) cargadas en la matriz portadora HEALOS®. Se asignaron ocho animales a los grupos de tratamiento con células y se asignaron cuatro animales a los grupos de BMP-2 y defecto vacio. Los defectos se trataron con Healos que contiene las siguientes dosificaciones: 5 pg de BMP-2, ó 3 x 105 - 4 x 105 células.

Las ratas se sacrificaron sietes (7) días después de la implantación. En la necropsia, los cráneos se recolectaron y se colocaron en formaldehido al 10%. La cúpula del cráneo se escaneo con un PIXI, se radiografió, y luego se descalcificó para incrustarse en parafina y seccionarse. Las secciones histológicas coronarias de la cúpula del cráneo se tiñeron con azul de toluidina y tinte H&E (hematoxilina y eosina) . La cantidad de crecimiento óseo hacia adentro en el defecto se evaluó con un sistema de puntuación de 0 a 4 , con 4 como la cantidad más grande.

Detalles de la cirugía Se ordenó un total de cuarenta y ocho (48) más cuatro (4) ratas Hsd: RH-Foxnlrnu atimicas macho de reserva, de Harían, Indianapolis, IN USA. Los animales estaban libres de patógenos específicos y eran de aproximadamente 6 semanas de edad, llegaron a MDS-PS-Efficacy Pharmacology . Las ratas se anestesiaron utilizando ketamina/xilazina suministrada a través de inyección intra-peritoneal, según procedimientos de operación estándar (SOP) . La anestesia general se logró en aproximadamente 3-5 minutos y se observó una falta de respuesta a un pellizco en el dedo del pie. La sedación se mantuvo en toda la cirugía con isoflurano, cuando fue necesario .

El área del cráneo se rasuró utilizando una máquina eléctrica para cortar pelo y se preparó con alcohol y se esterilizó por frotación con clorhexadina . El animal se colocó sosteniendo firmemente la cabeza en una posición estable hacia adelante y se le administró subcutáneamente una inyección de anestésico local (aproximadamente 0.2 mi de xilocaína) en el área craneal central entre las orejas. Se hizo una incisión transversal en la piel en el sitio de la inyección de xilocaína y se colocó un extensor de tejido en la región central del margen rostral de la incisión (colgajo de la piel) . El extensor abrió la incisión y dejo al descubierto el cráneo. La xilocaína, que se vuelve parecida al gel, se extirpó y se hizo una incisión transversal en el periostio en la sutura parietal/interparietal utilizando la hoja del bisturí. El periostio se removió de los huesos parietales después de que se hizo la incisión. Se utilizó un taladro Dremel a una velocidad media para cortar en rodajas suavemente el margen de ambos defectos, un área de aproximadamente 3 mm por 5 mm en cada hueso parietal, hasta que la pieza central del hueso estuvo completamente libre de adhesión. El área se irrigó con un goteo de solución salina estéril durante la perforación para evitar que el hueso se sobrecaliente. Cuando la pieza de hueso se despegó completamente la misma se removió con los fórceps Adson. Los bordes del defecto se revisaron y se aplanaron suavemente utilizando fórceps si era necesario. Para remover el polvo y fragmentos de hueso, el cráneo se enjuagó con aproximadamente 3 mL de solución salina estéril, la cual luego se absorbió con un pedazo de gasa estéril. Un vez que se limpió y removió el exceso de fluido, el defecto se trató con el articulo de prueba asignado. La dermis entonces se jaló de nuevo sobre el cráneo y la incisión dérmica se cerró utilizando suturas Vicryl 3.0 ó 4.0. El personal del área de animales hizo chequeos post-operatorios para documentar la recuperación completa del animal. El Dia 49 post-cirugía, los animales restantes se sometieron a eutanasia por asfixia con CO2.

Detalles de análisis Las cúpulas del cráneo se recolectaron y colocaron en formaldehido al 10%. Después de la fijación, se utilizó una absorbimetria de rayos x a doble energía Lunar (PIXI) para determinar la densidad mineral ósea (BMD) de ambos defectos de la cúpula del cráneo. Se estableció un ROI más pequeño que los márgenes del área del' defecto y se utilizó el ROI del mismo tamaño para ambos defectos en todas las muestras. La PIXI midió el área mineral ósea (BMA) y el contenido mineral óseo (BMC; g) . El BMC se dividió entonces entre el BMA (mm2 ) para determinar la densidad mineral ósea del área (BMD; g/mm2 ) . Después de la terminación de la densitometria PIXI las cúpulas del cráneo se radiografiaron y procesaron para Histología. Las cúpulas del cráneo se radiografiaron, se procesaron a través del procesamiento de tejido descalcificado y se recaudaron en dos piezas. Después de recaudarse, las cúpulas del cráneo se incrustaron en parafina. Se cortaron tres secciones de la corona a través de las áreas del defecto, cada una de aproximadamente 4-6 m . de grosor, y se montaron en portaobjetos. Una sección se tiñó con azul de toluidina y otra se tiñó con H&E para la evaluación histopatológica del crecimiento óseo hacia adentro. La determinación del cierre del defecto utilizando escaneos de rayos x se realizó designando una región de interés circundante al defecto craneal, creando umbrales de uso para definir un área radio-luminosa (defecto residual oscuro) de las áreas radio-opacas, cuantificando estas áreas de defecto residual utilizando un programa informático para procesamiento de imágenes.

Los resultados demostraron un incremento del 20% en la formación ósea, como se observa mediante los incrementos en BMC y BMD, y mediante tinción H&E, para las OPACs en comparación con las PDAC™s en este modelo. En base al análisis de los datos in vivo, las OPACs exhibieron al menos 20% más formación ósea que las PDAC™s mediante análisis histológico (Figura 14) y análisis densitométrico (PIXI) (Figura 15). Además, el análisis del área de defecto residual utilizando escaneos con rayos x obtenidos al momento del sacrificio, indicó que 63% de los animales en el grupo OPAC mostró más del 50% de cierre del defecto en comparación con 38% de los animales en el grupo PDAC (Figura 16). 6.3 EJEMPLO 3: TRATAMIENTO DE MIELOMA MÚLTIPLE UTILIZANDO OPACS 6.3.1 Materiales & Métodos 6.3.1.1 Establecimiento de las OPACs transducidas establemente con proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) El vector retrovírico pLEGFP que contiene una secuencia codificadora de la Proteina Fluorescente Verde Mejorada (EGFP) (Clontech, Palo Alto, California, USA) , se utilizó para transfectar temporalmente la linea celular de empaque Phoenix Eco (ecotrópica) utilizando SuperFect (QIAGEN Inc., Valencia, California, USA) . La EGFP es una variante cambiada a roja de la proteina fluorescente verde de tipo natural Aequorea victoria que ha sido optimizada para fluorescencia más brillante y expresión más alta en células mamíferas. Se recolectaron sobrenadantes que contenían partículas retrovíricas 24-48 horas después de la transfeccion. Las OPACs se infectaron con las partículas retrovíricas en la presencia de 8 pg/ml de polibreno durante 12 horas tiempo en el cual los medio se reemplazaron con medio de cultivo recién hecho. En algunos experimentos, las células se expusieron a los sobrenadantes que contenían las partículas virales una vez más antes de seleccionarse cultivando las mismas en la presencia de 200-400 µ?/p?? de G418 durante 2-3 semanas. 6.3.1.2 Implantación de OPACs en Ratones SCID-Rab con Mieloma o Mielomatosos Como una alternativa al uso de tejido óseo humano en un modelo SCID-hu de mieloma humano primario, en su lugar se utilizó un sistema en el cual se implantaron huesos de conejo en ratones SCID (ratones SCID-rab) , seguido por la introducción de células de mieloma directamente en el hueso implantado. Se crearon ratones SCID-rab mielomatosos como se describe previamente. Ver Yata, K. y Yaccoby, S., et al., Leukemia 2004; 18:1891-1897. Se adquirieron ratones CB.17/Icr-SCID (de 6-8 semanas de edad) de Harían Sprague Dawley (Indianapolis, IN, USA) y conejos preñados New Zealand de Myrtle Rabbitry (Thompson Station, TN, USA) . Los conejos de 3-4 semanas de edad se anestesiaron profundamente con una alta dosis de pentobarbital sódico y se sometieron a eutanasia mediante dislocación cervical. Los femorales y tibias de los conejos se cortaron en dos pedazos, con los extremos proximales y distales cercanos, mientras que las vertebras se cortaron en pequeños fragmentos (1 x 2 cm2 ) .

Para el implante óseo, el lado derecho o izquierdo del ratón SCID se enjuagó con alcohol y se secó con gasa estéril. El hueso del conejo se insertó subcutáneamente a través de una pequeña incisión (5 mm) . La incisión se cerró entonces con grapas quirúrgicas estériles, y se permitió llevar a cabo el injerto de los huesos durante 6-8 semanas. En algunos ratones experimentales, se implantaron de manera simultánea dos huesos contra-lateralmente en el mismo ratón. Para cada experimento, se inyectaron directamente 10-50 x 106 células de médula ósea con mieloma, derivadas de pacientes humanos, no separadas, que contienen 17 +/- 8% de células de plasma (PCs) ó 3.3 +/- 1.6 x 106 PCs en 50 µ? de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) en el hueso de conejo implantado. Se utilizaron al menos dos ratones para cada experimento. Los ratones se desangraron periódicamente desde la vena de la cola para medir cambios en los niveles de inmunoglobulina (Ig) humana circulante del isotipo de la proteina M.

El establecimiento del crecimiento del mieloma se demostró por medio de niveles incrementados de inmunoglobulinas monoclonales humanas (hlg) en el suero del ratón, como se observan mediante ELISA, y mediante la evaluación radiográfica de lesiones óseas liticas. Se recolectaron 5 x 105 OPACs que expresan EGFP con el uso de tripsina-EDTA y se re-suspendieron en 50 µ? de PBS. Las OPACs se inyectaron directamente en los huesos implantados en los ratones SCID-rab. Los experimentos se continuaron durante 8-16 semanas post-inyección . Los cambios en la densidad mineral ósea (BMD) de los huesos implantados, se determinaron utilizando un densitómetro PIXImus DEXA (GE Medical Systems LUNAR, Madison, WI) . 6.3.1.3 Inmunohistoquímica del Tejido Cosechado de Ratones SCID/Rab Las secciones de hueso descalcificado de los ratones SCID-rab con mieloma primario se retiraron de la parafina con xileno, se rehidrataron con etanol, se enjuagaron en PBS, y el antígeno se recuperó utilizando microondas como se describe previamente (ver Yata, K., supra) . Las OPACs cultivadas se tripsinaron, se prepararon portaobjetos con citospina y se fijaron con formalina amortiguada con fosfato al 10% durante 20 minutos. Después del templado de peroxidasa con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 min, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos monoclonales contra EGFP, y CD166 humano, osteocalcina y BMP-2 (5-0 pg/ml) durante 30-60 min y se desarrollaron utilizando el kit de inmunoperoxidasa de Dako y se contra-tiñeron con hematoxilina . 6.3.1.4 Tinción Von Kossa y de Rojo de Alizarina Para la detección de la deposición de calcio (tinción von Kossa) , las OPACs se fijaron en formalina amortiguada con fosfato al 10% durante 10 min. Se agregó nitrato de plata al 5% recién preparado y los especímenes se dejaron en la oscuridad durante 10 min, se enjuagaron con agua destilada y luego se expusieron a luz UV durante 15 min mientras se cubrían con agua. La reacción se detuvo enjugando completamente con agua destilada. 6.3.1.5 Análisis Estadístico A menos que se indique de otra manera, todos los valores se expresan como media ± error estándar de la media (SE ) . Se utilizó la prueba de la t de Student para analizar el efecto de diferentes condiciones de cultivo en números o cifras de células de mieloma, viabilidad, apoptosis, y proliferación y para analizar el efecto de las OPACs en el crecimiento tumoral y densidad mineral ósea humana (BMD) en ratones SCID-rab. 6.3.1.6 Transducción Mediada con Lentivirus de OPACs Todos los lentivirus recombinantes se produjeron mediante la transfección temporal de células 293T de acuerdo a un protocolo estándar. Brevemente, las células 293T se incubaron durante toda la noche con precipitado de transfección; posteriormente, el medio de cultivo se reemplazó y se siguió por incubación durante unos 2 días adicionales. Los medios de las células transfectadas se cosecharon, se centrifugaron a 3,000 rpm a 4°C durante 15 minutos, y se filtraron a través de un filtro con tamaño de poro 0.22 m. El filtrado se aplicó en capas en la parte superior de un amortiguador o reserva de sacarosa al 20% y se giró a 26,000 rpm a 4°C durante 100 minutos en una centrífuga Beckman utilizando un rotor SW28. Las partículas semejantes a virus, comprimidas o aglomeradas, se suspendieron en DMEM y se almacenaron a -80°C. Las titulaciones de las muestras base o stocks de virus (unidades de titulación [TU] /mi) se determinaron agregando alícuotas de suspensión de virus en monocapas de células 293T u otros tipos de células apropiadas y luego se evaluó el porcentaje de células positivas GFP mediante clasificación de células activada por fluorescencia (FACScan, Becton Dickinson) . Rutinariamente se obtuvieron titulaciones mayores de 109 TU/ml.

Se transfectaron OPACs con las partículas retrovíricas en la presencia de polibreno 8 pg/ml durante 12 horas tiempo en el cual los medios se reemplazaron con medio de cultivo recién hecho. En algún experimento, las células se expusieron a los sobrenadantes que contienen las partículas virales una vez más antes de seleccionarse cultivando las mismas en la presencia de 200-400 pg/ml de G418 durante 2-3 semanas. 6.3.2 Resultados 6.3.2.1 Mineralización de Matriz mediante las OPACs Se cultivaron OPACs en la presencia o ausencia de medios osteogénicos (alfa ME suplementado con FBS al 10%, dexametasona (100 nM) , ascorbato (0.05 mM) y beta GP (10 mM) ) durante aproximadamente 2 semanas. Para la detección de deposición de calcio las células se fijaron en formalina amortiguada con fosfato al 10% durante 10 minutos. Las células fijadas se tiñeron con tinte rojo de alizarina. La reacción se detuvo enjugando completamente con agua destilada. Las OPACs que se cultivaron en medios osteogénicos exhibieron señales de mineralización de matriz como se indica por el enlace del rojo de alizarina al calcio que se deposita en la matriz extracelular producida por las células. La mineralización de matriz es un marcador de diferenciación osteogénica (datos no mostrados) . 6.3.2.2 Inhibición de OPAC de Maduración de Osteoclastos Experimentos de co-cultivo: Utilizando dispositivos de pozos para cultivos polarizados, las OPACs o MSCs primero se cultivaron en la parte posterior de la membrana de inserto con medios osteoblásticos ; los precursores de osteoclastos se incubaron entonces en la cámara superior. Para permitir la diferenciación de osteoblastos y osteoclastos simultáneamente, los insertos se incubaron entonces con a-MEM suplementado con PBS al 10%, RANKL (50 ng/ml), M-CSF (25 ng/ml), dexametasona (100 nM) , ascorbato (0.05 mM) y GP (10 mM) durante aproximadamente 2 semanas. Este procedimiento dio como resultado el crecimiento simultáneo de osteoclastos multinucleados que expresan fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP) y osteoblastos que expresan fosfato alcalino. Los precursores de osteoclastos cultivados en la ausencia de OPACs o células madre mesenquimatosas produjeron un promedio de 120 osteoclastos (ver la Figura 17) . En contraste, los precursores de osteoclastos produjeron un promedio de 40 osteoclastos al cultivarse en la presencia de células madre, placentarias , y un promedio de 60 osteoclastos al cultivarse en la presencia de SCs. Por consiguiente, las OPACs parecen suprimir la formación de osteoclastos más efectivamente que las células madre mesenquimatosas.

El efecto de OPACs en la diferenciación de osteoclastos se redujo de manera significativa, y se formaron significativamente más osteoclastos, cuando se cultivaron osteoclastos y OPACs en la presencia de un anticuerpo para osteoprotegerina (anti-OPG; p < 0.04) . Adicionalmente, de manera significativa (p<0.04) se formaron más osteoclastos cuando se cultivaron OPACs, solas, con precursores de osteoclastos que cuando se cultivaron precursores de osteoclastos en la presencia de anti-OPG. Por consiguiente, sin desear limitarse a ningún mecanismo o teoría particular, la supresión de la diferenciación de osteoclastos mediante OPACs parece mediarse por medio de la osteoprotegerina secretada por la OPAC. 6.3.2.3 Supresión del Crecimiento de Células de Mieloma Múltiple mediante OPACs Se obtuvieron células de mieloma múltiple de aspirados de médula ósea (B ) tratada con heparina de 27 pacientes con mieloma activo durante visitas clínicas programadas. Las muestras de médula ósea se separaron mediante centrifugación por densidad utilizando Ficoll-Paque (gravedad especifica 1.077 g/ml) y la proporción de células de plasma de mieloma múltiple en las fracciones de células de poca densidad, se determinó mediante citometria de flujo CD38/CD45. Se aislaron células de plasma (PCs) utilizando selección con perlas inmunomagnéticas CD138 y el sistema de separación automática autoMACs (Milteny-Biotec, Auburn, CA) . La pureza de PC se determinó mediante citometria de flujo CD38/CD45 que rutineramente es = 94%.

Las OPACs y MSCs se trataron bajo condiciones estándar o condiciones osteogénicas y se co-cultivaron con células de mieloma múltiple. Para experimentos de co-cultivo se utilizaron insertos de pozos polarizados con poros de 1 µ??. En este sistema, se hicieron crecer osteoblastos (es decir, crecimiento de MSCs u OPACs bajo condiciones osteogénicas), las MSCs u OPACs se hicieron crecer en la parte posterior de las membranas de los insertos y se cultivaron células de mieloma múltiple (Con MM) en la cámara superior de los insertos. Para el cultivo, se voltearon boca abajo los insertos de 6 pozos y se colocaron en un platillo hondo estéril. Se recolectaron MSCs u OPACs con tripsina-EDTA- y se re-suspendieron en medio de MSC (aproximadamente 0.5 x 106/ml). Se colocaron aproximadamente 600 µ? de células sobre el centro del inserto invertido. El platillo se cubrió entonces con parafilm y se colocó en la incubadora durante 1 hora, permitiendo a las células adherirse a la membrana. Después de la incubación, los insertos se voltearon de nuevo y se colocaron en placas de 6 pozos. Cuando las MSCs u OPACs fueron aproximadamente 80% confluentes, las mismas se cultivaron con medio de MSC o con medio osteoblástico durante 2-3 semanas. La viabilidad de las células de mieloma múltiple se evaluó utilizando un ensayo MTT después de 72 horas. El ensayo MTT es un ensayo colorimétrico para medir la actividad de enzimas que reducen el MTT a formazán, dándole un color púrpura. Esta reducción tiene lugar sólo cuando las enzimas de reductasa mitocondrial son activas, y por lo tanto la conversión frecuentemente se utiliza como una medida de células viables.

Los resultados muestran que las OPACs no diferenciadas inhibieron la viabilidad de células Con MM aproximadamente al 70% mientras que las MSCs sólo inhibieron la viabilidad de Con MM aproximadamente al 40% (ver la FIG. 18). Bajo condiciones osteogénicas las OPACs inhibieron la viabilidad de las células Con MM aún más que bajo condiciones no osteogénicas; las MSCs también mostraron más inhibición bajo condiciones osteogénicas, aunque no al mismo nivel que las OPACs (ver la FIG. 18) .

También se analizó la capacidad de suprimir la proliferación de lineas de células de mieloma múltiple de las OPACs en comparación con las células madre mesenquimatosas , derivadas de médula ósea, fetales, (FB MSC) en un ambiente de co-cultivo que permita el contacto célula-célula. Se cultivaron OPACs (10,000 células/pozo) con lineas de células BN y JB de mieloma múltiple (ver Li et al., Br. J. Haematology 138 (6) : 802-811 (2007)), ARP1, (linea de células derivadas de mieloma múltiple con IgA sensible a la dexametasona) , U266 (una linea de células de plasma que producen IgE) , Dn y Hale (10,000 células/pozo), todas las cuales expresaron luciferasa, durante 7 días en el medio de RPMI que comprende suero bovino fetal al 10% y antibióticos. Se evaluó el crecimiento de las células de mieloma múltiple mediante la detección de actividad de luciferasa. Las OPACs suprimieron el crecimiento de las lineas de células de mieloma múltiple aproximadamente como sigue: BN (0.4); JB (0.5); ARP1 (0.15); U266 (0.28); Dn (0.32); y hale (0.75), en donde el número en paréntesis indica el crecimiento de las lineas de células MM al doble del crecimiento de las lineas de células MM co-cult ivadas con FB-MSC.

En un experimento adicional, se obtuvieron células de mieloma múltiple de seis diferentes pacientes humanos y se co-cultivaron a 400,00 células/pozo con células madre mesenquimatosas derivadas de médula ósea, fetales, u OPACs durante 6-10 días. La viabilidad de las células de mieloma múltiple se redujo significativamente en la presencia de OPACs en comparación con las MSCs fetales (p<0.03). 6.3.2.4 Biodistribución de OPACs Administradas Intralesionalmente, Etiquetadas , en Animales Este ejemplo demuestra la biodistribución de OPACs transfectadas en ratones. Las OPACs se transfectaron con un indicador de luciferasa. El vector retrovirico pLEGFP que contiene la EGFP (Clontech, Palo Alto, California, USA) se utilizó para transfectar temporalmente la linea de células de empaque Phoenix Eco utilizando SuperFect (QIAGEN Inc., Valencia, California, USA) . Se recolectaron sobrenadantes que contenían partículas retrovíricas 24-48 horas después de la transfección . Se transfectaron OPACs con las partículas retrovíricas en la presencia de polibreno 8 ug/ml durante 12 horas tiempo en el cual el medio se reemplazó con medio de cultivo recién hecho. En algunos experimentos, las células se expusieron a los sobrenadantes que contenían las partículas virales una vez más antes de seleccionarse cultivando las mismas en la presencia de 200-400 pg/ml de G418 durante 2-3 semanas .

Los animales SCID-rab se implantaron con hueso de conejo como se describe previamente. Los animales que tienen el hueso que mostró lesiones progresivas, se inyectaron con células etiquetadas (1 x 106 células) directamente en las lesiones. Se monitoreó la biodistribución de las OPACs en los ratones con procesamiento de imágenes por bioluminiscencia, una herramienta no invasiva, en tiempo real, en diferentes puntos de tiempo. Las OPACs que expresan EGFP podrían detectarse en los ratones 2 semanas y 5 semanas después de la infección en áreas donde el hueso exógeno se implantó en los animales SCID-rab (datos no mostrados) . 6.3.2.5 OPACS que Incrementan la Densidad Mineral Ósea en Ratones SCID-rab con Mieloma Primario Se crearon ratones SCID-rab con mieloma primario como se describe anteriormente. En el establecimiento del crecimiento del mieloma que se evaluó mediante el nivel incrementado de inmunoglobulinas monoclonales humanas (hlg) en el suero de los ratones utilizando ELISA y mediante la evaluación radiográfica de las lesiones óseas líticas, se recolectaron 1 x 106 OPACs que expresan EGFP con el uso de tripsina-EDTA y se re-suspendieron en PBS 100 µ? . Las OPACs y PBS se inyectaron directamente en los huesos implantados, que comprenden lesiones mielomatosas . Los cambios en la densidad mineral ósea (BMD) de los huesos implantados se determinaron utilizando un PIXImus DEXA (GE Medical Systems LUNAR, Madison, I), en intervalos de 5 semanas durante 8-16 semanas post-inyección . Se encontró que las OPACs administradas intra-lesionalmente incrementan la densidad mineral ósea (BMD) del hueso implantado en comparación con los controles en los cuales sólo se inyectó el medio (p = 0.0006). (Ver la Figura 19) 6.3.2.6 OPACs que Incrementan la Masa Ósea en Huesos Afectados por Mieloma Múltiple Se crearon ratones SCID-rab mielomatosos como se describe anteriormente y se inyectaron con células de mieloma primario de un paciente humano. Después del desarrollo de lesiones osteoliticas que se demostraron por un nivel incrementado de inmunoglobulinas monoclonales humanas (hlg) en el suero de los ratones, que se evaluaron mediante ELISA y mediante la evaluación radiográfica de las lesiones óseas liticas, se administraron 10 x 105 OPACs que expresan EGFP como se describe en el ejemplo previo. Los experimentos se continuaron durante 8-16 semanas post-inyección . El nivel de células de mieloma humano se determinó utilizando inmunoglobulinas monoclonales humanas (hlg) en el suero de ratones mediante ensayo ELISA post-inyección de las OPACS (ver la Figura 20) . Los cambios en la densidad mineral ósea (BMD) de los huesos implantados se determinaron utilizando PIXImus DEXa (BE Medical Systems LUNAR, Madison, WI) . Durante el transcurso del estudio, los huesos implantados en ratones mielomatosos que recibieron OPACs administradas intralesionalmente mostraron un incremento significativo (0.10 gm/cm2) en la masa ósea después de 35 días post-inyección en comparación con los ratones que recibieron sólo el amortiguador (p = 0.006). 6.3.2.7 OPACs que Inhiben la Destrucción Ósea en Animales SCID-Rab Administrados con una Línea de Células de Mieloma Múltiple Agresivo Se crearon ratones SCID-rab mielomatosos como se describe anteriormente. En el establecimiento del mieloma utilizando una linea de células de mieloma BN agresivo (una linea de células no hiperdiploides aisladas de un paciente humano) , el efecto del amortiguador u OPACs en el crecimiento de las células de mieloma, se evaluó por el nivel incrementado de inmunoglobulinas monoclonales humanas (hlg) en el suero de los ratones utilizando ELISA y la evaluación radiográfica de lesiones óseas liticas. Se recolectaron 0.5 x 106 OPACs que expresan EGFP (0.5 x 106 células) con el uso de tripsina-EDTA y se re-suspendieron en PBS 50 µ? . Las OPACs y PBS se inyectaron directamente en los huesos implantados en ratones SCID-rab. Los experimentos se continuaron durante 8-16 semanas pos-inyección. Los cambios en la densidad mineral ósea (BMD) de los huesos implantados, se determinaron utilizando un PIXImus DEXA (GE Medical Systems LUNAR, Madison, I). Los datos mostraron que las OPACs inhibieron la pérdida ósea que podría ser atribuible a esta línea de células de mieloma múltiple agresivo que se midió mediante densidad mineral ósea (BMD) y contenido mineral óseo (BMC). Ver la Figura 21.

La reducción/eliminación de pérdida masa ósea debido a las OPACs se confirmó mediante radiografía de rayos X (datos no mostrados) . Los animales tratados con OPAC tuvieron una masa ósea más alta en comparación con los animales de control que se demuestra por un incremento significativo en las áreas radio-densas del nuevo hueso. 6.4. EJEMPLO 4: TRATAMIENTO DE MIELOMA MÚLTIPLE UTILIZANDO OPACS EN COMBINACIÓN CON MELFALÁN Este ejemplo demuestra la efectividad de la administración de OPACs en combinación con el melfalán para tratar lesiones osteoliticas asociadas con mieloma múltiple.

Los ratones SCID-rab mielomatosos se implantaron con hueso como se describe en la Sección 6.3.1.2, anterior. Los ratones se separaron en grupos que recibieron OPACs, a una dosis de aproximadamente 1 millón en solución salina amortiguada con fosfato, y controles que no recibieron OPACs. Los ratones se inyectaron en la semana cero con una línea de células de mieloma múltiple que expresan EGFP/Luciferasa (BN) , directamente en el hueso implantado, y se trataron con 10 mg/kg de melfalán subcutáneamente dos veces a la semana por cuatro semanas, comenzado la semana 3 (semanas 3-7 postinyección de células de mieloma) . En la semana 7, el tratamiento de melfalán se descontinuó, y aproximadamente 1 millón de células/ratón de OPACs no etiquetadas se inyectaron intralesionalmente en el hueso implantado. El avance del padecimiento se siguió durante unas once semanas adicionales. Se realizó un procesamiento de imágenes en los animales vivos en las semanas 3, 7 y 18. Los ratones que recibieron OPACs mostraron una carga reducida de células tumorales de mieloma múltiple, como se evidencia por EGFP y fluorescencia con luciferasa, en comparación con los controles. Además, los ratones que recibieron OPACs mantuvieron su masa ósea mejor que los ratones del control, que muestran aproximadamente un 28% de incremento en la masa ósea post-melfalán en comparación con una pérdida de aproximadamente 4% post-melfalán para los ratones del control. 6.5 EJEMPLO 5: PRODUCCIÓN DEL PRODUCTO DE OPAC CRIOPRESERVADO Y BANCO DE CÉLULAS Este Ejemplo demuestra la producción de un producto a base de OPACs congeladas.

Criopreservación Las OPACs se obtienen como se describe en el Ejemplo 1. Las células que se congelan se cosechan del cultivo con Tripsina-EDTA; se templan con FBS al 2% en PBS, y se cuantifican en un hemacitómetro . Después de la centrifugación, las células se re-suspendieron con DMSO al 10% en FBS a una concentración de aproximadamente 1 millón de células/ml de células que se utilizan para el ensamble de un banco de células, y 10 millones de células/ml para dosis individuales de células congeladas. La solución de células se transfiere a un contenedor de congelación, el cual se coloca en un baño con alcohol isopropilico en un congelador a -80°C. El siguiente día, las células se transfieren a nitrógeno liquido . 6.5.1 Diseño de un Banco de OPAC Un "lote" se define como todas las dosis de células derivadas de un solo corion donador. Las células mantuvieron crecimiento normal, cariotipo, y fenotipo de marcador de superficie celular hasta por 8 pasadas y 30 duplicaciones durante el cultivo de expansión. Dada esta limitación, las dosis comprenden células de 5 pasadas y aproximadamente 20 duplicaciones. Para generar un suministro de células equivalentes, un solo lote se expande en cultivo y se almacena en un banco de células de dos estratos y dosis congeladas. En particular, se utilizan células se cosecharon del cultivo primario, las cuales se definen como células de la Pasada 0 que se han sometido a 0 duplicaciones, para iniciar un cultivo de expansión. Después de la primera pasada, ocurren aproximadamente 4 duplicaciones, y las células se congelan en un Banco de Células Máster (MCB) . Los viales del MCB se utilizan para sembrar cultivos de expansión adicionales. Después de dos pasadas adicionales de células se descongeladas del MCB, las células se solidificaron con congelación en un Banco de Células de Trabajo (WCB) , aproximadamente 12 duplicaciones acumulativas. Los viales del WCB se utilizan para sembrar un cultivo de expansión para otras 2 pasadas, que dan como resultado células de la Pasada 5 aproximadamente en 20 duplicaciones que se solidifican con congelación en dosis individuales . 6.5.2 Descongelación de Células para Cultivo Los contenedores congelados de células se colocan en una bolsa de plástico sellada y se sumergen en un baño de agua a 37 °C. Los contenedores se agitan suavemente hasta que todo el contenido se derrite o descongela excepto un pequeño pedazo de hielo. Los contenedores se remueven de la bolsa de plástico sellada y se agrega lentamente un volumen 10X de medio de cultivo a las células con mezclado suave. Una muestra se cuantifica en el hemacitómetro y se siembra en cultivos de expansión . 6.5.3 Descongelación de Células para Inyección Los contenedores congelados de células se transfieren al sitio de administración en un expedidor de nitrógeno seco. Antes de la administración, los contenedores se colocan en una bolsa de plástico sellada y se sumergen en un baño de agua a 37 °C. Los contenedores se agitan suavemente hasta que todo el contenido se descongela excepto un pequeño pedazo de hielo. Los contenedores se remueven de la bolsa de plástico sellada y se agrega un volumen igual de HSA al 2.5%/Dextrano al 5%. Las células se inyectan sin lavado adicional. 6.5.4 Análisis y Especificaciones Una muestra de sangre materna acompaña a todas las placentas donadoras. La muestra se analiza para el anticuerpo básico y el antigeno de superficie de Hepatitis B, anticuerpo y ácido nucleico del Virus Hepatitis C, y anticuerpo y ácido nucleico de VIH I y II. El procesamiento y el cultivo primario de la placenta comienzan antes de la recepción de los resultados de análisis, pero se continúa solamente para placentas asociadas con el análisis de muestras de sangre materna, negativo para todos los virus. Un lote se rechaza si los análisis de donadores son positivos para cualquier patógeno. Además, los análisis descritos en la Tabla 3 se realizan en el CB, el WCB, y una muestra del material de dosis de células derivado de un vial del WCB. Un lote se libera solamente cuando se cumplen todas las especificaciones. Tabla 3: Análisis y especificaciones de células *Para el producto se designa que es de 40 mi de congeladas células/dosis y un máximo de 5 EU/ml, el producto celular está por debajo del limite superior de 5 EU/kg/dosis para recipientes de más de 40 kg de peso corporal. 6.6 EJEMPLO 6: TRATAMIENTO DE MIELOMA MÚLTIPLE MEDIANTE ADMINISTRACIÓN DE OPACS 6.6.1 Administración intralesional de OPACS en solución Un individuo que presenta mieloma múltiple, con síntomas de dolor de huesos e hipercalcemia (en este caso, niveles de calcio en sangre de entre 3 y 4 mmol/L) . Las imágenes de rayos X confirman la presencia de lesiones múltiples en la tibia, peroné, hueso externo del brazo y cúbito. Se administran 1 x 107 hasta aproximadamente 1 x 108 OPACs en 1.0 - 2.0 mL de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) por lesión al individuo mediante inyección directamente en la lesión. El individuo se evalúa por medio de rayos X cada dos semanas después de la inyección para determinar el grado de las lesiones óseas, y los niveles de calcio en sangre se evalúan mediante rayos X cada semana hasta que las lesiones óseas se reducen visiblemente, o hasta que los niveles de calcio en sangre se reducen detectablemente . Las OPACs se re-administran opcionalmente dentro de las cuatro semanas de la administración inicial. 6.6.2 Administración intralesional de OPACs en gel de colágeno Un individuo que presenta mieloma múltiple, con síntomas de dolor de huesos e hipercalcemia (en este caso, niveles de calcio en sangre de entre 3 y 4 mmol/L) . Las imágenes de rayos X confirman la presencia de lesiones múltiples en la tibia, peroné, hueso externo del brazo y cubito. Se administran 1 x 107 hasta aproximadamente 1 x 108 OPACs, en 1.0 - 2.0 mL de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) que comprende suficiente colágeno para formar un gel inyectable, por lesión, se administran al individuo mediante inyección directamente en la lesión. El individuo se evalúa por medio de rayos X cada dos semanas después de la inyección para determinar el grado de las lesiones óseas, y los niveles de calcio en sangre se evalúan mediante rayos X cada semana hasta que las lesiones óseas se reducen visiblemente, o hasta que los niveles de calcio en sangre se reducen a 3 mmol/L o menos. Las OPACs se re-administran opcionalmente dentro de las cuatro semanas de la administración inicial. 6.6.3 Administración intralesional de OPACs con reemplazo de injerto óseo Un individuo que presenta mieloma múltiple, con síntomas de dolor de huesos e hipercalcemia (en este caso, niveles de calcio en sangre de entre 3 y 4 mmol/L) . Las imágenes de rayos X confirman la presencia de lesiones múltiples en la tibia, peroné, hueso externo del brazo y cúbito. En la cabecera de la cama, un sustituto de injerto de hueso inyectable (por ejemplo, HEALOS® se mezcla con aproximadamente 1 x 107 hasta aproximadamente 1 x 108 OPACs, en 1.0 - 2.0 mL de solución salina amortiguada con fosfato (PBS), luego se inyectan en el individuo en el sitio de las lesiones. El individuo se evalúa por medio de rayos X cada dos semanas después de la inyección para determinar el grado de las lesiones óseas, y los niveles de calcio en sangre se evalúan mediante rayos X cada semana hasta que las lesiones óseas se reducen visiblemente, o hasta que los niveles de calcio en sangre se reducen a 3 mmol/L o menos. Las OPACs se re-administran opcionalmente dentro de las cuatro semanas de la administración inicial. 6.6.4 Administración intravenosa de OPACs Un individuo que presenta mieloma múltiple, con síntomas de dolor de huesos e hipercalcemia (en este caso, niveles de calcio en sangre de entre 3 y 4 mmol/L) . Las imágenes de rayos X confirman la presencia de lesiones múltiples en la tibia, peroné, hueso externo del brazo y cúbito. Se administran aproximadamente 1 x 109 hasta aproximadamente 1 x 1010 OPACs, en aproximadamente 750 mL de solución salina amortiguada con fosfato (PBS) al individuo mediante infusión intravenosa. El individuo se evalúa por medio de rayos X cada dos semanas después de la inyección para determinar el grado de las lesiones óseas, y los niveles de calcio en sangre se evalúan mediante rayos X cada semana hasta que las lesiones óseas se reducen visiblemente, o hasta que los niveles de calcio en sangre se reducen a 3 mmol/L o menos. Las OPACs se re-administran opcionalmente dentro de las cuatro semanas de la administración inicial.

Equivalentes : Las composiciones y métodos dados a conocer en la presente no se limitan en su alcance por las modalidades especificas descritas en la presente. De hecho, serán evidentes varias modificaciones de las modalidades además de las descritas, para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras acompañantes. Se pretende que tales modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anexadas.

En la presente se citan varias publicaciones, patentes y solicitudes de patente, las descripciones de cada de las cuales se incorpora como referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para tratar un individuo que tiene mieloma múltiple, caracterizado en que administre a dicho individuo células adherentes placentarias osteoqénicas (OPACs) , en donde dichos OPACs se obtienen del corión, y son adherentes al plástico de cultivo de tejido, y en donde dichas OPACs son negativas para CD200 o son CD200dlfusa, y positivas para CD105, y en donde dicha administración reduce detectablemente la progresión de, detiene la progresión de, o mejora, uno o más síntomas de dicho mieloma múltiple.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dichas OPACs son SSEA3+ o SSEA4+.

3. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dichos OPACs son SSEA3+ y SSEA4+.

4. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dichas OPACs: expresan uno o más genes a un nivel altamente detectable que un número equivalente de células madre placentarias, adherentes CD200+, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más de B P3 (proteína 3 morfogenética de los huesos) , CDH11, COL10A1, C0L14A1, C0L15A1, DMPl ( fosfoproteína 1 ácida de la matriz de dentina) , DSPP ( sialofosfoproteína de dentina), ENA (enamelina) , FGFR2 (receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos), MMP10 (metaloproteasa 10 de matriz (estromelisina 2) ) , TGFB3, y/o TGFBR1, cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias CD200+ se cultivan en un medio de crecimiento, como se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel altamente detectable que un número equivalente de células madre placentarias, adherentes CD200+, en donde dicho uno o más genes comprenden uno o más de A BN (ameloblastina (proteina de matriz de esmalte)), B P2 (proteina 2 morfogenética de los huesos), CALCR (receptor de calcitonina) , CDHll, C0L11A1, C0L14A1, C0L15A1, C0L2A1, CSF2, CSF3, DMP1, DSPP, ENA , FGF3, GDF10 (factor 10 de diferenciación del crecimiento) , IGF1 (factor 1 de crecimiento similar a la insulina) , ITGA1 (integrina, alfa 1 (CD49)), ITGA2 (integrina alfa 2(CD49B)), MMP10, MMP8 (metaloproteasa 8 de matriz (colagenasa de neutrófilo) ) , MMP9, PDGFA (factor A de crecimiento derivado de las plaquetas), SMAD1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2 (factor beta de crecimiento de transformación, receptor 2) cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio osteogénico, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel altamente detectable que un número equivalente de células madre placentarias, adherentes CD200+, que no son trofoblastos o citotrofoblastos, en donde dicho uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de CDHll, C0L14A1, COL15A1, DMP1, DSPP, ENAM, MMP10, TGFB3 y/o TGFBR1 sin considerar si dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, cuando se evalúa por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel inferior detectable que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+ que no son trofoblastos o citotrofobalastos , en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de AHSG (alfa-2-HS-glicoproteina) , ALPL (fosfatasa alcalina de higado/hueso/riñón) , EGF (factor de crecimiento epidérmico), ' FLT1 (tirosina cinasa 1 relacionada a fms (factor del crecimiento endotelial vascular/receptor del factor de permeabilidad vascular)), IGF2, ITGA2, ITGAM (integrina, alfa M (subunidad del receptor 3 del componente 3 complemento) , SCARB1 (clase B del receptor de depurador, miembro 1), S0X9 (SRY (región Y que determina el sexo) -cuadro 9), TNF, TWIST1 (homólogo 1 Twist; anteriormente blefarofimosis , epicanthus inversus y ptosis 3, acrocefalosindactilil 3) , VCAM1 (molécula 1 de adhesión celular vascular) y/o VDR (vitamina D (1,25- dihidroxivitamina D3) receptor) cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivas en medio de crecimiento, cuando se valora por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel detectablemente inferior que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+ que no son trofoblastos o citotrofoblastos , en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de BGN (biglicano) , COL11A1, CO P (proteína de matriz oligomérica de cartílago) , FGFl y/o VCA 1 cuando dichos OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio osteogénico, cuando se evalúan por los valores Ct de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan VCAM1 a un nivel detectablemente inferior que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+ que no son trofoblastos o citotrofoblastos , sin considerar si dichos OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de BMP4, CALCR, CD36, CDHll, C0L12A1, COL14A1, C0L15A1, C0L13A1, COL5A1, DMPl, DSPP, FLT1 , MSX1, PDGFA, TGFB3, TGFBR1, y/o TUFT1 (Tuftelin 1), cuando los OPACs y las células madre se cultivan en medio de crecimiento, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de AMBN, CALCR, C0L14A1, C0L15A1, CSF3, DMP1, DSPP, ITGA1 , ITGA2, MMP10, MMP9, MSX1, PDGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2, cuando los OPACs y las células madre se cultivan en medio osteogénico, se cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de CALCR, COL14A1, C0L15A1, DMP1, DSPP, MSX1, PDGFA, TGFB3, y/o TGFBR1, sin considerar si las OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresar uno o más genes a un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de ALPL, BGLAP, (proteina gamma-carboxiglutamato del hueso (gla) ) , IGF2, ITGA2, ITGAM, SCARB1 y/o S0X1, cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de AHSG, ALPL, BGLAP, BGN, BMP3 , BMP5, CD36, COL10A1, COL11A1, COL12A1, COL2A1, COL4A3, COMP, EGF, FGF1, FGFR, IGF2, MMP8 , PHEX, (homólogo de la endopeptidasa que regula el fosfato, enlazado a X) , RUNX2 (factor 2 de transcripción relacionado al rechazo) , SCARB1, S0X1, VCAM1 y/o VEGFB, cuando los OPACs y las células madre placentarias se cultivan en medio osteogénic'o, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresar uno o más genes a un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de ALPL, BGLAP, IGF2, SCARBl y/o SOX9, sin considerar si las OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo;

5. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dichas OPACs: expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más de BMP4, BMP6, CD36, CDH11, COL14A1, C0L15A1, C0L1A1, COL3A1, COL5A1, CSF2, CTSK, FGF2, FGFR1 , FLT1, ITGA1, MINPP1, MMP9 , MSX1, PDGFA, SERPINH1, TGFB3 Y TGFBR1, en donde dichas OPACs y dichas células madre mesenquimales han sufrido un número equivalente de pasos o pasajes; o expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células de fibroblasto, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más de BMP4, BMP6, CDH11, C0L14A1, C0L15A1, COL1A1, C0L3A1, C0L5A1, FLT1, IGF1R, ITGA1, MINPPl, PDGFA, SERPINHl, SMAD3 , TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1 , TNF, TUFTl , VCAM1 y VEGFA, en donde dichas células de fibroblasto han sufrido un número equivalente de pasajes o pasos .

6. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dichas OPACs secretan una o más de las proteínas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27 proteína 1 de enlace TGF-beta latente (LTBP) , NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 ó TIMP-2.

7. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dichas OPACs secretan las proteínas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27 proteína 1 de enlace TGF-beta latente (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 ó TIMP-2.

8. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que dicho uno o más síntomas son dolor de huesos, lesiones osteoeíticas , anemia, o falla renal.

9. El método de la reivindicación 1, caracterizado en que comprende administrar al menos 1 x 108 OPACs/kg a dicho individuo .

10. Una célula adherente placentaria ostogénica aislada (OPAC) , caracterizada en que dicha célula se obtiene del corión, y es adherente al plástico de cultivo del tejido, y en donde dicha células es negativa para CD200 o es CD200difusa, y positiva para CD105.

11. La célula aislada de la reivindicación 9, caracterizada en que es SSEA3+ o SSEA4+.

12. La célula aislada de la reivindicación 9, caracterizada en que SSEA+ y SSEA4+.

13. La célula aislada de la reivindicación 9, caracterizada en que dicha célula produce osteoprotegerina .

14. La célula aislada de la reivindicación 9, caracterizada en que dicha célula es adicionalmente negativa para la expresión de la a-actina del músculo liso, negativa para la expresión de RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de la osteoprotegerina, o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible.

15. La célula aislada de la reivindicación 13, caracterizada en que dicha células es adicionalmente negativa para la expresión de la a-actina del músculo liso, negativa para la expresión de RANKL, positiva para la expresión de NG2, positiva para la expresión de la osteoprotegerina, o exhibe actividad de fosfatasa alcalina inducible.

16. La célula aislada de la reivindicación 9, caracterizada dicha célula en que: expresa uno o más genes a un nivel detectable más alto que una célula madre placentería, adherente CD200+, en donde uno o más genes comprende uno o más de BMP6, CDHll, COL10A1, C0L14A1, C0L15A1, C0L1A1, C0L1A2, C0L3A1, COL4A3, C0L5A1, CSF3, CTSK, IGF1R, MINPP1, MMP2, MMP9, MSXl, SMADl, SMAD3 , TGFB3, TGFBR1 y VEGFB, en donde dichas OPAC y dicha célula madre placentaria, adherente CD200+ han sufrido un número equivalente de pasos o pasajes; expresa uno o más genes a un nivel detectable más alto que una célula madre mesenquimal derivado de la médula ósea, en donde uno o más genes comprende uno o más de BMP4, BMP6, CD36, CDHll, COL14A1, COL15A1, COLlAl, COL3A1, COL5A1, CSF2, CTSK, FGF2, FGFR1, FLT1, ITGA1, MINPPl, MMP9, MSXl, PDGFA, SERPINH1, TGFB3 y TGFBR1, en donde dicha OPAC y dicha célula madre mesenquimal han sufrido un número equivalente de pasos o pasajes; y/o expresa uno o más genes a un nivel detectable más alto que una célula de fibroblasto, en donde uno o más genes comprende uno o más de BMP4, BMP6, CDHll, C0L14A1, C0L15A1, COLlAl, COL3A1, C0L5A1, FLT1, IGF1R, ITGA1, MINPPl, PDGFA, SERPINH1, SMAD3, TGFB1, TGFB2, TGFB3, TGFBR1, TNF, TUFT1 , VCAM1 y VEGFA, en donde dichas células de fibroblasto han sufrido un número equivalente de pasos o pasajes en cultivo que es equivalente al número de pasajes que dichas células de fibroblasto has sufrido.

17. La célula · aislada de la reivindicación 9, caracterizada en que dicha célula secreta uno o más de las proteínas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27 proteína 1 de enlace TGF-beta latente (LTBP) , NCAM-1, Smad , TFPI, TGF-beta R1/ALK5 ó TIMP-2.

18. La célula aislada de la reivindicación 16, caracterizada en que dicha célula secreta uno o más de las proteínas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27 proteína 1 de enlace TGF-beta latente (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 ó TIMP-2.

19. Una población aislada de células que comprende las células de la reivindicación 9.

20. La población aislada de células de la reivindicación 9, caracterizada en que dichas células: expresan uno o más genes a un nivel altamente detectable que un número equivalente de células madre placentarias , adherentes CD200+, en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más de BMP3 (proteína 3 morfogenética de los huesos) , CDH11, COL10A1, COL14A1, COL15A1, DMP1 ( fosfoproteína 1 ácida de la matriz de dentina), DSPP (sialofosfoproteína de dentina), ENAM (enamelina) , FGFR2 (receptor 2 del factor de crecimiento de fibroblastos) , MP10 (metaloproteasa 10 de matriz (estromelisina 2)), TGFB3, y/o TGFBR1, cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias CD200+ se cultivan en un medio de crecimiento, como se evalúa por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel altamente detectable que un número equivalente de células madre placentarias, adherentes CD200+, en donde dicho uno o más genes comprenden uno o más de AMBN ( ameloblastina (proteina de matriz de esmalte)), BMP2 (proteina 2 morfogenética de los huesos), CALCR (receptor de calcitonina ) , CDH11, COLllAl, COL14A1, C0L15A1, C0L2A1, CSF2, CSF3, DMP1, DSPP, ENAM, FGF3, GDF10 (factor 10 de diferenciación del crecimiento), IGF1 (factor 1 de crecimiento similar a la insulina) , ITGA1 (integrina, alfa 1 (CD49)), ITGA2 (integrina alfa 2(CD49B)), MMP10, MMP8 (metaloproteasa 8 de matriz (colagenasa de neutrófilo) ) , MMP9, PDGFA (factor A de crecimiento derivado de las plaquetas), SMAD1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2 (factor beta de crecimiento de transformación, receptor 2) cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio osteogénico, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel detectable más alto que un número equivalente de células madre placentarias, adherentes CD200+, que no son trofoblastos o citotrofoblastos , en donde dicho uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de CDH11, C0L14A1, C0L15A1, DMP1, DSPP, ENA , MP10, TGFB3 y/o TGFBR1 sin considerar si dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel inferior detectable que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+ que no son trofoblastos o citotrofobalastos , en donde dichos uno o más genes comprenden uno o más, o todos, de AHSG (alfa-2-HS-glicoproteína) , ALPL (fosfatasa alcalina de higado/hueso/riñón) , EGF (factor de crecimiento epidérmico), FLT1 (tirosina cinasa 1 relacionada al fms (factor del crecimiento endotelial vascular/receptor del factor de permeabilidad vascular), IGF2, ITGA2, ITGAM (integrina, alfa M (subunidad del receptor 3 del componente 3 complemento) ) , SCARB1 (clase B del receptor de depurador, miembro 1) , S0X9 (SRY (región Y que determina el sexo) -cuadro 9), TNF, TWIST1 (homólogo 1 Twist; anteriormente blefarofimosis , epicanthus inversus y ptosis 3, acrocefalosindactilil 3) , VCAM1 (molécula 1 de adhesión celular vascular) y/o VDR (vitamina D (1,25-dihidroxivitamina D3) receptor) cuando dichas OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel detectablemente inferior que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+ que no son trofoblastos o citotrofoblastos , en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de BGN (biglicano) , C0L11A1, COMP (proteina de matriz oligomérica de cartílago), FGF1 y/o VCAM1 cuando dichos OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio osteogénico, cuando se evalúan por los valores Ct de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan VCAM1 a un nivel detectablemente inferior que un número equivalente de células madre placentarias adherentes CD200+ que no son trofoblastos o citotrofoblastos , sin considerar si dichos OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de BMP4 , CALCR, CD36, CDH11, C0L12A1, C0L14A1, C0L15A1, C0L3A1, C0L5A1, DMP1, DSPP, FLT1, MSX1, PDGFA, TGFB3, TGFBR1, y/o TUFT1 (Tuftelin 1), cuando los OPACs y las células madre se cultivan en medio de crecimiento, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de A BN, CALCR, COL14A1, C0L15A1, CSF3, DMP1, DSPP, ITGAl, ITGA2, M P10, M P9, MSX1, PDGFA, TGFB1, TGFB3, TGFBR1 y/o TGFBR2, cuando los OPACs y las células madre se cultivan en medio osteogénico, se cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más alto que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de CALCR, C0L14A1, C0L15A1, DMP1, DSPP, MSX1, PDGFA, TGFB3, y/o TGFBRl, sin considerar si las OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de ALPL, BGLAP, (proteina gamma-carboxiglutamato del hueso (gla) ) , IGF2, ITGA2, ITGAM, SCARB1 y/o S0X1, cuando las OPACs y las células madre mesenquimales se cultivan en medio de crecimiento, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de AHSG, ALPL, BGLAP, BGN, B P3, BMP5, CD36, COL10A1, C0L11A1, C0L12A1, COL2A1, COL4A3, COMP, EGF, FGF1, FGFR2, IGF2, MMP8, PHEX, (homólogo de la endopeptidasa que regula el fosfato, enlazado a X) , RUNX2 (factor 2 de transcripción relacionado al rechazo), SCARB1, S0X1, VCAM1 y/o VEGFB, cuando los OPACs y las células madre placentarias se cultivan en medio osteogénico, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo; expresan uno o más genes a un nivel detectablemente más bajo que un número equivalente de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea, en donde dicho uno o más genes comprende uno o más, o todos, de ALPL, BGLAP, IGF2, SCARB1 y/o SOX9, sin considerar si las OPACs y dichas células madre placentarias se cultivan en medio de crecimiento o medio osteogénico, cuando se evalúan por los valores Ct a partir de PCR en tiempo real cuantitativo.

21. La población aislada de células de la reivindicación 18, caracterizada en que las células en dicha población de células expresan una o más de las proteínas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27 proteína 1 de enlace TGF-beta latente (LTBP) , NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 ó TIMP-2.

22. La población aislada de células de la reivindicación 18, caracterizada en que las células en dicha población de células expresan las proteínas decorina, epiregulina, IGFBP-3, IGFBP-6, IL-2 R alfa, IL-17RC, IL-27 proteína 1 de enlace TGF-beta latente (LTBP), NCAM-1, Smad4, TFPI, TGF-beta R1/ALK5 ó TIMP-2.

23. La población aislada de células de la reivindicación 18, caracterizada en que al menos 50% de las células de dicha población son las células de la reivindicación 9.

24. La población aislada de células de la reivindicación 18, caracterizada en que al menos 80% de las células de dicha población son las células de la reivindicación 9.

25. La población aislada de células de la reivindicación 18, caracterizada en que al menos 95% de las células de dicha población son las células de la reivindicación 9.

26. La población aislada de células de la reivindicación 18, caracterizada en que consiste esencialmente de las células de la reivindicación 9. RESUMEN DE LA INVENCION Se proporcionan aquí células adherentes placentarias osteogénicas aisladas (OPACs), métodos para usar OPACs y poblaciones de OPACs, y métodos para cultivasr, proliferar, expandir o diferenciar las OPACs. Además se proporcionan aquí los métodos para usar las OPACs para formular composiciones implantables o inyectables adecuadas para la administración a un sujeto. También se proporcionan aquí los métodos para el tratamiento de defectos de los huesos con OPACs y las coposiciones que comprenden OPACs. También se proporcionan aquí los métodos para usar OPACs en el tratamiento y manejo de mieloma múltiple, por ejemplo reduciendo la progresión de, detener la progresión de, o mejorar uno o más síntomas del mieloma múltiple en un individuo que tiene mieloma múltiple, que comprende administrar una pluralidad de OPACs al individuo .