JP3781433B2 - ヒト間葉幹細胞の試験管内軟骨形成誘導 - Google Patents
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Description
間葉幹細胞(MSCs)は骨髄、血液、真皮、および骨膜に見出される形態形成多能芽細胞あるいは胚状細胞であり、それは脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋組織、線維結合組織を含む間葉あるいは結合組織の特異的な型に分化することができる。これらの細胞が入り込む特異的分化経路は機械的影響およびもしくは成長因子、サイトカインなどの内因性生物活性因子およびもしくは宿主組織により確立された局所微環境条件からの各種影響に依存する。これらの細胞は通常骨髄で非常に低い頻度で存在するけれども、組織培養でこれらの細胞母集団を分離し、精製し、かつ有糸分裂拡張する製法はキャプラン他、合衆国特許番号5,197,985号および5,226,914号で報告されている。
出生前生物においては、特殊化結合組織細胞へのMSCsの分化は十分に確立されている。例えば胚ひな、マウスあるいはヒト肢芽間葉細胞は軟骨、骨および他の結合組織に分化する(キャプランAI,発展生物学協会39回年次報告、S.サブテルニーおよびUアボット編、3768ページ。ニューヨーク、アラン・アール・リス・インコーポレイテッド,1981;エルマー他、奇形学、24:215−223,1981;ホーシュカSD,発展生物学、37:345−368、1974;ソラーシュ他、発展生物学、83:9−19、1981;スウォラ他、発展生物学、116:31−38,1986)。加えて、クローン化ラット胎仔頭蓋冠細胞系も筋、脂肪、軟骨および骨に分化することが示されてきている(五島他、臨床整形外科関係研究、269:214−283、1991)。生後生物におけるMSCsの存在はいくつかの中胚葉表現型への胚後細胞の分化を示す目的について広範に研究されてこなかった。行われた数少ない研究は拡散チャンバーへの入れこおよび生体内移植に続く骨髄細胞による骨および軟骨の形成を伴っている(アシュトン他、臨床整形外科関係研究、151:294−307,1980;ブルーダー他、骨無機質、11:141−151,1990)。最近、ひな骨膜からの細胞が分離され、培養拡張され、また試験管内高密度条件の下で軟骨および骨に分化することが示された(中原他、実験細胞研究、195:492−503、1991)。ラット骨髄誘導間葉細胞が生体内移植された時に骨芽細胞および軟骨細胞に分化する能力を持つことが示された(デニス他、細胞移植、1:2332、1991;五島他、臨床整形外科関係研究、269:274−283、1991)。これらの軟骨形成能力の間接的証拠は移植研究から得られたけれども、これらの細胞が軟骨細胞に分化する試験管内システムは展開されなかった。
この発明に従って、ヒト間葉幹細胞が三次元形態に結合されると、細胞はある種の軟骨誘導剤あるいは因子と試験管内で接触した時軟骨形成経路に沿って委ねられ分化するように誘導することができるということが発明者により観察された。三次元形態はこの発明が試験管内軟骨形成にとっては重要であり、細胞は例えば充填されあるいはペレット化された細胞塊として望ましくは一緒に濃縮される。この試験管内製法は生体内で起こることを反復するものと考えられ、軟骨形成の製法で重要である分子事象を定義するのに使用することができる。
かくして、一つの見地において、この発明はヒト間葉前駆体細胞の試験管内軟骨形成のためおよびそのヒト軟骨細胞の試験管内形成のための一つの組成物を提供し、この組成物は三次元形態での分離ヒト間葉幹細胞およびそこで接触する少くとも1個の軟骨誘導剤を含む。間葉幹細胞は望ましくは合成無血清環境にある分離された培養拡張ヒト間葉幹細胞であり、三次元細胞塊、例えば充填細胞あるいは遠心分離細胞ペレットなどの形態にあるなどのようにごく近接して濃縮される。
軟骨誘導剤は望ましくは(i)デキサメタゾンなどのグルココルチコイド;(ii)骨形態発生タンパク質(望ましくはBMP−2あるいはBMP−4)、TGF−β1、インヒビンAあるいは軟骨形成刺激活性因子などのトランスフォーミング成長因子−β上科の一員;(iii)コラーゲンI(特にゲル形態のもの)などのコラーゲン性細胞外基質の成分;および(iv)レチノイン酸などのビタミンA類似体、よりなるグループから個別にあるいは組合せて選択される。とりわけ望ましいものはデキサメタゾンおよびTGF−β1の組合せである。
この発明はまたそこで幹細胞が三次元形態に結合される軟骨誘導剤に試験管内で間葉幹細胞を接触させることにより間葉幹細胞から軟骨細胞を生産する製法を提供する。
この発明は更にそこで幹細胞が三次元形態に結合される軟骨誘導剤に試験管内で間葉幹細胞を接触させることにより間葉幹細胞内に軟骨形成を誘導する製法を提供する。
前記の方法において、間葉幹細胞は望ましくは合成無血清環境において分離され培養拡張されたヒト間葉幹細胞であり、三次元細胞塊、例えば充填細胞あるいは遠心分離細胞ペレットの形態にあるなどのようにごく近接して濃縮される。更に接触は望ましくはヒト間葉前駆体細胞のペレットを合成無血清培地で培養することを含み、この合成無血清培地は(1)合成最少必須培地;(2)アルコルビン酸塩あるいはその類似体;(3)鉄源;(4)インスリンあるいはインスリン状成長因子;および(5)少くとも1個の軟骨誘導剤あるいは因子、を含む。前記の方法は更に望ましくは、細胞が軟骨誘導組成物で培養されその後セラミックキューブなどの硬い多孔性容器に置かれる段階を含む。
分離された非培養非相同ヒト間葉幹細胞製剤をこの発明の組成物および方法に使用することも可能である。MSCsは密度勾配分画などにより、骨髄、(末梢血を含む)血液、骨膜および真皮、ならびに中胚葉起点を持つ他の組織などの組織から非培養非相同製剤として分離することができる。これに関連して、これらの間葉幹細胞は通常骨髄に例えば非常に微量で存在し、またその量は年齢と共に(すなわち比較的若い患者で約1/10,000細胞から高年齢の患者で1/2,000,000と同じ位まで少なく)大きく減少するけれども、ヒト間葉幹細胞製剤は骨髄の他の型の細胞が事実上ないように組織、とりわけ骨髄から分離することができる。分離された分画製剤がその内少くとも約90%、また望ましくは少くとも約95%でヒト間葉幹細胞である細胞を含むことが考えられる。
前記の試験管内方法で軟骨形成の誘導および軟骨細胞生産で起こる事象の配列は胚肢形成における軟骨形成のそれと類似する。このシステムのすべての成分が定義されているため、システムは軟骨形成進行に関する成長因子等の作用の研究に対し貴重な研究手段として使用することができる。それはまた始原細胞からの哺乳類軟骨形成の分子制御についての研究にも適用できる。
この研究はこれから各図面の簡単な説明を引用して更に説明されるが、それは発明の範囲を決して制限するものではない。
図1.ヌードマウスへの皮下移植3週後に採取された間葉始原細胞積み込みコラーゲンスポンジを経由する切片のトルイジンブルー染色。ラビット骨髄誘導細胞はスポンジへの積み込み前に単層培養で14日間成長した。
図2A−2C.7日(図2A)、14日(図2B)および21日(図2C)の+DEX培養からのペレット化ラビット骨髄誘導の切片のトルイジンブルー染色。
図3A−3G.ペレット培養骨髄誘導始原細胞の免疫組織化学。7日(図3A)、14日(図3B)、および21日(図3C)でのII型コラーゲンの免疫染色。図3DはX型コラーゲンを免疫染色した21日目のペレットの切片である。免疫染色はまたグリコサミノグリカン:コンドロイチン硫酸(図3Eの7−D−4;図3Fの3−B−3(+))およびケラタン硫酸(図3Gの5−D−4)で示される。
図4.基質分子プローブを用いるラビット間葉始原細胞RNAのノーザンハイブリッド形成。ラビット骨髄誘導間葉始原細胞(レーン1、3)およびラビット皮膚線維芽細胞(レーン2、4)からの全細胞RNAがヒトコラーゲンα1(I)プローブ(レーン1、2)およびコラーゲンα2(I)に対するラビット特異的プローブ(レーン3、4)でハイブリッド形成された。同じブロットがヒトα1(II)およびラビット特異的アグレカン(aggrecan)ならびに化学結合タンパク質プローブで再プローブされた時にはmRNA帯は検出できなかった。
この発明はこれからそれを支持する数多くの実施例および例と関連してより詳細に説明されるであろう。
この発明は数多くの用途および利点を有する。その利点の一つは自己由来宿主に戻す移植の前にMSC分化に指向し促進する能力にある。例えば、軟骨形成細胞になるように試験管内で指向されるMSCsは、まず系列内に補充され次いで主要分化段階を通じて進行する筈であるMSCsよりもより速く均一に移植部位で軟骨基質を合成するであろう。このような生体外処置は更に精製MSCsに対する生物活性因子の均一で制御された適用を提供し、均一の系列委託および分化に導く。内因性生物活性因子の生体内有用性は容易に保証あるいは制御することができない。ここで開示されているような前処理段階はこれを回避する。加えて、移植の前にMSCsを前処理することにより、外因性生物活性因子の全身あるいは局所投与に関連する潜在的に有害な副作用は回避される。この技術のも一つの用途は細胞が移植の時点にある分化の段階に基づく組織再生に向ける能力にある。それはつまり軟骨細胞に関して、移植における細胞の状態が形成される最終組織の型を制御するということである。
ここで使用されるように、「軟骨誘導剤」あるいは「軟骨誘導因子」という用語は、試験管内軟骨形成誘導あるいは軟骨細胞生産を実施するように三次元形態にあるヒト間葉幹細胞に適用できるいずれかの天然あるいは合成、有機あるいは無機化合物もしくは生化学化合物もしくは化合物の組合せあるいは混合物、もしくは機械的あるいは他の物理的装置、コンテナー、影響あるいは力を引用する。軟骨誘導剤は望ましくは(i)デキサメタゾンなどのグルココルチコイド、(ii)骨形態発生タンパク質(望ましくはBMP−2あるいはBMP−4)、TGF−β1、インヒビンAあるいは軟骨形成刺激活性因子(CSA)などのトランスフォーミング成長因子−β上科の一員;(iii)コラーゲンI(特にゲル形態のもの)などのコラーゲン性細胞外基質の成分;および(iv)レチノイン酸などのビタミンA類似体、よりなるグループから個別にあるいは組合せて選択される。
ここで使用されるように、「合成培地」という用語は、この発明の組成物が特にこの発明の方法に従って試験管内軟骨形成を受けることのできる維持、成長あるいは培養培地を引用し、また最少必須培地、アスコルビン酸塩あるいはその類似体、鉄源およびインスリンもしくはインスリン状成長因子を含む。
ここで使用されるように、「最少必須培地」という用語は、試験管内でヒト間葉幹細胞の生存可能性を支持するいずれかの無血清動物細胞培養製剤あるいは既知の組成物の培地を引用する。その例はいずれかのイーグル基本培地、すなわちダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM);イスコーブ修飾イーグル培地、アルファ修飾イーグル培地、および更にマッコイ5A、ならびにBGJb(フィットン−ジャクソン修飾)などである。
ここで使用されるように、「鉄源」という用語は還元された第二鉄の鉄の形態を培地に放出するいずれかの化学種を引用し、必ずしもそれに限定されないがトランスフェリン、硫酸第一鉄(FeSO4)、あるいはフェリチンを含む。
ここで使用されるように、「インスリン」という用語は既知の各種インスリンのいずれかを引用する。インスリンは皮下注射後に作用の速効性、継続および強度に従って3種のカテゴリー、すなわち前記の通り速やかな、中間の、あるいは長期作用性に分割される。結晶性標準インスリンは塩化亜鉛の存在下で沈殿により調製され修飾形態が活性のパターンを変更するために開発された。プロタミン亜鉛インスリン(PZI)はタンパク質複合体を形成するためのインスリンおよび亜鉛と塩基性タンパク質プロタミンの反応の成果であり、この複合体は結晶性標準インスリンよりもよりゆるやかに溶解し吸収されしかもより着実な割合での吸収に高度に信頼できる。イソフェンは修飾結晶性プロタミン亜鉛インスリンであり、その作用は量の多い標準インスリンと量の少ないプロタミン亜鉛インスリンとの混合物に匹敵する。持続されかつ敏速なインスリン亜鉛懸濁液もこの発明での使用が考えられている。インスリンは例えばヒト、ウシ、めん羊あるいは他の動物源のものであり、あるいは組換え産物であることができる。
ヒトインスリンは今ではその組換えDNAによる生産の結果として広く利用できる。理論上それは精製ブタインスリンよりも免疫原性が少し少なく、代ってブタインスリンはウシインスリンよりも免疫原性が少ない。ウシインスリンは3個のアミノ酸残基でヒトインスリンとは異なり、一方ブタはβ鎖のカルボキシル末端にある1個のアミノ酸のみでヒトインスリンと異なる。しかし高度に精製された場合、3種のインスリンすべては免疫応答を刺激する比較的低いしかし測定可能な能力を持つ。
短期あるいは急速作用性インスリンは中性pHで緩衝液に溶解された標準の結晶性亜鉛インスリン(インスリン注射剤)の単なる溶液である。これらは作用の最速の開始としかし最短の継続期間を有し、すなわちグルコース水準は20−30分以内に最低の状態に達し、また約2−3時間で基線に戻る。
中間作用性インスリンはそれが皮下に投与された時によりゆるやかに溶解するように処方されており、その作用の継続期間は従ってより長い。もっともよく使用される2種の製剤は中性プロタミンハーゲドルン(NPH)インスリン(イソフェンインスリン懸濁液)およびレンテインスリン(インスリン亜鉛懸濁液)である。NPHインスリンは亜鉛とプロタミンをリン酸緩衝液で持つ複合体のインスリン懸濁液である。レンテインスリンは結晶性(ウルトラレンテ)インスリンおよびインスリンの溶解度を最小化する酢酸緩衝液内の無晶性(セミレンテ)インスリンの混合物である。製剤は類似の薬学動態プロファイルを持つ。
ウルトラレンテインスリン(持続型インスリン亜鉛懸濁液)およびプロタミン亜鉛インスリン懸濁液は長期作用性インスリンである。これらは非常にゆっくりとした開始および作用の延長された(「水平の」)最盛期を持つ。これらのインスリンは1日を通じてインスリンの低い基礎濃度を提供することが主張される。
ここで使用されるように、インスリンという用語はインスリン類似体を包含することも考慮される。吸収の割合を変化させた最近のインスリンの展開は関心を高めた。B9およびB27のそれぞれの位置で置換されたアスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩を持つインスリンは不十分に結晶化し、また「単量体インスリン」と名付けられた。このインスリンは皮下の貯蔵所からより急速に吸収され、かくして食後の需要に合致するのに有用となる。それに反して、他のインスリン類似体は注射部位で結晶化する傾向があり、よりゆるやかに吸収される。効力の向上したインスリンはB10の位置でアスパラギン酸塩をヒスチジンに置換することにより、またβ鎖のカルボキシル末端残基の修飾により生産されている。
ヒト間葉幹細胞の分離、精製および培養拡張
ここで記載の通り分離され精製されたヒト間葉幹細胞は、例えば骨髄、血液、真皮あるいは骨膜から誘導される。骨髄から得られた時、これは股関節部あるいは膝置換手術の間に変形性関節症の患者から得られた大腿頭海綿質片の栓子、あるいは正常な供与体および将来の骨髄移植のために骨髄を採取された腫瘍患者から得られた吸引骨髄の栓子を含む数多くの異なった源からの骨髄であり得る。採取された骨髄は次いで細胞培養を準備される。分離製法は、分化なしで間葉幹細胞の成長を可能にするだけでなく、培養容器のプラスチックあるいはガラス表面への間葉幹細胞のみの直接付着を可能にする作用薬を含む特別に用意された培地の使用を伴う。非常に微量の間葉組織サンプルに存在する望ましい間葉幹細胞の選択的付着を可能にする培地を創出するために、次いで源の間葉組織に存在する他の細胞(すなわち赤血球および白血球、他の分化間葉細胞等)から間葉幹細胞を分離することが可能となった。
骨髄は長骨の骨髄腔、いくつかのハヴァース管、および海綿質骨の小柱の間の空間を占める軟組織である。骨髄は2種の型:初期のすべての骨および成人の制限位置(すなわち海綿質)で見出され、また血球の生産(すなわち造血)およびヘモグロビン(かくして赤色)の生産に関連する赤;および主として脂肪細胞(かくして黄色)ならびに結合組織よりなる黄である。
全体として、骨髄は複組織であり、造血幹細胞を含む造血細胞、および赤血球ならびに白血球およびその前駆体;また「支質」と呼ばれる結合組織網様構造に貢献する間葉幹細胞、線維芽細胞、網状赤血球、脂肪細胞および内皮細胞を含む細胞のグループよりなる。支質より得た細胞は細胞表面タンパク質を経る直接の相互作用を通じる造血細胞の分化および成長因子の分泌を調節し、骨格構造の基礎および支持に従事する。動物モデルを使用する研究は、骨髄が軟骨、骨および他の結合組織細胞に分化する能力を持つ「前支質」細胞を含むことを示唆した(ベレスフォード、J、N.:骨形成幹細胞および骨と骨髄の支質システム、臨床整形外科、240:270、1989)。最近の証拠は、多能性支質幹細胞あるいは間葉幹細胞と呼ばれるこれらの細胞が数多くの生物活性因子の影響に依存する活性化に際して、いくつかの異なった型の細胞系(すなわち骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等)に生成する能力を持つことを示す。しかし間葉幹細胞は広範な種類の他の細胞(すなわち赤血球、血小板、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、脂肪細胞等)と共にごく微量で組織に依存する。
その結果、分化の前に組織からヒト間葉幹細胞を分離し精製し次いで筋骨格治療のための貴重な道具を生産する間葉幹細胞を培養拡張する製法が開発されてきた。このような操作の目的は間葉幹細胞の数を大きく増加しこれらの細胞を身体の正常な回復能力に再指向およびもしくは強化するのに利用することである。間葉幹細胞は数多く拡張され、かつ再生およびもしくは修復のための生体内成長を高めあるいは刺激し、続く活性化および分化を通じて各種の人工装置への移植片付着を改善し、あるいは造血細胞生産を高める等のため結合組織損傷の領域に適用される。
望ましい選択的付着に特によく適しており、下記の通り血清を補充された時「完全培地」としてここで引用されるいくつかの培地が準備されてきた。このような培地の一つはよく知られており容易に商業的に利用できるダルベッコ修飾イーグル培地−低グルコース(DMEM−LG)の増強版である。
商業的処方は重炭酸ナトリウム3700mg/lおよびペニシリン(塩基)の10,000単位、ストレプトマイシン(塩基)の10,000μg、ペニシリンG(ナトリウム塩)、硫酸ストレプトマイシン、および食塩水0.85%内でのファンジゾン▲R▼としてのアンホテリシンを利用するアンホテリシンB/mlの25μgを含む100×抗生物質−抗真菌剤10ml/lが補充される。
前に記載の培地は形成され使用に供するまで100ml当り90mlあるいは500ml当り450mlのボトルに4℃で貯蔵される。使用には、(選択されたロットからの)胎仔ウシ血清10mlあるいは50mlが培地のボトルに加えられ血清量10%の最終量となる。培地は使用の前に37℃まで温められる。
この点について、ウシ胎仔血清10%の試験され選択されたロット(カリフォルニア、ウッドランド、J.R.サイエンティフィックあるいは他の供給業者)と共にBGJb培地(ニューヨーク、グランドアイランド、ジブコ)がこの発明の用途に充分に適していた。同じく「完全培地」であるこの培地は、更に分化なしで間葉幹細胞成長を刺激し、特異的タンパク質結合部位等を通じて間葉幹細胞のみのペトリ皿のプラスチック表面への選択的付着を可能にした因子を含んでいた。
加えて、培地F−12単養混合物(ハム)(ニューヨーク、グランドアイランド、ジブコ)は選択的間葉幹細胞分離に対する望ましい物性を示したことが同じく発見された。
前に示したように、完全培地は細胞培養分離用の採取骨髄を用意するために使用される当初の採取工程の特異的な型に依存する数多くの異なった分離工程を利用することができる。これに関して、海綿質骨髄の栓子が利用された時、骨髄は完全培地に加えられ分散を形成するために渦動され、それは次いで骨片等から骨髄細胞を分離するために遠心分離された。骨髄細胞(主として赤血球および白血球、また微量の間葉幹細胞、等よりなる)は次いで一連の16、18、および20ゲージ針に適した注射器を通じて骨髄細胞を含む完全培地を連続的に通過させることにより単一細胞に解離された。いずれかの酵素分離工程とは逆に、機械的分離工程の利用を通じて生産された利点は、機械的工程が殆ど細胞変化をもたらさなかったが一方酵素工程は細胞付着および選択的分離に必要なタンパク質結合部位、およびもしくは前記間葉幹細胞に特異的なモノクローナル抗体の生産に必要なタンパク質部位に特に細胞損傷をもたらし得ると考えられている。単一細胞懸濁液(約50−100×106有核細胞で構成されているもの)は次いで懸濁液で見出される残存細胞から間葉幹細胞を選択的に隔離およびもしくは分離する目的で100mm皿に連続して平板培養された。
吸引骨髄がヒト間葉幹細胞の源として利用された時、(骨片は殆どあるいは全然なく大量の血液を含んでいた)骨髄幹細胞は完全培地に加えられ、パーコル(ミズーリ、セントルイス、シグマ)勾配で分画された。パーコル勾配は骨髄誘導間葉幹細胞を含む低密度血小板分画から大きな割合の赤血球および単核造血細胞を分離した。これに関して、約30−50×106細胞を含む血小板分画は確定されない量の血小板、30−50×106有核細胞、および骨髄供給体の年齢に依存する約50−500個のみの間葉幹細胞で構成されていた。低密度の血小板分画は次いで細胞付着に基づく選択的分離のためにペトリ皿で平板培養された。
これに関して、海綿質あるいは腸骨吸引液(すなわち一次培養)のいずれかから得られた骨髄は完全培地で成育され下記の実施例1で設定された条件に従って1乃至7日間ペトリ皿の表面に付着された。最小細胞付着が3日後に観察されたので、非付着細胞がもとの完全培地を新鮮完全培地で置換することにより培養から除去される時間の標準の長さとして3日が選ばれた。続く培地変更は培養皿が通常は14−21日を要する密集になるまで4日毎に実施された。これは未分化ヒト間葉幹細胞の数で103−104倍の増加を示した。
細胞は次いでEDTA(エチレンジアミンテトラ酢酸)を持つトリプシン(トリプシン0.25%、EDTA(1X)1mM、ニューヨーク、グランドアイランド、ジブコ)などの除去剤を利用して培養皿から分離された。除去剤は次いで不活性化され、分離培養未分化間葉幹細胞は次の使用のために完全培地で洗浄された。
非培養ヒト間葉幹細胞の分離
この発明の組成物および方法で分離された非培養非均質ヒト間葉幹細胞製剤を使用することも可能である。MSCsは非培養非均質製剤として、密度勾配分画化などにより、骨髄、血液(末梢血を含む)、骨膜および真皮、ならびに中胚葉起源を持つ他の組織などの組織から分離することができる。これに関して、これらの間葉幹細胞は例えば非常に微量で骨髄に通常存在しかつこれらの量は年齢で(すなわち比較的若い患者の約1/10,000細胞から高年齢の1/2,000,000までと同じ位)大幅に減少するけれども、ヒト間葉幹細胞製剤は骨髄の他の型の細胞を事実上欠いているように組織、とりわけ骨髄から分離できることが発見された。分離された分画化製剤が少くとも約90%、また望ましくは少くとも約95%がヒト間葉幹細胞である細胞を含むであろうということも熟考される。
大腿頭海綿質片の骨髄は股関節部あるいは膝置換手術の間に変形性関節症の患者から得られる。加えて骨髄は更に正常な供与体および将来の骨髄移植のために採取される骨髄を持つ腫瘍患者からの腸骨吸引液により得られる。腫瘍患者のすべては支質細胞には無関係の悪性腫瘍を持ちその支質細胞は正常な核型を発現する。
骨髄は無菌作業条件の下で胸骨、肋骨および腸骨稜からのいくつかの部位から吸引される。吸引は注射器での凝固を避けるためにゆるやかである。1乃至2個の皮膚貫通部位を持つ骨からの多重吸引部位は比較的低い量の希釈末梢血で汚染された高い有核細胞総数を提供する。注射器は従来の胸骨吸引針、12ゲージ骨髄吸引套管針、あるいは骨髄採取に用いられる管錐針を備える。25mlの骨髄が無菌食塩水のヘパリン化注射器91000単位/リットルに採取される。
ヒト骨髄は次いで50ml遠心分離管に移され細胞ペレットを産出するために低速で遠心分離される。脂肪および血漿は吸引で遠心分離管から除去される。細胞ペレットはトリス塩基20mMおよび塩化アンモニウム0.7%を含む無菌溶液で再懸濁される。pHは7.2に調節され懸濁液は次いで細胞ペレットを産出するために低速で遠心分離される。トリスNH4Cl溶液が細胞ペレットから吸引され、ペレットはDMEM培地10mlに再懸濁される。再懸濁ペレットは70%パーコルTM35mlを含む50ml管に注意深く層状に挿入される。管は460×gで15分遠心分離される。間葉幹細胞、血小板およびその他細胞を含む勾配の上部25%あるいはパーコル勾配の12.5mlはピペットで採取される。この分画はそれに25mlの培地が加えられていた50ml遠心分離管に移される。この管は細胞を懸濁するために数回逆転され次いで細胞ペレットを産出するために低速で再遠心分離される。この工程は新鮮培地で2回反復される。
ヒト骨髄サンプルは次いで血漿を除去するために濃縮されまた前に記載されたNH4Cl処理によりあるいは脂肪、赤血球および血漿を除去するために注射器カートリッジフィルターに含まれるルーコソーブTMフィルター上でのサンプルの継代接種によるいずれかで赤血球を除去される。フィルターで保持される細胞分画はクエン酸ナトリウムを含む緩衝液を用いてフィルターから溶離される。フィルターから溶離するMSC富化細胞は次いでMSCと優先的に結合するヒドロキシアパタイトカラムの継代接種により更に富化される。赤血球枯渇骨髄を含む注射器フィルター溶離液はヒドロキシアパタイトで充たされた注射器を通過させられる。この実施例で使用されるヒドロキシアパタイトはインターポア・コーポレイション(IP200)から得られる。200マイクロメートルの最小孔サイズおよび500マイクロメートルまでの最大孔サイズを持つ多孔性ヒドロキシアパタイト顆粒が使用される。細胞は無菌移転段階にヒドロキシアパタイトを含む注射器に負荷される。細胞は15分間結合を許され細胞内に存在する緩衝液は流出が可能となる。注射器は次いで培地(DMEM)15mlで1回洗浄される。ねじ山を切られた注射器の底部はねじを抜かれ、移植物質は更なる処理のためあるいは移植部位への直接の手術時適用のためにプランジャで注射器から押し出される。
モノクローナル抗体分離は次いで以下の通り実施される。ダイナビーズM−450(ニューヨーク、レーク・サクセス、ダイナル(アール)インコーポレイテッド)はATCCアクセス番号HB10743、HB10744およびHB10745を持つ抗MSCモノクローナル抗体と結合され、この結合は抗体をダイナビーズで被覆された二次抗体(2.0μg抗MSC抗体/mgダイナビーズ)をPBS内で30分間4℃で保温することで行われる。1×107ダイナビーズ/mlを含むビード溶液が使用される。抗体は保温される。ダイナビーズはビーズおよび抗体を含む溶液をマグネティック・パーティクル・コンセントレーター(磁性粒子濃縮器)(ダイナルMPC)に置くことにより収集される。上澄みは除去され、一方ダイナビーズは磁石により試験管壁に保持される。ダイナビーズは5回PBSで洗浄することにより遊離抗体を除去される。最後の洗浄の後、ダイナビーズは収集され上澄みは除去される。ダイナビーズ80mlに35mlのヘパリン化骨髄が加えられる。細胞はダイナビーズト共に15分振動させながら保温される。添加MSCsを持つダイナビーズは次いでダイナルMPCを用いて収集される。上澄みは除去され磁性粒子はPBSで濃縮洗浄される。約200×106細胞がダイナビーズで収集される。細胞は1%EDTAを含む溶液50mlでビーズを保温することによりビーズから除去される。EDTA溶液は低速での遠心分離により細胞から除去され、この発明の使用に適した細胞が得られる。
実施例1
デキサメタゾンを使用する試験管内軟骨形成
我々の予備研究において、14日間で培養され次いでセラミックキューブあるいはコラーゲンスポンジのいずれかに播種されまたヌードマウスに皮下移植されたラビット骨髄誘導間葉始原細胞は骨および軟骨を3週以内に産出するということを我々は発見した(図1)。
この発明は、試験管内で前軟骨凝縮の創出が生後骨髄から誘導される間葉始原細胞での軟骨形成を促進し、ここでそのような母集団が軟骨細胞のための幹細胞あるいは始原細胞を含むということを考える。これは分離成長平板培養細胞で使用するために開発されたペレット培養システムを使用して達成され、(加藤他、全米科学アカデミー紀要、85:9552−9556、1988;バロックおよびレッディ、細胞生物学ジャーナル、126:1311−1318、1994)また、培養内に置かれた軟骨細胞の軟骨表現型の発現を維持するためにも使用されてきた。
ラビットおよびヒト骨髄誘導細胞の両方が使用された。骨髄誘導間葉始原細胞がニュージーランド白ラビット頸骨あるいは腸骨稜から3000Uヘパリンを含む注射器に吸引により採取された。これらの細胞は胎仔ウシ血清10%を含むDMEMで20,000,000/100mm皿で平板培養され、14日間37℃、炭酸ガス5%内で4日毎に培地変更により成育された。血清スクリーンは、これらの細胞の増殖を支持し前に引用した生体内セラミックキューブ検定で最初の継代接種細胞の大抵の骨および軟骨を生産する沢山の血清を同定するためにまず行われた。付着細胞のコロニーが(約10−14日で)培養皿に形成された後、細胞は皿全体をトリプシン消化され計数された。200,000細胞のアリコートが血清10%、アスコルビン酸−2−リン酸50ng/ml+/−10-7Mデキサメタゾン(DEX)を持つDMEMで無菌15ml円錐形ポリプロピレン管で10分間500×gで遠心分離され、次いで37℃で5%炭酸ガス恒温器で3週間まで保温された。24時間後細胞のいくつかの部分は管内でペレットを形成し、一方いくつかの細胞は管の側壁に単層として残った。3週後ペレットの大部分は分解した。残存するペレットの内、軟骨細胞の外観を持つ細胞は全然含まれずまたII型コラーゲン染色のものは見出されなかった。血清に対する一つの選択肢として、定義された培地補充剤(ITS+プレミックスTM、コラボレイティブ・バイオメディカル・プロダクツ)が試験された。この補充剤は成長平板培養軟骨細胞のペレット培養にこれまで使用されていた(バロックおよびレッディ、細胞生物学ジャーナル、126:1311−1318、1994)。補充剤はインスリン(6.25μg/ml)、トランスフェリン(6.25μg/ml)、亜セレン酸(6.25μg/ml)、リノール酸(1.25μg/ml)およびウシ血清アルブミン(5.35μg/ml)を有するDMEMよりなる(与えられた濃度は最終のものである)。これに対しデキサメタゾン(DEX)10-7Mありもしくはなしでピルビン酸塩(1mM)、アスコルビン酸−2−リン酸(50μg/ml)が加えられた。いくつかの実験に関しFBS10%含有培地は置換されなかった。スパン細胞は37℃で炭酸ガス5%で保温された。ヒト骨髄細胞は健全な供与体から腸骨稜の吸引により得られた。培養条件はラビット細胞に用いられたものと同一であった。保温の24時間内に、細胞はペレットを形成した。培地交換は2日毎に行われた。21日の時点でペレットが採取された時、各ペレットのアルカリ性ホスファターゼ活性がリン酸P−ニトロフェニルでの保温および405nmでの吸光度測定により決定された。+/−DEXで保温されたペレットの典型的な実験で得られた吸光度は培養の最初の14日の間に3−5倍増加し、21日まで上昇した水準に留まった。組織学および免疫組織化学的分析のためにペレットはOCT(オルチニン・カルバミル・トランスフェラーゼ)内で氷結され、5μmの部分が切断された。トルイジンブルー染色および免疫組織化学が行われ、後者は抗コラーゲンI、IIおよびX、および3−B−3、7−D−4(コンドロイチン硫酸)、および5−D−4(ケラタン硫酸)を含む細胞外基質成分に対する抗体と共に行われた(図2および3)。反応性はFITC結合二次抗体および蛍光顕微鏡検査あるいはアルカリ性ホスファターゼ結合抗体ならびに基質のいずれかで検出された。ペレットは更にグアニジン4M、酢酸ナトリウム20mM含有プロテアーゼインヒビター20mMに抽出されSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングによる分離の後免疫局在性を受けた。
培養7日までに+DEX規定培地ペレットの部分のいくつかの異染染色がトルイジンブルーで見ることができた。14日までに、+DEXペレットは内部局在細胞の領域の周りに明らかな異染染色を含み、それは肥厚性軟骨細胞の外観を有していた。ペレットの周辺にあるこれらの細胞は平坦なままであり異染性を示さなかった。21日までに、+DEXペレットは肥厚性軟骨細胞の球体に類似していた。それに反して、−DEX規定培地ペレットはすべてそのサイズを収縮し多くの場合21日までに培養で分解した。明らかな肥厚性細胞はいずれの−DEXペレットでも明白ではなかった。
II型コラーゲンに対する抗体を使用する免疫組織化学はいくつかのサンプルで7日と同じ位初期に+DEX規定培地ペレットで正であった(図3A)。14日までに肥厚状細胞の領域の基質はII型コラーゲンを正に染色した(図3B)。いくつかの実験で、全ペレットは21日に分析された時II型コラーゲンを正に染色した(図3C)。他では、薄い外部領域はまだII型コラーゲンに負であった。X型コラーゲンの正の染色は同じく14日までに見られた(図3D)。肥厚性細胞の基質は更に染色分布にいくらか差はあるもののコンドロイチン硫酸(図3Eの7−D−4;図3Fの3−B−3(+))およびケラタン硫酸(図3Gの5−D−4)を正に染色した。DEX不在で成長したペレットはいずれもII型コラーゲンの正の染色がなかった。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の免疫染色が分離し、抗II型抗体を持つウエスタンブロットペレット抽出物はα(II)鎖の移動で正の帯を与えた(図4)。続く実験において、この同じ規定培地、+DEXが単層あるいは微小塊培養のいずれにも軟骨形成を生産しなかったことを我々は発見した。これらの観察は重要であり、初期細胞−細胞相互作用が軟骨形成に必要であることを示している。かくして試験管内細胞濃縮を創り出しまた適切な許容因子を加えることの組合せを通じて、我々は生後哺乳類骨髄源からの細胞に軟骨形成を生産することができた。
前記のことはラビットおよびヒト骨髄誘導間葉始原細胞が肥厚性軟骨細胞に分化する培養システムを実証する。事象の配列は胚肢形成における軟骨形成のそれと類似する。すべての成分が定義されるので、このシステムは軟骨形成の進行に関する成長因子等の作用についての研究に使用することができる。それは更に始原細胞からの哺乳類軟骨形成の分子制御についての研究にも適用できる。
このシステムは生後源を利用し、また骨髄誘導始原細胞に関するデータを増大させる。これらの細胞母集団が骨形成および脂肪細胞能を持つことを示すために試験管内システムが他で使用されてきた。我々はここで少くともその母集団の一つのサブセットが軟骨形成能を持つことを実証する。このシステムは軟骨形成の制御の探索を促進するであろうし、またこの生体内工程を促進するためにはいかなる因子が必要とされるかについての理解に導くことができる。これは軟骨修復のための臨床適用可能性を有する。
実施例2
デキサメタゾンおよびTGF−β1を使用する試験管内軟骨形成
ラビットおよびヒト骨髄誘導間葉細胞が入手され実施例1に記載の通りペレット化された。培養培地は下記の通り修飾された。
ラビット骨髄誘導間葉細胞は(i)TGF−β1(10ng/ml)の追加あるいは(ii)TGF−β1(10ng/ml)の追加およびデキサメタゾンの削除、のいずれかと共に実施例1に記載の通り培養された。ヒト骨髄誘導間葉細胞は(i)TGF−β1(10ng/ml)の追加あるいは(ii)TGF−β1(10ng/ml)の追加およびデキサメタゾンの削除、のいずれかと共に実施例1に記載の通り培養された。
ラビット細胞培養において、MSCsの軟骨細胞への分化がデキサメタゾンありおよび無しで、TGF−β1の存在下で観察された。ヒト細胞培養において、MSCsの軟骨細胞への分化がデキサメタゾンありのTGF−β1の存在下で観察されたが、デキサメタゾン無しの場合には観察されなかった。
実施例2
デキサメタゾンおよびBMP−2を使用する試験管内軟骨形成
ラット骨髄誘導間葉細胞が入手され実施例1に記載の通りペレット化された。培養培地は下記の通り修飾された。ラット骨髄誘導間葉細胞はデキサメタゾン(10-7M)の存在あるいは不在下で10ng/mlおよび100ng/mlでのBMP−2の追加と共に実施例1に記載の通り培養された。MSCsの軟骨形成への分化はデキサメタゾンと共にTGF−β1の存在下で観察されたが、デキサメタゾン不在下では観察されなかった。
Claims (28)
- ヒト間葉前駆細胞の試験管内軟骨形成およびそれからのヒト軟骨細胞の試験管内形成のための一つの組成物であって、この組成物が充填細胞ペレットとして近接して濃縮された単離ヒト間葉幹細胞、およびそれと接触する少くとも1個の軟骨誘導剤を含むことを特徴とする組成物。
- 請求項1記載の組成物であって、ここで間葉幹細胞が単離され培養拡張されたヒト間葉幹細胞であることを特徴とする組成物。
- 請求項1記載の組成物であって、ここで間葉幹細胞が既知組成無血清環境にあることを特徴とする組成物。
- 請求項1記載の組成物であって、ここで軟骨誘導剤が(i)グルココルチコイド;(ii)トランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーの一員;および(iii)コラーゲン性細胞外マトリックスの成分より成るグループから選択されることを特徴とする組成物。
- 請求項4記載の組成物であって、ここでグルココルチコイドがデキサメタゾンであることを特徴とする組成物。
- 請求項4記載の組成物であって、ここでトランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーの一員が骨形態形成タンパク質、TGF−β1、インヒビンAおよび軟骨形成刺激活性因子より成るグループから選択されることを特徴とする組成物。
- 請求項6記載の組成物であって、ここで骨形態形成タンパク質がBMP−4であることを特徴とする組成物。
- 請求項4記載の組成物であって、ここでコラーゲン性細胞外マトリックスの成分がコラーゲンIであることを特徴とする組成物。
- 請求項8記載の組成物であって、ここでコラーゲンIがゲルの形態にあることを特徴とする組成物。
- 請求項1記載の組成物であって、ここで軟骨誘導剤がデキサメタゾンおよびTGF−β1を組合せたものであることを特徴とする組成物。
- 間葉幹細胞を試験管内で軟骨誘導剤と接触させることにより間葉幹細胞から軟骨細胞を生産する一つの方法であって、ここで幹細胞が充填細胞ペレットとして近接して濃縮されることを特徴とする方法。
- 請求項11記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が単離され培養拡張されたヒト間葉幹細胞であることを特徴とする方法。
- 請求項11記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が既知組成無血清環境にあることを特徴とする方法。
- 請求項11記載の方法であって、ここで軟骨誘導剤が(i)グルココルチコイド;(ii)トランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーの一員;および(iii)コラーゲン性細胞外マトリックスの成分より成るグループから選択されることを特徴とする方法。
- 請求項11記載の方法であって、ここで軟骨誘導剤がデキサメタゾンおよびTGF−β1を組合せたものであることを特徴とする方法。
- 請求項11記載の方法であって、ここで接触の段階がヒト間葉幹細胞のペレットを既知組成無血清培地で培養することを含むことを特徴とする方法。
- 請求項16記載の方法であって、ここで既知組成無血清培地が(1)既知組成最少必須培地;(2)アスコルビン酸塩あるいはその類似体;(3)鉄源;(4)インスリンあるいはインスリン状増殖因子;および(5)少くとも1個の軟骨誘導剤あるいは因子を含むことを特徴とする方法。
- 請求項11記載の方法であって、ここで細胞が軟骨誘導組成物と共に培養され、その後硬質多孔性容器に置かれることを特徴とする方法。
- 請求項18記載の方法であって、ここで硬質多孔性容器がセラミックキューブであることを特徴とする方法。
- 間葉幹細胞を試験管内で軟骨誘導剤に接触させることにより間葉幹細胞に軟骨形成を誘導する一つの方法であって、ここで幹細胞が充填細胞ペレットとして近接して濃縮されることを特徴とする方法。
- 請求項20記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が単離され培養拡張されるヒト間葉幹細胞であることを特徴とする方法。
- 請求項20記載の方法であって、ここで間葉幹細胞が既知組成無血清環境にあることを特徴とする方法。
- 請求項20記載の方法であって、ここで軟骨誘導剤が(i)グルココルチコイド;(ii)トランスフォーミング増殖因子−βスーパーファミリーの一員;および(iii)コラーゲン性細胞外マトリックスの成分より成るグループから選択されることを特徴とする方法。
- 請求項20記載の方法であって、ここで軟骨誘導剤がデキサメタゾンおよびTGF−β1を組合せたものであることを特徴とする方法。
- 請求項20記載の方法であって、ここで接触の段階がヒト間葉幹細胞のペレットを既知組成無血清培地で培養することを含むことを特徴とする方法。
- 請求項25記載の方法であって、ここで既知組成無血清培地が(1)既知組成最少必須培地;(2)アスコルビン酸塩あるいはその類似体;(3)鉄源;(4)インスリンあるいはインスリン状増殖因子;および(5)少くとも1個の軟骨誘導剤あるいは因子を含むことを特徴とする方法。
- 請求項20記載の方法であって、ここで細胞が軟骨誘導組成物で培養され、その後硬質多孔性容器に置かれることを特徴とする方法。
- 請求項27記載の方法であって、ここで硬質多孔性容器がセラミックキューブであることを特徴とする方法。
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Families Citing this family (139)
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US5736396A (en) * | 1995-01-24 | 1998-04-07 | Case Western Reserve University | Lineage-directed induction of human mesenchymal stem cell differentiation |
DE69733292T2 (de) | 1996-03-01 | 2006-04-27 | Isotis N.V. | Verfahren zur in vitro Herstellung von Knochen |
WO1998004681A2 (en) * | 1996-07-25 | 1998-02-05 | Genzyme Corporation | Chondrocyte media formulations and culture procedures |
AU742638B2 (en) * | 1996-12-06 | 2002-01-10 | Mesoblast International Sarl | Improved chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells |
ES2178102T3 (es) | 1997-07-16 | 2002-12-16 | Isotis Nv | Dispositivo para la generacion de tejido oseo, que comprende un termoplastico de copoliester biodegradable y celulas cultivadas. |
DE69714035T2 (de) * | 1997-08-14 | 2003-03-06 | Sulzer Innotec Ag | Zusammensetzung und Vorrichtung zur Reparatur von Knorpelgewebe in vivo bestehend aus Nanokapseln mit osteoinduktiven und/oder chondroinduktiven Faktoren |
DE19755023C2 (de) * | 1997-12-11 | 2000-03-09 | Celanese Chem Europe Gmbh | Katalysator und Verfahren zur Herstellung von Vinylacetat |
AU773012B2 (en) * | 1998-07-24 | 2004-05-13 | Carnegie Institution Of Washington | Method for maintenance and propagation of germline stem cells using members of the TGF-beta family of growth factors |
WO2000006701A1 (en) * | 1998-07-31 | 2000-02-10 | Genzyme Corporation | Improvement of cardiac function by mesenchymal stem cell transplantation |
DE19842802A1 (de) * | 1998-09-18 | 2000-03-23 | Christoph Geissmaier | Kultursystem zur optimierten Anregung des Wachstums und der Differenzierung von Knorpelzellen und/oder von Knochenzellen, Verfahren zur Herstellung des Kultursystems sowie Produkt unter Verwendung des Kultursystems |
US7001746B1 (en) * | 1999-01-29 | 2006-02-21 | Artecel Sciences, Inc. | Methods and compositions for the differentiation of human preadipocytes into adipocytes |
US6197061B1 (en) * | 1999-03-01 | 2001-03-06 | Koichi Masuda | In vitro production of transplantable cartilage tissue cohesive cartilage produced thereby, and method for the surgical repair of cartilage damage |
US20030082152A1 (en) | 1999-03-10 | 2003-05-01 | Hedrick Marc H. | Adipose-derived stem cells and lattices |
US20050076396A1 (en) * | 1999-03-10 | 2005-04-07 | Katz Adam J. | Adipose-derived stem cells and lattices |
JP2002537849A (ja) * | 1999-03-10 | 2002-11-12 | ユニヴァーシティ オヴ ピッツバーグ オヴ ザ コモンウェルス システム オヴ ハイアー エデュケーション | 脂肪由来の幹細胞および格子 |
US6777231B1 (en) * | 1999-03-10 | 2004-08-17 | The Regents Of The University Of California | Adipose-derived stem cells and lattices |
US7078232B2 (en) | 1999-08-19 | 2006-07-18 | Artecel, Inc. | Adipose tissue-derived adult stem or stromal cells for the repair of articular cartilage fractures and uses thereof |
US6555374B1 (en) | 1999-08-19 | 2003-04-29 | Artecel Sciences, Inc. | Multiple mesodermal lineage differentiation potentials for adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof |
US6429013B1 (en) | 1999-08-19 | 2002-08-06 | Artecel Science, Inc. | Use of adipose tissue-derived stromal cells for chondrocyte differentiation and cartilage repair |
EP1229940B1 (en) * | 1999-11-15 | 2014-05-14 | Piramal Healthcare (Canada) Limited | Temperature-controlled and ph-dependant self-gelling biopolymeric aqueous solution |
ATE243049T1 (de) * | 1999-12-09 | 2003-07-15 | Biosyntech Canada Inc | Mineral-polymer hybrid-zusammensetzung |
US20030158302A1 (en) * | 1999-12-09 | 2003-08-21 | Cyric Chaput | Mineral-polymer hybrid composition |
DE60009956T2 (de) * | 1999-12-28 | 2005-04-28 | Iso Tis N.V. | Wachstumsfaktoren und l-glutamin enthaltendes zellkulturmedium |
EP1918366A1 (en) | 2000-02-26 | 2008-05-07 | Artecel, Inc. | Pleuripotent stem cells generated from adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof |
US7582292B2 (en) | 2000-02-26 | 2009-09-01 | Artecel, Inc. | Adipose tissue derived stromal cells for the treatment of neurological disorders |
AU3869501A (en) * | 2000-02-26 | 2001-09-03 | Artecel Sciences Inc | Pleuripotent stem cells generated from adipose tissue-derived stromal cells and uses thereof |
US7182781B1 (en) | 2000-03-02 | 2007-02-27 | Regeneration Technologies, Inc. | Cervical tapered dowel |
AU2001257236B2 (en) * | 2000-04-25 | 2006-03-09 | Mesoblast International Sarl | Joint repair using mesenchymal stem cells |
DK1294414T3 (da) * | 2000-06-29 | 2006-07-24 | Biosyntech Canada Inc | Præparat og fremgangsmåde til heling og regenerering af brusk og andre væv |
DE60125973D1 (de) * | 2000-11-15 | 2007-02-22 | Biosyntech Canada Inc | Verfahren zur wiederherstellung einer geschädigten bandscheibe |
US7311905B2 (en) * | 2002-02-13 | 2007-12-25 | Anthrogenesis Corporation | Embryonic-like stem cells derived from post-partum mammalian placenta, and uses and methods of treatment using said cells |
EP2305795B1 (en) | 2000-12-06 | 2019-07-03 | Celularity, Inc. | Method of collecting placental stem cells |
EP2336300B1 (en) | 2001-02-14 | 2015-07-08 | Anthrogenesis Corporation | Post-partum mammalian placenta, its use and placental stem cells therefrom |
EP1367892B1 (en) | 2001-02-14 | 2013-10-30 | Anthrogenesis Corporation | Renovation and repopulation of decellularized tissues and cadaveric organs by stem cells |
GB2392674B (en) * | 2001-07-06 | 2005-08-10 | Geron Corp | Mesenchymal cells and osteoblasts from human embryonic stem cell |
CA2460539C (en) | 2001-09-15 | 2013-10-29 | Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center | Stratified cartilage tissue and methods to engineer same |
US20030165473A1 (en) * | 2001-11-09 | 2003-09-04 | Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center | Engineered intervertebral disc tissue |
US20050008626A1 (en) * | 2001-12-07 | 2005-01-13 | Fraser John K. | Methods of using adipose tissue-derived cells in the treatment of cardiovascular conditions |
US8404229B2 (en) | 2001-12-07 | 2013-03-26 | Cytori Therapeutics, Inc. | Methods of using adipose derived stem cells to treat acute tubular necrosis |
ES2545385T3 (es) | 2001-12-07 | 2015-09-10 | Cytori Therapeutics, Inc. | Sistema para procesamiento de células lipoaspiradas |
US7585670B2 (en) | 2001-12-07 | 2009-09-08 | Cytori Therapeutics, Inc. | Automated methods for isolating and using clinically safe adipose derived regenerative cells |
US7651684B2 (en) * | 2001-12-07 | 2010-01-26 | Cytori Therapeutics, Inc. | Methods of using adipose tissue-derived cells in augmenting autologous fat transfer |
US9597395B2 (en) | 2001-12-07 | 2017-03-21 | Cytori Therapeutics, Inc. | Methods of using adipose tissue-derived cells in the treatment of cardiovascular conditions |
US20050095228A1 (en) * | 2001-12-07 | 2005-05-05 | Fraser John K. | Methods of using regenerative cells in the treatment of peripheral vascular disease and related disorders |
US8105580B2 (en) | 2001-12-07 | 2012-01-31 | Cytori Therapeutics, Inc. | Methods of using adipose derived stem cells to promote wound healing |
US7771716B2 (en) | 2001-12-07 | 2010-08-10 | Cytori Therapeutics, Inc. | Methods of using regenerative cells in the treatment of musculoskeletal disorders |
US20060204556A1 (en) * | 2001-12-07 | 2006-09-14 | Cytori Therapeutics, Inc. | Cell-loaded prostheses for regenerative intraluminal applications |
EP1463800A4 (en) * | 2001-12-07 | 2006-04-26 | Geron Corp | CHONDROCYTE PRE-CREATOR CELLS DERIVED FROM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS |
US7595043B2 (en) * | 2001-12-07 | 2009-09-29 | Cytori Therapeutics, Inc. | Method for processing and using adipose-derived stem cells |
US7514075B2 (en) | 2001-12-07 | 2009-04-07 | Cytori Therapeutics, Inc. | Systems and methods for separating and concentrating adipose derived stem cells from tissue |
JP2005518828A (ja) * | 2001-12-20 | 2005-06-30 | マクロポア インコーポレイテッド | 脂肪組織から抽出したコラーゲンに富む物質を用いた患者を治療するためのシステム及び方法 |
ATE408666T1 (de) * | 2002-05-28 | 2008-10-15 | Toyo Boseki | Verfahren zur kultur, zum speichern und zur induzierung von differenzierung von zellen und gerät zur verwendung in diesem verfahren, und dazugehöriges gebrauchsverfahren. |
US7622562B2 (en) | 2002-06-26 | 2009-11-24 | Zimmer Orthobiologics, Inc. | Rapid isolation of osteoinductive protein mixtures from mammalian bone tissue |
DE60334224D1 (de) * | 2002-07-16 | 2010-10-28 | Biosyntech Canada Inc | Zusammensetzung für die herstellung zellkompatibler, injizierbarer, selbstgelierender chitosan lösungen zum einkapseln und verabreichen von lebenden zellen oderbiologisch aktiven faktoren |
KR20050086780A (ko) | 2002-11-26 | 2005-08-30 | 안트로제네시스 코포레이션 | 세포요법제, 세포요법제 단위 및 이를 이용한 치료방법 |
CA2784829C (en) * | 2003-04-01 | 2015-10-06 | United States Of America Department Of Veteran's Affairs | Stem-cell, precursor cell, or target cell-based treatment of multi-organ failure and renal dysfunction |
AU2004280616A1 (en) | 2003-10-08 | 2005-04-21 | Vet-Stem Inc. | Methods of preparing and using stem cell compositions and kits comprising the same |
WO2005039662A2 (en) * | 2003-10-10 | 2005-05-06 | Kw2 Implantattechnologie Gmbh | Cartilage regeneration by generation of chondrons under high concentrations of magnesium |
JP2006000059A (ja) * | 2004-06-17 | 2006-01-05 | Two Cells Co Ltd | 細胞外基質を用いた動物細胞の増殖及び分化促進方法 |
US8182806B2 (en) * | 2004-09-07 | 2012-05-22 | Johnson Lanny L | Synovial villi for use with tissue engineering |
US7785582B2 (en) * | 2004-09-07 | 2010-08-31 | Johnson Lanny L | Use of synovium and omentum for tissue engineering |
US20060051328A1 (en) * | 2004-09-07 | 2006-03-09 | Johnson Lanny L | Mobilization of cells via physical means |
US8697139B2 (en) | 2004-09-21 | 2014-04-15 | Frank M. Phillips | Method of intervertebral disc treatment using articular chondrocyte cells |
CA2512667A1 (en) * | 2005-01-07 | 2006-07-07 | Takahiro Ochiya | Human hepatocyte-like cells and uses thereof |
US20080140451A1 (en) * | 2005-01-10 | 2008-06-12 | Cytori Therapeutics, Inc. | Devices and Methods for Monitoring, Managing, and Servicing Medical Devices |
EP1888741B1 (en) | 2005-05-27 | 2013-04-17 | Viacell, Inc. | Treatment of ischemia using stem cells |
US7531355B2 (en) | 2005-07-29 | 2009-05-12 | The Regents Of The University Of California | Methods and compositions for smooth muscle reconstruction |
WO2007030811A2 (en) | 2005-09-09 | 2007-03-15 | Duke University | Tissue engineering methods and compositions |
US8518349B2 (en) | 2005-09-12 | 2013-08-27 | Lanny Johnson | Use of autologous sediment from fluid aspirates as vehicles for drug delivery |
US7927630B2 (en) * | 2005-09-12 | 2011-04-19 | Johnson Lanny L | Use of autologous sediment from fluid aspirates as vehicles for drug delivery |
EP1764117A1 (en) | 2005-09-20 | 2007-03-21 | Zimmer GmbH | Implant for the repair of a cartilage defect and method for manufacturing the implant |
JP4958094B2 (ja) * | 2005-09-22 | 2012-06-20 | 国立大学法人広島大学 | 間葉系幹細胞の均質性識別方法、その方法を利用して得られる均質間葉系幹細胞 |
NZ567335A (en) | 2005-10-13 | 2012-02-24 | Anthrogenesis Corp | Immunomodulation using placental stem cells |
CA2628244A1 (en) * | 2005-11-04 | 2007-05-10 | Bio Syntech Canada Inc. | Gel formation of polyelectrolyte aqueous solutions by thermally induced changes in ionization state |
KR20180105266A (ko) | 2005-12-29 | 2018-09-27 | 안트로제네시스 코포레이션 | 태반 줄기 세포 집단 |
AU2006332679A1 (en) | 2005-12-29 | 2007-07-12 | Anthrogenesis Corporation | Co-culture of placental stem cells and stem cells from a second source |
CA2641022A1 (en) | 2006-01-30 | 2007-08-09 | University Of Virginia Patent Foundation | Methods of preparing and characterizing mesenchymal stem cell aggregates and uses thereof |
PT2626417E (pt) | 2006-03-23 | 2015-11-16 | Pluristem Ltd | Métodos para expansão celular e usos de células e de meios condicionados produzidos através deles para terapia |
WO2007139551A1 (en) * | 2006-05-30 | 2007-12-06 | Cytori Therapeutics, Inc. | Systems and methods for manipulation of regenerative cells from adipose tissue |
MX2008015645A (es) * | 2006-06-09 | 2009-02-06 | Anthrogenesis Corp | Nicho placentario y uso de este para cultivar celulas primordiales. |
WO2008013863A2 (en) * | 2006-07-26 | 2008-01-31 | Cytori Therapeutics, Inc. | Generation of adipose tissue and adipocytes |
JP5013584B2 (ja) * | 2006-08-30 | 2012-08-29 | 株式会社日立製作所 | 軟骨細胞の培養方法および軟骨細胞 |
CA2665475A1 (en) * | 2006-10-06 | 2008-05-22 | University Of Virginia Patent Foundation | Methods and compositions useful for diabetic wound healing |
JP2010507392A (ja) * | 2006-10-23 | 2010-03-11 | アントフロゲネシス コーポレーション | 胎盤細胞集団で骨欠損を治療するための方法及び組成物 |
EP2120977B1 (en) | 2007-02-12 | 2013-05-15 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of inflammatory diseases using placental stem cells |
US7632340B2 (en) * | 2007-03-07 | 2009-12-15 | Hamilton Beach Brands, Inc. | Air purifier for removing particles or contaminants from air |
EP2155860B1 (en) | 2007-05-03 | 2014-08-27 | The Brigham and Women's Hospital, Inc. | Multipotent stem cells and uses thereof |
TWM322542U (en) * | 2007-05-23 | 2007-11-21 | Universal Scient Ind Co Ltd | Testing machine |
US9200253B1 (en) | 2007-08-06 | 2015-12-01 | Anthrogenesis Corporation | Method of producing erythrocytes |
ES2392729T5 (es) | 2007-09-19 | 2015-08-28 | Pluristem Ltd. | Células adherentes de tejidos adiposos o de placenta y uso de las mismas en terapia |
PT2203176E (pt) | 2007-09-28 | 2015-03-02 | Anthrogenesis Corp | Supressão de tumor utilizando perfusato placentário humano e células assassinas naturais intermédias derivadas de placenta humanas |
US8603819B2 (en) * | 2008-05-23 | 2013-12-10 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods for generating musculoskeletal tissue |
CA2725637A1 (en) | 2008-05-27 | 2009-12-03 | Pluristem Ltd. | Methods of treating inflammatory colon diseases |
WO2010021993A1 (en) * | 2008-08-19 | 2010-02-25 | Cytori Therapeutics, Inc. | Methods of using adipose tissue-derived cells in the treatment of the lymphatic system and malignant disease |
US8828376B2 (en) | 2008-08-20 | 2014-09-09 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of stroke using isolated placental cells |
NZ601497A (en) | 2008-08-20 | 2014-03-28 | Anthrogenesis Corp | Improved cell composition and methods of making the same |
DK2331109T3 (da) | 2008-08-22 | 2013-09-08 | Anthrogenesis Corp | Fremgangsmåder og sammensætninger til behandling af knogledefekter med placentale cellepopulationer |
RU2539786C2 (ru) | 2008-09-02 | 2015-01-27 | Плуристем Лтд. | Выращенные в прикрепленной к субстрату культуре клетки из ткани плаценты и их использование при лечении |
EP2182055A1 (en) | 2008-10-14 | 2010-05-05 | Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf | Human cord blood derived unrestricted somatic stem cells (USSC) |
US20100098739A1 (en) * | 2008-10-20 | 2010-04-22 | University Of Virginia Patent Foundation | Compositions and methods for modular soft tissue repair |
CN107201337A (zh) | 2008-11-19 | 2017-09-26 | 人类起源公司 | 羊膜来源的贴壁细胞 |
US9192695B2 (en) | 2008-11-20 | 2015-11-24 | Allosource | Allografts combined with tissue derived stem cells for bone healing |
ES2625893T3 (es) * | 2009-05-01 | 2017-07-20 | Bimini Technologies Llc | Sistemas, procedimientos y composiciones para optimizar injertos enriquecidos con tejido y células |
CA2767014C (en) * | 2009-07-02 | 2022-01-25 | Anthrogenesis Corporation | Method of producing erythrocytes without feeder cells |
US9081008B2 (en) | 2009-12-04 | 2015-07-14 | James Sherley | Detecting and counting tissue—specific stem cells and uses thereof |
WO2011087779A2 (en) | 2009-12-22 | 2011-07-21 | National Cheng Kung University | Cell tissue gel containing collagen and hyaluronan |
MX2012008636A (es) | 2010-01-26 | 2012-10-15 | Anthrogenesis Corp | Tratamiento de canceres relacionados con el hueso utilizando celulas madre placenterias. |
NZ602808A (en) | 2010-04-07 | 2014-10-31 | Anthrogenesis Corp | Angiogenesis using placental stem cells |
WO2011127113A1 (en) | 2010-04-08 | 2011-10-13 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of sarcoidosis using placental stem cells |
WO2013106655A1 (en) | 2012-01-11 | 2013-07-18 | The Gid Group, Inc. | Method for processing adipose tissue and processing apparatus |
US9206387B2 (en) | 2010-07-09 | 2015-12-08 | The Gid Group, Inc. | Method and apparatus for processing adipose tissue |
WO2012006587A2 (en) | 2010-07-09 | 2012-01-12 | The Gid Group, Inc. | Apparatus and methods relating to collecting and processing human biological material containing adipose |
US9296984B2 (en) | 2010-07-09 | 2016-03-29 | The Gid Group, Inc. | Tissue processing apparatus and method for processing adipose tissue |
EP2593542B1 (en) | 2010-07-13 | 2018-01-03 | Anthrogenesis Corporation | Methods of generating natural killer cells |
JP6091415B2 (ja) | 2010-10-07 | 2017-03-08 | ナショナル チェン クン ユニバーシティー | 糖尿病における虚血肢の血流の促進のためのヒアルロナンの使用 |
WO2012048298A2 (en) | 2010-10-08 | 2012-04-12 | Caridianbct, Inc. | Methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system with control conditions |
US8969315B2 (en) | 2010-12-31 | 2015-03-03 | Anthrogenesis Corporation | Enhancement of placental stem cell potency using modulatory RNA molecules |
EP3260533B1 (en) | 2011-03-22 | 2019-09-11 | Pluristem Ltd. | Methods for treating radiation or chemical injury |
WO2012166844A2 (en) | 2011-06-01 | 2012-12-06 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of pain using placental stem cells |
WO2013055476A1 (en) | 2011-09-09 | 2013-04-18 | Anthrogenesis Corporation | Treatment of amyotrophic lateral sclerosis using placental stem cells |
BR112015004003B1 (pt) | 2012-09-06 | 2020-05-19 | The Gid Group Inc | aparelho para processar material biológico humano contendo tecido fibroso e método para processar tecido adiposo |
CN105142651A (zh) | 2013-02-05 | 2015-12-09 | 人类起源公司 | 来自胎盘的自然杀伤细胞 |
WO2014128634A1 (en) | 2013-02-20 | 2014-08-28 | Pluristem Ltd. | Gene and protein expression properties of adherent stromal cells cultured in 3d |
KR102312720B1 (ko) | 2013-03-15 | 2021-10-13 | 알로소스 | 연조직 회복 및 재생을 위한 세포 재배치된 콜라겐 매트릭스 |
US10336980B2 (en) | 2013-09-05 | 2019-07-02 | The Gid Group, Inc. | Tissue processing apparatus and method for processing adipose tissue |
US9617506B2 (en) | 2013-11-16 | 2017-04-11 | Terumo Bct, Inc. | Expanding cells in a bioreactor |
US11008547B2 (en) | 2014-03-25 | 2021-05-18 | Terumo Bct, Inc. | Passive replacement of media |
EP2979710B8 (en) | 2014-07-29 | 2020-07-15 | National Cheng Kung University | Cell tissue gel containing collagen and hyaluronan |
CN106715676A (zh) | 2014-09-26 | 2017-05-24 | 泰尔茂比司特公司 | 按计划供养 |
HUP1500218A2 (hu) | 2015-05-08 | 2016-11-28 | Deltabio 2000 Kft | Eljárás és készítmény ortopédiai betegségek, így ízületiporc-sérülések, különösen ízületi diszplázia kezelésére |
WO2017004592A1 (en) | 2015-07-02 | 2017-01-05 | Terumo Bct, Inc. | Cell growth with mechanical stimuli |
US11104874B2 (en) | 2016-06-07 | 2021-08-31 | Terumo Bct, Inc. | Coating a bioreactor |
US11685883B2 (en) | 2016-06-07 | 2023-06-27 | Terumo Bct, Inc. | Methods and systems for coating a cell growth surface |
WO2018044791A1 (en) | 2016-08-30 | 2018-03-08 | Lifecell Corporation | Systems and methods for medical device control |
USD851777S1 (en) | 2017-01-30 | 2019-06-18 | Lifecell Corporation | Canister-type device for tissue processing |
US11655454B1 (en) * | 2017-03-23 | 2023-05-23 | Elite IP, LLC | Method and apparatus for improved mesenchymal stem cell harvesting |
CN110612344B (zh) | 2017-03-31 | 2023-09-12 | 泰尔茂比司特公司 | 细胞扩增 |
US11624046B2 (en) | 2017-03-31 | 2023-04-11 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
US11732233B2 (en) | 2017-07-18 | 2023-08-22 | Gid Bio, Inc. | Adipose tissue digestion system and tissue processing method |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5486359A (en) * | 1990-11-16 | 1996-01-23 | Osiris Therapeutics, Inc. | Human mesenchymal stem cells |
US5226914A (en) * | 1990-11-16 | 1993-07-13 | Caplan Arnold I | Method for treating connective tissue disorders |
US5197985A (en) * | 1990-11-16 | 1993-03-30 | Caplan Arnold I | Method for enhancing the implantation and differentiation of marrow-derived mesenchymal cells |
US5646001A (en) * | 1991-03-25 | 1997-07-08 | Immunivest Corporation | Affinity-binding separation and release of one or more selected subset of biological entities from a mixed population thereof |
US5436151A (en) * | 1992-04-03 | 1995-07-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Method for culturing human hematopoietic stem cells in vitro |
US5466572A (en) * | 1992-09-03 | 1995-11-14 | Systemix, Inc. | High speed flow cytometric separation of viable cells |
US5736396A (en) * | 1995-01-24 | 1998-04-07 | Case Western Reserve University | Lineage-directed induction of human mesenchymal stem cell differentiation |
-
1996
- 1996-11-15 CA CA2237890A patent/CA2237890C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-15 US US08/749,484 patent/US5908784A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-15 EP EP96940480A patent/EP0868505B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-15 WO PCT/US1996/018371 patent/WO1997018299A1/en active IP Right Grant
- 1996-11-15 AU AU77351/96A patent/AU713280B2/en not_active Ceased
- 1996-11-15 DK DK96940480T patent/DK0868505T3/da active
- 1996-11-15 ES ES96940480T patent/ES2238077T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-15 PT PT96940480T patent/PT868505E/pt unknown
- 1996-11-15 AT AT96940480T patent/ATE288480T1/de active
- 1996-11-15 DE DE69634303T patent/DE69634303T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-15 JP JP51911497A patent/JP3781433B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE69634303D1 (de) | 2005-03-10 |
DK0868505T3 (da) | 2005-06-06 |
AU713280B2 (en) | 1999-11-25 |
WO1997018299A1 (en) | 1997-05-22 |
DE69634303T2 (de) | 2006-01-05 |
JP2000516802A (ja) | 2000-12-19 |
CA2237890C (en) | 2011-03-29 |
AU7735196A (en) | 1997-06-05 |
EP0868505B1 (en) | 2005-02-02 |
CA2237890A1 (en) | 1997-05-22 |
ES2238077T3 (es) | 2005-08-16 |
PT868505E (pt) | 2005-06-30 |
US5908784A (en) | 1999-06-01 |
ATE288480T1 (de) | 2005-02-15 |
EP0868505A4 (en) | 2002-07-17 |
EP0868505A1 (en) | 1998-10-07 |
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---|---|---|
JP3781433B2 (ja) | ヒト間葉幹細胞の試験管内軟骨形成誘導 | |
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