MX2012008636A

MX2012008636A - Tratamiento de canceres relacionados con el hueso utilizando celulas madre placenterias.

Info

Publication number: MX2012008636A
Application number: MX2012008636A
Authority: MX
Inventors: Sascha Abramson; Xiaokui Zhang; Shmuel Yaccoby
Original assignee: Anthrogenesis Corp
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2011-01-25
Publication date: 2012-10-15
Also published as: US9121007B2; DK3284818T3; ES2646750T3; HK1251012A1; EP2529007B1; CN102822330A; WO2011094181A1; AR080030A1; JP2013518108A; EP3284818B1; EP3284818A1; EP2529007A1; US20110206645A1; AU2011209819A1; CA2787992A1; US20150306150A1; KR20120115602A

Abstract

Se describe una unidad de red de seguridad para bloquear en forma selectiva y exponer una abertura en un contenedor de flete que tenga una unidad de pared que se una a un espacio de almacenamiento. Una red flexible se coloca a elección en: i) un primer estado, en donde la red abarca una altura y amplitud considerable de una abertura de acceso; y ii) un segundo estado, en donde la abertura está más expuesta. Con la red en el primer estado, la red tiene una primera longitud entre una primera y segunda ubicación separadas que abarca una parte de la amplitud de la abertura a lo largo de una línea horizontal a una primera altura. La red puede extenderse para permitir que la primera ubicación en la red sea descendida manteniendo al mismo tiempo la segunda ubicación de la red a la primera altura, de modo que la línea entre la primera y segunda ubicaciones tenga un ángulo respecto a la línea horizontal, y tiene una segunda longitud entre la primera y segunda ubicaciones que es mayor que la primera longitud.

Description

TRATAMIENTO DE CÁNCERES RELACIONADOS CON EL HUESO UTILIZANDO CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS Esta solicitud reclama el beneficio ante la Solicitud de Patente Provisional Serie U.S. No. 61/298,517, presentada el 26 de enero de 2010; la Solicitud de Patente Provisional U.S. No. 61/307,821, presentada el 24 de febrero de 2010; y la Solicitud de Patente Provisional U.S. Serie No. 61/352,768, presentada el 8 de junio de 2010, cada una de las cuales se incorpora para referencia en la presente en su totalidad. 1. CAMPO En la presente se proporcionan los métodos para utilizar células madre placentarias que se adhieren al plástico en cultivo de tejido (en adelante se mencionan como sus siglas en inglés PDAC) , y/o células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea (por sus siglas en inglés BM-MSC) para tratar cánceres relacionados con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple, para suprimir la proliferación de células de los cánceres relacionados con el hueso, p. ej . , células de mieloma múltiple o células de condrosarcoma, y para suprimir el crecimiento de los cánceres relacionados con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple, condrosarcoma, y otros cánceres relacionados con el hueso, p. ej . , tumores. 2. ANTECEDENTE El mieloma múltiple (también conocido como MM, mieloma, mieloma de células plasmáticas, o enfermedad de Kahler) es un tipo de cáncer de células plasmáticas, las cuales son células del sistema inmunitario productor de anticuerpos. Los síntomas del mieloma múltiple pueden ser dolor de huesos, infección, insuficiencia renal, anemia, y lesiones óseas. Se considera que la enfermedad es incurable, y solo se dispone de algunos tratamientos, como puede ser lenalidomida (REVLIMID®) que son prometedores. Por tanto, existe la necesidad de nuevos tratamientos para mieloma múltiple. A la fecha, nadie ha descrito la capacidad de las células madre placentarias que se adhieren al plástico en cultivo de tejido, no hematopoyéticas , para suprimir el crecimiento de cánceres relacionados con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple, o para suprimir la proliferación de las células de los cánceres relacionados con el hueso. 3. COMPENDIO En un aspecto, se proporcionan en la presente métodos para el tratamiento de un individuo que tenga cáncer relacionado con el hueso, que consisten en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de células madre placentarias que se adhieren al plástico en cultivo de tejido, aisladas, también mencionados en la presente como las PDAC (células adherentes obtenidas de placenta) , poblaciones aisladas de tales células madre placentarias, o poblaciones aisladas de células que contengan las células madre placentarias; y/o células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea (BM-MSC), aisladas, o médula ósea que contenga las BM-MSC.

En una modalidad, se proporciona en la presente un método de tratamiento para un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de células madre placentarias y/o las BM-MSC, en donde la cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC mejora, p. ej . , mejora de manera que pueda detectarse, uno o más síntomas de, o disminuye, p. ej . , disminuye de manera que pueda detectarse, el progreso del cáncer relacionado con el hueso. En una modalidad específica, el cáncer relacionado con el hueso es mieloma múltiple. En una modalidad específica, el cáncer relacionado con el hueso es condrosarcoma . En otras modalidades, el cáncer relacionado con el hueso es cáncer óseo, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, cordoma, histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer prostético o fibrosarcoma de hueso. En una modalidad especifica, el cáncer relacionado con el hueso no es cáncer prostético. En otras modalidades, el cáncer relacionado con el hueso consiste en un tumor sólido. En otra modalidad, el individuo es un mamífero. En otra modalidad, el individuo es un humano. En otra 'modalidad, la administración de las células madre placentarias produce un mejoramiento mayor, p. ej . , mayor y que pueda ser detectado, de uno o más síntomas en comparación con la administración de un número equivalente de células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea. En ciertas modalidades, las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea son uno o más de los siguientes: células CD34~, CD45", CD73+ y/o CD105+.

En ciertas modalidades, el individuo presenta una lesión ósea, p. ej . , una lesión ósea ocasionada por cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , una lesión ósea visible en un radiograma de rayos X. En otras modalidades, el individuo no presenta una lesión ósea, p. e . , una lesión ósea ocasionada por cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , una lesión ósea visible en un radiograma de rayos X. En otras modalidades, la administración permite retardar la presencia de, o el inicio de lesiones óseas, p. ej . , lesiones óseas ocasionadas por cáncer relacionado con el hueso, p. e . , como se puede observar en un radiograma de rayos X, o lesiones óseas ocasionadas por el tratamiento de un cáncer .

En algunas modalidades, las células madre placentarias , y/o las BM-MSC, se administran al individuo por vía intravenosa. En otras modalidades, el método de tratamiento consiste en administrar al menos aproximadamente 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010 o 1 x 10u células madre placentarias, y/o las BM-MSC a un individuo, en términos del número total de células. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias, las BM-MSC o ambas han sido proliferadas in vitro para no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 duplicaciones de población antes de la administración. En otra modalidad, las células madre placentarias, y/o las BM-MSC, se administran al individuo en o junto a una lesión ósea, p. ej . , una lesión ósea ocasionada por cáncer relacionado con el hueso. En otra modalidad, el método de tratamiento además consiste en administrar al individuo uno o más compuestos anticáncer. En otra modalidad de cualquiera de las modalidades de la presente, las células madre placentarias y/o las BM-MSC han sido criopreservadas y descongeladas antes de la administración .

En una modalidad, los métodos de tratamiento pueden consistir en determinar, una vez o una pluralidad de veces antes de la administración y/o una vez o una pluralidad de veces después de la administración, uno o más de lo siguiente: (1) un número o grado de lesiones óseas en el individuo; (2) un número de precursores de osteoclastos en el individuo; o (3) un número de células de mieloma múltiple en el individuo, p. ej . , al menos una vez antes y al menos una vez después de la administración. En ciertas modalidades, la cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias, y/o las BM-MSC, disminuye, p. ej . , disminuye de manera que pueda detectarse, el número de, o el grado de severidad de, o disminuye la velocidad de aumento en el número de, o el grado de severidad, de las lesiones óseas en el individuo, p. ej . , como se puede determinar por densitometria ósea o rayos X. En otras modalidades, la cantidad terapéutica eficaz de las células madre placenterías , y/o las BM-MSC, disminuyen, p. ej . , disminuye de manera que pueda detectarse, el número precursores de los osteoclastos en el individuo, p. ej . , tal y como se determina utilizando un anticuerpo específico para los precursores de los osteoclastos para detectar los precursores de los osteoclastos en, p. ej . , la sangre periférica o médula ósea del individuo. En otras modalidades, la cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias, y/o las BM-MSC, disminuye el número de células cancerosas relacionadas con el hueso, p. ej . , células de mieloma múltiple, en el individuo, p. ej . , tal y como se determina por el recuento de las células (p. ej . , por citometria de flujo), o la tinción de los anticuerpos de las células sanguíneas nucleadas obtenidas del individuo empleando un anticuerpo específico para tales células, p. ej . , células de mieloma múltiple o células plasmáticas, p. ej . , un anticuerpo específico para los marcadores celulares CD28 o CD138, o como puede determinarse mediante la evaluación del nivel o concentración de proteínas M en la sangre del individuo. En otras modalidades, las células madre placentarias, y/o las BM-MSC, disminuyen el número de células del cáncer relacionado con el hueso, o los precursores de los osteoclastos, en al menos, p. ej . , 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%, en comparación con el número de células antes de la administración de las células madre placentarias .

En otra modalidad, el individuo tiene condrosarcoma; p. ej . , el cáncer relacionado con el hueso es condrosarcoma. En ciertas modalidades, el método de tratamiento consiste en determinar, una vez o una pluralidad de veces antes de la administración, y/o una vez o una pluralidad de veces después de la administración, uno o más de lo siguiente: el número de células de condrosarcoma en el individuo o el número de lesiones óseas (p. ej . , masas ocasionadas por condrosarcoma) en el individuo.

En otro aspecto, en la presente se proporciona un método para suprimir la proliferación de las células de cáncer relacionado con el hueso, que consiste en poner en contacto las células de un cáncer relacionado con el hueso con una pluralidad de células madre placentarias, y/o las BM-MSC, durante un tiempo suficiente para que las células madre placentarias y/o las BM-MSC supriman, p. ej . , supriman de manera detectable la proliferación de las células de un cáncer relacionado con el hueso, en comparación con una pluralidad de las células del cáncer relacionado con el hueso que no se pusieron en contacto con las células madre placentarias y/o las BM-MSC, p. e . , como se puede determinar por una disminución, p. ej . , una disminución detectable, en el número de células cancerosas relacionadas con el hueso, o una disminución detectable en el aumento en el número de las células cancerosas relacionadas con el hueso. En ciertas modalidades, las células de un cáncer relacionado con el hueso son células de mieloma múltiple. En otra modalidad del método, las células de un cáncer relacionado con el hueso son células de condrosarcoma. En otras modalidades, las células de un cáncer relacionado con el hueso son células de cáncer óseo, células de neuroblastoma, células de osteosarcoma, células de sarcoma de Ewing, células de cordoma, células de un histiocitoma fibroso maligno de hueso o células de fibrosarcoma de hueso. En otra modalidad especifica, las células de un cáncer relacionado con el hueso son parte de un tumor sólido.

En ciertas modalidades del método, el contacto se hace in vitro. En algunas otras modalidades, el contacto se hace in vivo. En ciertas modalidades, el contacto se hace en un individuo que tenga las células del cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , en un individuo que tenga una enfermedad ocasionada por tales células. En otras modalidades, el contacto se hace en un individuo que tenga células de mieloma múltiple, p. ej . , en un individuo que tenga mieloma múltiple. En ciertas modalidades, el individuo es un mamífero, p. ej . , un humano. En otra modalidad específica, el contacto consiste en administrar las células madre placentarias al individuo por vía intravenosa. En otra modalidad específica, el contacto consiste en administrar las células madre placentarias, y/o las BM- SC, al individuo en o junto a una lesión ósea del individuo.

En otra modalidad, los métodos para suprimir la proliferación de las células de un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , las células de mieloma múltiple, además consisten en poner en contacto las células de un cáncer relacionado con el hueso con uno o más compuestos contra cáncer, p. ej . , con una cantidad terapéutica eficaz de uno o más compuestos contra cáncer. En otra modalidad, el método consiste en administrar al menos alrededor de 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109 o 1 x 1010 células madre placentarias, y/o las BM-MSC, al individuo. En ciertas modalidades, las células madre placentarias y/o las BM-MSC, y/o las BM-MSC han sido proliferadas in vitro durante no más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 duplicaciones de población. En otras modalidades, las células madre placentarias, y/o las BM-MSC, suprimen la proliferación de las células del cáncer relacionado con el hueso en al menos, p. ej . , 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%. 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%), 95%, 98% o 99%, en comparación con la proliferación de un número equivalente de células de cáncer relacionado con el hueso en ausencia de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, p. ej . , tal y como se puede determinar por una disminución detectable en el número de las células de cáncer relacionadas con el hueso, o una disminución detectable en el aumento en el número de células de cáncer relacionado con el hueso, o tal y como se puede determinar por una disminución detectable en el número y/o la gravedad de las lesiones óseas en un individuo que tenga tales células cancerosas.

En otras modalidades, las células madre placentarias o las BM-MSC, o ambas, han sido criopreservadas y descongeladas antes de ponerlas en contacto. En otra modalidad, el método consiste en determinar que tales células madre placentarias suprimen, p. ej . , suprimen de manera detectable, la proliferación de una muestra de tales células de un cáncer relacionado con el hueso antes de ponerlas en contacto.

En otra modalidad, se proporciona un método para disminuir la maduración de los precursores de los osteoclastos , en osteoclastos , que consiste en poner en contacto los precursores de los osteoclastos con una pluralidad de células madre placentarias y/o las B -MSC, en donde la pluralidad de las células madre placentarias y/o las BM-MSC es un número de células suficiente para disminuir, p. ej . , disminuir de manera detectable, la maduración de los osteoclastos a partir de los precursores de los osteoclastos, p. ej . , tal y como se pude determinar por una disminución detectable de, o la ausencia del aumento en, el número de los osteoclastos como resultado del contacto. En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para aumentar la apoptosis de los precursores de los osteoclastos, que consiste en poner en contacto los precursores de los osteoclastos con una pluralidad de células madre placentarias y/o las BM-MSC, en donde la pluralidad de las células madre placentarias y/o las BM-MSC es un número de células suficiente para aumentar, p. e . , aumentar de manera detectable, la apoptosis de los precursores de los osteoclastos. En ciertas modalidades, el aumento de la apoptosis de los precursores de los osteoclastos se detecta mediante un aumento detectable en la tinción con anexina V y/o yoduro de propidio de los precursores de los osteoclastos del individuo. En ciertas modalidades, los precursores de los osteoclastos están en un individuo, p. ej . , un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple, condrosarcoma, o uno de los demás cánceres relacionados con el hueso descritos en la presente. En algunas otras modalidades, el método consiste en poner en contacto los precursores de los osteoclastos con lenalidomida, p. ej . , administrando lenalidomida a un individuo que tenga precursores de los osteoclastos.

En ciertas modalidades de los métodos antes mencionados, el contacto se lleva a cabo in vitro. En otras modalidades, el contacto se lleva a cabo in vivo. En otra modalidad, el contacto toma lugar en un humano. En otra modalidad, el contacto se lleva a cabo en un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , un individuo que tenga células de un cáncer relacionado con el hueso, o una enfermedad ocasionada por tales células. En otra modalidad, el individuo es un individuo que tiene mieloma múltiple o células de mieloma múltiple. En otra modalidad, el individuo tiene al menos un síntoma de mieloma múltiple. En otra modalidad, el individuo tiene al menos una lesión ósea ocasionada por mieloma múltiple.

En ciertas modalidades de cualquiera de los métodos antes mencionados, las células madre placentarias son uno o más de lo siguiente: (1) adherentes al plástico de cultivo de tejido; (2) CD34~, CD10+, CD105+ y CD200+, tal y como se puede detectar por citometria de flujo; y/o (3) tienen la capacidad para diferenciarse en células oteogénicas o condrogénicas , p. ej . , in vitro o in vivo, o ambos. En otra modalidad, las células madre placentarias, pueden adherirse al plástico del cultivo de tejido; son CD34", CD10+, CD105+ y CD200+, tal y como se puede detectar por citometria de flujo; y tienen la capacidad para diferenciarse en células que tengan un o más de las características de las células osteogénicas o condrogénicas, p. ej . , características de osteocitos o condrocitos, p. ej . , in vitro o in vivo, o ambos. En otras modalidades, las células madre placentarias además tienen la capacidad para diferenciarse en células que tengan un o más de las características de las células neuronales o células neurogénicas, p. ej . , las características de las neuronas; una o más de las características de las células gliales, p. ej . , las características del glía o los astrocitos; una o más de las características de las células adiposas, p. ej . , las características de los adipocitos; una o más de las características de las células pancreáticas; y/o una o más de las características de las células cardiacas. En una modalidad específica de cada una de las modalidades de las células madre placentarias descritas en la presente, las células madre placentarias se aislan de las células madre placentarias.

En otra modalidad, las células madre placentarias son células CD34", CD10+, CD105+ y CD200+, y son una o más de lo siguiente: células CD44+, CD45", CD90+, CD166+, KDR" o CD 133". En una modalidad especifica, las células madre placentarias son células CD34", CD10+, CD105+ y CD200+, CD44+, CD45", CD90+, CD166"1', KDR" y CD 133". En otra modalidad, las células madre placentarias son células CD34", CD10+, CD105+ y CD200+, y una o más de las siguientes: HLA ABC+, HLA DR, DQ, DP", CD8C", CD86", CD98" o PD-L1+. En una modalidad más específica, las células madre placentarias son CD34", CD10+, CD105+ y CD200+, HLA ABC+, HLA DR, DQ, DP", CD8CT, CD86", CD98" y PD-L1+ . En otra modalidad, las células madre placentarias son CD34", CD10+, CD105+ y CD200+, y una o más de las siguientes CD38", CD45", CD80", CD86", CD 133", HLA-DR, DP, DQ", SSEA3", SSEA4", CD29+, CD44+, CD73+, CD90+, CD105+, HLA-A,B,C+, PDL1+, ABC-p+ y/o OCT-4+, tal y como se puede detectar por citometría de flujo y/o por RT-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa de transmisión inversa) En otra modalidad, las células madre placentarias son CD34 , CD45 , CD10+, CD90+, CD105+ y CD200+, tal y como se puede detectar por citometría de flujo. En otra modalidad, las células madre placentarias son CD34", CD45", CD10+, CD80", CD86", CD90+, CD105+ y CD200+, tal y como se puede detectar por citometría de flujo. En otra modalidad, las células madre placentarias son CD34", CD45", CD10+, CD80", CD86", CD90+ , CD105+ y CD200+, y además una o más de las siguientes CD29+, CD38", CD44+ , CD54+, SH3+ o SH4+, tal y como se puede detectar por citometría de flujo. En otra modalidad, las células madre placentarias son CD34", CD38", CD45~, CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD73+, CD80", CD86", CD90+ , CD105+, y CD200+ tal y como se puede detectar por citometría de flujo.

En otra modalidad, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+ y CD200+ son además una o más de las siguientes: CD3~, CD9~, CD117", CD133", CD146+, CD166+, KDR~ (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR~, o Programmed Death-1 Ligand (ligando para muerte programada 1, PDL1)+, o cualquier combinación de éstos. En otra modalidad específica, las células madre placentarias son CD3~, CD9", CD34", CD38", CD45", CD10+, CD29+, CD44+ , CD54 +, CD73+, CD80", CD86~, CD90+, CD105+, CD1 IT, CD133", CD146+, CD166+, CD200+, KDR" (VEGFR2") , HL7A- A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR", o Programmed Death-1 Ligand (PDL1)+, tal y como se puede detectar por citometría de flujo.

En otra modalidad, cualquiera de las células madre placentarias descritas en la presente además son ABC-p+, tal y como se puede detectar por citometría de flujo, o 0CT-4+ (P0U5F1+), p. ej . , tal y como se puede detectar por RT-PCR, en donde ABC-p es una proteína transportadora ABC específica de la placenta (también conocida como proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) y como proteína de resistencia a mitoxantrona (MXR) ) . En otra modalidad, cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente son además SSEA3" o SSEA4", p. ej . , como se puede determinar por citometría de flujo, en donde SSEA3 es un antígeno embrionario específico del estadio 3, y SSEA4 es el antígeno embrionario específico del estadio 4. En otra modalidad, cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente además son SSEA3" y SSEA4".

En otra modalidad de los métodos que se describen en la presente, cualquiera de las poblaciones de las células madre placentarias de las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente además son uno o más de lo siguientes: MHC-1+ (p. ej . , HLA-A,B,C+), MHC-II" (p. ej . , HLA-DP, DQ, DR~) o HLA-G". En otra modalidad, cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente además son cada uno de los siguientes: MHC-I+ (p. ej . , HLA-A, B,C+), MHC-II" (p. ej . , HLA-DP, DQ, DR") y HLA-G".

En otra modalidad, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+, CD200+ son además uno o más de los siguientes: CD3", CD9", CD29+, CD38", CD44+, CD54+ , CD80", CD86", CD146+, CD166+, SH3+ o SH4+ . En otra modalidad, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+, CD200+ además son CD44+. En otra modalidad, las células madre placentarias CD34~, CD10+, CD105+, CD200+ además son una o más de las siguientes: CD3", CD9~, CD13+, CD29+, CD33+, CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD62E", CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+), CD80", CD86", CD90+, SH2+ (CD105+) , CD106A/VCAM+, CD117", CD144 /VE-caderinaba o, CD184 /CXCR4", CD133", OCT-4+, SSEA3", SSEA4" ABC-p+, DR" (VEGFR21, HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQr DR", HLA-G-, o ligando de muerte programada-1 (PDL1)+, o cualquier combinación de éstas. En otra modalidad, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+, CD200+ además son CD13+, CD29+, CD33+, CD38", CD44+ , CD45", CD54/ICAM+, CD62E", CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+) , SH4+ (CD73+) , CD80", CD86", CD90+, SH2+ (CD105+) , CD 106/VCAM+, CDl XT, CD144 VE-caderinadim, CD146+, CD166+, CD184 /CXCR4", CD133", OCT-4 , SSEA3", SSEA4", ABC-p+, DR~ (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR~, HLA-G" y ligando de muerte programada-1 (PDL1)+.

En otras modalidades de los métodos que se describen en la presente, las células madre placentarias aisladas son células CD200+ y HLA-G"; CD73+, CD105+, y CD200+; CD200+ y OCT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G-; CD73+ y CD105+; o 0CT-4+; o cualquier combinación de éstas.

En ciertas modalidades de los métodos que se describen en la presente, las células madre placentarias son una o más de las siguientes: CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3", SSEA4", OCT-4+, MHC-I+ o ABC-p+, donde ABC-p es una proteina transportadora ABC especifica de la placenta (también conocida como proteina de resistencia al cáncer de mama (BCRP) y como proteina de resistencia a mitoxantrona (MXR) ) . En otra modalidad, las células madre placentarias son células CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3", SSEA4" y 0CT-4+. En otra modalidad, las células madre placentarias son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD45~ CD54+, SH2+, SH3+, y SH4T. En otra modalidad, las células madre placentarias son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD45"", CD54+, SH2+, SH3+, SH4+ y OCT-4+. En otra modalidad, las células madre placentarias son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, MHC-1+, SH2+, SH3+, SH4+. En otra modalidad, las células madre placentarias son OCT-4+ y ABC-p+. En otra modalidad, las células madre placentarias son SH2+, SH3+, SH4+ y 0CT-4+. En otra modalidad, las células madre placentarias son 0CT-4+, CD34", SSEA3", y SSEA4". En una modalidad especifica, las células madre placentarias 0CT-4\ CD34", SSEA3", y SSEA4~ además son CD10+, CD29+, CD34", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, y SH4+ . En otra modalidad, las células madre placentarias son OCT-4+ y CD34", y SH3+ o SH4+. En otra modalidad, las células madre placentarias son CD34" y cualquiera de CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90+ o 0CT-4+. En ciertas modalidades, las células madre placentarias son CD10+, CD34", CD105+ y CD200+ .

En otra modalidad, las he células madre placentarias son una o más de CD10+, CD29+, CD44+, CD45", CD54/ICAM", CD62-E", CD62-L", CD62-F", CD80", CD86" CD103", CD104", CD105+, CD106 VCAM+, CD144/VE-caderinadim, CD184 /CXCR4", 2-microglobulinadira, MHC-ldim, MHC-II", HLA-Gdim y/o PDLldim. En ciertas modalidades, tales células madre placentarias o población de células madre placentarias aisladas son al menos CD29+ y CD54". En otra modalidad, tales células madre placentarias son al menos CD44 y CD106+. En otra modalidad, tales células madre placentarias son al menos CD29+.

En ciertas modalidades de cualquiera de las características antes mencionadas, la expresión del marcador celular (p. e . , el agregado de diferenciación o marcador inmunógeno) se determina por citometría de flujo. En algunas otras modalidades, la expresión del m marcador celular se determina por RT-PCR.

En otra modalidad, las células madre placentarias, p. ej . , las células CD10+, CD34", CD105+, CD200+, p. ej . , las células el agregado, expresan uno o más genes a un nivel superior, p. ej . , un nivel detectablemente mayor, que un número equivalente de células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea, en donde el uno o más genes son uno o más de, o todos de los siguientes, ACTG2, ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cl lorf9, CD200, C0L4A1, COL4A2, CPA4, DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2, F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8, LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1, PCDH7, PDLIM3, PKP2, RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2, VTN y ZC3H12A, y en donde las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea han sufrido un número de pases en cultivo equivalente al número de pases que las células madre placentarias aisladas han sufrido. En ciertas modalidades, la expresión de uno o más genes se determina, p. ej . , por RT-PCR o análisis de microarreglos, p. e . , utilizando un microarreglo U133-A (Affymetrix) . En otra modalidad, las células madre placentarias expresan, p. ej . , expresan de manera diferencial, los uno ó más genes cuando se cultivan, p. ej . , desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 35 duplicaciones de la población, en un medio que contenga 60% de DMEM-LG (p. ej . , de Gibco) y 40% de MCDB-201 (p. e . , de Sigma) ; 2% de suero bovino fetal (p. ej . , de Hyclone Labs.); lx de insulina-transferrina-selenio (ITS); lx de ácido linoléico-albúrr.ina sérica de bovino (LA-BSA) ; dexametasona 10"9 (p. ej . , de Sigma); 2-fosfato del ácido ascórbico 10"4 M (p. ej . , de Sigma); factor de crecimiento epidermal 10 ng/mL (p. ej . , de R&D Systems); y el factor de crecimiento obtenido de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL (p. ej . , de R&D Systems) . En otra modalidad, las células madre placentarias expresan, p. ej . , expresan de manera diferencial, el uno o más genes cuando se cultivan desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 35 duplicaciones de la población en un medio que contenga 60% de DMEM-LG (p. ej . , de Gibco) y 40% de MCDB-201 (p. ej . , de Sigma) ; 2% de suero fetal bovino (p. e . , de Hyclone Labs.); lx de insulina-transferrina-selenio (ITS) ; lx de ácido linoléico-albúmina sérica de bovino (LA-BSA) ; dexametasona 10"9 (p. ej . , de Sigma); 2-fosfato del ácido ascórbico 10~4 M (Sigma) ; factor de crecimiento epidermal 10 ng mL (p. ej . , de R&D Systems); y factor de crecimiento obtenido de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL (p. ej . , de R&D Systems) .

En ciertas modalidades, las células madre placentarias expresan CD200 y ARTS1 (aminopeptidasa regulador del factor de necrosis tumoral tipo 1) ARTS-1 y LRAP (arginina aminopeptidasa obtenido de leucocitos); IL6 ( interleucina-ß) y TGFB2 (factor de crecimiento transformante, beta 2); IL6 y RT18 (queratina 18); IER3 (respuesta temprana inmediata 3), MEST (homólogo de transcripción especifico del mesodermo) y TGFB2; CD200 y IER3; CD200 e IL6; CD200 y KRT18; CD200 y LRAP; CD200 y MEST; CD200 y NFE2L3 (tipo factor nuclear (derivado eritroide 2) 3); o CD200 y TGFB2 a un nivel superior, p. ej . , a un nivel detectablemente mayor, que un número equivalente de células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea (las BM-MSC) , en donde las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea han sufrido un número de pases en cultivo, equivalente al número de pases que las células madre placentarias han sufrido. En otras modalidades, las células madre placentarias expresan ARTS-1, CD200, IL6 y LRAP; ARTS-1, IL6, TGFB2, IER3, KRT18 y MEST; CD200, IER3, IL6, RT18, LRAP, EST, NFE2L3, y TGFB2; ARTS-1, CD200, IER3, IL6, KRT18, LRAP, MEST, NFE2L3, y TGFB2; o IER3, MEST y TGFB2 a un nivel superior, p. ej . , un nivel detectablemente superior que un número equivalente de células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea (las BM-MSC), en donde las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea han sido sometidas a un número de pases en cultivo equivalente al número de pases que las células madre placentarias han sido sometidas.

En diversas modalidades, las células madre placentarias útiles para los métodos que se describen en la presente están contenidas dentro de una población de células, al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células de las cuales son las células madre placentarias. En algunas otras modalidades, las células madre placentarias de la población de células están considerablemente libres de células que tengan un genotipo materno; p. ej . , al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células madre placentarias de la población tienen un genotipo fetal, es decir, son de origen fetal. En algunas otras modalidades, la población de células que contienen células madre placentarias son prácticamente libres de células que tengan un genotipo materno; p. ej . , al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células de la población tienen un genotipo fetal, es decir, son de origen fetal. En algunas otras modalidades, la población de células que contienen células madre placentarias contiene células que tienen un genotipo materno; p. ej . , al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células de la población tiene un genotipo materno, es decir, son de origen materno.

En una modalidad de cualquiera de las modalidades de las células madre placentarias que se describen en la presente, las células madre placentarias facilitan la formación de uno o más cuerpos embrioide en una población de .células placentarias que contengan las células madre placentarias aisladas, cuando la población se cultiva en condiciones que permitan la formación de un cuerpo tipo embrioide, p. e . , el cultivo en condiciones de proliferación) .

En algunas modalidades de cualquiera de las células madre placentarias o las BM-MSC que se describen en la presente, las células son de mamífero, p. ej . , de humano.

En algunas modalidades, cualquiera de las células madre placentarias y/o las BM-MSC que se describen en la presente son autólogas para un recipiendario, p. ej . , un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , un individuo que tenga mieloma múltiple, o que tenga un síntoma de un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , un síntoma de mieloma múltiple. En algunas otras modalidades, las células madre placentarias y/o las BM-MSC son alógenas para un recipiendario, p. ej . , un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , un individuo que tenga mieloma múltiple, o que tenga un síntoma de un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , un síntoma de mieloma múltiple.

En ciertas modalidades de los métodos de tratamiento o los métodos para suprimir la proliferación de las células cancerosas relacionadas con hueso que se describen en la presente, las células madre placentarias y/o las BM-MSC son criopreservadas antes de la administración. En otra modalidad, las células madre placentarias se obtienen de un banco de células, p. ej . , un banco de células madre placentarias. En otra modalidad, las BM-MSC se obtienen de un banco de células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea.

En cualquiera de las modalidades de las células madre placentarias que se describen en la presente, las células madre placentarias generalmente no se diferencian del cultivo en medio de crecimiento, es decir, el medio formulado para favorecer la proliferación, p. ej . , durante la proliferación en el medio de crecimiento. En otra modalidad, las células madre placentarias no necesitan una capa alimentadora para proliferar, p. ej . , no necesitan una capa alimentadora para proliferar cuando se cultivan en el medio de crecimiento. En otra modalidad, las células madre placentarias no se diferencian en el cultivo solamente como resultado del cultivo en ausencia de una capa celular alimentadora.

En cualquiera de las modalidades de la BM-MSC aisladas descritas en la presente, las células por lo regular no se diferencian durante el cultivo en el medio de crecimiento, es decir, en el medio formulado para favorecer la proliferación, p. ej . , durante la proliferación en el medio de crecimiento. En otra modalidad, las BM-MSC aisladas no necesitan una capa alimentadora para proliferar, p. ej . , no necesitan de una capa alimentadora para proliferar cuando se cultivan en el medio de crecimiento. En otra modalidad, las BM-MSC aisladas no se diferencian en el cultivo solamente como resultado del cultivo en ausencia de una capa celular alimentadora .

En ciertas modalidades, las células madre placentarias se obtiene por perfusión de una placenta post parto que ha sido drenada de sangre y perfundida para remover la sangre residual; drenada de la sangre pero no perfundida para retirar la sangre residual; o ni drenada de sangre ni perfundida para eliminar la sangre residual. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias se obtiene por rompimiento físico y/o enzimático del tejido placentario. En otra modalidad específica, las células madre placentarias se obtienen cultivando una parte de una placenta y permitiendo que las células madre placentarias proliferen de la parte de una placenta.

La superficie celular, los marcadores moleculares y genéticos característicos de las células madre placentarias útiles en los métodos que se proporcionan en la presente están descritos con detalle en la Sección 5.2, más adelante.

En otra modalidad especifica del método, una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC es un número de células que permite la eliminación de, el mejoramiento detectable en, la disminución de la gravedad de, o la progresión lenta de uno o más síntomas de, un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple. En una modalidad específica, el síntoma de un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , el síntoma de mieloma múltiple, es una lesión ósea. En otra modalidad específica, la cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC aumenta, p. e . , aumenta de manera detectable, la densidad mineral ósea (BMD) en al menos un hueso de un individuo que reciba las células, p. ej . , tal y como se mide por densitometría, o el contenido mineral del hueso (BMC), p. ej . , tal y como se mide por densitometría. En otra modalidad específica, la cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC disminuye, p. ej . , disminuye de manera detectable, una lesión ósea, p. ej . , al menos una lesión ósea ocasionada por cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , tal y como se puede ver por rayos X, MRI ( Imagenología de resonancia magnética) o barrido CAT (por tomografía computarizada) o similares .

En otra modalidad especifica, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran a un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple, en o junto a una lesión ósea ocasionada por cáncer relacionado con el hueso, es decir, se administra dentro de la lesión. En otra modalidad especifica de los métodos que se describen en la presente, las células madre placentarias aisladas y/o las BM-MSC se administran por inyección en bolo. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran por infusión intravenosa. En una modalidad especifica, la infusión intravenosa es infusión intravenosa durante aproximadamente 1 a aproximadamente 8 horas. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran por vía intracraneal. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas se administran por vía intraperitoneal . En otra modalidad especifica, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran por vía intra-arterial . En otra modalidad especifica del método de tratamiento, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran por via intramuscular, intradérmica , subcutánea o infraocular.

En otra modalidad de los métodos descritos en lo anterior, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran implantando por métodos quirúrgicos en el individuo una composición de materia que contenga tales células, p. ej . , en o junto a la lesión ósea ocasionada por un cáncer relacionado con el hueso. En una modalidad especifica, la composición de materia es una matriz o andamio. En otra modalidad especifica, la matriz o el andamio es un hidrogel. En otra modalidad especifica, la matriz o el andamio es un tejido descelulari zado . En otra modalidad especifica, la matriz o el andamio es una composición sintética biodegradable . En otra modalidad específica, la matriz o andamio es una espuma. En otra modalidad específica, la matriz o el andamio es un material cerámico aceptado para el medio fisiológico, p. ej . , fosfato de mono-, di-, tri-, alfa-tri-, beta-tri- y tetra-calcio, hidroxiapatita, fluoroapatita, un sulfato de calcio, un fluoruro de calcio, un óxido de calcio, un carbonato de calcio, un fosfato de calcio y magnesio o un vidrio con actividad biológica (p. ej . , BIOGLASS®) , o una mezcla de cualquiera de estos. En otra modalidad específica, la matriz o el andamio es un material cerámico poroso, biocompatible (p. ej . , SURGIBONE®, ENDOBON®, CEROS® o similar) , o un producto de colágeno mineralizado para injertar hueso (p. e . , HEALOS™, VITOSS®, RHAKOSS™ y CORTOSS®, o similar) .

En otra modalidad especifica de los métodos que se describen en lo anterior, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran una vez al individuo. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran al individuo en dos o más administraciones diferentes. En otra modalidad especifica, tal administración consiste en administrar entre aproximadamente 1 x 104 y 1 x 105 células madre placentarias y/o BM-MSC, p. ej . , por kilogramo de peso del individuo. En otra modalidad especifica, la administración consiste en administrar entre aproximadamente 1 x 105 y 1 x 106 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo. En otra modalidad especifica, la administración consiste en administrar entre aproximadamente 1 x 106 y 1 x 107 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo. En otra modalidad especifica, la administración consiste en administrar entre aproximadamente 1 x 107 y 1 x 108 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo. En otra modalidad especifica, la administración consiste en administrar al individuo entre aproximadamente 1 x 106 y aproximadamente 2 x 106 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo; entre aproximadamente 2 x 106 y aproximadamente 3 x 106 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo; entre aproximadamente 3 x 106 y aproximadamente 4 x 10° células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo; entre aproximadamente 4 x 106 y aproximadamente 5 x 106 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo; entre aproximadamente 5 x 106 y aproximadamente 6 x 106 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo; entre aproximadamente 6 x 106 y aproximadamente 7 x 106 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo; entre aproximadamente 7 x 106 y aproximadamente 8 x 106 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo; entre aproximadamente 8 x 106 y aproximadamente 9 x 106 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo; o entre aproximadamente 9 x 106 y aproximadamente 1 x 107 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo. En otra modalidad especifica, la administración consiste en administrar al individuo entre aproximadamente 1 x 107 y aproximadamente 2 x 107 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo. En otra modalidad especifica, la administración consiste en administrar al individuo entre aproximadamente 1.3 x 107 y aproximadamente 1.5 x 107 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo. En otra modalidad especifica, la administración consiste en administrar al individuo hasta aproximadamente 3 x 107 células madre placentarias y/o las BM-MSC por kilogramo de peso del individuo. En una modalidad especifica, la administración consiste en administrar al individuo entre aproximadamente 5 x 106 y aproximadamente 2 x 107 células madre placentarias y/o las BM-MSC. En otra modalidad especifica, la administración consiste en administrar al individuo aproximadamente 150 x 106 células madre placentarias y/o las BM-MSC en aproximadamente 20 mililitros de solución.

En ciertas modalidades de los métodos que se describen en lo anterior, las BM-MSC se utilizan en una cantidad, por número de células, generalmente al menos 50% mayor que las células madre placentarias.

En una modalidad especifica, la administración consiste en administrar al individuo entre aproximadamente 5 x 106 y aproximadamente 2 x 107 células madre placentarias y/o las BM-MSC, en donde las células están contenidas en una solución que contiene 10% de dextrano, p. ej . , dextrano-40, 5% de albúmina sérica humana y, como una opción, un inmunosupresor .

En otra modalidad especifica, la administración consiste en administrar al individuo entre aproximadamente 5 x 107 y 3 x 109 células madre placentarias y/o las BM-MSC por vía -intravenosa. En las modalidades especificas, la administración consiste en administrar por vía intravenosa aproximadamente 9 x 108 células madre placentarias y/o las BM-MSC o aproximadamente 1.8 x 109 células madre placentarias y/o BM-MSC. En otra modalidad especifica, la administración consiste en administrar por vía intralesional entre aproximadamente 5 x 107 y 1 x 108 células madre placentarias y/o BM-MSC. En otra modalidad específica, la administración consiste en administrar aproximadamente 9 x 107 células madre placentarias y/o BM-MSC dentro de la lesión .

En otra modalidad especifica del método de tratamiento, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran al individuo en el lapso de 21-30, p. ej . , 21 días; en el transcurso de 7 días; en el transcurso de 48 horas; o en el transcurso de 24 horas a partir del diagnóstico de un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , mielorna múltiple, o la presencia de uno o más síntomas de un cáncer relacionado con el hueso.

Las células madre placentarias y/o las BM-MSC que se utilizan en los métodos que se proporcionan en la presente, en ciertas modalidades, pueden ser genéticamente manipuladas para producir una o más proteínas que supriman el crecimiento o la proliferación de las células de un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , células de mieloma múltiple. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la una o más proteínas puede consistir en osteoprotegerina, una o más proteínas morfogenéticas del hueso (las BMP); una o más conexinas, p. ej . , conexina 26 (Cx26) y/o conexina 43 (Cx43) ; osteocontina; o activina A. En otras modalidades, las células madre placentarias y/o las BM-MSC han sido manipuladas para expresar IFN-ß o IL-2 exógeno, p. ej . , en una cantidad que da como resultado supresión mayor, p. ej . , detectablemente mayor, de la proliferación de las células tumorales, cuando las células tumorales se ponen en contacto con las células madre placentarias y/o las BM-MSC en comparación con tales células cuando no expresan IFN-ß o IL-2 exógeno.

También se proporciona en la presente las composiciones farmacéuticas que contienen estas células madre placentarias y/o las BM-MSC genéticamente manipuladas para utilizarlas para suprimir el crecimiento o la proliferación de las células cancerosas relacionadas con el hueso, p. ej . , células de mieloma múltiple, o para tratar a un individuo que tenga células de cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , células de mieloma múltiple . 3.1 Definiciones Cuando se utiliza en la presente, el término "aproximado", cuando se refiere a un valor numérico establecido, indica un valor dentro de más o menos 10% del valor numérico establecido.

Cuando se utiliza en la presente, "lesión ósea, " en el contexto de un cáncer relacionado con el hueso, significa una anomalía en el crecimiento o la estructura de un hueso, la cual es causada por, o es un síntoma de, el cáncer relacionado con el hueso. En un ejemplo no limitativo, el mieloma múltiple por lo regular ocasiona lesiones óseas líticas, las cuales son áreas ahuecadas de un hueso causadas por la desmineralización del hueso. En otro ejemplo no limitativo, el condrosarcoma por lo regular causa lesiones caracterizadas por un crecimiento sobre uno o más huesos, normalmente comprende un crecimiento cartilaginoso que puede ser calcificado.

Cuando se utiliza en la presente, "células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea," a las que también se hace referencia como las BM-MSC, se refiere a las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea, o cultivadas a partir de células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea, p. ej . , las células que se describen en la Patente U.S. No. 5,486,359, la descripción de la cual se incorpora para referencia en la presente .

Cuando se utiliza en la presente, el término "cáncer relacionado con el hueso" se refiere a un cáncer que, en cualquier fase de la enfermedad, afecta o metastatiza a uno o más huesos en un individuo que tiene el cáncer. Por ejemplo, el mieloma múltiple es un cáncer relacionado con el hueso porque el cáncer afecta a los huesos; un aspecto del mieloma múltiple es la presencia de lesiones óseas debido al menos en parte a la regulación de avance de la actividad de los osteoclastos resultante de las citocinas secretadas por las células de mieloma múltiple.

Cuando se utiliza en la presente, "contacto" en el contexto de poner en contacto las células madre placentarias con las células de un cáncer relacionado con el hueso, comprende, más no necesita, la colocación de las células en tal proximidad para que estas realmente hagan contacto físico entre sí (p. ej . , en co-cultivo en una placa de múltiples pozos o similar) , y la colocación de las células en el mismo espacio, sin contacto físico real, pero en el mismo espacio, p. ej . , en un sistema de cultivo TRANSWELL® o la administración a un individuo, p. ej . , un humano. "Poner en contacto" cuando se utiliza en la presente comprende acercar las células madre placentarias y las células de cáncer relacionado con el hueso juntas in vitro, p. ej . , en un solo envase (p. ej . , una caja de cultivo, matraz, vial, etc.)- "Poner en contacto" también comprende reunir las células madre placentarias y las células tumorales juntas o in vivo, por ejemplo, en el mismo individuo (p. ej . , un mamífero, por ejemplo, un ratón, rata, perro, gato, oveja, cabra, caballo, humano, etc.) . Por ejemplo, las células madre placentarias pueden ponerse en contacto con células de cáncer relacionado con el hueso administrando las células madre placentarias por vía intravenosa a un individuo que tenga el cáncer relacionado con el hueso, o mediante la inyección directa en el sitio de un tumor, p. ej . , una lesión ósea ocasionada por un cáncer relacionado con el hueso, o similares. Las células madre placentarias pueden ponerse en contacto con las células de cáncer relacionadas con el hueso mediante la administración de las células madre placentarias y las células de cáncer relacionado con el hueso por vía intravenosa a, por ejemplo, un animal experimental.

Cuando se utiliza en la presente, el término "SH2" se refiere a un anticuerpo que se une a un epitope sobre el marcador celular CD105. Asi pues, las células a las que se hace referencia como SH2+ son CD105+.

Cuando se utiliza en la presente, los términos "SH3" y SH4" se refieren a los anticuerpos que se unen a los epitopes presente sobre el marcador celular CD73. Asi pues, las células a las que se hace referencia como SH3 y/o SH4 son CD73+.

Una placenta tiene el genotipo del feto en el que se desarrolla, pero también está en contacto físico cercano con el tejido materno durante la gestación. Como tal, cuando se utiliza en la presente, el término "genotipo fetal" significa el genotipo del feto, p. ej . , el genotipo del feto asociado con la placenta de ala cual se obtienen las células madre placentarias aisladas, específicas, como se describe en la presente, contrario al genotipo de la madre que llevó el feto. Cuando se utiliza en la presente, el término "genotipo materno" significa el genotipo de la madre que llevó el feto, p. ej . , el feto asociado con la placenta de la cual se obtienen las células madre placentarias aisladas, particulares, como se describe en la presente.

Cuando se utiliza en la presente, células madre, p. ej . , células madre placentarias, son "asiladas" si al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o al menos 99% de las demás células con las cuales las células madre están naturalmente asociadas se separan de las células madre, p. ej . , durante la recolección y/o el cultivo de las células madre.

Cuando se utiliza en la presente, "multipotente" , cuando se hace referencia a una célula, significa que las células tienen la capacidad para diferenciarse en algunos, más no necesariamente a todos, los tipos de células del cuerpo, o en células que tengan las características de algunos, más no todos, los tipos de células del cuerpo, o en células de uno o más de las tres capas germinales. En ciertas modalidades, por ejemplo, las células madre placentarias aisladas (PDAC), como se describe en la Sección 5.2, más adelante, que tienen la capacidad para diferenciarse en células que tengan las características de las células neurogénicas, condrogénicas y/o osteogénicas son células multipotentes.

Cuando se utiliza en la presente, el término "población de células aisladas" significa una población de células que se separan considerablemente de otras células del tejido, p. ej . , la placenta, del cual se obtienen o aisla la población of células. En ciertas modalidades, la población de células se separa de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de otras células de tejido, p. ej . , la placenta, del cual se obtiene o aisla la población de células .

Cuando se utiliza en la presente, el término "célula madre placentaria" se refiere a una célula madre, o célula progenitora que se obtiene de una placenta de mamífero, p. e . , como se describe más adelante, como un aislado primario o una célula cultivada independientemente de si la célula es una célula primaria, parte de un cultivo celular primario o ha sido pasada después de un cultivo primario. Una célula p. ej . , una "célula madre placentaria, " se considera una "célula madre" si la célula presenta uno, dos o tres de los siguientes aspectos: un perfil de expresión del marcador o gen asociado con uno o más tipos de células madre; la capacidad para replicarse al menos 10-40 veces en cultivo; y la capacidad para diferenciarse en células que presenten las características de las células diferenciadas de una o más de las tres capas germinales. A menos que se indique de otro modo en la presente, el término "placentaria" incluye el cordón umbilical. Las células placentarias aisladas, p. ej . , las células madre placentarias que se describen en la presente, en ciertas modalidades, se diferencian in vitro en condiciones de diferenciación), se diferencian in vivo, o ambos.

Cuando se utiliza en la presente, una célula o población de células es "positiva" para un marcador específico cuando el marcador puede ser detectado por encima del fondo, a través, por ejemplo, de detección en la que intervienen anticuerpos o en la que interviene ácido nucleico. La detección de un marcador específico puede ser, por ejemplo, logrado mediante el uso de anticuerpos, o por sondas de oligonucleotidos o cebadores basados en la secuencia del gen o el mRNA que codifica el marcador. Por ejemplo, una célula madre placentaria es positiva para, p. e . , CD73, porque CD73 puede ser detectado en las células madre placentarias en una cantidad mayor, p. ej . , detectablemente mayor que el fondo (en comparación con, p. ej . , un testigo isotipo de anticuerpo) . Una célula también es positiva para un marcador cuando este marcador puede ser utilizado para distinguir las células de al menos otro tipo de célula, o puede utilizarse para seleccionar o aislar las células cuando está presente o es expresado por la célula. En el contexto de, p. ej . , la detección en la que interviene el anticuerpo, "positivo" cuando está presente una indicación de un marcador de superficie celular particular, significa que el marcador puede ser detectado utilizando un anticuerpo, p. ej . , un anticuerpo marcado con fluorescencia, especifico para ese marcador; "positivo" también se refiere a una célula que presenta el marcador en una cantidad que produzca una señal, p. ej . , en un citómetro, que esté por encima, p. ej . , detectablemente por encima del fondo. Por ejemplo, una célula es "CD200+" donde la célula está marcada, p. ej . , detectablemente marcada con un anticuerpo especifico para CD200, y la señal del anticuerpo es mayor, p. ej . , detectablemente mayor que la de un testigo (p. ej . , el fondo o un testigo isotipo) . Por ejemplo, es posible determinar que una célula o población de células es OCT-4+ si la cantidad del RNA de OCT-4 detectada en el RNA de la célula o la población de células es detectablemente mayor que el fondo tal y como se determina, p. ej . , mediante un método para detectar RNA, como puede ser RT-PCR, técnicas de slot blot, etc. En ciertas modalidades, se determina que OCT-4 está presente, y una célula es "0CT-4+" si es posible detectar OCT-4 utilizando RT-PCR. A menos que se indique de otro modo en la presente, los marcadores del clúster o agregado de diferenciación ("CD") se detectan utilizando anticuerpos. Con respecto a HLA-G, una población de células madre placentarias es, en ciertas modalidades, positiva para HLA-G si más del 5% de las células de la población son positivas para HLA-G, p. ej . , mediante la tinción detectable con un anticuerpo contra HLA-G.

Cuando se utiliza en la presente para todos los marcadores, con excepción de HLA-G, una célula madre placentaria es "negativa" para un marcador celular particular si el marcador celular no es detectable, p. ej . , utilizando un anticuerpo especifico para ese marcador, en comparación con un testigo (p. e . , el fondo o un testigo isotipo) , o no es detectable utilizando un método de detección basado en ácido nucleico, p. ej . , RT-PCR. Por ejemplo, una célula es "CD34~" cuando la célula no se marca de manera reproducible o detectable con un anticuerpo especifico para CD34 en una magnitud mayor que un testigo (p. ej . , el fondo o un testigo isotipo) . Los marcadores, p. ej . , los marcadores no detectados, o que no pueden ser detectados, utilizando anticuerpos, pueden determinarse como positivos o negativos en una forma semejante utilizando un testigo apropiado, utilizando, por ejemplo, otros métodos de detección en las que intervengan ácidos nucleicos. A menos que se indique de otro modo en la presente, los marcadores del clúster o agregado de diferenciación ("CD") se detectan utilizando anticuerpos. Con respecto a HLA-G, una población de células madre placentarias es, en ciertas modalidades, negativa para HLA-G si 5% o menos de las células de la población son positivas para HLA-G, p. ej . , por la tinción detectable con un anticuerpo contra HLA-G.

Cuando se utiliza en la presente, la denominación "bajo" o "dim", cuando se refiere a la expresión de un marcador que puede ser detectado en citometria de flujo, significa que el marcador se expresa por menos del 10% de las células probadas, o que la fluorescencia que puede ser atribuida al marcador en, p. ej . , citometria de flujo, es menor que 1 log por encima del fondo.

Cuando se utiliza en la presente, "tratar" comprende la cura, remediación o mejoría de, disminución de la gravedad de o disminución del transcurso temporal de, una enfermedad, trastorno o estado, o cualquier parámetro o síntoma de éste. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIG. 1: Las células madre placentarias mejoran la reparación de los defectos óseos en ratas experimentales. Eje Y: grado de cierre del defecto óseo del cráneo, tal y como se evaluó por el área. Eje X - condiciones: material HEALOS® solo; HEALOS® en combinación con la proteína morfogenética de hueso 2 (BMP-2); HEALOS® y células madre placentarias; HEALOS® y células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea (BM-MSC) ; o sin reparación (vacío) . El asterisco indica mejoramiento significativo (p<0.05) en la reparación del defecto en HEALOS® en combinación con la proteína morfogenética de hueso-2 (BMP-2); HEALOS® en combinación con células madre placentarias; y HEALOS® en combinación con BM-MSC, contra los testigos.

FIG. 2: Las células madre placentarias suprimen la diferenciación de los precursores de los osteoclastos . Eje X: osteoclastos (OC) ; precursores de los osteoclastos no co-cultivados con células madre placentarias , o con células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea (BM-MSC) . Eje Y: número de osteoclastos maduros formados.

FIG. 3: Las células madre placentarias disminuyen el crecimiento de las células tumorales de diferentes individuos. Las células de mieloma múltiple (las lineas de células BN, JB, ARP1, U266, Dn y Hale) fueron transfectadas con un gen que codifica para luciferasa y fueron co-cultivadas con (de izquierda a derecha en cada estado) célula madre mesenquimales fetales (FB-MSC) , células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea del paciente (Pt-MSC) , o células madre placentarias. La disminución del crecimiento de las células de mieloma múltiple después de varias semanas fue expresada como valor múltiple de la expresión de luciferasa en las células de mieloma múltiple co-cultivadas con células madre placentarias o Pt-MSC, en comparación con la expresión de luciferasa por las células de mieloma múltiple co-cultivadas con FB-MSC.

FIG. 4: Diagrama de un experimento con TRANSWELL®, en el cual las células madre placentarias o las células madre mesenquimales se cultivan en el lado inferior de una membrana y las células de mieloma múltiple se cultivan en el lado superior de la membrana.

FIG. 5: Supresión de las células de mieloma múltiple de cada uno de seis pacientes (eje X) mediante las células madre placentarias (PDAC) y células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea fetal (MSC fetal) . Eje Y: porcentaje de viabilidad en comparación con las células de mieloma cultivadas en ausencia de las células madre placentarias.

FIG. 6: Las células madre placentarias disminuyen el crecimiento de las células de mieloma múltiple en ratones SCID-rab/SCID-hu. El número de células de mieloma múltiple fue valorado por el titulo de los anticuerpos humanos presentes en los sueros de los ratones, tal y como se evaluó por el ensayo ELISA. Pre-Rx: titulo de los anticuerpos humanos antes de la administración de las células de mieloma. 2 semanas, 4 semanas: titulo del anticuerpo humano dos semanas y cuatro semanas después de la administración de las células de mieloma múltiple, solas (testigo) o con células madre placentarias.

FIG. 7: Cambio en la densidad de la masa ósea, tal y como se evaluó por rayos X, de los implantes óseos en ratones SCID-rab/SCID-hu. B D: Densidad mineral ósea.

FIGS. 8-9: Los efectos de las células madre placentarias sobre la enfermedad ósea mieloma y el crecimiento del tumor son dependientes de la dosis y pueden compararse con las MSC fetales. Ratones SCID-rab injertados con 2 células de mieloma del paciente. (A-C) Luego del establecimiento de la elevada carga tumoral, los hospederos fueron inyectados por vía intralesional con vehículo, con 0.1, 0.5 y 1 x 106 células madre placentarias, o fueron injertados por vía subcutánea con 5 x 106 células madre placentarias empleando el portador hidrogel HyStem-C (para ver los detalles consulte los Métodos) (6-7 ratones/grupo) .

FIG. 8: Cambios en la inmunoglobulina (Ig) humana antes del tratamiento (Pre-Rx), 2 y 4 semanas después del tratamiento con células madre placentarias. IL = administración intralesional de 0.1, 0.5 o 1 x 106 células. SC = administración subcutánea de células. TEST = testigo (sin células) .

FIG. 9: Cambios en la densidad mineral ósea a partir de los niveles previos al tratamiento del hueso mielomatoso implantado. IL = administración intralesional de 0.1, 0.5 o 1 x 106 células. SC = administración subcutánea de las células. TEST = testigo (sin células) .

FIG. 10: Los hospederos fueron inyectados por via intralesional con vehículo, o con 1 x 106 células madre placentarias o MSC. La Figura 10 representa los cambios en la densidad mineral ósea respecto a los niveles previos al tratamiento del hueso mielomatoso implantado. Estado a la izquierda: testigo (sin células); estado intermedio: células madre placentarias; estado a la derecha: células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea.

FIG. 11: Se inyectó a los hospederos por vía intralesional con vehículo o con 1 x 106 células madre placentarias o MSC. La Figura 11 representa los cambios en la Ig humana antes del tratamiento (Pre-Rx) y al final del experimento. Estado a la izquierda: testigo (sin células); estado intermedio: células madre placentarias; estado a la derecha: células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea.

FIG. 12: Comparación del número promedio (n=3) de células de la línea celular de mieloma múltiple (U-266, PMI-8226, L363 y OMP-2) por pozo en presencia o ausencia de células madre placentarias en el día 5 del cultivo o co-cultivo. Los valores P se proporcionan para el testigo y los estados experimentales por cada una de la línea de células de mieloma múltiple.

FIGS. 13A-13C: Disminución en la fosforilación · de la proteina retinoblastoma (Rb) en Serine 78 0 ( S 7 80 ) , o en serines 8 07 y 811 ( S 8 07/S811) para las lineas de células de mieloma múltiple H929 (FIG. 13A) , OPM-2 (FIG. 13B) y LP1 (FIG. 13C) . D2: Día 2 del co-cultivo. D4 : Día 4 del co-cultivo. GM: Media geométrica del aumento/disminución de la fosforilación de Rb. ?: Cambio en la media geométrica .

FIG. 14: Número de osteoclastos formados cuando se cultivaron en presencia de lenalidomida 1 µ?. La linea horizontal gruesa representa el número de osteoclastos que se formaron en los pozos testigo.

FIG. 15: Número de osteoclastos formados cuando se co-cult ivaron con células madre placentarias (PDAC) solas, células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea (BM-MCS) , o la combinación de PDAC y lenalidomida. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA 5.1 TRATAMIENTO DE CÁNCERES RELACIONADOS CON EL HUESO UTILIZANDO LAS CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS Y/O CÉLULA MADRES MESENQUIMALES AISLADAS En la presente se proporcionan los métodos de tratamiento a un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, que consiste en administrar al individuo células madre placentarias aisladas, en particular, las células madre placentarias descritas con detalle en la Sección 5.2, más adelante, a las que se hace también referencia en la presente como las PDAC (Células adherentes obtenidas de placenta), y/o células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea (BM-MSC) , p. ej . , una cantidad terapéutica eficaz de cualquiera o ambas células. Los cánceres relacionados con el hueso pueden ser, sin limitación, mieloma múltiple, cáncer óseo, neuroblastoma, osteosarcoma , sarcoma de Ewing, condrosarcoma, cordoma, histiocitoma fibroso maligno de hueso, fibrosarcoma de hueso, cáncer prostético y cualquier forma de cáncer metastásico caracterizado por metástasis ósea. En ciertas modalidades, el cáncer relacionado con el hueso no incluye cáncer prostético. En ciertas modalidades, la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas es terapéuticamente eficaz para disminuir, mejorar o invertir uno o más de los síntomas asociados con el cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , un síntoma ocasionado por, asociado con o relacionado con un efecto del cáncer en uno o más huesos de un individuo, p. ej . , un defecto óseo que puede ser atribuido al cáncer relacionado con el hueso. El tratamiento de los cánceres relacionados con el hueso con las células madre placentarias y/o las BM-MSC, como se indica en la presente, puede suceder, antes, después o al mismo tiempo con un tratamiento contra cáncer secundario, como se describe más adelante. Por consiguiente, en una modalidad, los defectos óseos que son un síntoma de un cáncer relacionado con el hueso son tratados antes de que el cáncer sea tratado con un segundo tratamiento contra cáncer. En otra modalidad, los defectos óseos que son un síntoma de un cáncer relacionado con el hueso son tratados al mismo tiempo o casi al mismo tiempo que el cáncer sea tratado con un segundo tratamiento contra cáncer. En otra modalidad, los defectos óseos que son un síntoma de un cáncer relacionado con el hueso son tratados después de que el cáncer es tratado con un segundo tratamiento contra cáncer.

En un aspecto, en la presente se proporcionan los métodos de tratamiento a un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, que consisten en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de células madre placentarias y/o las BM-MSC. En una modalidad, en la presente se proporciona un método para tratar a un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de células madre placentarias y/o las BM-MSC durante un tiempo suficiente para que las células madre placentarias y/o las BM-MSC mejoren, p. ej . , mejoren de manera detectable, uno o más síntomas de, o disminuyan, p. ej . , que disminuyan de manera detectable, la progresión del cáncer relacionado con el hueso. En una modalidad específica, el cáncer relacionado con el hueso es mieloma múltiple. En otra modalidad específica, el cáncer relacionado con el hueso es sarcoma. En otras modalidades específicas, el cáncer relacionado con el hueso es cáncer de hueso, neuroblastoma, osteosarcoma, sarcoma de Ewing, cordoma, histiocitoma fibroso maligno de hueso o fibrosarcoma de hueso. En otra modalidad específica, el cáncer relacionado con el hueso consiste en un tumor sólido. En otra modalidad específica, el cáncer relacionado con el hueso no es cáncer prostático.

Cuando se utiliza en la presente, "administrar durante un tiempo suficiente", y similares, comprende, por ejemplo, la administración de las células, p. ej . , una unidad de células, seguida por la evaluación de uno o más síntomas del cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple, durante un tiempo suficiente para determinar cualquier cambio en el uno o más síntomas, p. ej . , durante el transcurso de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 horas, o 1, 2, 3, 4, 5 o 6 días, o durante 1, 2, 3 o 4 semanas, o similares. Si no se detecta cambio, pueden llevarse a cabo una o más administraciones subsiguientes de las células.

En ciertas modalidades, el tratamiento de los cánceres relacionados con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple, consiste en administrar una cantidad, p. ej . , una cantidad terapéutica eficaz, de las células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas, a un individuo que tenga células de cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , células de mieloma múltiple, en donde al menos alguna de las células madre placentarias y/o las BM-MSC hacen contacto directo con al menos algunas de las células de cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , existe un contacto directo célula-célula entre al menos algunas de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, y al menos algunas de las células de cáncer relacionado con el hueso. En algunas otras modalidades, el tratamiento de los cánceres relacionados con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple, consiste en administrar una cantidad, p. ej . , una cantidad terapéutica eficaz, de células madre placentarias y/o las BM-MSC a un individuo que tenga células de cáncer relacionadas con el hueso, p. ej . , células de mieloma múltiple, en donde ninguna, o prácticamente ninguna de las células madre placentarias y/o las BM-MSC hace contacto directo con las células de cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , no existe, o prácticamente no existe contacto directo célula-célula entre la mayoría o cualquiera de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, y las células de cáncer relacionado con el hueso.

En algunas modalidades, las células madre placentarias y/o las BM-MSC, se administran por vía intralesional , p. ej . , directamente en o junto a (p. ej . , alrededor de 1-5 cm de) una o más lesiones óseas ocasionadas por el cáncer relacionado con el hueso. En ciertas modalidades, las células madre placentarias y/o las BM-MSC, se administran en combinación con una matriz, p. ej . , una matriz que pueda ser inyectada. En algunas otras modalidades, las células madre placentarias y/o las BM-MSC, se administran a un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso en combinación con alginato, o con plasma rico en plaquetas. En algunas otras modalidades, las células madre placentarias y/o BM-MSC se administran a un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso en combinación con una matriz sólida, p. ej . , un sustituto de hueso o un sustituto de matriz o hueso como se describe en la Sección 5.7.4, más adelante .

En algunas otras modalidades, las células madre placentarias y/o las B -MSC se administran por via intravenosa al individuo. Las células madre placentarias y/o las BM-MSC pueden ser administradas desde cualquier envase, o por cualquier sistema de entrega, médicamente apropiado para la entrega de líquidos, p. ej . , líquidos que contengan células, a un individuo. Tales envases pueden ser, por ejemplo, una bolsa de plástico estéril, matraz, frasco u otro envase del cual puedan dosificarse fácilmente las células madre placentarias o las BM-MSC. Por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de sangre u otro plástico, una bolsa aceptada para uso médico apropiada para la administración intravenosa de un líquido a un recipiendario.

La administración intralesional o intravenosa puede contener, p. ej . , alrededor, al menos o no más de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 10s, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o más células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas en una sola dosis. En ciertas modalidades, una dosis de BM-MSC contiene aproximadamente 50% más células que una dosis de células madre placentarias , p. ej . , las PDAC.

En una modalidad, la administración intralesional o intravenosa puede contener alrededor de 2 x 108 células madre placentarias en una sola dosis. En otra modalidad, la administración intralesional o intravenosa puede contener alrededor de 8 x 108 células madre placentarias en una sola dosis. Las células madre placentarias aisladas pueden ser administradas una vez, o más de una vez, durante el transcurso de una terapia. Preferentemente, las células madre placentarias administradas contienen al menos 50% de células viables o más (es decir, al menos alrededor de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de células madre placentarias en una población de células madre placentarias son funcionales o están vivas) . Preferentemente, al menos alrededor de 60% de las células de la población son viables. Más preferentemente, al menos alrededor de 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las células de la población en la composición farmacéutica son viables.

La administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas, además del tratamiento de los síntomas de los cánceres relacionados con el hueso, p. ej . , los síntomas de mieloma múltiple, como pueden ser las lesiones óseas, puede suprimir la proliferación o el crecimiento de las células del cáncer relacionado con el hueso, p. e . , las células de mieloma múltiple. La supresión de la proliferación puede consistir en, p. e . , la disminución de la velocidad de crecimiento o proliferación de las células tumorales, o la muerte de algunas o todas las células tumorales. Así pues, en otro aspecto, en la presente se proporciona un método para suprimir la proliferación de las células de un cáncer relacionado con el hueso, que consiste en poner en contacto la pluralidad de las células tumorales con una pluralidad de células madre placentarias y/o las BM-MSC durante un tiempo suficiente para que las células madre placentarias y/o 3M-MSC supriman, p. ej . , supriman de manera detectable, la proliferación de las células de un cáncer relacionado con el hueso, en comparación con una pluralidad de las células de un cáncer relacionado con el hueso que no esté en contacto con las células madre placentarias y/o las BM-MSC, p. ej . , tal y como se determina por una disminución detectable en el número de tales células después del tratamiento, una disminución detectable en el incremento en el número de tales células después del tratamiento, o similares. En modalidades específicas, las células de un cáncer relacionado con el hueso son células de mieloma múltiple, células de cáncer óseo, células de neuroblastoma , células de osteosarcoma, células de sarcoma de Ewing, células de condrosarcoma, células de cordoma, células de un histiocitoma fibroso maligno de hueso, células de un cáncer que metastatiza al hueso, células de cáncer prostético o células de un fibrosarcoma de hueso. En otra modalidad especifica, las células de un cáncer relacionado con el hueso son células de o dentro de un tumor sólido. En otra modalidad especifica, las células de un cáncer relacionado con el hueso no son células de cáncer prostático.

En otra modalidad especifica, el contacto se hace ín vitro. En otra modalidad especifica, el contacto se hace in vivo, p. ej . , mediante la administración de las células a un individuo que tenga células de un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple o un condrosarcoma. En otra modalidad especifica, el individuo es un mamífero. En otra modalidad específica, el mamífero es un humano. En otra modalidad específica, el contacto consiste en administrar las células madre placentarias y/o las BM-MSC al individuo por vía intravenosa. En otra modalidad específica, el contacto consiste en administrar las células madre placentarias y/o las BM-MSC al individuo en o junto a una lesión ósea ocasionada por el cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , por vía intralesional o intraósea.

En otra modalidad, el método de suprimir la proliferación de células de un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , las células de mieloma múltiple, mediante el contacto de las células de un cáncer relacionado con el hueso con las células madre placentarias y/o las BM-MSC además consiste en el contacto de las células de un cáncer relacionado con el hueso con uno o más compuestos contra cáncer, p. ej . , uno o más de los compuestos contra cáncer de la Sección 5.1.3, p. ej . , la administración de uno o más de los compuestos contra cáncer al individuo.

En otra modalidad, el método consiste en administrar al menos 1 x 107 células madre placentarias y/o las BM-MSC al individuo, por números totales de células. En otra modalidad especifica, el método consiste en administrar al menos 1 x 108 células madre placentarias y/o las BM-MSC al individuo, por número total de células. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias y/o las BM-MSC han sido proliferadas in vitro antes de la administración para no más de 30 duplicaciones de la población. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias y/o las BM-MSC han sido proliferadas in vitro antes de la administración para no más de 10 duplicaciones de la población. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias y/o las BM-MSC han sido criopreservadas y descongeladas antes de ponerlas en contacto.

En otra modalidad especifica del método, las células madre placentarias y/o BM-MSC suprimen la proliferación de las células de un cáncer relacionado con el hueso, p. ej., en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, p. ej . , en comparación con la proliferación de un número equivalente de células de un cáncer relacionado con el hueso en ausencia de las células madre placentarias y/o las BM-MSC. En ciertas modalidades, el porcentaje de disminución de la proliferación se puede valorar, por ejemplo, comparando un número de células de cáncer relacionado con el hueso en una muestra de tejido (p. ej . , la sangre) de un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso antes y después de la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC. En otra modalidad especifica, el método consiste en determinar, antes de ponerlas en contacto, que las células madre placentarias y/o BM-MSC suprimen, p. ej . , suprimen de manera que se puede detectar, la proliferación de una muestra de las células de un cáncer relacionado con el hueso. En tal modalidad, por ejemplo, se podría determinar que las células madre placenterías y/o BM-MSC suprimen la proliferación de una muestra de las células de un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , tomando una muestra de una población de las células madre placentarias y/o BM-MSC (por ejemplo, una muestra de una unidad o lote de un banco de células madre, o similares ) .

En cualquiera de los métodos que se describen en la presente, p. ej . , los métodos de tratamiento, los métodos para suprimir el crecimiento de tumor o los métodos para suprimir la maduración de los osteoclastos , descritos en la presente, las células madre placentarias, p. ej . , las PDAC o las BM-MSC pueden utilizarse solas, o las células madre placentarias y las BM-MSC pueden utilizarse combinadas. Cuando se utilizan en combinación, las células pueden ser combinadas para que puedan ser administradas al mismo tiempo, p. ej . , en la misma unidad de células; o puedan ser administradas separadas, p. ej . , mantenidas en unidades de células diferentes, por ejemplo, en bolsas tipo sangre separadas. Cuando se utilizan combinadas, la administración de las células madre placentarias y BM-MSC puede tomar lugar al mismo tiempo, o puede llevarse a cabo en momentos diferentes.

Además, en la presente se proporciona un método para disminuir la maduración de los precursores de los osteoclastos en osteoclastos, que consiste en poner en contacto los precursores de los osteoclastos con una pluralidad de células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas (p. ej . , las BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) , en donde la pluralidad de las células madre placentarias y/o las BM-MSC es un número de células madre placentarias y/o las BM-MSC suficiente para disminuir, p. e . , disminuir de manera detectable, la maduración de los osteoclastos a partir de los precursores de los osteoclastos. En una modalidad especifica, el contacto se lleva a cabo in vitro. En otra modalidad específica, el contacto se lleva a cabo in vivo. En otra modalidad específica, el contacto se lleva a cabo en un mamífero, p. ej . , en un humano. En otra modalidad específica, el contacto se lleva a cabo en un individuo que tenga mieloma múltiple o que tenga células de mieloma múltiple, o que tenga uno o más síntomas de mieloma múltiple. En otra modalidad específica, el uno o más síntomas de mieloma múltiple consisten en una o más lesiones óseas, o dolor de huesos resultante de la actividad de los osteoclastos.

En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para aumentar la apoptosis de los precursores de los osteoclastos , que consiste en poner en contacto los precursores de los osteoclastos con una pluralidad de células madre placentarias y/o las BM-MSC (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en la médula ósea) , en donde la pluralidad de células madre placentarias y/o las BM-MSC, es un número de células madre placentarias y/o las BM-MSC, suficiente para aumentar, p. ej . , aumentar de manera que pueda detectarse, la apoptosis de los precursores de los osteoclastos. En una modalidad especifica, el contacto se lleva a cabo in vitro. En otra modalidad especifica, el contacto se lleva a cabo in vivo. En otra modalidad especifica, el contacto se lleva a cabo en un humano. En otra modalidad específica, el contacto se lleva a cabo en un individuo que tenga mieloma múltiple, o que tenga células de mieloma múltiple o que tenga uno o más síntomas de mieloma múltiple. En otra modalidad específica, uno o más síntomas de mieloma múltiple consisten en una o más lesiones óseas, o dolor de huesos resultante de la actividad de los osteoclastos. En otra modalidad específica, el aumento de la apoptosis de los precursores de los osteoclastos se detecta por un aumento detectable en la tinción con anexina V y yoduro de propidio de los precursores de los osteoclastos del individuo .

En cualquiera de las modalidades antes mencionadas, las células madre placentarias y/o las BM-MSC pueden ser células madre placentarias genéticamente modificadas, p. e . , las células genéticamente modificadas descritas en la Sección 5.7.2, más adelante .

En cualquiera de los métodos que se describen en la presente, el individuo es un mamífero. En una modalidad específica, el individuo es un humano.

En cualquiera de los métodos que se describen en la presente, las BM-MSC pueden ser médula células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea, aisladas, p. e j . , BM-MSC que hayan sido cultivadas o adquiridas de una fuente comercial, o pueden ser BM-MSC contenidas dentro de la médula ósea, p. ej . , un aspirado de médula ósea, médula ósea cruda o similares. 5.1.1 Tratamiento de Mieloma múltiple En la presente se proporcionan los métodos de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple, los métodos consisten en administrar al individuo las células madre placentarias y/o las BM-MSC, en donde las células madre placentarias aisladas tienen cualquier combinación de, o todas, las características que se describen en la Sección 5.2, más adelante.

El mieloma múltiple es un cáncer de células plasmáticas, las cuales son células productoras de anticuerpos del sistema inmunitario. La enfermedad por lo regular presenta tres características principales: lesiones óseas, el desarrollo de las cuales puede dar como resultado dolor de huesos y calcio elevado en sangre: anemia; e insuficiencia renal.

En ciertas modalidades, en la presente se proporcionan los métodos de tratamiento a individuos que tengan una o más enfermedades o estados relacionados con mieloma múltiple, o síntomas de éste. En las modalidades específicas, las enfermedades o estados relacionados con mieloma múltiple son gamopatía monoclonal de significación desconocida (MGUS) , mieloma quiescente (p. ej . , mieloma múltiple quiescente), plasmacitoma solitario, gamopatía monoclonal benigna, gamopatía monoclonal asintomática, gamopatía monoclonal no mielomatosa, gamopatía monoclonal discreta, gamopatía monoclonal criptogénica, gamopatía monoclonal lantánica, gamopatía monoclonal rudimentaria, disinmunoglobuline ia, parainmunoglobulinemia asintomática o paraproteinemia idiopática. En algunas modalidades, una persona que tenga mieloma quiescente presenta paraproteina en sangre, pero ningún otro síntoma de mieloma múltiple.

En ciertas modalidades, los síntomas son los siguientes : Lesiones óseas y Dolor de huesos - Las células de mieloma secretan el factor activador de los osteoclastos , el cual es una citocina que activa los osteoclastos para que rompan el hueso, creando lesiones óseas dolorosas. Estas lesiones óseas, visibles, p. ej . , por radiografías de rayos X, son de naturaleza lítica y por lo regular se observan como una o más regiones en las cuales el hueso parece ausente o "perforado" . El dolor óseo por mieloma por lo regular implica la columna vertebral y las costillas, y empeora con la actividad. Puede estar presente dolor persistente y localizado y puede indicar una fractura ósea patológica. La participación de las vértebras puede conducir a la compresión de la columna vertebral. El rompimiento del hueso también da origen a la liberación de calcio hacia la sangre, ocasionando hipercalcemia y sus síntomas asociados.

Anemia - La anemia ocasionada por mieloma por lo regular es normocítica y normocrómica, y resulta de la sustitución de la médula ósea normal por infiltración de las células tumorales y la inhibición de la producción de los eritrocitos normales (hematopoyesis) por parte de las citocinas .

Insuficiencia renal - El mieloma múltiple también tiende a provocar insuficiencia renal, lo cual puede desarrollarse en forma aguda y crónica. La insuficiencia renal en mieloma múltiple puede en gran medida a la hipercalcemia, la cual se desarrolla cuando los osteoclastos desmantelan el hueso existente. La insuficiencia renal también es ocasionada por el daño tubular causado por la excreción de cadenas ligeras, también denominadas proteínas de Bence Jones, el cual puede manifestarse como el síndrome de Fanconi (acidosis tubular renal tipo II) . Otras causas pueden ser la depositación glomerular de amiloide, hiperuricemia, infecciones recurrentes (p. ej . , pielonefritis ) , e infiltración local de células tumorales. La insuficiencia renal puede estar asociada con concentraciones elevadas de creatinina en suero.

El mieloma múltiple puede estar presente con otros síntomas también, como los siguientes: Infección - Otro síntoma común de mieloma múltiple es la infección, en vista de que se rompe el sistema inmunitario. El riesgo aumentado de infecciones se debe a la deficiencia inmunitaria que resulta de hipogamaglobulinemia difusa, lo cual se debe a la producción disminuida y destrucción aumentada de los anticuerpos normales. Las infecciones más comunes son neumonías y pielonefritis . Los patógenos de neumonía comunes que ocasionan la enfermedad en pacientes de mieloma múltiple pueden ser Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae, mientras que los patógenos comunes que causan pielonefritis pueden ser Escherichia coli. Por lo regular la infección se observa en los primeros meses después de comenzar la quimioterapia.

Síntomas neurológicos - Los síntomas de mieloma múltiple pueden ser un espectro de estados neurológicos como debilidad, confusión y fatiga debido a cefalea causada por hipercalcemia, cambios visuales y retinopatía, los cuales pueden ser el resultado de la hiperviscosidad de la sangre, dependiendo de las propiedades de la paraproteína (véase más adelante) . Otros síntomas neurológicos pueden ser dolor radicular, pérdida de control de los intestinos o la vejiga (por ejemplo, debido a la participación de la columna vertebral que da origen a la compresión de la columna) , y síndrome de túnel carpiano y otras neuropatías (por ejemplo, debido a la infiltración de los nervios periféricos por el material amiloide) . El mieloma múltiple puede dar origen a paraplejia en los casos de presentación tardía.

Presencia de paraproteína - Un síntoma diagnóstico de mieloma múltiple es la presencia en la sangre y/u orina de paraproteína, la cual es una proteína monoclonal (la proteína M) , p. ej . , una cadena ligera de inmunoglobulina que se produce por la proliferación clonal de las células plasmáticas, o fragmentos de inmunoglobulina. La presencia de paraproteína se puede determinar analizando la proteína de orina y/o suero de un individuo por electroforesis en gel de agarosa o por inmunofij ación utilizando uno o más anticuerpos para la cadena ligera o pesada de la inmunoglobulina.

En ciertas modalidades, se diagnostica mieloma múltiple sintomático cuando están presentes los siguientes síntomas o signos: células plasmáticas clónales que constituyan más del 10% de las células en biopsia de médula ósea o, en cualquier cantidad en una biopsia de otros tejidos (p. ej . , plasmacitoma) ; paraproteina en suero u orina; evidencia de daño de órgano específico o blanco (relacionado con deterioro del órgano o tejido), por ejemplo, hipercalcemia (p. ej . , calcio corregido mayor de aproximadamente 12 mg por decilitro de sangre o mayor de aproximadamente 2.75 mmol en la sangre) , insuficiencia renal atribuible a mieloma, anemia definida como hemoglobina <10 g/dL de sangre, lesiones óseas (p. ej . , lesiones líticas u osteoporosis con fracturas por compresión, infecciones graves frecuentes (>2 por año) , amiloidosis (la depositación de proteína amiloide) de otros órganos, y el síndrome de hiperviscosidad (aumento de la viscosidad de la sangre), p. ej . , una viscosidad de la sangre por encima de 1.8 centipoises, p. e . , una viscosidad de la sangre de al menos 2, 3, 4 o 5 centipoises.

Los individuos que tengan mieloma múltiple, en algunas modalidades, entran en uno de los siguientes grupos. En una modalidad, el individuo que tenga mieloma múltiple nunca ha sido tratado para la enfermedad. En otra modalidad, el individuo tiene mieloma sensible; es decir, mieloma múltiple que está respondiendo al tratamiento. En una modalidad específica, tal individuo presenta una disminución de la proteína M (paraproteina) de al menos 50%, como resultado del tratamiento. En otra modalidad especifica, el individuo presenta una disminución en la proteina M de entre 25% y 50% como resultado del tratamiento. En otra modalidad, el individuo tiene mieloma múltiple estable, lo cual se refiere a mieloma que no ha respondido al tratamiento (por ejemplo, la disminución de la proteina M no ha llegado al 50%), pero no ha progresado ni ha empeorado. En otra modalidad, el individuo tiene mieloma múltiple progresivo, lo cual se refiere a mieloma activo que está empeorando (por ejemplo, incremento de la proteina y empeoramiento del daño al órgano o tejido o daño al órgano especifico) . En otra modalidad, el individuo tiene mieloma múltiple con recidiva, lo cual se refiere a la enfermedad mieloma que inicialmente respondió al tratamiento pero luego comenzó a progresar otra vez. En las modalidades especificas, el individuo es recidivante después del tratamiento inicial y es recidivante después del tratamiento posterior. En otra modalidad, el individuo tiene mieloma múltiple refractario. En una modalidad especifica, el mieloma múltiple refractario es mieloma múltiple que no ha respondido al tratamiento inicial. En otra modalidad especifica, el mieloma múltiple refractario es mieloma múltiple con recidiva que no ha respondido al tratamiento posterior. En otra modalidad especifica, el mieloma múltiple refractario es la enfermedad refractaria que progresa sin respuesta, lo cual se refiere a la enfermedad refractaria que está progresando. En otra modalidad especifica, el mieloma múltiple refractario es la enfermedad refractaria que no progresa ni responde, lo cual se refiere a la enfermedad refractaria que no está empeorando.

Asi pues, en una modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple, el método consiste en administrar al individuo células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) , en donde la administración permite hacer la disminución detectable de la progresión, disminución detectable del empeoramiento, y/o mejoramiento detectable de uno o más síntomas de mieloma múltiple, p. ej . , de uno o más cualesquiera de los síntomas de mieloma múltiple que se describen en la presente, sin limitación. En las modalidades específicas, el uno o más síntomas consisten en concentración elevada de calcio en sangre u orina en comparación con la concentración normal, la presencia de lesiones óseas, anemia o insuficiencia renal. En otra modalidad específica, el uno o más síntomas consisten en células plasmáticas, p. ej . , células plasmáticas clónales que constituyen más del 10% de las células en biopsia de la médula ósea o, en cualquier cantidad en una biopsia de otros tejidos (p. ej . , plasmacitoma) ; paraproteina en suero u orina; y/o evidencia de año a órgano especifico. En otra modalidad especifica, el uno o más síntomas es una concentración de calcio en la sangre de más de aproximadamente 2.75 mmol/L, insuficiencia renal, menos de aproximadamente 10 g de hemoglobina por decilitro de sangre, la presencia de lesiones óseas, o amiloidosis de uno o más órganos que no sean la médula ósea.

En otra modalidad específica, el síntoma es infección, p. e . , infección causada por hipergamaglobulinemia . En ciertas modalidades, la infección es neumonía o pielonefritis . En ciertas modalidades, la infección ocurre en el lapso de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses después del comienzo de la quimioterapia, p. e . , la quimioterapia para tratar el mieloma múltiple.

En otra modalidad específica, el síntoma es un síntoma neurológico. En otras modalidades específicas, los síntomas neurológicos son debilidad, confusión, fatiga, cefalea, cambios visuales, retinopatía, dolor radicular, pérdida del control intestinal lo de la vejiga, síndrome del túnel carpiano y/o paraplejia.

En una modalidad especifica, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple, el método consiste en administrar al individuo las células madre placentarias y/o las BM-MSC (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) , siendo que la administración da como resultado la disminución detectable en el número de células de mieloma múltiple, p. ej . , células de mieloma múltiple clónales, en uno o más órganos o tejidos del individuo.

En una modalidad especifica, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple, que consiste en administrar al individuo células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas (p. e . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) , en donde la administración da como resultado el aumento detectable de la hemoglobina en sangre del individuo, p. ej . , un aumento respecto a los limites normales. Los niveles normales de hemoglobina varían por la edad y sexo del individuo, como se muestra en la Tabla 1A, siguiente: Tabla 1A De este modo, en otra modalidad especifica, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple, que consiste en administrar al individuo células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) , en donde la administración da como resultado el aumento de las concentraciones de hemoglobina en sangre en el individuo entre 11 g/dL de sangre y 20 g/dL de sangre. En otra modalidad especifica, la administración da como resultado el aumento de las concentraciones de hemoglobina en sangre en el individuo entre 11 g/dL de sangre y 13 g /dL de sangre. En otra modalidad especifica, la administración da como resultado el aumento de las concentraciones de hemoglobina en sangre en el individuo entre 12 g/dL de sangre y 16 g /dL de sangre. En otra modalidad especifica, la administración da como resultado el aumento de las concentraciones de hemoglobina en sangre en el individuo entre 14 g/dL de sangre y 18 g /dL de sangre. En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento para un individuo que tenga anemia, p. ej . , que tenga menos de aproximadamente 10 g de hemoglobina por decilitro de sangre, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias , en donde la anemia es ocasionada por mieloma múltiple, y en donde la cantidad terapéutica eficaz es una cantidad que provoca una elevación en las concentraciones de hemoglobina en sangre del individuo a aproximadamente 10 gramos por decilitro o más.

En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple, que consiste en administrar al individuo células madre placentarias aisladas, una población de células madre placentarias aisladas o una población de células que contenga células madre placentarias aisladas, en donde la administración da como resultado la disminución detectable en la concentración de paraproteina en sangre u orina del individuo. En- una modalidad especifica, la administración da como resultado la disminución de paraproteina en sangre u orina del individuo a un nivel no detectable. En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga paraproteina en la sangre del individuo, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de células madre placentarias y/o las BM- SC, en donde la presencia de paraproteina es ocasionada por mieloma múltiple, y en donde la cantidad terapéutica eficaz es una cantidad suficiente para provocar una caída detectable en la concentración de paraproteina en la sangre del individuo.

En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga un número de células plasmáticas clónales mayor de 10%, de todas las células nucleadas, en una biopsia de médula ósea o muestra de sangre del individuo, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, en donde el número de células plasmáticas clónales es ocasionado por mieloma múltiple, y en donde la cantidad terapéutica eficaz es una cantidad suficiente para provocar una caída detectable en el número de células plasmáticas clónales en una biopsia de médula ósea o muestra de sangre por debajo de 10%.

En otra modalidad, en la presente se proporciona a método de tratamiento a un individuo que tenga hipercalcemia que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica . eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, en donde la hipercalcemia es ocasionada por mieloma múltiple, y en donde la cantidad terapéutica eficaz es una cantidad suficiente para provocar una calda detectable en la concentración de calcio en sangre del individuo. En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga niveles elevados de calcio en sangre (p. ej . , niveles de calcio corregidos mayores de aproximadamente 12 mg por decilitro de sangre, o mayor de aproximadamente 2.75 mmol), que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las B -MSC, en donde las concentraciones altas de calcio en sangre son ocasionados por mieloma múltiple, y en donde la cantidad terapéutica eficaz es una cantidad suficiente para provocar una caída detectable en las concentraciones de calcio en sangre, p. ej . , una caída en las concentraciones de calcio en sangre por debajo de aproximadamente 12 mg por decilitro de sangre, o por debajo de aproximadamente 2.75 mmol.

En otra modalidad, se proporciona en la presente un método de tratamiento a un individuo que tenga anemia, en donde la anemia es ocasionada por mieloma múltiple, en donde la anemia se define como concentraciones de hemoglobina en sangre de menos de 10 g/dL de sangre, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, en donde la cantidad terapéutica eficaz es una cantidad suficiente para provocar un aumento detectable en la concentración de hemoglobina en sangre del individuo. En una modalidad especifica, la cantidad terapéutica eficaz es una cantidad que da como resultado un incremento de los niveles de .hemoglobina en sangre del individuo a 10 g/dL o mayor.

En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga síndrome de hiperviscosidad de la sangre, en donde la sangre tiene una viscosidad por encima de 1.8 centipoises, en donde el síndrome de hiperviscosidad de la sangre es ocasionada por mieloma múltiple, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, en donde la cantidad terapéutica eficaz es una cantidad suficiente para provocar una disminución detectable en la viscosidad de la sangre del individuo. En las modalidades especificas, la cantidad terapéutica eficaz es una cantidad que da como resultado una disminución en la viscosidad de la sangre del individuo por debajo de 5, 4, 3, 2 o 1.8 centipoises .

En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga más de, p. ej., 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18% o 20% de células plasmáticas en la médula ósea del individuo, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, en donde la cantidad terapéutica eficaz es una cantidad suficiente para provocar una disminución detectable en el porcentaje de las células plasmáticas en la médula ósea del individuo.

En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple, que consiste en administrar al individuo células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea), en donde la administración da como resultado la disminución detectable en la gravedad y/o el número de lesiones óseas ocasionadas por mieloma múltiple en el individuo, tal y como se puede determinar por, p. ej . , barrido óseo o radiografía. En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para tratar a un individuo que tenga mieloma múltiple, que consiste en administrar al individuo las células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas, en donde la administración da como resultado la disminución detectable en la pérdida de la masa ósea o el contenido mineral óseo, la interrupción de la pérdida de masa ósea o el contenido mineral óseo o el aumento en la masa ósea o el contenido mineral óseo, en el individuo.

En otra modalidad específica del método de tratamiento, el uno o más síntomas de mieloma múltiple son dolor de huesos, lesiones osteocíticas (p. ej . , visibles por rayos y X o imagenoloqía de resonancia magnética (MRI)), osteoporosis, anemia, hipercalcemia o un síntoma debido a hipercalcemia o insuficiencia renal. En otras modalidades específicas, el individuo nunca ha sido tratado para mieloma múltiple; el individuo ha sido tratado para mieloma múltiple y responde al tratamiento sin células madre placentarias y/o BM-MSC; el individuo ha sido tratado para mieloma múltiple y no ha respondido al tratamiento sin células madre placentarias y/o BM-MSC, pero el curso de mieloma múltiple en el individuo no ha progresado; o el individuo tiene mieloma múltiple progresivo .

En otra modalidad, la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) , es suficiente para provocar un aumento detectable en uno o más marcadores de la formación de hueso en el individuo. Por ejemplo, la formación de hueso puede ser evaluada por análisis de los niveles de la fosfatasa alcalina especifica del hueso (BSAP) y/o del péptido N-terminal del procolágeno tipo I intacto (PINP) en suero en, p. ej . , muestras de suero del individuo. Un aumento detectable en los niveles de BSAP y/o PINP en suero después de la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC a un individuo que tenga mieloma múltiple es un indicio de un aumento en la formación del hueso. Asi pues, en otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple, que consiste en administrar al individuo células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas, en donde la administración da como resultado un aumento detectable en los niveles de BSAP o PINP en suero del individuo.

En otra modalidad, la administración de las células madre placentarias y/o BM-MSC aisladas, es suficiente para ocasionar una disminución detectable en uno o más marcadores de la resorción ósea. Por ejemplo, la resorción ósea puede ser evaluada por análisis de los niveles del telopéptido de colágeno tipo I, C-terminal (CTX) en suero y/o la isoforma-5b de la fosfatasa ácida resistente a tartrato en suero (TRACP-5b) . Una disminución detectable en los niveles de CTX o TRACP-5b después de la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, a un individuo que tenga mieloma múltiple, es un indicio de una disminución de la resorción ósea. Asi pues, en otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple, que consiste en administrar al individuo las células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) , en donde la administración da como resultado una disminución detectable en los niveles de CTX o TRACP-5b en el suero del individuo.

En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple, Estadía I, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) , en donde el mieloma múltiple en Estadía I se caracteriza por: (i) nivel de hemoglobina de 10 g/dL o más; (ii) hueso normal, o sólo 1-2 lesiones, como se observa en un radiograma; (iii) menos de 12 mg/dL de calcio en sangre; y niveles detectables de paraproteína; en donde la cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC es una cantidad suficiente para provocar el mejoramiento de uno o más de los síntomas, y/o una disminución detectable en el número de células plasmáticas en la sangre del individuo.

En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple en Estadía II, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) , en donde el mieloma múltiple en Estadía II se caracteriza por los síntomas: (i) nivel de hemoglobina en sangre por debajo de 8.5 g/dL; (ii) nivel de calcio en sangre por encima de 12 mg/dL; (iii) 3 o más áreas de lesiones óseas, como se observan en un radiograma; y (iv) niveles altos de paraproteína; en donde la cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas es una cantidad suficiente para obtener un mejoramiento de uno o más de los síntomas y/o una disminución detectable en el número de células plasmáticas en la sangre del individuo.

En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple Estadía I, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) , en donde el mieloma múltiple en Estadía I se caracteriza por niveles de beta-2 microglobulina en suero menores de 3.5 mg/L y un nivel de albúmina en suero de 3.5 g/dL o mayor, y en donde la cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC es una cantidad suficiente para disminuir, p. ej . , disminuir de manera que pueda detectarse, el nivel de beta-2 microglobulina en suero, o aumentar, p. e . , aumentar de manera que pueda detectarse, el nivel de albúmina en sangre del individuo.

En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple en Estadía II, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) , en donde el mieloma múltiple Estadía II se caracteriza por niveles de beta-2 microglobulina en suero entre aproximadamente 3.3 mg/L y 5.5 mg/L con cualquier nivel de albúmina sérica, o nivel de albúmina sérica por debajo de aproximadamente 3.5 g/dL y nivel de beta-2 microglobulina en suero menor de aproximadamente 3.5 g/L, y en donde la cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC es una cantidad suficiente para disminuir, p. ej . , disminuir de manera detectable, el nivel de beta-2 microglobulina en suero, p. ej . , hasta por debajo de aproximadamente 3.3 mg/L, o aumentar, p. ej . , aumentar de manera que pueda detectarse, el nivel de albúmina en sangre, del individuo.

En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple Estadía III, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) , en donde el mieloma múltiple Estadía III se caracteriza por niveles de beta-2 microglobulina en suero mayores de 5.5 mg/L con cualquier nivel de albúmina sérica, en donde la cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, es una cantidad suficiente para disminuir, p. ej . , disminuir de manera que pueda detectarse, la cantidad de beta-2 microglobulina en suero o en la sangre del individuo, p. e . , a un nivel por debajo de aproximadamente 5.5 mg/L, o a un nivel por debajo de aproximadamente 3.5 mg/L.

En algunas otras modalidades especificas de cualquiera de las anteriores, el individuo que tiene mieloma múltiple es refractario a una o más de las terapéuticas no celulares para mieloma múltiple, p. ej . , melfalano (con o sin prednisolona) , ciclofosfamida (con o sin prednisolona) , agentes alquilantes, VAD (vincrist ina, adriamicina y dexametasona en dosis altas) , ABC (vincristina, adriamicina, prednisolona y carrmustina) , dexametasona en dosis altas, talidomida, bifosfonatos, etcétera .

En otro aspecto, en la presente se proporciona un método para suprimir la proliferación de células de mieloma múltiple, que consiste en poner en contacto las células de mieloma múltiple con células madre placentarias aisladas, p. ej . , las células madre placenterías aisladas que se describen en la Sección 5.2, más adelante, una población de tales células madre placentarias aisladas, o una población de células que contenga las células madre placentarias aisladas, y/o las BM-MSC aisladas o médula ósea que contenga BM-MSC, de modo que la proliferación de las células de mieloma múltiple sea suprimida, p. ej . , suprimida de manera que pueda detectarse. En ciertas modalidades, en la presente se proporciona un método para suprimir la proliferación de células de mieloma múltiple in vivo, que consiste en administrar una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, a un individuo que contenga células de mieloma múltiple, en donde la administración disminuye, p. ej . , disminuye de manera que pueda detectarse, la proliferación de las células de mieloma múltiple. En una modalidad específica, la administración disminuye, p. ej . , disminuye de manera que pueda detectarse (p. ej . , mejora), uno o más síntomas o signos de mieloma múltiple, o disminuye el empeoramiento de uno o más síntomas o signos de mieloma múltiple. Una disminución en la proliferación de las células de mieloma múltiple después de la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, puede ser evaluada, p. ej . , detectando una disminución en el número de células plasmáticas de la sangre o médula ósea de un individuo que tenga mieloma múltiple, p. ej . , empleando uno o más anticuerpos específicos para células plasmáticas o las células de mieloma múltiple, por ejemplo, los anticuerpos para CD28 o CD138.

En otro aspecto, en la presente se proporciona un método para disminuir un número de células de mieloma múltiple, p. ej . , en un individuo que tenga mieloma múltiple, que consiste en poner en contacto las células de mieloma múltiple con células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) , de modo que el número de células de mieloma múltiple del individuo sea suprimido, p. ej . , suprimido de manera que pueda detectarse, después del contacto. En una modalidad específica, el contacto se hace administrando las células madre placentarias y/o las BM-MSC al individuo. En otra modalidad específica, la administración disminuye, p. ej . , disminuye de manera que pueda detectarse (p. ej . , mejora), uno o más síntomas o signos de mieloma múltiple, o disminuye el empeoramiento de uno o más síntomas o signos de mieloma múltiple. Una disminución en el número de células de mieloma múltiple después de la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, en comparación con antes de la administración, se puede evaluar, p. ej . , mediante la detección de una disminución en el número de las células plasmáticas de la sangre o médula ósea de un individuo que tenga mieloma múltiple, p. ej . , empleando uno o más anticuerpos específicos para las células plasmáticas o las células de mieloma múltiple, por ejemplo, los anticuerpos para CD28 o CD138.

Por lo regular, un individuo que presente uno o más síntomas de mieloma múltiple es evaluado para mieloma múltiple al menos una vez antes de un diagnóstico final de mieloma múltiple, p. ej . , como parte de las pruebas realizadas para llegar a un diagnóstico de mieloma múltiple. Asimismo, por lo regular, un individuo al que se ha diagnosticado mieloma múltiple es evaluado al menos una vez, por lo regular más de una vez, después de un diagnóstico de mieloma múltiple, para detectar síntomas de mieloma múltiple para calibrar el progreso de la enfermedad. Tal evaluación puede consistir en una determinación de la magnitud y/o el número de lesiones óseas empleando, p. ej . , análisis de rayos X, imagenología de resonancia magnética (MRI), barrido por tomografía computarizada (CT) , barrido por tomografía de emisión de positrones (PET) o similares; una determinación del nivel de calcio en sangre; una determinación del nivel de las proteínas M (anticuerpos o fragmentos de los anticuerpos) en la sangre u orina, y similares. La eficacia del tratamiento de mieloma múltiple, p. ej . , la eficacia de la administración de las madre placentarias y/o las BM-MSC, se puede evaluar mediante uno o más de tales síntomas de mieloma múltiple, p. ej . , por el mejoramiento de cualquiera o más de tales síntomas de mieloma múltiple. La eficacia también puede ser evaluada mediante la determinación del número de células de mieloma múltiple en la sangre o médula ósea del individuo, antes y después de la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC.

Así pues, en las modalidades específicas, cualquiera de los métodos anteriores consiste en determinar, una vez o una pluralidad de veces antes de la administración y, como una opción, una vez o una pluralidad de veces después de la administración, uno o más de lo siguiente: (1) un número o magnitud de las lesiones óseas en el individuo; (2) un nivel de proteínas M (paraproteína) en la sangre u orina del individuo; (3) un nivel de calcio en sangre del individuo; y/o (4) un número de células de mieloma múltiple en la sangre o médula ósea del individuo. En ciertas modalidades, si el nivel de calcio en la sangre del individuo, o el nivel de proteínas M en la sangre u orina del individuo, cae, p. ej . , cae de manera que pueda detectarse, después de la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas, en comparación con el nivel antes de la administración, las células madre placentarias y/o las BM-MSC, son una terapéutica eficaz. Del mismo modo, en ciertas modalidades, la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC es una terapéutica eficaz si el número de lesiones óseas, o la magnitud de la gravedad de las lesiones óseas del individuo, se disminuye después de la administración respecto al número de lesiones óseas, o la magnitud de la gravedad de las lesiones óseas antes de la administración. En algunas otras modalidades, la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC también es una terapéutica eficaz, p. ej . , si la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC da como resultado la disminución de un aumento en el nivel de la proteina M en la sangre u orina del individuo, o disminución en un aumento en el nivel de calcio en la sangre del individuo, o una disminución en el aumento en el número o gravedad de las lesiones óseas del individuo. En ciertas modalidades especificas, si no existe un cambio detectable en el número o gravedad de las lesiones óseas del individuo, el nivel de proteina M en la sangre u orina del individuo, o el nivel de calcio en sangre del individuo después de la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, se repite la administración de las células madre placentarias, de las BM-MSC, o de ambas.

La eficacia de la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas también se puede evaluar determinando que una cantidad, p. ej . , una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC disminuye, p. ej . , disminuye de manera que pueda detectarse, el número de precursores de los osteoclastos o células de mieloma múltiple en el individuo después de la administración. La disminución del número de los precursores de los osteoclastos en el individuo se puede determinar por cualquier método aceptado para uso médico. Por ejemplo, el número de los precursores de los osteoclastos se puede determinar con un anticuerpo especifico para los precursores de los osteoclastos con el fin de detectar los precursores de los osteoclastos en, p. ej . , una muestra de la sangre periférica o la médula ósea del individuo; el número de células marcadas puede ser evaluado, p. ej . , por histología, contando las células bajo un microscopio, clasificando las células marcadas por citometría de flujo, o similares. En otra modalidad específica, la cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias y/o las BM-MSC disminuye el número de células de mieloma múltiple en el individuo, p. ej . , tal y como se puede determinar por recuento de células (p. ej . , por citometria de flujo), o por tinción con anticuerpos, de las células de la sangre nucleadas del individuo empleando un anticuerpo especifico para las células de mieloma múltiple o las células plasmáticas, p. ej . , un anticuerpo especifico para los marcadores celulares CD28 o CD138.

En cualquiera de los métodos para el tratamiento de mieloma múltiple, el tratamiento de un síntoma de mieloma múltiple, o para suprimir la proliferación de las células de mieloma múltiple, como se describe en la presente, las células de mieloma múltiple presentan una translocación del material genético desde el cromosoma 4 hasta el cromosoma 14 (p. ej . , una translocación t(4:14)). En otras modalidades, las células de mieloma múltiple presentan una translocación t(14:16), una translocación t (11:14) y/o un reordenamiento IgH ilegítimo con un socio cromosómico desconocido. En algunas otras modalidades, las células de mieloma múltiple no secretan cantidades detectables de inmunoglobulina . En algunas otras modalidades, las células de mieloma múltiple secretan sólo, o prácticamente sólo, la inmunoglobulina de cadena ligera, p. ej . , la cadena ligera ? (kappa), la cadena ligera ? (lambda) , o ambas. En algunas otras modalidades, las células de mieloma múltiple secretan inmunoglobulina que contenga una cadena pesada y una cadena ligera. En otras modalidades, las células de mieloma múltiple producen inmunoglobulina IgG, inmunoglobulina IgA, o ambas .

En cualquiera de las modalidades antes mencionadas, las células madre placentarias aisladas pueden ser, p. e . , las células madre placentarias genéticamente modificadas que están descritas más adelante. En cualquiera de las modalidades antes mencionadas, las BM-MSC pueden ser BM-MSC genéticamente modificadas. Las BM-MSC pueden ser genéticamente modificadas en cualquier forma como está descrito para la ingeniería genética de las células madre placentarias, como está descrito en la Sección 5.7.2, más adelante.

En ciertas modalidades, el individuo que tenga mieloma múltiple además es tratado con un compuesto quimioterapéutico, p. ej . , con uno de los compuestos anticáncer descritos en la Sección 5.1.3, más adelante, por ejemplo uno o más de los compuestos contra cáncer así como con células madre placentarias y/o las BM-MSC. Las células madre placentarias y/o las BM-MSC pueden ser administradas al individuo para tratar mieloma múltiple, p. ej . , al mismo tiempo que, o dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses después del inicio de la quimioterapia, p. ej . , la quimioterapia para tratar el mieloma múltiple. En otras modalidades, el compuesto contra cáncer se administra en el transcurso de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 meses después de la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC. 5.1.2 Tratamiento de condrosarcoma En otro aspecto, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga un condrosarcoma, que consiste en administrar al individuo células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea). Como se menciona en otra parte de la presente, las células madre placentarias aisladas pueden tener cualquier combinación de o todas las características descritas en la Sección 5.2, más adelante. Además, las BM-MSC pueden ser aisladas o estar presentes en, p. ej . , médula ósea que contenga las BM-MSC.

Asi pues, en una modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga condrosarcoma, que consiste en administrar al individuo las células madre placentarias y/o las BM- SC aisladas, en donde la administración permite la disminución detectable de la progresión, la disminución detectable del empeoramiento y/o el mejoramiento detectable de uno o más síntomas de condrosarcoma. En las modalidades específicas, los síntomas pueden ser, más no se limitan a, dolor óseo, una o más lesiones óseas visibles, p. ej . , en una radiografía de rayos X, inflamación del hueso, p. ej . , en el sitio del tumor, o alargamiento de uno o más huesos.

En una modalidad específica, el condrosarcoma es un condrosarcoma de células claras. En otra modalidad específica, el condrosarcoma es un condrosarcoma benigno (encondroma) . En otra modalidad específica, el condrosarcoma es un condrosarcoma maligno de grado inferior (condrosarcoma Grado I; caracterizado por tumores que parecen cartílago normal; los tumores pueden rodear áreas de hueso lamelar y/o demostrar células atípicas que incluyen células binucleadas ) . En otra modalidad específica, el condrosarcoma es un condrosarcoma maligno grado intermedio (condrosarcoma Grado II; caracterizado por celularidad significativa con múltiples células atipicas, muchas de las cuales tienen hipercromasia (una abundancia de DNA con tinción oscura en el núcleo) y un tamaño nuclear aumentado, en comparación con el Grado I) . En otra modalidad específica, el condrosarcoma es un condrosarcoma maligno de grado elevado (condrosarcoma Grado III; caracterizado por áreas de pleomorfismo marcado, células grandes con hipercromasia significativa, células gigantes ocasionales y abundante necrosis. En otra modalidad específica, el condrosarcoma es un condrosarcoma dediferenciado (un condrosarcoma que comprende un tumor de cartílago bien diferenciado (encondroma o Grado II o condrosarcoma II) junto a un sarcoma no cartilaginoso de grado superior). En otra modalidad específica, el condrosarcoma es un condrosarcoma mesenquimal.

En ciertas modalidades, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran al individuo sin ningún otro tratamiento del condrosarcoma. En algunas otras modalidades, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran al individuo después de cirugía para retirar parte o todo el tumor condrosarcoma, o para retirar parte o todo el hueso afectado por condrosarcoma. En algunas otras modalidades, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran al individuo antes o al mismo tiempo de una cirugía para retirar parte o todo el tumor condrosarcoma, o para retirar parte o todo un hueso afectado por condrosarcoma. En algunas otras modalidades, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran por vía sistémica al individuo, p. ej . , en el lugar o por una vía diferente del sitio del condrosarcoma en el individuo; p. ej . , por vía intravenosa, intraarterial , peritoneal o similares. En algunas otras modalidades, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran a o junto al lugar del condrosarcoma (si el tumor no ha sido retirado), p. ej . , el lugar del condrosarcoma en el individuo, o el sitio desde el cual se retiró el condrosarcoma, si se llevó a cabo la remoción quirúrgica. 5.1.3 Tratamientos combinados El tratamiento del cáncer relacionado con el hueso, p. e . , mieloma múltiple, condrosarcoma, o uno de los demás cánceres relacionados con el hueso indicados en la presente, puede consistir en la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC (p. ej . , BM-MSC aisladas o BM-MSC en médula ósea) en combinación con una segunda terapéutica, al individuo que tenga el cáncer. En algunas modalidades, la segunda terapéutica se administra al mismo tiempo que las células madre placentarias y/o las BM-MSC en el mismo curso de tratamiento que las células placentarias, después de que las células madre placentarias y/o las BM-MSC han sido administradas (p. ej . , después del término de un curso de tratamiento que consista en administrar las células madre placentarias y/o las BM-MSC) , o antes de la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC (p. ej . , antes del inicio de un curso de tratamiento que consista en administrar las células madre placentarias y/o las BM-MSC) . En algunas modalidades, las células madre placentarias y/o las BM-MSC, y la segunda terapéutica se formulan juntas para que sean administradas, p. ej . , desde el mismo paquete o envase. En algunas otras modalidades, las células madre placentarias y/o las BM-MSC, y la segunda terapéutica, se formula cada una para la administración separada.

Asi pues, en otro aspecto, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple o condrosarcoma, o uno de los demás cánceres relacionado con el hueso que se enlistan en la presente, que consiste en administrar al individuo células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas, en combinación con una o más de otras terapéuticas contra cáncer, p. ej . , una o más quimioterapias o compuestos quimioterapéuticos . Estas otras terapéuticas contra cáncer pueden ser administradas al individuo al mismo tiempo que, durante el mismo curso de tratamiento que, o separado de, la administración de las células madre placentarias y/o BM-MSC. En una modalidad especifica, la una o más terapéuticas contra cáncer se administran en sucesión con la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC. En otra modalidad especifica, la otra terapéutica contra cáncer o las terapéuticas contra cáncer se administran al individuo antes de la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC; p. ej . , un curso de tales otras terapéuticas contra cáncer se administra al individuo y se completa, antes de la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC al individuo. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se administran al individuo antes de la administración de las otras terapéuticas contra cáncer; p. e . , un curso de células madre placentarias y/o las BM-MSC se administra al individuo antes de la administración de las otras terapéuticas contra cáncer, y se completa, antes de la administración de la otra terapéutica contra cáncer o terapéuticas contra cáncer al individuo.

Cuando se utiliza en la presente, "compuesto contra cáncer" o "terapéutica contra cáncer" es un compuesto o terapéutica que ha sido identificada, p. ej . , en estudios clínicos, preclínicos o científicos (así como en los estudios anecdóticos) con un efecto tumoristático o tumoricida sobre uno o más tipos de células tumorales o cancerosas .

En una modalidad específica, el compuesto contra cáncer es melfalano (también conocido como L-fenilalanina mostaza o L-PAM; nombre comercial Albertan) . Así pues, en una modalidad, el método de tratamiento a un individuo que tenga mieloma múltiple consiste en administrar al individuo melfalano, p. ej . , una dosis o varias dosis terapéutica eficaces de melfalano (p. ej . , ALKERAN®) . La administración por lo regular es por vía oral o intravenosa. En otra modalidad específica, el compuesto contra cáncer es talidomida. En otra modalidad específica, el compuesto contra cáncer es un análogo de talidomida sustituido con amino o un imidazol sustituido con amino. En otra modalidad específica, el compuesto contra cáncer es pomalidomida (comercializada con la marca ACTIMID®) ; lenalidomida (comercializado con la marca REVLIMID®) ; o lenalidomida en combinación con dexametasona . En otra modalidad específica, el tratamiento contra cáncer es bortezomib (p. ej . , VELCADE®) . En otra modalidad especifica, el agente anticáncer consiste en una combinación de melfalano, prednisona y talidomida (administrados por separado o juntos). En otra modalidad especifica, el agente contra cáncer es la combinación de bortezomib, melfalano y prednisona (administrados por separado o juntos). En otras modalidades especificas, el agente contra cáncer es uno o más de lo siguientes: ciclofosfamida (p. ej . , CYTOXAN®) , vincristina (p. ej . , ONCOVIN®, VINCASAR PFS®), doxorubicina (p. ej . , ADRIAMICINA RDF®, ADRIAMICINA PFS®), o doxorubicina liposomal (p. ej . , DOXIL®) .

Otros agentes contra cáncer son bien conocidos en la técnica. Asi pues, en otras modalidades especificas, los compuestos contra cáncer pueden ser, más no se limitan a: acivicina; aclarubicina ; clorhidrato de acodazol; acronina; adozelesina; aldesleucina ; altretamina; ambomicina; ametantrona acetato; amsacrina; anastrozol; antramicina ; asparaginasa ; asperlina; azacitidina; azetepa; azotomicina ; batimastat; benzodepa; bicalutamida; bisantreno clorhidrato; bisnáfido dimesilato; bizelesina; bleomicina sulfato; brequinar sodio; bropirimina; busulfan; cactinomicina; calusterona; caracemida; carbetimer; carboplatino; carmustina; carubicina clorhidrato; carzelesina; cedefingol; celecoxib (inhibidor de COX-2); clorambucil ; cirolemicina ; cisplatino; cladribina; crisnatol mesilato; citarabina; dacarbazina; dactinomicina; daunorubicina clorhidrato; decitabina; dexormaplatino; dezaguanina; dezaguanina mesilato; diaziquona; docetaxel; doxorubicina clorhidrato; droloxifeno; droloxifeno citrato; dromostanolona propionato; duazomicina; edatrexato; eflomitina clorhidrato; elsamitrucina; enloplatino; enpromato; epipropidina; epirubicina clorhidrato; erbulozol; esorubicina clorhidrato; estramustina; estramustina fosfato sodio; etanidazol; etoposido; etoposido fosfato; etoprina; fadrozol clorhidrato; fazarabina; fenretinida; floxuridina; fludarabina fosfato; fluorouracilo; flurocitabina ; fosquidona; fostriecina sodio; gemcitabina; gemcitabina clorhidrato; hidroxiurea; idarubicina clorhidrato; ifosfamida; ilmofosina; iproplatino; irinotecan; irinotecan clorhidrato; lanreotido acetato; letrozol; leuprolido acetato; liarozol clorhidrato; lometrexol sodio; lomustina; losoxantrona clorhidrato; masoprocol; maitansina; mecloretamina clorhidrato; megestrol acetato; melengestrol acetato; melfalano; menogaril; mercaptopurina; metotrexato; metotrexato sodio; metoprina; meturedepa; mitindomida; mitocarcina; mitocromina; mitogilina; mitomalcina ; mitomicina; mitosper; mitotano; mitoxantrona clorhidrato; ácido micofenólico; nocodazol; nogalamicina; ormaplatino; oxisurano; paclitaxel; pegaspargase ; peliomicina; pentamustina ; peplomicina sulfato; perfosfamida; pipobromano; piposulfano; piroxantrona clorhidrato; plicamicina ; plomestano; porfimero sodio; porfiromicina; prednimustina ; procarbazina clorhidrato; puromicina; puromicina clorhidrato; pirazofurina; riboprina; safingol; safingol clorhidrato; semustina; simtrazeno; esparfosato sodio; esparsomicina ; espirogermanio clorhidrato; espiromustina; espiroplatino; estreptonigrina ; estreptozocina; sulofenur; talisomicina; tecogalano sodio; taxotere; tegafur; teloxantrona clorhidrato; temoporfina ; teniposido; teroxirona; testolactona; tiamiprina; tioguanina; tiotepa; tiazofurina; tirapazamina ; toremifeno citrato; trestolona acetato; triciribina fosfato; trimetrexato; trimetrexato glucuronato; triptorelina ; tubulozol clorhidrato; mostaza uracilo; uredepa; vapreotido; verteporfina; vinblastina sulfato; vincristina sulfato; vindesina; vindesina sulfato; vinepidina sulfato; vinglicinato sulfato; vinleurosina sulfato; vinorelbina tartrato; vinrosidina sulfato; vinzolidina sulfato; vorozol; zeniplatino; zinostatina; y zorubicina clorhidrato.

Otros compuestos contra cáncer pueden ser, más no se limitan a: 20-epi-l,25 dihidroxivitamina D3; 5-etiniluracilo; abiraterona ; aclarubicina ; acilfulveno; adecipenol; adozelesina; aldesleucina ; antagonistas ALL-TK; altretamina; ambamustina ; amidox; amifostina; ácido aminolevulinico; amrubicina; amsacrina; anagrelida; anastrozol; andrografolido; inhibidores de la angiogenesis ; antagonista D; antagonista G; antarelix; proteina morfogenética anti-dorsalizante 1; antiandrógeno, carcinoma prostético; anti estrógeno; antineoplaston; oligonucleótidos antisentido; glicinato afidicolina; moduladores del gen de la apoptosis; reguladores de la apoptosis; ácido apurinico; ara-CDP-DL-PTBA; arginina desaminasa; asulacrina; atamestano; atrimustina; axinastatina 1; axinastatina 2; axinastatina 3; azasetron; azatoxina; azatirosina; derivados de bacatina III; balanol; batimastat; antagonistas de BCR/ABL; benzoclorinas ; benzoilestaurosporina ; derivados beta lactámicos; beta-aletina ; betaciamicina B; ácido betulinico; inhibidor de bFGF; bicalutamida ; bisantreno; bisaziridinilespermina ; bisnafido; bistrateno A; bizelesina; breflato; bropirimina; budotitano; butionina sulfoximina; calcipotriol ; calfostina C; derivados de camptotecina; capecitabina; carboxamida-amino-triazol; carboxiamidotriazol ; CaRest M3; CARN 700; inhibidor derivado de cartílago; carzelesina; inhibidores de caseína cinasa (ICOS); castanospermina; cecropina B; cetrorelix; clorinas; cloroquinoxalina sulfonamida; cicaprost; cis-porfirina ; cladribina; análogos declomifeno; clotrimazol ; colismicina A; colismicina B; combretastatina A ; análogo de combretastatina; conagenina; crambescidina 816; crisnatol; criptoficina 8; derivados de criptoficina A; curacina A; ciclopentantraquinonas ; cicloplatam; cipemicina; citarabina ocfosfato; factor citolítico; citostatina; dacliximab; decitabina; dehidrodidenmina B; deslorelina; dexametasona ; dexifosfamida ; dexrazoxana; dexverapamilo; diaziquona; didemnina B; didox; dietilnorespermina; dihidro-5-azacitidina; 9-dihidrotaxol; dioxamicina; difenil espiromustina; docetaxel; docosanol; dolasetron; doxifluridina; doxorubicina; droloxifeno; dronabinol; duocarmicina SA; ebselen; ecomustina; edelfosina; edrecolomab; eflornitina; elemene; emitefur; epirubicina epristérido; análogo de estramustina ; agonistas de estrógeno; antagonistas de estrógeno; etanidazol; etopósido fosfato; exemestano; fadrozol; fazarabina; fenretinida; filgrastim; finastérido; flavopiridol; flezelastina ; fluasterona; fludarabina; fluorodaunorunicina clorhidrato; forfenimex; formestano; fostriecina; fotemustina; gadolinio texapirina; nitrato de galio; galocitabina; ganirelix; inhibidores de gelatinasa; gemcitabina; inhibidores de glutation; hepsulfam; heregulina; hexametileno bisacetamida; hipericina; ácido ibandrónico ; idarubicina; idoxifeno; idramantona ; ilmofosina; ilomastat; imatinib (p. ej . , GLEEVEC®) , imiquimod; péptidos immunoestimulantes ; inhibidor del receptor del factor de crecimiento - 1 tipo insulina; agonistas del interferón; interferones ; interleucinas ; iobenguano; yododoxorubicina; 4-ipomeanol; iroplact; irsogladina; isobengazol; isohomohalicondrina B; itasetron; j asplakinolida; kahalalida F; lamelarina-N triacetato; lanreótido; leinamicina; lenograstim; lentinan sulfato; leptolestatina; letrozol; factor inhibidor de leucemia; interferón alfa de leucocitos; leuprólido + estrógeno + progesterona; leuprorelina; levamisol; liarozol; análogo de poliamina lineal; péptido disacárido lipofilico; compuestos lipofilicos de platino; lisoclinamida 7; lobaplatino; lombricina; lometrexol; lonidamina; losoxantrona ; loxoribino; lurtotecan; lutecio texapirina; lisofilina; péptidos Uticos; maitansina; manostatina A; marimastat; masoprocol; maspina; inhibidores de matrilisina; inhibidores de metaloproteinasa de matriz; menogaril; merbarona; meterelina; metioninasa; metoclopramida; inhibidor de MIF; mifepristona ; miltefosina; mirimostim; mitoguazona; mitolactol; análogos de mitomicina; mitonafido; mitotoxina factor de crecimiento de los fibroblastos -saporina; mitoxantrona; mofaroteno; mo1gramostim; Erbitux, gonadotrofina coriónica humana; monofosforil lipido A + sk de la pared celular de miobacterias ; mopidamol ; mostaza agente anticáncer; micaperóxido B; extracto de la pared celular micobacteriana; miriaporona; N- acetildinalina ; benzamidas N-sustituidas ; nafarelina; nagrestip; naloxona+pentazocina ; napavina; nafterpina; nartograstim; nedaplatino; nemorubicina ; ácido neridrónico; nilutamida; nisamicina; moduladores del óxido nítrico; antioxidante nitróxido; nitrulina; oblimersen (p. ej . , GENASENSE®) ; 06-bencil guanina; octreótida; okicenona; oligonucleótidos ; onapristona; ondansetron; ondansetron; oracina; inductor oral de citocina; ormaplatino; osaterona; oxaliplatino; oxaunomicina ; paclitaxel; análogo des paclitaxel; derivados de paclitaxel; palauamina; palmitoilrhizoxina; ácido pamidrónico; panaxitriol; panomifeno; parabactina; pazeliptina; pegaspargasa; peldesina; pentosana polisulfato de sodio; pentostatina ; pentrozol; perflubron; perfosfamida ; perilil alcohol; fenazinomicina ; fenilacetato; inhibidores de la fosfatasa; picibanilo; pilocarpina clorhidrato; pirarubicina; piritrexim; placetina A; placetina B; inhibidor del activador del plasminógeno; complejo de platino; compuestos de platino; complejo platino-triamina; porfimero sodio; porfiromicina ; prednisona; propil bis-acridona ; prostaglandina J2; inhibidores del proteasoma; inmunomoduladores basados en proteína A; inhibidor de la proteína cinasa C; inhibidor de la proteína cinasa C, microalgal; inhibidores de la proteína tirosina fosfatasa; inhibidores de la purina nucleósido fosforilasa; purpurinas; pirazoloacridina ; conjugado hemoglobina polioxietileno piridoxilado; antagonistas de raf; raltitrexed; ramosetron; inhibidores de la farnesil proteína transferasa en ras; inhibidores del ras; inhibidor ras-GAP; reteliptina demetilada; rhenio Re 186 etidronato; rhizoxina; ribozimas; retinamida RII; rohitukina; romurtida; roquinimex; rubiginona Bl; ruboxil; safingol; saintopina; SarCNU; sarcofitol A; sargramostim; miméticos de Sdi 1; semustina; inhibidor derivado de senescencia 1; oligonucleotidos sentido; inhibidores de la transducción de la señal; sizofiran; sobuzoxano; borocaptato de sodio; fenilacetato de sodio; solverol; proteína de unión a somatomedina; sonermin; ácido esparfósico; espicamicina D; espiromustina; esplenopentina; espongistatina 1; escualamina; estipiamida; inhibidores de estromelisina; sulfinosina; antagonista del péptido intestinal vasoactivo superactivo; suradista; suramin; swainsonina; talimustina; tamoxifenO metyoduro; tauromustina; tazaroteno; tecogalan sodio; tegafur; telurapirilio; inhibidores de la telomerasa; temoporfina; tenipósido; tetraclorodecaóxido; tetrazomina ; taliblastina; tiocoralina; trombopoyetina; mimético de trombopoyetina; timalfasina; agonista del receptor de timopoyetina; timotrinano; hormona estimuladora de la tiroides; etiopurpurina etil estaño; tirapazamina; bicloruro de titanoceno; topsentina; toremifeno inhibidores; de la traducción; tretinoína; triacetiluridina; triciribina; trimetrexato ; triptorelina ; tropisetron; turosterida; inhibidores de la tirosine cinasa; tirfostinas; inhibidores de UBC; ubenimex; factor inhibidor del crecimiento obtenido del seno urogenital; antagonistas de los receptores de urocinasa; vapreótido; variolina B; velaresol; veramina; verdinas; verteporfina ; vinorelbina; vinxaltina; vitaxina; vorozol; zanoterona; zeniplatino; zilascorb; y estimalámero de zinostatina.

En otras modalidades, el tratamiento combinado consiste en la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC, a un individuo en combinación con un inhibidor de los osteoclastos , p. ej . , un inhibidor de la formación de los osteoclastos o de la diferenciación de los precursores de los osteoclastos a los osteoclastos. En una modalidad especifica, el inhibidor de los osteoclastos es un inhibidor de RANKL, p. ej . , Denosumab. En otra modalidad especifica, el inhibidor de los osteoclastos es una integrina o inhibidor de catepsina K.

En otra modalidad, el tratamiento combinado consiste en la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC en combinación con bisfosfonatos . En las modalidades especificas, los bisfosfonatos son aledronato (p. ej . , a una dosis de aproximadamente 5 mg hasta aproximadamente 10 mg por día, o aproximadamente 35 mg hasta aproximadamente 70 mg una vez por semana; con o sin vitamina D suplementaria) , ibandronato, risedronato, clodronato y/o pamidronato. En otra modalidad, el tratamiento combinado consiste en la administración de las células madre placentarias y/o las BM-MSC combinadas' con uno o más de los siguientes: calcitonina, estrógeno, hormone paratiroidea (p. e . , teriparátido, p. ej . , FORTEO®) o raloxifeno.

En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo gue tenga un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple, condrosarcoma, o uno de los demás cánceres relacionados con el hueso que se enlistan en la presente, que consiste en administrar al individuo las células madre placentarias y/o las BM-MSC, en combinación con un compuesto que tenga actividad antagonista de activina o antagonista del receptor Rila de activina (ActRIIa) , p. ej . , un antagonista de ActRIIa. En una modalidad especifica, el antagonista de ActRIIa es una proteina de fusión IgC-Fc tipo IIA receptora de activina, soluble (p. ej . , ACE-011®) . Véase, p. ej . , la Publicación de la solicitud de Patente U.S. No. 2009/0142333, la cual se incorpora para referencia en la presente en su totalidad.

En otra modalidad, en la presente se proporciona un método de tratamiento a un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, p. e . , mieloma múltiple, condrosarcoma, o uno de los demás cánceres relacionado con el huesos que se enlistan en la presente, que consiste en administrar al individuo células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas, en combinación con radioterapia. En algunas modalidades, la radioterapia consiste en administrar rayos X a un órgano o tejido del individuo que tenga el cáncer relacionado con el hueso, el cual está afectado por el cáncer relacionado con el hueso. En las modalidades especificas, por ejemplo, la radioterapia, p. ej . , los rayos X, se administran a una lesión ósea ocasionada por mieloma múltiple, o a una lesión ósea causada por condrosarcoma . En otras modalidades especificas, la radioterapia, p. ej . , los rayos X, se administran a una mitad del cuerpo del individuo que es afectado por cáncer relacionado con el hueso. En otras modalidades especificas, la radioterapia, p. ej . , los rayos X, se administra a todo el cuerpo del individuo afectado. En otras modalidades, la terapia de radiación consiste en administrar un haz de protones o un haz de electrones a un órgano o tejido del individuo que tenga el cáncer relacionado con el hueso, el cual está afectado por el cáncer relacionado con el hueso. En algunas otras modalidades, la radioterapia se administra como preparación para el tratamiento de reemplazo de células madre hematopoyéticas (p. ej . , radioterapia para matar el sistema hematopoyético existente del individuo) .

En otra modalidad, las células madre placentarias y/o las BM-MSC aisladas se combinan con un sustituto del hueso, p. ej . , para tratar una lesión ósea asociada con un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , mediante la administración en o junto a una lesión ósea ocasionada por un cáncer relacionado con el hueso. En una modalidad especifica, el sustituto del hueso es un material cerámico aceptado para uso en el medio fisiológico, p. ej . , fosfato de mono-, di-, tri-, alfa-tri-, beta-tri- y tetra-calcio, hidroxiapatita, una fluoroapatita, un sulfato de calcio, un fluoruro de calcio, un óxido de calcio, un carbonato de calcio, un fosfato de calcio y magnesio, un vidrio con actividad biológica (p. ej . , BIOGLASS®) , o una mezcla de cualquiera de estos. En otra modalidad especifica, el sustituto del hueso es un material cerámico biocompatible poroso (p. ej . , SURGIBONE®, ENDOBON®, CEROS® o similares), o un producto para injertar hueso de colágeno mineralizado (p. ej . , HEALOS™, VITOSS®, RHAKOSS™ y CORTOSS®, o similares) 5.2 CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS Las células madre placentarias aisladas útiles para el tratamiento de los individuos que tienen un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple, o que tengan células of a cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , células de mieloma múltiple, son células que pueden ser obtenidas a partir de una placenta o parte de ésta, que se adhieren a un sustrato de cultivo de tejido (p. ej . , un plástico no recubierto para el cultivo de tejido), y tienen las características de las células multipotenciales o célula madres. En algunas modalidades, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos que se describen en la presente tienen la capacidad para diferenciarse en uno o más tipos de células no placentarias . Las células madre placentarias útiles en los métodos que se describen en la presente están descritos en la presente y, p. ej . , en la Patente U.S. No. 7, 486, 276, y en la Publicación de la solicitud de Patente U.S. No. 2007/0275362, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. Las células madre placentarias son no trofoblastos, citotrofoblastos , células germinales embriónicas ni células madre embriónicas, como estas células son entendidas por las personas expertas en la técnica .

Las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos que se describen en la presente pueden ser de origen fetal o materno (es decir, pueden tener el genotipo del feto o la madre, respectivamente) . Preferentemente, las células madre placentarias aisladas y las poblaciones de las células madre placentarias aisladas son de origen fetal. Las células madre placentarias aisladas o las poblaciones de las células que contienen las células madre placentarias aisladas, pueden contener células madre placentarias aisladas que sean solamente de origen fetal o materno, o pueden contener una población mixta de células madre placentarias aisladas de origen fetal y materno. En algunas modalidades de cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente, las células madre placentarias aisladas son de¦ origen no materno. En algunas otras modalidades, las células madre placentarias son prácticamente libres de células maternas; p. ej . , al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células no son de origen materno.

Las células madre placentarias aisladas, y las poblaciones de células que contienen las células madre placentarias aisladas, pueden ser identificadas y seleccionadas por las características morfológicas, de los marcadores y del cultivo como se describe más adelante. En algunas modalidades, cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente son autólogas para un recipiendario, p. ej . , un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, o las células de un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple o células de mieloma múltiple, o condrosarcoma o células de condrosarcoma , u otro cáncer relacionado con el hueso de las células de otro cáncer relacionado con el hueso. En algunas otras modalidades, cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente son heterólogas para un recipiendario, p. ej . , un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, o células de un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple o células de mieloma múltiple, o condrosarcoma o células de condrosarcoma, u otro cáncer relacionado con el hueso de las células de otro cáncer relacionado con el hueso.

En algunas modalidades, las células madre placentarias útiles en los métodos de la invención, p. ej . , las células madre placentarias que se describen en la presente, se obtienen a partir de la placenta, a término, es decir, una placenta de mamífero, p. ej . , humana, post parto. En algunas otras modalidades, las células madre placentarias útiles en los métodos de la invención, p. e . , las células madre placentarias que se describen en la presente, se obtienen a partir de la placenta de mamífero, p. ej . , humano, antes de término. 5.2.1 Características físicas y morfológicas Las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente (las PDAC) , cuando se cultivan en cultivos primarios o en cultivo celular, se adhieren al sustrato del cultivo de tejido, p. ej . , a la superficie del envase del cultivo de tejido (p. ej . , el plástico para cultivo de tejido), o a una superficie del cultivo del tejido recubierta con matriz extracelular o ligandos como puede ser laminina, colágeno (p. ej . , natural o desnaturalizado) , gelatina, fibronectina, ornitina, vitronectina y proteina de la membrana extracelular (p. ej . , MATRIGEL® (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.))- Las células madre placentarias aisladas en cultivo toman un aspecto generalmente fibroblastoide, estrellado, con un número de procesos citoplásmicos extendiéndose desde el cuerpo celular central. No obstante, las células pueden distinguirse desde el punto de vista morfológico de los fibroblastos cultivados en las mismas condiciones, puesto que las células madre placentarias aisladas presentan un mayor número de tales procesos en comparación con los fibroblastos. Desde el punto de vista morfológico, las células madre placentarias aisladas también pueden ser distinguidas de las células madre hematopoyéticas, las cuales en cultivo toman una morfología más redondeada tipo piedrecilla, y no se adhieren al plástico para el cultivo de tejido. Desde el punto de vista morfológico, las células madre placentarias también pueden ser distinguidas de los trofoblastos o citotrofoblastos , los cuales tienden a aparecer redondeados o epiteloides, y en el caso de los citotrofoblastos, multinucleados en comparación con las células madre placentarias uninucleadas . Las células madre placentarias son unicelulares y siguen siendo unicelulares durante el cultivo y durante los pases múltiples, y no forman, p. e . , células multinucleares durante el cultivo, p. ej . , en cultivo en medio de crecimiento en aire, o en cultivo en medio de crecimiento con 95% de aire/5% de C02.

En ciertas modalidades, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos que se describen en la presente, p. ej . , los métodos para el tratamiento o los métodos para suprimir el crecimiento de las células de cáncer relacionadas con el hueso o para suprimir la diferenciación de los precursores de los osteoclastos en osteoclastos , cuando se cultivan en un medio de crecimiento, desarrollan cuerpos tipo embrioide. Los cuerpos tipo embrioide son bien conocidos en la técnica y son acumulaciones no contiguas de células que pueden crecer sobre la capa adherente de las células madre placentarias aisladas en proliferación. El término "tipo embride" se utiliza porque las acumulaciones de células se parecen a los cuerpos embrioides, acumulaciones de células que crecen desde los cultivos de las células madre embriónicas. El medio de crecimiento en el cual se pueden desarrollar los cuerpos tipo embrioide en un cultivo para proliferación de células madre placentarias aisladas puede ser medio que contenga, p. ej . , D EM-LG (p. ej . , de Gibco) ; 2% de suero fetal bovino (p. ej . , de Hyclone Labs.); lx de insulina-transferrina-selenio (ITS); lx de ácido linoléico-albúmina sérica de bovino (LA-BSA) ; dexametasona 10"9 M (p. ej . , de Sigma); 2-fosfato del ácido ascórbico 10~4 M (p. ej . , de Sigma); factor de crecimiento epidermal 10 ng/mL (p. ej . , de R&D Systems); y factor de crecimiento obtenido de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL (p. ej . , de R&D Systems). 5.2.2 Marcadores de la superficie celular, moleculares y genéticos Las células madre placentarias aisladas son células madre placentarias humanas, que se adhieren al plástico del cultivo de tejido, que tienen las características de las células multipotenciales o células madre, y expresan una pluralidad de marcadores que se pueden utilizar para identificar y/o separar las células, o poblaciones de células que contienen las células madre. Las células madre placentarias aisladas incluyen células y poblaciones de células que contienen células madre placentarias obtenidas directamente de la placenta, o una parte de ésta. Las poblaciones de células madre placentarias aisladas también incluyen poblaciones de (es decir, dos o más) células madre placentarias aisladas en cultivo, y una población en un envase, p. ej . , una bolsa. Las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente son células mesenquimales no obtenidas de médula ósea, células madre mesenquimales obtenidas de tejido adiposo o células mesenquimales obtenidas de sangre del cordón umbilical, sangre placentaria o sangre periférica. Las células madre placentarias útiles en los métodos y las composiciones que se describen en la presente están descritas, p. ej . , en las Patentes U.S. Nos. 7,311,904; 7,311,905; y 7,468,276; y en la Publicación de la Solicitud de Patente U.S. No. 2007/0275362, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia en su totalidad. En una modalidad especifica de cualquiera de las modalidades de las células madre placentarias que se describen en la presente, las células son células de mamífero, p. e . , de humano.

En ciertas modalidades, las células madre placentarias aisladas son células madre placentarias aisladas. En algunas otras modalidades, las células placentarias aisladas son células multipotenciales placentarias aisladas. En una modalidad, las células madre placentarias útiles en los métodos que se describen en la presente son CD34", CD10+ y CD105+, tal y como se puede detectar por citometria de flujo. Cuando se utiliza en la presente, la frase "tal y como se puede detectar por", "como se puede detectar por", y similares, no indican que es necesario que las células sean valoradas para la expresión de los marcadores mencionados para que las células sean "aisladas", ni es necesario que las células sean aisladas empleando los marcadores. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas tienen el potencial de diferenciarse en células de un fenotipo neuronal, células de un fenotipo osteogénico y/o células de un fenotipo condrogénico, p. ej . , in vitro o in vivo, o ambos. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD34, CD10+, CD105+ aisladas, además son CD200+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas además son CD45" o CD90+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas además son CD45" y CD90+, tal y como puede detectarse por citometria de flujo. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+, CD200+ aisladas además son CD90+ ó CD45", como se puede detectar por citometria de flujo. En una modalidad específica, las células madre placentarias CD34, CD10+, CD105+, CD200* aisladas además son una o más de las siguientes: CD44+, CD45", CD90+, CD166+, KDR+ ó CD133". En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+, CD200+ aisladas además son CD44+, CD45", CD90\ CD166+, DR+ y CD133". En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+, CD200+ aisladas además son CD90+ y CD45~, como se puede detectar por citometría de flujo, es decir, las células madre placentarias are CD34 , CD10+, CD45", CD90+, CD105+ y CD200+. En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD45", CD90+, CD 105 CD200+ además son CD44+ , CD80" y/o CD86". En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD44+, CD45", CD90+, CD105+, CD200+ además son uno o más de CD80", CD86", CD117", CD133", citoqueratina+, KDR+, HLA-A,B,C+, HLA- DR, DP, DQ", y HLA-G". En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD34-, CD10+, CD105+ además son uno o más de SSEA1", SSEA3" y/o S SEA4. En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+ además son SSEA1", SSEA3" y SSEA4".

En otra modalidad, las células madre placentarias son CD34", CD10+, CD105+ y CD200+, y una o más de CD44+, CD45", CD90+, CD166+, KDR" o CD133". En una modalidad más especifica, las células madre placentarias son CD34", CD10+, CD105+ y CD200+, CD44+, CD45", CD90+, CD166+, KDR" y CD133\ En otra modalidad, las células madre placentarias son CD34", CD10+, CD105" y CD200+, y una o más de HLA ABC+, HLA DR, DQ, DP~, CD80", CD86", CD98" o PD-L1+. En una modalidad más especifica, las células madre placentarias son CD34", CD10+, CD105+ y CD200+, HLA ABC+, HLA DR, DQ, DP", CD80", CD86", CD98" y PD-Ll\ En ciertas modalidades, las células madre placentarias son CD34", CD10+, CD105+ y CD200+, y una o más de CD3", CD9", CD38", CD45", CD80", CD86", CD133", HLA-DR, DP, DQ", SSEA3", SSEA4", CD29+, CD44-+, CD73+, CD90+, CD105+, HLA-A,B,C+, PDL1+, ABC-p+, y/o 0CT-4+, como se puede detectar por citometria de flujo. En otras modalidades, cualquiera de las células madre placentarias CD34~, CD10+, CD105+ que se describen en lo anterior además son una o más de las siguientes: CD29+, CD38", CD44+ , CD54+, SH3+ ó SH4+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias además son CD44+. En otra modalidad especifica de cualesquiera de las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas antes mencionadas, las células además son una o más de las siguientes: CD117", CD 133", KDR" (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR", ó el Ligando de Muerte Programada 1 (Programmed Death-1 Ligand, PDL 1)+, o cualquier combinación de éstas.

En otra modalidad, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas además son uno o más de las siguientes: CD3", CD9", CD13+, CD29+, CD33+, CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD62E", CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+) , SH4+ (CD73+) , CD80", CD86", CD90+, SH2+ (CD105+) , CD106/VCA +, CD117", CD144/VE-cadherinabaja, CD146+, CD166+, CD184/CXCR4", CD200+, CD 133", 0CT-4+, SSEA3", SSEA4", ABC-p\ KDR" (VEGFR2 ), HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR" HLA-G", o el Ligando de Muerte Programada 1 (Programmed Death-1, PDL1)+, o cualquier combinación de éstas. En otra modalidad, las células madre placentarias CD3", CD9", CD34" CD10+, CD105+ además son CD13+, CD29+, CD33+, CD38" CD44+, CD45", CD54/ICAM+, CD62E , CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+), SH4+ (CD73+) , CD80", CD86", CD90+, SH2+ (CD 105+) , CD106/VCAM+, CD117", CD144 /VE-cadherinabaja, CD146+, CD166+, CD184/CXCR4", CD200+, CD133", OCT-4+, SSEA3", SSEA4", ABC-p+, KDR" (VEGFRT), HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR", HLA-G", y el Ligando de Muerte Programada 1 (Programmed Death-1 Ligand (PDL1)+.

En otra modalidad especifica, cualquiera de las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente son ABC-p+, como se puede detectar por citometria de flujo, y/o OCT-4+ (POU5Fl+) , tal y como se puede determinar por RT-PCR, en donde ABC-p es una proteína transportadora de ABC específica de la placenta (también conocida como proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) y como proteína de resistencia a mitoxantrona (MXR) ) , y OCT-4 es la proteína Octámero-4 (POU5F1). En otra modalidad específica, cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente además son SSEA3" o SSEA4", tal y como se puede determinar por citometría de flujo, en donde SSEA3 es el Antígeno Embrionico Específico del Estadía 3 y SSEA4 es el Antígeno Embrionico Específico del Estadía 4. En otra modalidad específica, cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente además son SSEA3" y SSEA4".

En otra modalidad específica, cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente son una o más de las siguientes: MHC-I+ (p. ej . , HLA-A, B, C+) , HC-II" (p. ej . , HLA-DP, DQ, DR~) ó HLA-G". En otra modalidad específica, cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente son una o más de las siguientes: MHC-I+ (p. ej . , HLA-A, B,C+), MHC-II" (p. e . , HLA-DP, DQ, DR") y HLA-G".

También se proporcionan en la presente las poblaciones de las células que comprenden, p. ej . , que están enriquecidas para, las células madre placentarias aisladas, que son útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente. Las poblaciones preferidas de las células contiene las células madre placentarias aisladas, en donde al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ó 98% de las células en la población de células son células madre placentarias CD10+, CD105+ y CD34" aisladas. En una modalidad especifica, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas además son CD200+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+, CD200+ aisladas además son CD90+ ó CD45", como se puede detectar por citometria de flujo. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD34+, CD10+, CD105+, CD200+ aisladas además son CD90+ y CD45~, como se puede detectar por citometria de flujo. En otra modalidad especifica, cualquiera de las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas, descritas en lo anterior, además son una o más de las siguientes: CD29+, CD38", CD44+, CD54+, SH3+ ó SH4+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas, ó las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+, CD200+, aisladas además son CD44+. En una modalidad especifica de cualquiera de las poblaciones de células que contienen las células madre placentarias CD34", CD10+, CD105+ aisladas antes descritas, las células madre placentarias aisladas además son una o más de las siguientes CD13+, CD29+, CD33+, CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD62E", CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+) , SH4+ (CD73+) , CD80", CD86", CD90+, SH2+ (CD105+), CD106/VCAM+, CD117", CD144 /VE-cadherinabaja, CD184/CXCR4", CD200+, CD133", 0CT-4+, SSEA3", SSEA4", ABC-p+, KDRT (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR", HLA-G", ó el Ligando de Muerte Programada 1 (Programmed Death-1 Ligand, PDL1)+, o cualquier combinación de éstas. En otra modalidad especifica, las células CD34", CD10+, ' CD105+ además son CD13+, CD29+, CD33+, CD38", CD44+, CD45", CD54/ICAM+, CD62E" CD62L", CD62P", SH3+ (CD73+) , SH4+ (CD73+), CD80", CD86", CD90+, SH2+ (CD105+) , CD106/VCAM+, CD117", CD144/VE-cadherinabaja, CD184/CXCR4", CD200+, CD133", OCT-4+, SSEA3", SSEA4-, ABC-p+, KDR" (VEGFR2") , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR", HLA-G", y Programmed Death-1 Ligand (PDL1)+.

En ciertas modalidades, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son una o más, o todas, las siguientes: CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+ , CD45", CD54 +, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3", SSEA4", OCT-4+, y ABC-p+, en donde las células madre placentarias aisladas se obtienen por rompimiento físico y/o enzimático del tejido placentario. En una modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son OCT-4+ y ABC-p+. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son 0CT-4+ y CD34", en donde las células madre placentarias aisladas tienen al menos una, o todas las características siguientes: CD10+ , CD29+ , CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH3+, SH4+, SSEA3 , y SSEA4". En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son OCT-4+, CD34", CD10+, CD29+, CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH3+, SH4 +, SSEA3" y SSEA4". En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas son 0CT-4+, CD34", SSEA3~ y SSEA4" . En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son 0CT-4+ y CD34", y cualquiera de las siguientes SH2+ ó SH3+. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son OCT-4+, CD34", SH2+, y SH3+. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son OCT-4+, CD34", SSEA3" y SSEA4", y son SH2+ ó SH3+, cualesquiera. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son OCT-4+ y CD34", y SH2+ ó SH3+, cualesquiera, y es al menos una de CD10+ , CD29+ , CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SSEA3, o SSEA4". En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son 0CT-4+, CD34", CD10+, CD29+, CD44\ CD45~, CD54 + , CD90+, SSEA3", y SSEA4", y SH2+ ó SH3+ cualesquiera.

En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son SH2+, SH3+, SH4+ y 0CT-4+ . En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90+, CD34~, CD45", SSEA3" o SSEA4". En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas son SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3" y SSEA4". En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3" y SSEA4-, CD10+, CD29+, CD44+, CD54 +, CD90+, OCT-4+, CD34" ó CD45".

En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son CD10+, CD29+, CD34~ CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+ y SH4+; en donde las células madre placentarias aisladas además son una o más de las siquientes 0CT-4+, SSEA3" o SSEA4".

En ciertas modalidades, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones descritas en la presente son CD200+ o HLA-G". En úna modalidad especifica, las aisladas células madre placentarias son CD200+ y HLA-G- . En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas además son CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas además son CD34", CD38" ó CD45". En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas además son CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son CD34+, CD38", CD45", CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD200+ o HLA-G" aisladas facilitan la formación de cuerpos tipo embrioide en una población de células madre placentarias que contiene las células madre placentarias aisladas, en condiciones que permitan la formación de cuerpos tipo embrioide. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas, se aislan o separan de las células placentarias que no son células madre ni multipotenciales . En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas se aislan a partir de las células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra modalidad, una población de células útil en los métodos y composiciones que se describen en la presente es una población de células que contiene, p. ej . , que está enriquecida para, células madre placentarias CD200+, HLA-G". En una modalidad especifica, dicha población es una población de células placentarias. En diversas modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 4 0 % , al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en dicha población de células son células madre placentarias C D200+ , HLA-G" aisladas. En ciertas modalidades, al menos aproximadamente 7 0 % de las células en dicha población de células son células madre placentarias C D2 0 0+ , HLA-G" aisladas. En algunas otras modalidades, al menos aproximadamente 90%, 95%, ó 99% de tales células son células madre placentarias CD200+, HLA-G" aisladas En una modalidad especifica de las poblaciones de células, dichas células madre placentarias CD200+, HLA-G" aisladas también son CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD200+, HLA-G" aisladas también son CD34", CD38" ó CD45". En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD200+, HLA-G" aisladas también son CD34", CD38", CD45", CD73+ y CD105+. En otra modalidad especifica, la población de células se aisla de células placentarias que no son células madre. En otra modalidad especifica, dichas células madre placentarias CD200, HLA-G' aisladas se separan de células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son CD73+, CD105+, y CD200+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son HLA-G". En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son CD34", CD38" o CD45". En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son CD34", CD38- y CD45". En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son CD34", CD38", CD45" y HLA- G". En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no son las células madre placentarias aisladas. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas se aislan a partir de las células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra modalidad, una población de células útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente es una población de células que contiene, p. ej . , que está enriquecida para, células madre placentarias CD73+, CD105+, CD200+ aisladas. En diversas modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células de la población de células son células madre placentarias CD73+ , CD105+, CD200+ aisladas. En otra modalidad, al menos aproximadamente 70% de las células en la población de células son células madre placentarias CD73+, CD105+, CD200+ aisladas. En otra modalidad, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% de las células en la población de células son células madre placentarias CD73+, CD105+, CD200+ aisladas. En una modalidad específica de las poblaciones, las células madre placentarias, aisladas, son HLA-G'. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas además son CD34", CD38" o CD45-. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas además son CD34", CD38 y CD45". En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas además son CD34", CD38", CD45" y HLA-G". En otra modalidad específica, la población de células placentarias se aisla a partir de las células placentarias que no son células madre. En otra modalidad específica, la población de células madre placentarias se aisla a partir de las células placentarias que no presentan estas características .

En algunas otras modalidades, las células madre placentarias aisladas son una o más de CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3-, SSEA4", 0CT-4+, HLA-G" o ABC-p+. En una modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3- , SSEA4" y OCT-4". En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son CD10+, CD29\ CD34~, CD38", CD45", CD54+, SH2+, SH3+, y SH4+. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD45", CD54+, SH2+, SH3+, SH4+ y OCT-4+. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son CD10+, CD29+, CD34", CD38", CD44+, CD45", CD54+, CD90+, HLA-G", SH2+, SH3+, SH4+ . En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son OCT-4+ y ABC-p+. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son SH2+, SH3+, SH4+ y 0CT-4+. En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas son OCT-4+, CD34", SSEA3" y SSEA4". En una modalidad específica, las células madre placentarias aisladas OCT-4+, CD34", SSEA3", y SSEA4" además son CD10+, CD29+, CD34", CD44+, CD45~r CD54+, CD90\ SH2+, SH3+, y SH4+. En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas son OCT-4+ y CD34~, y cualquiera de SH3+ o SH4+. En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas son CD34" y cualquiera de CD10+, CD29+, CD44+, CD54+, CD90+ o OCT-4+ .

En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son CD200+ y OCT-4+ . En una modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son CD73+ y CD105+. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son HLA-G". En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas son CD34", CD38" o CD45". En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas son CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD200+ , OCT-4+ aisladas son CD34", CD38", CD45", CD73+, CD105+ y HLA-G". En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas, se aislan a partir de las células placentarias que no son células madre. En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD200+, 0CT-4+ aisladas, se aislan a partir de las células que no presentan estas características.

En otra modalidad, una población de células útil en los métodos y composiciones que se describen en la presente es una población de células que contiene, p. ej . , que está enriquecida para células madre placentarias CD200+, 0CT-4+. En diversas modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de células en la población de células son células madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas. En otra modalidad, al menos aproximadamente 70% de las células son células madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas. En otra modalidad, al menos aproximadamente 80%, 90%, 95%, o 99% de células en la población de células son células madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas. En una modalidad específica de las poblaciones aisladas, las células madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas, además son CD73+ y CD105+. En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas, además son HLA-G-. En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD200+, OCT-4+ aisladas además son CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad específica, las células madre placentarias CD200+, 0CT-4+ aisladas además son CD34", CD38", CD45", CD73+, CD105+ y HLA-G". En otra modalidad especifica, la población de células se aisla a partir de células placentarias que no son células madre placentarias CD200+, 0CT-4+ aisladas. En otra modalidad especifica, la población de células se aisla a partir de células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son CD73+, CD105+ y HLA-G". En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD73+, CD105+ y HLA-G" aisladas además son CD34", CD38" o CD45". En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas además son CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas además son 0CT-4+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas además son CD200+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas además son CD34", CD38", CD45", 0CT-4+ y CD200+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas se aislan a partir de células placentarias que no son células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas se aislan a partir de células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra modalidad, una población de células útil en los métodos y composiciones que se describen en la presente es una población de células que contiene, p. ej . , que es enriquecida para, células madre placentarias CD73+, CD105+ y HLA-G" aisladas. En diversas modalidades, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, o al menos aproximadamente 60% de las células en la población de células son células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas. En otra modalidad, al menos aproximadamente 70% de las células en la población de células son células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas. En otra modalidad, al menos aproximadamente 90%, 95% o 99% de las células en la población de células son células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas. En una modalidad especifica de las poblaciones anteriores, las células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas, además son CD34", CD38" o CD45". En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas además son CD34", CD38" y CD45". En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas además son 0CT-4+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" aisladas además son CD200+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G" además son CD34", CD38-, CD45", 0CT-4+ y CD200+. En otra modalidad especifica, la población de células se aisla a partir de células placentarias que no son células madre placentarias CD73+, CD105+, HLA-G". En otra modalidad especifica, la población de célula se aisla a partir de células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son células madre placentarias HLA-A,B,C+, CD45", CD133" y CD34" aisladas. En otra modalidad, una población de células útil en los métodos y composiciones que se describen en la presente es una población de células que contiene células placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en la población células aisladas son células madre placentarias HLA-A,B,C+, CD45", CD133" y CD34" aisladas. En una modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas o la población de células madre placentarias asiladas se aislan a partir de células placentarias que no son células madre placentarias HLA-A,B,C+, CD45", CD133" y CD34". En otra modalidad especifica de cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente, las células madre placentarias aisladas son de origen no materno. En otra modalidad específica, la población de células madre placentarias aisladas está prácticamente libre de componentes maternos; p. ej . , al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en la población de células placentarias aisladas son de origen no materno.

En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son células madre placentarias CD10+, CD13+, CD33+, CD45", CD117" y CD133" aisladas. En otra modalidad, una población de células útil en los métodos y composiciones que se describen en la presente es una población de células que contiene las células madre placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en la población de células son células madre placentarias CD10+, CD13+, CD33+, CD45", CD117" y CD133" aisladas. En una modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas o la población de células madre placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no son células placentarias aisladas. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias CD10+, CD13+, CD33+, CD45", CD117" y CD133" aisladas son de origen no materno, es decir, tienen un genotipo fetal. En otra modalidad especifica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en la población de células madre placentarias aisladas, son de origen no materno. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas o la población de células madre placentarias aisladas se aislar, a partir de células placentarias que no presentan estas características.

En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son células madre placentarias CD10", CD33", CD44+, CD45" y CD117". En otra modalidad, una población de células útil en los métodos y composiciones que se describen en la presente es una población de células que contiene, p. ej . , enriquecida para, células madre placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en la población de células son células madre placentarias CD10", CD33", CD44+, CD45", y CD117" aisladas. En una modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas o la población de células madre placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no son células madre placentarias. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son de origen no materno. En otra modalidad especifica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98%) o 99% de las células madre placentarias en la población de células son de origen no materno. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas · o población de células madre placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son células madre placentarias CD10", CD13", CD33", CD45~ y CD117" aisladas. En otra modalidad, una población de células útil en los métodos y composiciones que se describen en la presente es una población de células que contiene, p. e . , enriquecida para, células madre placentarias CD10", CD13", CD33", CD45~ y CD117" aisladas, en donde al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95% o al menos aproximadamente 99% de las células en la población son células madre placentarias CD10", CDT3", CD33~, CD45~, y CD117". En una modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas o población de células madre placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no son células madre placentarias. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son de origen no materno. En otra modalidad especifica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en la población de células son de origen no materno. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas o la población de células madre placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no presentan estas características.

En otra modalidad, las células madre placenterías aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son HLA A,B,C+, CD45", CD34", y CD133", y además son CD10+, CD13+, CD38+, CD44+, CD90+, CD105+, CD200+ y/o HLA-G", y/o negativas para CD117. En otra modalidad, una población de células útil en los métodos que se describen en la presente es una población de células que contiene las células madre placentarias aisladas, en donde al menos aproximadamente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o aproximadamente 99% de las células en la población son células madre placentarias aisladas que son HLA A,B,C", CD45", CD34", CD133", y que además son positivas para CD10, CD13, CD38, CD44, CD90, CD105, CD200, y/o negativas para CD117 y/o HLA-G. En una modalidad específica, las células madre placentarias aisladas o la población de células madre placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no son células madre placentarias. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas son de origen no materno. En otra modalidad específica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en la población de células son de origen no materno. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas o la población de células madre placentarias aisladas se aislan a partir de células placentarias que no presentan estos marcadores.

En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son CD200+ y CD10+-, tal y como se puede determinar por unión de anticuerpos y CD117", tal y como se puede determinar por unión de anticuerpos y RT-PCR. En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son CD10+, CD29", CD54+, CD200+, HLA-G", MHC clase I+ y -2-microglobulina+ . En otra modalidad, las células madre placentarias aislada, útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son células placentarias en donde la expresión de al menos un marcador celular es al menos dos veces mayor que para una célula madre mesenquimal (p. ej . , una célula madre mesenquimal derivada de médula ósea) . En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son de origen no materno. En otra modalidad especifica, al menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 90%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en la población de células son de origen no materno.

En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son una o más de CD10+, CD29+, CD44 + , CD45", CD54 /ICAM+, CD62E", CD62L", CD62P , CD80", CD86~, CD103", CD104", CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-cadherinaba]a, CD134/CXCR4", p2-microglobulinabaja, MHC-lbaja, MHC-II", HLA-Gbaja y/o PDLlbaja. En una modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son al menos CD29+ y CD54+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son al menos CD44+ y CD106+. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son al menos CD29+.

En otra modalidad, una población de células útil en los métodos y composiciones que se describen en la presente contienen células madre placentarias aisladas, en donde al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%. 95%, 98% o 99% de las células en la población de células son células madre placentarias aisladas que son una o más de CD10+, CD29+, CD44+, CD45", CD54 ICAM+, CD62E", CD62L", CD62P", CD80", CD86", CD103", CD104", CD105+, CD106/VCAM+, CD144/VE-cadherinadim, CD184 /CXCR4", p2-microglobulinadim, HLA-Idim, HLA-II", HLA-Gdim, y/o PDLldim. En otra modalidad especifica, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células en la población de células son células madre placentarias CD10+, CD29+, CD44+, CD45", CD54 /ICAM+, CD62-E", CD62-L", CD62-P", CD80", CD86", CD103", CD104", CD105+, CD106 VCAM+, CD14 /VE-cadherinadim, CD184 /CXCR4", p2-microglobulinadim, MHC-Idim, MHC-II", HLA-Gdim, y PDLldim.

En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y las composiciones que se describen en la presente son una o más, o todas las siguientes: CD10+, CD29+, CD34~, CD38~, CD44+, CD45", CD54+, CD90+, SH2+, SH3+, SH4+, SSEA3", SSEA4", OCT-4+, y ABC-p+, donde ABC-p es una proteina transportadora ABC específica de la placenta (también conocida como proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP) y como proteína de resistencia a mitoxantrona (MXR) ) , en donde las células madre placentarias aisladas se obtienen por perfusión de una placenta de mamífero, p. ej . , humana, que ha sido drenada de sangre de cordón y perfundida para eliminar la sangre residual.

En otra modalidad específica de cualquiera de las modalidades de las células madre placentarias que se describen en la presente, las células dan prueba negativa para la expresión del gen de telomerasa, prueba negativa para la actividad de la telomerasa, o ambas. La expresión del gen de telomerasa puede ser detectada utilizando, p. ej . , la detección de la RNA de telomerasa empleando, p. ej . , los análisis dot blots o slot blot; o un ensayo con el protocolo de amplificación de la repetición del telómero (TRAP) (p. ej . , TRAPEZE® ELISA, kit para ensayos fluorométricos o basados en gel de Millipore) .

En otra modalidad especifica de cualquiera de las modalidades de las células madre placentarias que se describen en la presente, las células madre placentarias dan prueba positiva para vimentina, p. ej . , al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de las células madre placentarias expresan vimentina. El compuesto vimentina se puede detectar, p. ej . , por citometria de flujo empleando uno o más anticuerpos para vimentina, p. ej . , que estén disponibles de Abcam; por tinción fluorescente in situ, o procedimientos similares.

En otra modalidad especifica de cualquiera de las modalidades de las células madre placentarias que se describen en la presente, las células madre placentarias no secretan cantidades que puedan ser detectadas de gonadotropina coriónica humana (hCG) . La gonadotropina coriónica humana puede detectarse, p. ej . , por el ensayo ELISA o empleando inmunofluorescencia , por ejemplo, el anticuerpo monoclonal de hCG HCG1 (Abcam) , o anticuerpos policlonales contra hCG (Abcam, Novus Biologicals) , En otra modalidad de cualquiera de las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente, una población de células madre placentarias aisladas contiene las células placentarias que se adhieren al plástico para el cultivo de tejido CD56+ que no son células asesinas naturales. En una modalidad especifica, la población contiene aproximadamente 1% hasta aproximadamente 30% de las células placentarias CD56+ en la población de células madre placentarias aisladas, tal y como se puede determinar por citometria de flujo empleando CD56-FITC ( isotiocianato de fluoresceina) . En otra modalidad especifica, la población contiene aproximadamente 16% hasta aproximadamente 62% de las células placentarias CD56+ en la población de células madre placentarias aisladas, tal y como se puede determinar por citometria de flujo empleando CD56-APC (aloficocianina) .

En otra modalidad especifica de cualquiera de las características anteriores, la expresión del marcador celular (p. ej . , el clúster de diferenciación o marcador inmunógeno) se puede determinar por citometria de flujo; en otra modalidad especifica, la expresión del marcador puede determinarse por RT-PCR.

El perfil génico confirma que las células madre placentarias aisladas pueden ser distinguidas de otras células, p. e . , de las célula madre mesenquimales, p. ej . , de las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea. Las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente se pueden distinguir de, p. ej . , las células madre mesenquimales de acuerdo con la expresión de uno o más genes, la expresión de los cuales es mucho mayor en las células madre placentarias aisladas, o en algunas células madre del cordón umbilical, aisladas, en comparación con las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea. En particular, las células madre placentarias aisladas, útiles en los métodos de tratamiento que se proporcionan en la presente, pueden ser distinguidas de las células madre mesenquimales, p. ej . , de las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea, con base en la expresión de uno o más genes, la expresión de los cuales es mucho mayor (es decir, al menos dos veces mayor) en las células madre placentarias aisladas en comparación con un número equivalente de células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea, en donde el uno o más genes son: ACTG2, ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, C0L4A1, COL4A2, CPA4 , DMD, DSC3, DSG2, EL0VL2 , F2RL1 , FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICAM1, IER3, IGFBP7, IL1A, IL6, IL18, KR 18 , KRT8, LIPG, LRAP, MATN2 , MEST, NFE2L3 , NUAK1, PCDH , PDLIM3, PKP2 , RTN1, SERPINB9, ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2 , VTN , ZC3H12A, o una combinación de cualquiera de los anteriores, cuando las células crecen en condiciones equivalentes. Véase, p. e . , U.S. la Publicación de la Solicitud de Patente No. 2007/0275362, la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En ciertas modalidades especificas, la . expresión de uno o más genes se determina, p. ej . , por RT-PCR o análisis de microarreglos , p. ej . , utilizando el microarreglo U133-A (Affymetrix) . En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas expresan el uno o más genes cuando se cultivan para un número de duplicaciones de población, p. ej . , cualesquiera de aproximadamente 3 hasta aproximadamente 35 duplicaciones de población, en un medio que contenga DMEM-LG (p. e . , de Gibco) ; 2% de suero fetal bovino (p. ej . , de Hyclone Labs.); lx insulina-transferrina-selenio (ITS); lx ácido linolénico-albúmina sérica de bovino (LA-BSA) , 10"9 M de dexametasona (Sigma) , 10~4 M de 2-fosfato del ácido ascórbico (Sigma) , factor de crecimiento epidermal (EGF) 10ng/mL (R&D Systems), factor de crecimiento obtenido de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL (R&D Systems) . En otra modalidad especifica, el gen especifico de la célula madre placentaria aislada es CD200. Debe entenderse que, en general, la expresión de un gen especifico, p. ej . , cualquiera de los genes que se enlistan en la presente, se valora por análisis de la expresión del agregado del gen en una población de células madre placentarias .

Las secuencias especificas de estos genes se pueden encontrar en GenBank, p. ej . , en los números de acceso: NM_001615 (ACTG2), BC065545 (ADARBl), (NM_181847 (AMIG02), AY358590 (ARTS-1) , BC074884 (B4GALT6) , BC008396 ( BCHE ) , BC020196 (Cllorf9), BC031103 (CD200), NM_001845 (COL4A1), NM_001846 (COL4A2), BC052289 (CPA4), BC094758 (DMD), AF293359 (DSC3), NM_001943 ( DSG2 ) , AF338241 (ELOVL2), AY336105 (F2RL1), NM_018215 (FLJ10781), AY416799 (GATA6) , BC075798 (GPR126), NM_016235 (GPRC5B) , AF340038 (ICAM1), BC000844 (IER3), BC066339 (IGFBP7), BC013142 (IL1A), BT019749 (IL6), BC007461 (IL18), (BC072017) KRT18, BC075839 (KRT8), BC060825 (LIPG) , BC065240 (LRAP), BC010444 (MATN2), BC011908 (MEST) , BC068455 (NFE2L3), NMJ) 14840 (NUAK1), AB006755 (PCDH7), NM_014476 (PDLIM3), BC126199 (PKP-2), BC090862 (RTN1), BC002538 (SERPINB9), BC023312 (ST3GAL6) , BC001201 (ST6GALNAC5) , BC126160 o BC065328 (SLC12A8) , BC025697 (TCF21), BC096235 (TGFB2), BC005046 (VTN ) , y BC005001 (ZC3H12A) con fecha de marzo de 2008.

En algunas modalidades específicas, las células madre placentarias aisladas expresan cada uno de: ACTG2, ADARB1, AMIG02, ARTS-1, B4GALT6, BCHE, Cllorf9, CD200, COL4A1, COL4A2, CPA4 , DMD, DSC3, DSG2, ELOVL2 , F2RL1, FLJ10781, GATA6, GPR126, GPRC5B, HLA-G, ICA 1, IER3, IGFBP7 , IL1A, IL6, IL18, KRT18, KRT8 , LIPG, LRAP, MATN2, MEST, NFE2L3, NUAK1 , PCDH7, PDLIM3, PKP2 , RT 1 , SER P T NB 9 , ST3GAL6, ST6GALNAC5, SLC12A8, TCF21, TGFB2 , VTN y ZC3H12A a un nivel más alto, p. ej . , un nivel más alto detectable, de un número equivalente de células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea, cuando las células son crecidas en condiciones equivalentes.

En las modalidades específicas, las células madre placentarias expresan el marcador CD200 y ARTS1 (regulador aminopeptidasa del factor de necrosis de tumoral tipo 1); CD200 y NUAK1, ARTS-1 y LRAP (arginina aminopeptidasa obtenido de leucocitos); IL6 ( interleucina-6) y TGFB2 (factor de crecimiento de transformación beta 2); IL6 y KRT18 (queratina 18); IER3 (respuesta precoz inmediata 3), MEST (homólogo del transcrito especifico del mesodermo) y TGFB2; CD200 y IER3; CD200 y IL6; CD200 y RT18; CD200 y LRAP; CD200 y MEST; .CD200 y NFE2L3 (tipo factor nuclear (obtenido de eritroides 2) 3); o CD200 y TGFB2 a un nivel superior, p. ej . , un nivel detectablemente superior que un número equivalente de células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea (BM- SC) en donde las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea han sido sometidas a un número de pases en cultivo equivalente al número de pases que las células madre placentarias aisladas han sido sometidas. En otras modalidades especificas, las células madre placentarias expresan ARTS-1, CD200, IL6 y LRAP; ARTS-1, IL6, TGFB2, IER3, RT18 y MEST; CD200, IER3, IL6, KRT18, LRAP, MEST, NFE2L3, y TGFB2; ARTS-1, CD200, IER3, IL6, KRT18, LRAP , MEST, NFE2L3 , y TGFB2; o IER3, MEST y TGFB2 a un nivel mayor, p. e . , un nivel detectablemente mayor que un número equivalente de las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea, BM-MSC, en donde las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea han sido sometidas a un número de pases en cultivo equivalente al número de pases que las células madre placentarias aisladas han sido sometidas.

La expresión, p. ej . , la expresión diferencial en comparación con las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea, de los genes antes referidos puede evaluarse mediante las técnicas normalizadas. Por ejemplo, las sondas basadas en la secuencia del (los) gen (es) pueden seleccionarse y construirse en forma individual por las técnicas tradicionales. La expresión de los genes se puede evaluar, p. ej . , en un microarreglo que contenga sondas para uno o más de los genes, p. ej . , un arreglo Affymetrix GENECHIP® Human Genome U133A 2.0, o un arreglo Affymetrix GENECHIP® Human Genome U133 Plus 2.0 (Santa Clara, California). La expresión de estos genes se puede evaluar incluso si la secuencia de un número de acceso GenBank especifico se modifica porque las sondas especificas para la secuencia modificada pueden ser generadas fácilmente utilizando las técnicas normalizadas bien conocidas.

El nivel de expresión de estos genes se puede utilizar para confirmar la identidad de una población de células madre placentarias aisladas, para identificar una población de células que contenga al menos una pluralidad de células madre placentarias aisladas, o similares. Las poblaciones de las células madre placentarias aisladas, la identidad de las cuales se confirma, pueden ser clónales, p. ej . , pueden ser poblaciones de células madre placentarias aisladas expandidas a partir de una sola célula madre placentaria aislada, o una población mixta de células madre, p. e . , una población de células que contenga las células madre placentarias aisladas que sean expandidas a partir de múltiples células madre placentarias aisladas, o una población de células que contenga las células madre placentarias aisladas, tal y como se describe en la presente, y al menos otro tipo de célula .

El nivel de expresión de estos genes se puede utilizar para seleccionar poblaciones de células madre placentarias aisladas. Por ejemplo, una población de células madre placentarias, p. ej . , las células madre placentarias expandidas en forma clonal, puede ser seleccionada si la expresión de uno o más de los genes antes enlistados es significativamente mayor en una muestra de la población de las células madre placentarias que una población equivalente de células madre mesenquimales, p. ej . , las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea.

Las células madre placentarias aisladas pueden ser seleccionadas con base en el nivel de expresión de uno o más de tales genes en comparación con el nivel de expresión de uno o más genes en, p. ej . , una célula madre mesenquimal testigo, por ejemplo, el nivel de expresión de uno o más genes en un número equivalente de células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea. En una modalidad, el nivel de expresión del uno o más genes en una muestra que contenga un número equivalente de célula madre mesenquimales se utiliza como testigo. En otra modalidad, el testigo, para las células madre placentarias aisladas probadas en ciertas condiciones, es un valor numérico que representa el nivel, de expresión del uno o más genes en las célula madre mesenquimales en estas condiciones.

Las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente, en ciertas modalidades, presentan las características antes mencionadas (p. ej . , combinaciones de marcadores de la superficie celular y/o perfiles de expresión génica) en el cultivo primario, o durante la proliferación en un medio que contenga, p. ej . , DME -LG (Gibco) , 2% de suero fetal bovino (FCS) (Hyclone Laboratories), lx de insulina-transferrina-selenio (ITS), lx ácido linolénico-albúmina sérica de bovino (LA-BSA) , 1CT9 M de dexametasona (Sigma) , 10"4 M de 2-fosfato del ácido ascórbico (Sigma) , factor de crecimiento epidermal (EGF) 10ng/mL (R&D Systems) , factor de crecimiento obtenido de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL ( R&D Systems), y 100 U de penicilina/1000 U de estreptomicina .

En ciertas modalidades de cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente, las células son humanas. En algunas modalidades de cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente, las características del marcador celular o las características de la expresión génica son marcadores humanos o genes humanos.

En otra modalidad específica de las células madre placentarias aisladas o poblaciones de células que contienen las células madre placentarias aisladas, las células madre placentarias o la población ha sido expandida, por ejemplo, ha sido pasada al menos, aproximadamente, o no más de, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 veces, o se ha proliferado por al menos a aproximadamente, o no más de, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38 o 40 duplicaciones de la población. En otra modalidad específica de las células madre placentarias aisladas o poblaciones de células que contienen las células madre placentarias aisladas, las células o la población son aislados primarios. En otra modalidad especifica de las células madre placentarias aisladas, o las poblaciones de células que contienen las células madre placentarias aisladas, que están descritas en la presente, las células madre placentarias aisladas son de origen fetal (es decir, tienen el genotipo fetal) .

En ciertas modalidades, las células madre placentarias aisladas no se diferencian durante el cultivo en el medio de crecimiento, es decir, en el medio formulado para favorecer la proliferación, p. ej.,. durante la proliferación en el medio de crecimiento. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas no necesitan una capa alimentadora para proliferar. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas no se diferencian en cultivo en ausencia de una capa alimentadora, solamente por la ausencia de una capa de células alimentadoras .

En otra modalidad, las células útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente son las células madre placentarias aisladas, en donde una pluralidad de las células madre placentarias aisladas dan prueba positiva para aldehido deshidrogenasa (ALDH) , tal y como se evalúa por un ensayo de la actividad de la aldehido deshidrogenasa. Estos ensayos son conocidos en la técnica (véase, p. ej . , Bostian y Betts, Biochem. J. , 173, 787, (1978)). En una modalidad especifica, el ensayo de ALDH utiliza ALDEFLUOR® (Aldagen, Inc., Ashland, Oregon) como marcador de la actividad de aldehido deshidrogenasa . En una modalidad especifica, la pluralidad es entre aproximadamente 3% y aproximadamente 25% de las células de la población de células. En otra modalidad, en la presente se proporciona una población de células aisladas del cordón umbilical, p. ej . , células del cordón umbilical aisladas, multipotenciales , en donde una pluralidad de las células aisladas del cordón umbilical dan prueba positiva para aldehido deshidrogenasa, como se evalúa mediante un ensayo de la actividad de la aldehido deshidrogenasa que utiliza ALDEFLUOR® como un indicador de la actividad de la aldehido deshidrogenasa. En una modalidad especifica, la pluralidad es entre aproximadamente 3% y aproximadamente 25% de las células en la población de células. En otra modalidad, la población de células madre placentarias aisladas o las célula madre aisladas del cordón umbilical muestran una actividad de ALDH al menos tres veces, o al menos cinco veces mayor que una población de células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea que tenga aproximadamente el mismo número de células y cultivadas en las mismas condiciones.

En una modalidad específica de cualquiera de las modalidades antes mencionadas de las células madre placentarias útiles en los métodos que se proporcionan en la presente, las células madre placentarias expresan una cualesquiera o cualquier combinación de los marcadores para citometría de flujo y/o marcadores de la expresión génica que se describen en la presente. En ciertas modalidades, al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de las células madre placentarias en una población aisladas de las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente expresa una cualesquiera o cualquier combinación de los marcadores para citometría de flujo y/o los marcadores de la expresión génica que se describen en la presente.

En ciertas modalidades de cualquiera de las poblaciones de células que contenga las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente, las células madre placentarias de las poblaciones de células están prácticamente libres de células que tengan un genotipo materno; p. ej . , al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células madre placentarias en la población tiene un genotipo fetal. En algunas otras modalidades de cualquiera de las poblaciones de células que contenga las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente, las poblaciones de células que contienen células madre placentarias están prácticamente libres de células que tengan un genotipo materno; p. ej . , al menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de las células de la población tiene un genotipo fetal.

En una modalidad especifica de cualquiera de las células madre placentarias aisladas o las poblaciones de células de las células madre placentarias aisladas, el cariotipo de las células, o al menos aproximadamente 95% o aproximadamente 99% de las células de la población, es normal. En otra modalidad especifica de cualquiera de las células madre placentarias antes mencionadas, las células madre placentarias, o las células de la población de células, son de origen no materno.

Diferentes poblaciones de las células madre placentarias aisladas que llevan cualquiera de las combinaciones de marcadores antes mencionadas se pueden combinar en cualquier proporción. Dos o más poblaciones cualesquiera de las células madre placentarias aisladas antes mencionadas se pueden combinar para formar una población de célula madre placentarias aisladas. Por ejemplo, una población de células madre placentarias aisladas puede contener una primera población de células madre placentarias aisladas definida por una de las combinaciones de marcadores antes descritas, y una segunda población de células madre placentarias aisladas definida por otra de las combinaciones de marcadores antes descritas, en donde la primera y segunda poblaciones se combinan en una proporción de aproximadamente 1:99, 2:98, 3:97, 4:96, 5:95, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, o aproximadamente 99:1. Del mismo modo, es posible combinar tres, cuatro, cinco o más poblaciones cualesquiera de las células madre placentarias aisladas antes descritas.

Las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y las composiciones que se describen en la presente pueden obtenerse, p. ej . , mediante el rompimiento del tejido placentario, con o sin digestión enzimática (véase la Sección 5.3.3) o por perfusión (véase la Sección 5.3.4). Por ejemplo, las poblaciones de células placentarias aisladas, de las cuales las células madre placentarias se pueden aislar, pueden producirse de acuerdo con un método que consista en perfundir una placenta de mamífero que haya sido drenada de cordón umbilical y perfundida para eliminar la sangre residual; la perfusión de la placenta con una solución para la perfusión; y recolectar la solución de la perfusión, en donde la solución de la perfusión después de la perfusión contiene una población de células placentarias que contiene las células madre placentarias aisladas; y el aislamiento o separación de una pluralidad de las células placentarias aisladas a partir de la población de células. En una modalidad especifica, la solución de la perfusión se pasa a través de la vena umbilical y las arterias umbilicales y se recolecta después de que se exuda de la placenta. En otra modalidad especifica, la solución de la perfusión se pasa a través de la vena umbilical y se recolecta de las arterias umbilicales, o se pasa a través de las arterias umbilicales y se recolecta de la vena umbilical.

En algunas modalidades, las células madre placentarias aisladas, contenidas en una población de células obtenidas a partir de la perfusión de una placenta, son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99.5% de la población de células placentarias. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas recolectadas por perfusión contienen células fetales y maternas. En otra modalidad específica, las células madre placentarias aisladas recolectadas por perfusión son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99.5% células fetales.

En otra modalidad específica, en la presente se proporciona una composición que contiene una población de células madre placentarias aisladas, tal y como se describe en la presente, recolectadas por perfusión, en donde la composición contiene al menos una parte de la solución de la perfusión utilizada para recolectar las células madre placentarias aisladas.

Las células madre placentarias descritas en la presente también pueden ser aisladas por digestión del tejido placentario con una o más enzimas para romper el tejido a fin de obtener una población de células placentarias que contenga las células madre placentarias, y aislando, o aislando considerablemente las células madre placentarias a partir del resto de las células placentarias. El total, o parte de la placenta puede ser digerida para obtener las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente. En otra modalidad específica, la enzima que rompe el tejido es tripsina o colagenasa. En algunas modalidades, las células madre placentarias aisladas, contenidas en una población de células obtenidas a partir de la digestión de una placenta, son al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o al menos 99.5% de la población de células placentarias .

Las poblaciones de las células madre placentarias aisladas que se describen en lo anterior pueden contener alrededor, al menos o no más de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108, 5 x 10 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o más de las células madre placentarias aisladas. Las poblaciones de las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos de tratamiento que se describen en la presente contienen al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99% de células madre placentarias aisladas, viables, p. ej . , tal y como se puede determinar por, p. ej . , la exclusión con azul de tripano.

Las células madre placentarias que se describen en la presente, útiles en los métodos que se proporcionan en la presente, presentan las características anteriores (p. ej . , las combinaciones de los marcadores de la superficie celular y/o perfiles de expresión génica) en el cultivo primario, o durante la proliferación en un medio que contenga 60% de DMEM-LG (Gibco) , 40% de CDB-201 (Sigma), 2% de suero fetal bovino (FCS) (Hyclone Laboratories), lx insulina-transferrina-selenio (ITS) , IX ácido linolénico-albúmina sérica de bovino (LA-BSA) , 10"9 M de dexametasona (Sigma) , 10~4 M de 2-fosfato del ácido ascórbico (Sigma), factor de crecimiento epidermal (EGF) 10 ng/mL (R&D Systems) , factor de crecimiento obtenido de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL (R&D Systems), y 100 U de penicilina/1000 U de estreptomicina. 5.2.3 Crecimiento en cultivo El crecimiento de las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente en la Sección 5.2.2 en algunas modalidades depende, en parte, del medio especifico elegido para el crecimiento. En las condiciones óptimas, las células madre placentarias aisladas por lo regular se duplican en número en aproximadamente 1-3 días. Durante el cultivo, las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente se adhieren a un sustrato en cultivo, p. ej . , a la superficie de un envase para cultivo de tejido (p. ej . , una caja de plástico para cultivo de tejido, plástico recubierto con fibronectina, y similares) y forman una monocapa . En las modalidades especificas, las células madre placentarias se duplican en cultivo cuando se cultivan a 37°C con 95% de aire/5% de C02 en un medio que contenga 60% D EM-LG (Gibco) y 40% MCDB-201 (Sigma) suplementado con 2% de suero fetal bovino (FCS) (Hyclone Laboratories), IX de insulina-transferrina-selenio (ITS), lx de ácido linolénico-albúmina sérica de bovino (LA-BSA) , 10~9 M de dexametasona (Sigma), 10~4 M de 2-fosfato del ácido ascórbico (Sigma) , factor de crecimiento epidermal (EGF) 10 ng/mL (R&D Systems), factor de crecimiento obtenido de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL (R&D Systems), y 100 ü de penicilina/1000 U de estreptomicina; o en medio que contenga DMEM-LG (Gibco) suplementado con 2%-10% de suero fetal bovino (FCS) (Hyclone Laboratories), IX ITS, IX (LA-BSA) , 10""9 M dexametasona (Sigma), 10~4 M de 2-fosfato del ácido ascórbico (Sigma), actor de crecimiento epidermal (EGF) 10 ng/mL (R&D Systems) , factor de crecimiento obtenido de plaquetas (PDGF-BB) 10 ng/mL (R&D Systems), y 100 U de penicilina/1000 U de estreptomicina. 5.3 MÉTODOS PARA OBTENER LAS CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS AISLADAS 5.3.1 Composición para la recolección de las células Las células madre placenterías se obtienen a partir de una placenta de mamífero utilizando una solución aceptada para el medio fisiológico, p. ej . , una composición para la recolección de la células. Una composición para la recolección de las células, ejemplar, está descrita con detalle en la Publicación de la Solicitud de Patente U.S. No. 2007/0190042 relacionada, la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad La composición para la recolección de las células puede contener cualquier solución que se pueda utilizar en el medio fisiológico, adecuada para la recolección y/o el cultivo de las células, p. ej . , las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente, por ejemplo, una solución salina (p. ej . , salina amortiguada con fosfatos, solución de Kreb, solución de Kreb modificada, solución de Eagle, NaCl al 0.9%, etc.), un medio de cultivo (p. ej . , DMEM, H.DMEM, etc.), y similares .

La composición para la recolección de las células puede contener uno o más componentes que puedan preservar las células madre placentarias aisladas, es decir, que eviten que las células madre placentarias aisladas se sequen, o para retardar la muerte de las células madre placentarias aisladas, que reduzca el número de células madre placentarias aisladas de una población de células que muera, o similares, desde el momento de la recolección hasta el tiempo del cultivo. Tales componentes pueden ser, p. ej . , un inhibidor de la apoptosis (p. ej . , un inhibidor de caspasa o inhibidor de JNK) ; un vasodilatador (p. ej . , sulfato de magnesio, un medicamento antihipertensivo, un péptido natriurético atrial (ANP) , adrenocorticotropina, hormona liberadora de corticotropina, nitroprusiato de sodio, hidralazina, trifosfato de adenosina, adenosina, indometacina o sulfato de magnesio, un inhibidor de fosfodiesterasa, etc.); un inhibidor de necrosis (p. e . , 2- (lH-indol-3-il-3-pentilamino-maleimida, ditiocarbamato de pirrolidina o clonazepam) ; un inhibidor de TNF-a; y/o un perfluorocarburo portador de oxigeno (p. ej . , bromuro de perfluorooctilo, bromuro de perfluorodecilo, etc.).

La composición para la recolección de las células puede contener uno o más enzimas degradadoras del tejido, p. ej . , metaloproteasa, una serina proteasa, una proteasa neutra, una RNasa o una DNasa, o similares. Tales enzimas pueden ser, más no se limitan a, colagenasas (p. ej . , colagenasa I, II, III o IV, una colagenasa procedente de Clostridium histolyticum, etc.); dispasa, termolisina, elastasa, tripsina, LIBERASE, hialuronidasa y similares.

La composición para la recolección de células puede contener una cantidad bactericida o bacteriostática eficaz de un antibiótico. En ciertas modalidades no limitativas, este antibiótico es un macrólido (p. ej . , tobramicina) , una cefalosporina (p. ej . , cefalexina, cefradina, cefuroxima, cefprozil, cefaclor, cefixima o cefadroxil) , una claritromicina, una eritromicina, una penicilina (p. ej . , penicilina V) o una quinolona (p. e . , ofloxacina, ciprofloxacino o norfloxacino) , una tetraciclina, una estreptomicina, etc. En una modalidad especifica, el antibiótico es activo contra bacterias Gram( + ) y/o Gram(-), p. ej . , Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, y similares. En una modalidad, el antibiótico es gentamicina, p. ej . , aproximadamente 0.005% hasta aproximadamente 0.01% (p/v) en el medio de cultivo .

La composición para la recolección de las células también puede contener uno o más de los siguientes compuestos: adenosina (alrededor de 1 m hasta aproximadamente 50 mM) ; D-glucosa (aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 100 mM) ; iones magnesio (aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 50 mM) ; una macromolécula de peso molecular mayor de 20,000 daltons, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para mantener la integridad endotelial y la viabilidad celular (p. ej . , un coloide sintético o natural, un polisacárido como puede ser dextrano o un polietilen glicol presentes en aproximadamente 25 g/L hasta aproximadamente 100 g/L, o aproximadamente 40 g/L hasta aproximadamente 60 g/L); un antioxidante (p. ej . , hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, glutation, vitamina C o vitamina E presentes en aproximadamente 25 µ? hasta aproximadamente 100 µ?) ; un compuesto reductor (p. ej . , N-acetilcisteina presente a aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 5 mM) ; un compuesto que evite la entrada de calcio en las células (p. e . , verapamilo presente a aproximadamente 2 µ? hasta aproximadamente 25 µ?) ; nitroglicerina (p. ej . , alrededor de 0.05 g/L hasta aproximadamente 0.2 g/L); un anticoagulante, en una modalidad, presente en una cantidad suficiente para ayudar a prevenir la coagulación de la sangre residual (p. ej . , heparina o hirudina presentes en una concentración de alrededor de 1000 unidades/L hasta aproximadamente 100,000 unidades/L) ; o un compuesto que contenga amilorida (p. ej . , amilorida, etil isopropil amilorida, hexametileno amilorida, dimetil amilorida o isobutil amilorida presente en aproximadamente 1.0 µ? hasta aproximadamente 5 µ?. 5.3.2 Recolección y manejo de la placenta En general, una placenta humana se recupera poco después de su expulsión después del nacimiento. En una modalidad preferida, la placenta se recupera de una paciente después de que ésta ha dado el consentimiento informado y después de haber tomado un historial médico completo de la paciente y se asocia con la placenta. Preferentemente, el historial médico continúa después del parto. Tal historial médico puede ser utilizado para coordinar el uso posterior de la placenta o las células madre placentarias aisladas cosechadas a partir de ésta. Por ejemplo, las células madre placentarias humanas, aisladas, pueden ser utilizadas, a la luz del historial médico, para la medicina personalizada para el bebé al cual pertenece la placenta, y para los padres, hermanos u otros parientes del recién nacido.

Antes de la recuperación de las células madre placentarias aisladas, la sangre del cordón umbilical y la sangre placentaria preferentemente se separan. En ciertas modalidades, después del parto se recupera la sangre del cordón que se encuentra en la placenta. La placenta puede ser sometida a un proceso de recuperación de la sangre del cordón, tradicional. Por lo regular se utiliza una aguja o cánula, con la ayuda de la gravedad, para exsanguinar la placenta (véase, p. ej . , Anderson, Patente U.S. No. 5,372,581 ; Hessel et al, Patente U.S. No. 5,415,665). Normalmente se coloca la aguja o la cánula en la vena umbilical y la placenta puede ser suavemente masajeada para ayudar a drenar la sangre del cordón a partir de la placenta. Esta recuperación de la sangre del cordón puede hacerse en forma comercial, p. ej . , mediante LifeBank USA, Cedar Knolls, NJ. Preferentemente, la placenta se drena por gravedad sin manipulación adicional para llevar al mínimo el rompimiento del tejido durante la recuperación de la sangre del cordón.

Por lo regular, una placenta es transportada desde la sala de partos a otro lugar, p. ej . , un laboratorio, para recuperar la sangre del cordón y para hacer la recolección de las células madre placentarias , p. ej . , por perfusión o disociación de tejidos. La placenta preferentemente es transportada en un dispositivo de transporte aislado térmicamente, estéril (manteniendo la temperatura de la placenta entre 20-28°C), por ejemplo, colocando la placenta, con el cordón umbilical proximal sujetado con pinza, en una bolsa de plástico zip-lock estéril, la cual luego se coloca en un recipiente aislado. En otra modalidad, la placenta es transportada en un kit para recolección de la sangre del cordón prácticamente como está descrito en la Solicitud de Patente de Estados Unidos pendiente No. 7,147,626, la descripción de la cual se incorpora para referencia en la presente. Preferentemente, la placenta es entregada al laboratorio de cuatro a veinticuatro horas después del parto. En ciertas modalidades, el cordón umbilical proximal está sujetado, preferentemente, en 4-5 cm (centímetros) de la inserción en el disco placentario antes de recuperar la sangre del cordón. En otras modalidades, el cordón umbilical proximal es sujetado después de la recuperación de la sangre del cordón pero antes de otro procesamiento de la placenta.

Antes de la recolección de las células, la placenta puede ser almacenada en condiciones estériles y a temperatura ambiente o a una temperatura de 5°C hasta 25°C. La placenta puede ser almacenada durante un tiempo de cuatro a veinticuatro horas, hasta cuarenta y ocho horas, o más de cuarenta y ocho horas, antes de perfundir la placenta para separar cualquier sangre de cordón residual. En una modalidad, la placenta se cosecha desde entre aproximadamente cero horas hasta aproximadamente dos horas después de la expulsión. Preferentemente, la placenta se almacena en una solución anticoagulante a una temperatura de 5°C hasta 25°C. Las soluciones anticoagulantes apropiadas son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, es posible utilizar una solución de heparina o warfarina sódica. En una modalidad preferida, la solución anticoagulante contiene una solución de heparina (p. ej . , 1% p/p en una solución 1:1000). La placenta exsanguinada preferentemente se guarda durante no más de 36 horas antes de que se recolecten las células madre placentarias .

La placenta de mamífero o una parte de ésta, una vez recolectada y preparada, generalmente como se indica en lo anterior, puede ser tratada en cualquier forma conocida en la técnica, p. ej . , puede ser perfundida o se puede romper, p. ej . , puede ser digerida con una o más enzimas que rompan el tejido, para obtener las células madre placentarias aisladas. 5.3.3 Rompimiento físico y digestión enzimática del tejido placentario En una modalidad, las células madre se recolectan a partir de la placenta de mamífero por rompimiento físico de parte o todo el órgano. Por ejemplo, la placenta, o una parte de ésta, puede ser, p. ej . , triturada, cortada, picada, triturada, troceada, macerada o similares. El tejido puede ser luego cultivado para obtener una población de células madre placentarias aisladas. Por lo regular, el tejido placentario se rompe utilizando, p. ej . , medio de cultivo, una solución salina o una composición para la recolección de células madre (véase la Sección 5.5.1 y más adelante).

Por lo regular, las células madre placentarias aisladas pueden obtenerse mediante el rompimiento de un bloque pequeño de tejido placentario, p. ej . , un bloque de tejido placentario que sea de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o aproximadamente 1000 milímetros cúbicos de volumen. Es posible utilizar cualquier método de rompimiento físico, a condición de que el método de rompimiento deje una pluralidad, más preferentemente una mayor parte y más preferentemente al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, o 99% de las células en el órgano viables, tal y como puede determinar por, p. ej . , exclusión con azul de tripano.

Las células madre placentarias aisladas por lo regular pueden ser recolectadas a partir de una placenta, o una parte de ésta, en cualquier momento en el lapso de aproximadamente los primeros tres días después de la expulsión, pero preferentemente entre alrededor de 8 horas y aproximadamente 18 horas después de la expulsión.

En una modalidad especifica, el tejido roto se cultiva en el medio de cultivo de tejido apropiado para la proliferación de las células madre placentarias aisladas (véase, p. ej . , la Sección 5.6, más adelante, que describe el cultivo de las células madre placentarias, p. ej . , las PDAC) .

En otra modalidad especifica, las células madre placentarias se aislan p. ej . , en parte, mediante el rompimiento físico del tejido placentario, en donde el rompimiento físico consiste en la digestión enzimática, la cual se puede lograr mediante el uso de una o más enzimas que digieran el tejido. La placenta, o una parte de ésta, también puede ser rota físicamente y digerida con una o más enzimas, y el material obtenido luego puede ser sumergido en, o mezclado en, una composición para la recolección de las células.

Una composición para la recolección de las células, preferida, contiene una o más enzimas que rompen el tejido. Las enzimas que pueden utilizarse para romper el tejido placentario pueden ser papaína, desoxirribonucleasas , serina proteasas, como puede ser tripsina, quimiotripsina, colagenasa, dispasa o elastasa. Las serina proteasas pueden ser inhibidas por la alfa 2 microglobulina en suero, y por tanto, el medio que se utilice para la digestión por lo regular será libre de suero. Comúnmente se utiliza EDTA y DNasa en los procedimientos de digestión enzimática para aumentar la eficiencia de la recuperación celular. El digerido preferentemente se diluye para evitar el arrastre de las células hacia adentro del digerido viscoso.

Es posible utilizar cualquier combinación de enzimas para la digestión del tejido. Las concentraciones típicas para la digestión utilizando tripsina pueden ser, 0.1% hasta aproximadamente 2% de tripsina, p. ej . , aproximadamente 0.25% de tripsina. Se pueden utilizar proteasas combinadas, es decir, dos o más more proteasas en la misma reacción de digestión, o se pueden utilizar en forma sucesiva para liberar las células madre placentarias . Por ejemplo, en una modalidad, una placenta o parte de ésta se digiere primero con una cantidad apropiada de colagenasa I a una concentración de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 2 mg/mL durante, p. ej . , 30 minutos, seguido por la digestión con tripsina, a una concentración de aproximadamente 0.25%, durante, p. ej . , 10 minutos, at 37°C. Las serina proteasas preferentemente se utilizan en forma sucesiva después del uso de otras enzimas.

En otra modalidad, el tejido además se puede romper mediante la adición de un quelador, p. ej . , ácido etilen glicol bis (2-aminoetil éter ) -N, N, ' N ' -tetraacético (EGTA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) a la composición para la recolección de células madre que contenga las célula madre, o a una solución en la cual se rompa y/o digiera el tejido antes de la separación de las células madre placentarias con la composición para la recolección de las células madre.

Después de la digestión se lava el digerido, por ejemplo, tres veces con medio de cultivo, y las células lavadas se siembran en matraces para el cultivo. Las células después se aislan por adherencia diferencial, y se determinan sus características para determinar, p. ej . , la viabilidad, los marcadores de la superficie celular, la diferenciación y similares.

Se observará que donde una placenta entera o una parte de una placenta contiene células fetales y maternas (por ejemplo, donde la parte de la placenta contiene el corión o cotiledones), las células madre placentarias aisladas pueden contener una mezcla de células madre placentarias obtenidas de fuentes fetales y maternas. Donde una parte de la placenta que no contiene, o contiene un número insignificante de, células maternas (por ejemplo, el amnión) , las células madre placentarias aisladas a partir de ésta contendrán casi exclusivamente células madre placentarias fetales (es decir, células madre placentarias que tengan el genotipo del feto) .

Las células madre placentarias, p. ej . , las células madre placentarias descritas en la Sección 5.2.2, en lo anterior, pueden ser aisladas a partir del tejido placentario roto por tripsinización diferencial (véase la Sección 5.3.5, más adelante) seguido por el cultivo en uno o más nuevos envases para el cultivo en medio de proliferación nuevo, como una opción, seguido por un segundo paso de de tripsinización diferencial. 5.3.4 Perfusión placentaria Las células madre placentarias, p. ej . , las células madre placentarias descritas en la Sección 5.2.2, anterior, pueden ser también aisladas, p. ej . , en parte, por perfusión de la placenta mamaria. Lo métodos de perfusión de la placenta mamaria para obtener las células madre placentarias están descritas, p. ej . , en las Patentes U.S. Nos. 7,045,148 y 7,255,729, en la Publicación de Solicitud de Patente U.S. Publicación Nos. 2007/0275362 y 2007/0190042, las descripciones de cada una de las cuales se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.

Las células madre placentarias pueden ser recolectadas, p. ej . , aisladas, por perfusión, p. ej . , a través de la vasculatura placentaria, utilizando, p. ej . , una composición para la recolección de las células como una solución para perfusión. En una modalidad, una placenta mamaria es perfundida mediante el pase de la solución de perfusión a través de la arteria umbilical o la vena umbilical, o ambas. El flujo de la solución de perfusión a través de la placenta se puede lograr utilizando, p. ej . , flujo por gravedad hacia la placenta. Preferentemente, la solución para perfusión se envía a través de la placenta empleando una bomba, p. ej . , una bomba peristáltica. La vena umbilical puede ser, p. ej . , canulada con una cánula, p. ej . , una cánula de TEFLON® o de plástico que esté conectada a un aparato de conexión estéril, como puede ser tubería estéril. El aparato de conexión estéril se conecta a un colector de perfusión.

Durante la preparación para la perfusión, la placenta preferentemente se orienta (p. ej . , se suspende) en tal forma que la arteria umbilical y la vena umbilical estén ubicadas en el punto más elevado de la placenta. La placenta puede ser perfundida mediante el pase de un fluido de perfusión a través de la vasculatura placentaria y el tejido circundante. La placenta también puede ser perfundida mediante el pase de un fluido de perfusión hacia la vena umbilical y la recolección de las arterias umbilicales, o el pase de un fluido de perfusión hacia las arterias umbilicales y la recolección de la vena umbilical.

En una modalidad, por ejemplo, la arteria umbilical y la vena umbilical se conectan al mismo tiempo, p. ej . , a una pipeta que esté conectada a través de un conector flexible a un depósito de la solución para perfusión. La solución para perfusión se pasa hacia la vena y arteria umbilical. La solución para perfusión exuda de y/o pasa a través de las paredes de los vasos sanguíneos hacia el tejido circundante de la placenta, y se recolecta en un recipiente abierto adecuado desde la superficie de la placenta que estuvo unida al útero de la madre durante la gestación. La solución para perfusión también puede ser introducida a través de la abertura del cordón umbilical y se puede dejar fluir o percolar de las aberturas hacia la pared de la placenta la cual formó la interfaz con la pared uterina materna. Las células madre placentarias que se recolectan por este método, al cual se puede hacer referencia como un método "pan", por lo regular son una mezcla de células fetales y maternas.

En otra modalidad, la solución para perfusión se pasa a través de las venas umbilicales y se recolecta de la arteria umbilical, o se pasa a través de la arteria umbilical y se recolecta de las venas umbilicales. Las células madre placentarias recolectadas por este método, al cual se puede hacer referencia como un método de "circuito cerrado", por lo regular son casi exclusivamente fetales.

Se observará que la perfusión utilizando el método pan, es decir, con el que el perfundido se recolecta después de que se ha exudado del lado materno de la placenta, da como resultado una mezcla de células fetales y maternas. Como resultado, las células recolectadas por este método pueden contener una población mixta de células madre placentarias, de origen fetal y materno. Por el contrario, la perfusión solamente a través de la vasculatura placentaria en el método del circuito cerrado, con el cual el fluido para perfusión es pasado a través de uno o dos vasos placentarios y se recolecta solamente a través de vasos restantes, da como resultado la recolección de una población de células madre placentarias casi exclusivamente de origen fetal. o El método de perfusión por circuito cerrado puede, en una modalidad, hacerse como sigue. Se obtiene una placenta después del parto en el lapso de aproximadamente 48 horas después del nacimiento. Se pinza el cordón umbilical y se corta por encima de la pinza. El cordón umbilical puede ser descartado o se puede procesar para recuperar, p. ej . , células madre del cordón umbilical y/o para procesar la membrana del cordón umbilical para la producción de un biomaterial. La membrana amniótica puede ser conservada durante la perfusión, o puede ser separada del corión, p. ej . , utilizando disección con punta roma con los dedos, si se separa la membrana amniótica del corión antes de la perfusión, ésta puede ser, p. ej . , desechada o procesada, p. ej . , para obtener células madre por digestión enzimática, o para producir, p. ej . , un biomaterial de membrana amniótica, p. ej . , el biomaterial que está descrito en la Publicación de la Solicitud U.S. No. 2004/0048796, la descripción de la cual se incorpora para referencia en la presente en su totalidad. Después de limpiar la placenta de todos los coágulos sanguíneos visibles y de la sangre residual, p. e . , utilizando una gasa estéril, se exponen los vasos del cordón umbilical, p. ej . , haciendo un corte parcial de la membrana del cordón umbilical para exponer la sección transversal del cordón. Se identifican los vasos y se abren, p. ej . , haciendo avanzar una pinza caimán cerrada a través del extremo cortado de cada vaso. El aparato, p. ej . , la tubería de plástico conectada a un dispositivo de perfusión o a la bomba peristáltica después se inserta en cada una de las arterias placentarias . La bomba puede ser cualquier bomba adecuada para este fin, p. e . , una bomba peristáltica. La tubería de plástico conectada a un depósito para la recolección, estéril, p. ej . , una bolsa de sangre, como puede ser una bolsa para recolectar 250 mL, se inserta entonces en la vena placentaria. De otro modo, la tubería conectada a la bomba se inserta en la vena placentaria y los tubos a un depósito para recolección se insertan en una o ambas arterias placentarias. La placenta entonces se perfunde con un volumen de la solución para perfusión, p. ej . , alrededor de 750 mL de la solución para perfusión. Las células del perfundido entonces se recolectan, p. ej . , por centrifugación. En algunas modalidades, la placenta se perfunde con solución para perfusión, p. ej . , 100-300 mL de la solución para perfusión, para retirar la sangre residual antes de la perfusión para recolectar las células madre placentarias . En otra modalidad, la he placenta no se perfunde con solución para perfusión para eliminar la sangre residual antes de la perfusión para recolectar las células madre placentarias.

En una modalidad, se pinza el cordón umbilical proximal durante la perfusión, y más preferentemente, se pinza a los 4-5 cm (centímetros) de la inserción del cordón en el disco placentario.

La primera recolección del fluido para perfusión a partir de la placenta mamaria durante el proceso de exsanguinación por lo regular está colorida con las células sanguíneas rojas residuales de la sangre del cordón y/o la sangre placentaria. El fluido para perfusión se vuelve más incoloro a medida que procede la perfusión y las células residuales de la sangre del cordón se lavan de la placenta. Por lo regular, desde 30 hasta 100 mL (mililitros) del fluido para perfusión son adecuados para exsanguinar inicialmente la placenta, pero es posible utilizar más o menos fluido para perfusión, dependiendo de los resultados observados.

El volumen del líquido para perfusión que se utiliza para separar las células madre placentarias puede variar, dependiendo del número de células que se van a recolectar, el tamaño de la placenta, el número de recolecciones que han de hacerse de una sola placenta, etc. En algunas modalidades, el volumen del líquido para perfusión puede ser desde 50 mL hasta 5000 mL, 50 mL hasta 4000 mL, 50 mL hasta 3000 mL, 100 mL hasta 2000 mL, 250 mL hasta 2000 mL, 500 mL hasta 2000 mL, o 750 mL hasta 2000 mL. Por lo regular, la placenta es perfundida con 700-800 mL del líquido para perfusión después de la exsanguinación .

La placenta pude ser perfundida una pluralidad de veces durante el curso de varias horas o varios días. Donde la placenta va a ser perfundida una pluralidad de veces, se puede mantener o cultivar en condiciones asépticas en un envase u otro recipiente apropiado, y puede ser perfundida con la composición para la recolección de las células, o una solución para perfusión normalizada (p. ej . , una solución salina normal, como puede ser solución salina amortiguada con fosfato ("PBS") ) con o sin un anticoagulantc (p. ej . , heparina, warfarina sódica, coumarina, bishidroxicoumarina) y/o con o sin un compuesto antimicrobiano (p. ej . , ß-mercaptoetanol (0.1 mM) antibióticos como estreptomicina (p. ej . , a 40-100 g/mL) , penicilina (p. ej . , a 40 U/mL) , amfotericina B (p. ej . , a 0.5 µg/mL) . En una modalidad, una placenta aislada se mantiene o se cultiva durante un tiempo sin recolectar el perfundido, de modo que la placenta se mantiene o se cultiva durante 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 horas, o 2 o 3 o más días antes de la perfusión y la recolección del perfundido. La placenta perfundida se puede mantener durante uno o más tiempo (s) adicional (es ) , p. ej . , 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 horas o más y se puede perfundir una segunda vez con, p. ej . , 700-800 mL de fluido para perfusión. La placenta puede ser perfundida 1, 2, 3, 4, 5 o más veces, por ejemplo, una vez cada 1, 2 , 3, 4, 5 o 6 horas. En una modalidad preferida, la perfusión de la placenta y la recolección de la solución para perfusión, p. ej . , la composición para la recolección de las células, se repite hasta que el número de células nucleadas recuperadas cae por debajo de 100 células/mL. Además, en diferentes puntos temporales los perfundidos pueden ser procesados en forma individual para recuperar poblaciones de células dependientes del tiempo, p. ej . , células madre. Los perfundidos de diferentes puntos temporales también pueden ser combinados. En una modalidad preferida, las células madre placentarias se recolectan en un tiempo o tiempos entre aproximadamente 8 horas y aproximadamente 18 horas después de la expulsión.

Las células madre placentarias pueden ser aisladas de la placenta por perfusión con una solución que contenga una o más proteasas u otras enzimas que rompan el tejido. En una modalidad especifica, una placenta o parte de ésta (p. ej . , membrana amniótica, amnión y corion, lóbulo placentario o cotiledón, cordón umbilical o una combinación de cualquiera de los anteriores) se lleva a una temperatura de 25-37°C, y se incuba con una o más enzimas para romper el tejido en 200 mL de un medio de cultivo durante 30 minutos. Se recolectan las células del perfundido, se llevan a 4°C, y se lavan con una mezcla inhibidora fría que contenga EDTA 5 mM, ditiotreitol 2 mM y beta-mercaptoetanol 2 mM. Las células madre placentarias se lavan después de varios minutos con una composición para la recolección de células madre, fría (p. ej . , 4°C) .

En ciertas modalidades, la perfusión (sea por el método pan o por el método de circuito cerrado) se lleva a cabo abierta bajo una campana estéril en, p. ej . , un recipiente. En algunas otras modalidades, la perfusión se lleva a cabo dentro de un ambiente cerrado, p. ej . , una bolsa estéril que contenga la placenta. En algunas otras modalidades, la placenta es doblada, p. ej . , doblada a la mitad, o prácticamente a la mitad, una vez o una pluralidad de veces durante la perfusión. En las modalidades especificas, el doblez se hace a mano, o por métodos mecánicos.

La perfusión, llevada a cabo como se describe en lo anterior, da como resultado la recolección del perfundido placentario, una solución que contenga una población heterogénea de diferentes células placentarias, cuya población contiene las células madre placentarias adheridas al plástico para el cultivo de tejido antes descritas en la Sección 5.2.2, asi corno las células madre placentarias hematopoyéticas , p. ej . , células madre placentarias CD34+, las cuales no se adhieren al plástico del cultivo de tejido. 5.3.5 Aislamiento, clasificación y caracterización de las células madre placentarias Las células madre placentarias aisladas, p. ej . , las células que se adhieren el plástico para cultivo de tejido que se describen en la Sección 5.2.2, anterior, sean obtenidas por perfusión o por rompimiento físico, p. ej . , por digestión en enzimática, al principio pueden ser purificadas a partir de (es decir, ser aisladas de) otras células por centrifugación en gradiente Ficoll. La centrifugación puede seguir cualquier protocolo normal para la velocidad de centrifugación, etc. En una modalidad, por ejemplo, las células recolectadas de placenta se recuperan del perfundido por centrifugación a 5000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente, condiciones que separan las células de, p. ej . , desechos contaminantes y plaquetas. En ciertas modalidades, la solución de Ficoll se utiliza a una densidad desde aproximadamente 1.070 g/mL hasta aproximadamente 1.090 g/mL, p. ej . , alrededor de 1.073 g/mL, 1.077 g/mL, o aproximadamente 1.084 g/mL; las células madre placentarias serán recolectadas en la parte superior del gradiente a estas densidades. En otra modalidad, el perfundido placentario se concentra a aproximadamente 200 mL, se estratifica suavemente sobre Ficoll y se centrifuga a aproximadamente 1100 x g durante 20 minutos a 22°C, y la capa de células en la interfaz, de baja densidad se recolecta para otro procesamiento.

El sedimento celular puede ser resuspendido en la composición para recolección de células madre, nueva, o en un medio adecuado para el mantenimiento de las células, p. ej . , el mantenimiento de las células madre, por ejemplo, medio IMDM libre de suero que contenga 2 U/mL de heparina y EDTA 2 mM (GibcoBRL, NY) . La fracción total de las células mononucleares se puede aislar, p. ej . , utilizando Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega) de acuerdo con el procedimiento sugerido por el fabricante .

Las células madre placentarias obtenidas por perfusión o digestión, por ejemplo, pueden ser además, o inicialmente, aisladas por tripsinización diferencial empleando, p. ej . , una solución de 0.05% de tripsina con 0.2% de EDTA (Sicma, St . Louis MO) . La tripsinización diferencial es posible porque las células madre placentarias aisladas, las cuales se adhieren el plástico del cultivo de tejido, normalmente se desprenden de la superficie del plástico en el transcurso de aproximadamente cinco minutos, mientras que otras poblaciones adherentes por lo regular requieren más de 20-30 minutos de incubación. Las células madre placentarias desprendidas se pueden cosechar después de la tripsinización y la neutralización de la tripsina empleando, p. ej . , Solución Neutralizante de Tripsina (TNS, Cambrex) . En una modalidad de la separación de las células adherentes, alícuotas de, por ejemplo, aproximadamente 5-10 x 10e células se colocan en cada uno de los diferentes matraces T-75, preferentemente matraces T75 recubiertos con fibronectina . En una modalidad como esta, las células pueden ser cultivadas con medio de crecimiento de células madre mesenquimales (MSCGM) comercial (Cambrex) , y colocadas en un incubador de cultivo de tejido (37°C, 5% C02) . Después de 10 a 15 días, las células no adherentes se separan de los matraces lavándolas con PBS. La solución PBS luego se sustituye por MSCGM.

Es posible vigilar el número y tipo de células recolectadas de una placenta de mamífero, por ejemplo, midiendo los cambios de la morfología y los marcadores de la superficie celular empleando las técnicas normalizada para la detección de las células, como puede ser citometría de flujo, selección celular, inmunocitoquímica (p. ej . , mediante la tinción con anticuerpos específicos de tejido o de marcador celular), clasificación de las células activadas por fluorescencia (FACS), clasificación celular activada magnetismo (MACS) , mediante el examen de la morfología de las células utilizando microscopía luminosa o confocal y/o mediante la medición de los cambios en la expresión génica utilizando técnicas bien conocidas en la materia, como puede ser PCR y el perfilado de la expresión génica. Estas técnicas pueden utilizase también para identificar células que sean positivas para uno o más marcadores específicos. Por ejemplo, mediante los anticuerpos para CD73 es posible determinar, empleando las técnicas antes mencionadas, si una célula contiene una cantidad detectable del marcador CD73; si es así, la célula es CD73+. Del mismo modo, si una célula produce suficiente RNA para OCT-4 que sea detectable por RT-PCR, o mucho más RNA para OCT-4 en comparación con una célula adulta (con su diferenciación terminal) (p. ej . , un fibroblasto dérmico), la célula es OCT-4+. En una modalidad específica, la célula es positiva para un mRNA específico si el mRNA se amplifica por encima del valor de fondo por RT-PCR, empleando un par de cebadores adecuado, en 35 ciclos o menos. Los anticuerpos para los marcadores de la superficie celular (p. ej . , los marcadores CD, como puede ser CD34) y la secuencia de los genes específicos de las células madre, como puede ser OCT-4, son bien conocidos en la materia.

Las células madre placentarias , en particular las células que han sido aisladas por separación Ficoll, adherencia diferencial o una combinación de ambas, pueden ser clasificadas, p. ej . , utilizando el clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). La clasificación o selección de células activadas por fluorescencia (FACS) es un método bien conocido para separar partículas, incluidas las células, con base en las propiedades fluorescentes de las partículas (Kamarch, 1987, Methods Enzymol, 151: 150-165) . En una modalidad, los anticuerpos o ligandos específicos de los marcadores de la superficie celular se marcan con distintas etiquetas fluorescentes. Las células son pasadas a través de un clasificador de células, permitiendo la separación de las células con base en su capacidad para unirse a los anticuerpos que se utilicen. Las partículas seleccionadas por FACS pueden ser directamente depositadas en pozos individuales de placas de 96 o 384 pozos para facilitar la separación y su clonación.

En un esquema de clasificación, las células madre placentarias , p. ej . , las PDAC, se clasifican con base en la expresión de uno o más de los marcadores CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD133, CD 166, CD200 y/o KDR; es decir, las células madre placentarias se clasifican con base en la expresión de uno o más de los marcadores CD44, CD73, CD90, CD 105, CD 166 o CD200, y/o la ausencia de expresión de CD34, CD45, CD133 o KDR. Esto se puede lograr junto con procedimientos para seleccionar tales células con base en sus propiedades de adherencia durante el cultivo. Por ejemplo, la selección de la adherencia al plástico para cultivo de tejido se puede lograr antes o después de la selección con base en la expresión de los marcadores. En una modalidad, por ejemplo, las células se clasifican primero con base en su expresión del marcador CD34; se retienen las células CD34" y las células CD34- que además son una o más de lo siguiente CD73+, CD90+ o CD200+ se separan de todas las demás células CD34". En otra modalidad, las células de placenta se clasifican con base en su expresión de CD200; por ejemplo, las células que presenten el marcador CD200 se separan para otro uso. Las células que expresan, p. ej . , el marcador CD200 pueden, en una modalidad especifica, ser además separadas con base en su expresión del marcador CD73 y/o CD105, o los epitopes que reconozcan los anticuerpos SH2, SH3 o SH4, o la ausencia de la expresión de CD34, CD38 o CD45. Por ejemplo, en otra modalidad, las células madre placentarias se clasifican por la expresión, o la ausencia de ésta, de los marcadores CD200, CD73, CD105, CD34, CD38 y CD45, y las células madre placentarias que sean CD200+, CD73+, CD105+, CD34", CD38" y CD45- se aislan de las demás células placentarias para otro uso.

Es posible utilizar la clasificación de las células para confirmar la identidad de una población de células madre placentarias . Por ejemplo, las células madre placentarias que se adhieren al plástico para cultivo de tejido, p. ej . , las PDAC, que se describen en la presente pueden ser cultivadas para uno o más pases, luego pueden ser recolectadas y se determinan las características de una muestra utilizando los anticuerpos para los marcadores CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, y/o CD200, para determinar si, p. ej . , el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de las células cultivadas son CD34", CD44+, CD45", CD73+, CD90+ ( CD105+ y/o CD200+.

En las modalidades específicas de cualquiera de las modalidades antes mencionadas de las células madre placentarias clasificadas, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de las células en una población celular que permanece después de la clasificación son células madre placentarias aisladas. Las células madre placentarias pueden ser clasificadas mediante uno o más de cualquiera de los marcadores que se describen en la Sección 5.2.2, anterior. En una modalidad específica, por ejemplo, las células placentarias que son: (1) adherentes para el plástico para cultivo de tejido, y (2) CD10+, CD34" y CD105+ se seleccionan de (es decir, se aislan de) otras células placentarias. En otra modalidad especifica, las células placentarias que son (1) adherentes al plástico para cultivo de tejido, y (2) CD10+, CD34", CD105+ y CD200+ se seleccionan de (es decir, se aislan de) otras células placentarias. En otra modalidad especifica, las células placentarias que son (1) adherentes al plástico para cultivo de tejido, y (2) CD10+, CD34", CD45", CD90+, CD105+ y CD200+ se seleccionan de (es decir, se aislan de) otras células placentarias. Sin embargo, no es necesario que las células madre placentarias sean seleccionadas de acuerdo con un marcador celular especifico o serie de marcadores celulares para que sean "aisladas".

Con respecto a la detección y/o análisis de acuerdo con la secuencia de nucleótidos de las células madre placentarias, las secuencias de los marcadores que se enlistan en la presente están a la disposición fácilmente en las bases de datos de acceso público como GenBank o EMBL.

Con respecto a la detección y selección en la que intervienen anticuerpos de las células madre placentarias, p. ej . , las células madre placentarias o las células multipotenciales placentarias, es posible utilizar cualquier anticuerpo, especifico para un marcador particular, en combinación con algún fluoróforo u otra etiqueta apropiada para la detección y selección de las células (p. ej . , la clasificación de las células activadas por fluorescencia) . Las combinaciones anticuerpo/fluoróforo para marcadores específicos pueden ser, más no se limitan a, isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con anticuerpos monoclonales contra HLA-G (disponible de Serotec, Raleigh, Carolina del Norte) , CD10 (disponible de BD Immunocytometry Systems, San José, California) , CD44 (disponible de BD Biosciences Pharmingen, San José, California) , y CD 105 (disponible de R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota); el conjugado ficoeritrina (PE) anticuerpos monoclonales contra CD44, CD200, CD117 y CD13 (BD Biosciences Pharmingen); el conjugado ficoeritrina-Cy7 (PE Cy7) anticuerpos monoclonales contra CD33 y CD10 (BD Biosciences Pharmingen) ; el conjugado aloficocianina (APC) -estreptavidina y anticuerpos monoclonales contra CD38 (BD Biosciences Pharmingen) ; y CD90 biotinado (BD Biosciences Pharmingen) . Otros anticuerpos que pueden utilizarse pueden ser, más no se limitan a, CD133-APC (Miltenyi), KDR-Biotina (CD309, Abcam) , Citokeratina-Fitc (Sigma o Dako) , HLA ABC-Fitc (BD) , HLA DR, DQ, DP-PE (BD), ß-2-microglobulina-PE (BD), CD80-PE (BD) y CD86-APC (BD) . Otras combinaciones de anticuerpo/etiqueta que pueden utilizarse incluye, más no se limita a, CD45-PerCP (proteina peridina clorofila) ; CD44-PE; CD10-F ( fluoresceina ) ; HLA-G-F y 7-amino-actinomicina-D (7-AAD) ; HLA-ABC-F; y similares. Esta lista no es exhaustiva, y también están disponibles en el comercio otros anticuerpos de otros proveedores.

Las células madre placentarias aisladas pueden ser ensayadas para detectar el marcador CD117 o CD133 empleando, por ejemplo, ficoeritrina-Cy5 (PE Cy5) conjugada a estreptavidina y biotina conjugada con anticuerpos monoclonales contra CD117 o CD133; sin embargo, con este sistema las células pueden aparecer positivas para el marcador CD117 o CD133, respectivamente, debido a un fondo relativamente alto.

Las células madre placentarias aisladas pueden ser marcadas con un anticuerpo para un solo marcador y pueden ser detectadas y/o seleccionadas. Las células madre placentarias también pueden ser simultáneamente marcadas con múltiples anticuerpos para diferentes marcadores.

En otra modalidad, es posible utilizar perlas magnéticas para separar las células, p. ej . , para separar células madre placentarias de otras células placentarias.

Las células pueden ser seleccionadas utilizando la técnica de clasificación de células activadas por magnetismo (MACS) , un método para separar partículas con base en su capacidad para unirse a las perlas magnéticas (de diámetro 0.5-100 m) . Es posible hacer una variedad de modificaciones útiles sobre las microesferas magnéticas, incluida la adición covalente del anticuerpo que reconozca específicamente una molécula de la superficie celular o hapteno particular. Las perlas entonces se mezclan con las células para hacer posible la unión. Las células después se pasan a través de un campo magnético para separar las células que tengan un marcador específico de la superficie celular. En una modalidad, estas células pueden ser luego asiladas y nuevamente mezcladas con las perlas magnéticas acopladas a un anticuerpo contra otros marcadores de la superficie celular. Nuevamente las células se pasan a través de un campo magnético, aislando las células que se unen a ambos anticuerpos. Estas células después pueden ser diluidas en cajas separadas, como pueden ser las jacas de microtitulación para el aislamiento clonal.

Las células madre placentarias aisladas también pueden ser caracterizadas y/o seleccionadas con base en la morfología celular y las características del crecimiento. Por ejemplo, las células madre placentarias aisladas pueden ser caracterizadas para que tengan, y/o seleccionadas con base en, p. ej . , un aspecto fibroblastoide durante el cultivo. Las células madre placentarias aisladas también pueden ser caracterizadas para tener y/o ser seleccionadas, con base en su capacidad para formar cuerpos tipo embrioide. En una modalidad, por ejemplo, las células madre placentarias que son de forma fibroblastoide, expresan CD73 y CD105, y producen uno o más anticuerpos tipo embrioide en cultivo se aislan de otras células placentarias. En otra modalidad, las células madre placentarias OCT-4+ que producen uno o más cuerpos tipo embrioide en cultivos se aislan de otras células placentarias.

Es posible evaluar en las células madre placentarias aisladas la viabilidad, potencial de proliferación y longevidad empleando las técnicas normalizadas conocidas en la materia, como puede ser el ensayo de exclusión con azul de tripano, el ensayo de captación de diacetato de fluoresceina, el ensayo de captación de yoduro de propidio (para valorar la viabilidad) ; y el ensayo de captación de timidina, el ensayo de proliferación celular con MTT (bromuro de 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-difeniltetrazolio) (para evaluar la proliferación) . Se puede determinar la longevidad mediante los métodos bien conocidos en la materia, como puede ser determinando el número máximo de duplicación de la población en un cultivo extendido.

Las células madre placentarias aisladas, p. ej . , las células madre placentarias aisladas que se describen en la Sección 5.2.2, anterior, también pueden ser separadas de otras células placentarias utilizando otras técnicas conocidas en la materia, p. ej . , el crecimiento selectivo de las células deseadas (selección positiva) , la destrucción selectiva de células no deseadas (selección negativa) ; la separación con base en la capacidad de aglutinación diferencial de las células en la población mixta, por ejemplo, con aglutinina de soya; los procedimientos de congelación-descongelación; filtración; centrifugación tradicional y zonal; elutriación centrifuga (centrifugación a contracorriente) ; separación por gravedad unitaria; distribución a contracorriente; electroforesis ; y similares. 5.4 CULTIVO DE LAS CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS AISLADAS 5.4.1 Medios de cultivo Las células placentarias aisladas, o el tejido placentario del cual crecen las células madre placenterías, pueden utilizarse para iniciar, o sembrar, cultivos de células madre placentarias . Generalmente las células son transferidas a recipientes estériles para el cultivo de tejido no recubiertas o recubiertas con matriz extracelular o ligandos como laminina, colágeno (p. ej . , natural o desnaturalizado) , gelatina, fibronectina, ornitina, vitronectina y proteína de la membrana extracelular (p. ej . , MATRIGEL® (BD Discovery Labware, Bedford, Mass.)). Es posible utilizar procedimientos semejantes para el cultivo de las BM-MSC.

Las células placentarias aisladas, p. ej . , las células madre placentarias aisladas, pueden ser cultivadas en cualquier medio y bajo cualquiera de las condiciones reconocidas en la técnica como aceptadas para el cultivo de células, p. ej . , de células madre. Preferentemente, el medio de cultivo contiene suero, p. ej . , suero bovino, suero humano o similares. Las células madre placentarias aisladas pueden ser cultivadas, por ejemplo, en DMEM-LG (Medio Esencial Modificado de Dulbecco, con baja concentración de glucosa) /MCDB 201 (medio basal de fibroblastos de pollo) que contenga ITS (insulina-transferrina-selenio) , LA+BSA (ácido linoléico-albúmina sérica de bovino) , dexametasona, ácido L-ascórbico, PDGF, EGF, IGF-1 y penicilina/estreptomicina; DMEM-HG (con alto contenido de glucosa) que contenga 10% de suero fetal bovino (FBS) ; DMEM-HG que contenga 15% de FBS; IMDM (Medio de Dulbecco modificado de Iscove) que contenga 10% de FBS , 10% de suero de caballo e hidrocortisona; M199 que contenga 1% a 20% de FBS, EGF y heparina; a-MEM (medio mínimo esencial) que contenga 10% de FBS , GLUTAMAX™ y gentamicina; DMEM que contenga 10% de FBS, GLUTAMAX™ y gentamicina, etcétera.

Otros medios que pueden utilizarse para cultivar células madre placentarias pueden ser DMEM (con alto o bajo contenido de glucosa), medio basal de Eagle, medio FIO de Ham (FIO), medio F12 de Ham (F12), medio de Dulbecco modificado de Iscove, medio de crecimiento de células madre mesenquimales (MSCGM) , medio L15 de Liebovitz, MCDB, DMEM/F12. RPMI 1640, DMEM avanzado (Gibco) , DMEM/MCDB201 (Sigma) , y CELL-GRO FREE.

El medio de cultivo puede ser suplementado con uno o más componentes, como puede ser, por ejemplo, suero (p. ej . , suero bovino fetal (FBS), preferentemente alrededor de 2-15% (v/v) ; suero equino (de caballo) (ES) ; suero humano (HS) ) ; beta-mercaptoetanol (BME) , preferentemente alrededor de 0.001% (v/v); uno o más factores de crecimiento, por ejemplo, el factor de crecimiento obtenido de plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento epidermal (EGF) , factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) , el factor de crecimiento tipo insulina 1 (IGF-1), el factor inhibidor de leucemia (LIF) , el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , y eritropoyetina (EPO) ; aminoácidos como L-valina; y uno o más compuestos antibióticos y/o antimicóticos para controlar la contaminación microbiana, como puede ser, por ejemplo, penicilina G, sulfato de estreptomicina, anfotericina B, gentamicina y nistatina, solos o en combinación .

En algunas modalidades, las células madre placentarias apropiadas para utilizarlas en los métodos que se describen en la presente pueden ser cultivadas en un medio que contenga medio DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS, p. ej . , 1.9% de FBS v/v) , ácido linoléico-albúmina (p. e . , 0.01% v/v) (Sigma) , insulina-transf rrina-selenio (0.97% v/v) (Invitrogen, Carlsbad, CA) , gentamicina (p. ej . , 48 [mu]g/mL) (Invitrogen), la sal sesquimagnesio 2-fosfato de ácido L-ascórbico (p. ej . , 97 µ? (Sigma), dexametasona 48 nM (Sigma), PDGF-BB humano recombinante (p. ej . , 9.7 ng/mL) (Invitrogen), y EGF humano recombinante (p. ej . , 9.7 ng/mL) (Invitrogen) .

Las células madre placentarias aisladas pueden ser cultivadas en condiciones normales para cultivo de tejido, p. ej . , en cajas para cultivo de tejido o placas de múltiples pozos. Las células madre placentarias aisladas también pueden ser cultivadas utilizando el método de la gota pendiente. En este método, las células madre placentarias aisladas se suspenden a aproximadamente 1 x 104 células por mL en aproximadamente 5 mL de medio, y una o más gotas del medio se colocan en el interior de la tapa de un envase para cultivo de tejido, p. e . , una caja de Petri de 100 mL. Las gotas pueden ser, p. ej . , gotas individuales o múltiples gotas de, p. ej . , un pipeteador de múltiples canales. La tapa se invierte cuidadosamente y se coloca sobre la base de la caja la cual contiene un volumen de liquido, p. ej . , suficiente PBS estéril para conservar un contenido de humedad en la atmósfera de la caja, y se cultivan las células madre placentarias.

En una modalidad, las células madre placentarias aisladas se cultivan en presencia de un compuesto que actúe para mantener un fenotipo no diferenciado de las células madre placentarias aisladas. En este sentido, "no diferenciado" no requiere la no diferenciación completa, p. ej . , comprende un fenotipo relativamente no diferenciado en comparación con las células en las que se termina la diferenciación o se provoca la diferenciación de las células madre placentarias para que expresen una o más características de la célula diferenciada hasta su término. En una modalidad específica, el compuesto es una 3, -dihidropiridimol [4 , 5-d] pirimidina sustituida. En otra modalidad específica, el compuesto es un compuesto que tenga la siguiente estructura química: Es posible poner en contacto el compuesto con las células madre placentarias aisladas a una concentración de, por ejemplo, entre aproximadamente 1 µ? hasta aproximadamente 10 µ?. 5.4.2 Expansión y proliferación de las células madre placentarias Una vez que las células madre placentarias han sido aisladas (p. ej . , separadas de al menos 50% de las células placentarias con las cuales las células madre placentarias están normalmente asociadas in vivo) , las células o la población de las células pueden ser proliferadas y expandidas in vitro. Por ejemplo, las células madre placentarias aisladas pueden ser cultivadas en envases para cultivo de tejido, p. ej . , cajas, frascos, placas multipozos o similares, durante un tiempo suficiente para que las células proliferen hasta 70-90% de confluencia, es decir, hasta que las células y su progenie ocupen el 70-90% del área de superficie del envase para el cultivo de tejido.

Las células madre placentarias aisladas pueden ser sembradas en recipientes para cultivo a una densidad que permita el crecimiento de las células. Por ejemplo, las células pueden ser sembradas a baja densidad (p. ej . , aproximadamente 1,000 a aproximadamente 5,000 células/cm2) hasta alta densidad (p. ej . , aproximadamente 50,000 o más células/cm2). En una modalidad preferida, las células se cultivan en presencia de aproximadamente 0 hasta aproximadamente 5 por ciento en volumen de C02 en aire. En algunas modalidades preferidas, las células se cultivan a aproximadamente 2 hasta aproximadamente 25 por ciento de 02 en aire, preferentemente alrededor de 5 hasta aproximadamente 20 por ciento de O2 en aire. Preferentemente las células se cultivan a aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 40°C, preferentemente 37°C. Preferentemente las células se cultivan en un incubador. El medio de cultivo puede ser estático o con agitación, por ejemplo, utilizando un biorreactor. Las células madre placentarias, en algunas modalidades, son crecidas en condiciones de bajo estrés oxidante (p. ej . , con adición de glutation, ácido ascórbico, catalasa, tocoferol, N-acetilcisteina o similares) .

Una vez que se obtiene la confluencia de menos de 100%, por ejemplo, 70% hasta 90% es posible hacer el pase de las células. Por ejemplo, las células pueden ser tratadas con enzimas, p. ej . , tripsinizadas, utilizando las técnicas bien conocidas, para separarlas de la superficie para el cultivo de tejido. Después de separara las células por pipeteo y contar las células, se pasan aproximadamente 10,000-100,000 células/cm2 a un nuevo envase para cultivo que contenga medio de cultivo fresco. Por lo regular, el nuevo medio es del mismo tipo que el medio del cual las células madre placentarias aisladas fueron separadas. Las células^ madre placentarias aisladas pueden ser pasadas alrededor, al menos o no más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 veces, o más. 5.4.3 Poblaciones de células madre placentarias aisladas También se proporciona en la presente poblaciones de células madre placentarias aisladas, p. ej . , las células madre placenterías aisladas que se describen en la Sección 5.2.2, anterior, útiles en los métodos y las composiciones que se describen en la presente. Las poblaciones de células madre placenterías aisladas pueden ser aisladas directamente desde una o más placentas; es decir, la población de células puede ser una población de células placentarias que contengan las células placentarias aisladas, en donde las células madre placentarias aisladas se obtienen de, o están contenidas dentro de, el perfundido, o se obtienen desde o están contenidas dentro del tejido placentario roto, p. ej . , el tejido placentario digerido (es decir, la recolección de células obtenida por digestión enzimática de una placenta o parte de ésta) . Las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente también pueden ser cultivadas y expandidas para producir poblaciones de las células madre placentarias aisladas. Las poblaciones de las células placentarias que contienen las células madre placentarias aisladas también pueden ser cultivadas y expandidas para producir poblaciones de células madre placentaria .

Las poblaciones de células madre placentarias útiles en los métodos de tratamiento que se proporcionan en la presente contienen las células madre placentarias aisladas, por ejemplo, las células madre placentarias aisladas como se describe en la Sección 5.2.2 en la presente. En algunas modalidades, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las células en una población de células placentarias son las células madre placentarias aisladas. Es decir, una población de las células placentarias aisladas puede contener, p. ej . , tanto como 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% de células que no sean las células madre placentarias aisladas.

Las poblaciones de células placentarias aisladas que contienen las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente pueden ser producidas, p. ej . , seleccionando las células placentarias aisladas, sean obtenidas por digestión enzimática o perfusión, que expresen marcadores particulares y/o características del cultivo o morfológicas específicas. En algunas modalidades, por ejemplo, en la presente se proporciona un método para producir una población de células seleccionando las células placentarias que contienen las células madre placentarias que: (a) se adhieran a un sustrato, y (b) expresen uno cualesquiera o cualquier combinación de los marcadores para citometría de flujo y/o las características de expresión génica que se describen en la presente, p. ej . , en la Sección 5.2, anterior.

En otro aspecto, las poblaciones de células madre placentarias, p. ej . , las células madre placentarias descritas en la Sección 5.2, anterior, pueden ser producidas seleccionando para determinar las características de la expresión del marcador y la capacidad de la población de las células madre placentarias, p. ej . , una muestra de la población de las células madre placentarias, para suprimir, p. ej . , suprimir de manera que pueda detectarse, la proliferación de las células de un cáncer relacionado con el hueso. En algunas modalidades, las células de un cáncer relacionado con el hueso son células de mieloma múltiple, células de condrosarcoma, células de cáncer óseo, células de neuroblastoma, células de osteosarcoma, células de sarcoma de Ewing, células de cordoma, histiocitoma fibroso maligno de células óseas, células de cáncer prostático, o fibrosarcoma de células de hueso. Una selección como esta puede ser utilizada, por ejemplo, para diferentes poblaciones de células madre placentarias, p. ej . , lotes de células madre placentarias con el fin de identificar a las poblaciones que satisfagan, por ejemplo, algunos criterios previamente determinados para la eficacia.

La selección de las poblaciones celulares que contienen células madre placentarias que tengan cualquier combinación de marcadores descritas en la Sección 5.2.2, anterior, pueden ser aisladas u obtenidas del mismo modo.

Cualquiera de las modalidades anteriores, la selección de las poblaciones de células aisladas puede además consistir en la selección de células madre placentarias que expresen ABC-p (una proteina transportadora ABC especifica de la placenta; véase, p. ej., Allikmets et al., Cáncer Res. 58 (23) : 5337-9 (1998)). El método también puede consistir en la selección de células que presenten al menos una característica específica para, p. e . , una célula madre mesenquimal, por ejemplo, la expresión de CD44, la expresión de CD90 o la expresión de una combinación de las anteriores.

En las modalidades antes mencionadas, el sustrato puede ser cualquier superficie sobre la cual se pueda lograr el cultivo y/o la selección de las células, p. e . , de las células madre placentarias aisladas. Por lo regular, el sustrato es plástico, p. ej . , el plástico de una caja para cultivo de tejido o de una placa de múltiples pozos. El plástico para el cultivo de tejido puede estar recubierto con una biomolécula, p. ej . , laminina o fibronectina .

Las células madre placentarias aisladas pueden ser seleccionadas por cualquiera de los medios conocidos en la materia para la selección de las células. Por ejemplo, las células pueden ser seleccionadas utilizando un anticuerpo o anticuerpos para uno o más marcadores de la superficie celular, por ejemplo, en citometria de flujo o FACS. Los anticuerpos específicos para ciertos marcadores relacionados con las células madre se conocen en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos para OCT-4 (Abcam, Cambridge, MA) , CD200 (Abcam), HLA-G (Abcam), CD73 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) , CD 105 (Abcam; BioDesign International, Saco, ME), etc. Los anticuerpos para otros marcadores también están disponibles en el comercio, p. ej . , CD34, CD38 y CD45 están a la disposición de, p. ej . , StemCell Technologies o BioDesign International.

Las poblaciones de célula madre placentaria aisladas pueden contener células placentarias que no sean células madres, o células que no sean células placentarias.

Las poblaciones de células madre placentarias que se proporcionan en la presente pueden combinarse con una o más poblaciones de célula no madre o células no placentarias. Por ejemplo, una población de células madre placentarias aisladas puede combinarse con sangre (p. ej . , sangre placentaria o sangre del cordón umbilical), células madre obtenidas de sangre (p. ej . , células madre obtenidas de sangre placentaria o de sangre de cordón umbilical) , células madre de cordón umbilical, poblaciones de células nucleadas obtenidas de sangre, células mesenquimales obtenidas de médula ósea, poblaciones de células madre obtenidas de hueso, médula ósea cruda, células madre adultas (somáticas) , poblaciones de células madre contenidas dentro de tejido, células madre cultivadas, poblaciones de células completamente diferencias (p. ej . , condrocitos, fibroblastos, células amnióticas, osteoblastos , células musculares, células cardiacas, etc.) y similares. En una modalidad especifica, una población de células útiles en los métodos y las composiciones que se describen en la presente contienen células madre placentarias aisladas y células madre de cordón umbilical aisladas. Las células de una población de células madre placentarias aisladas pueden ser combinadas con una pluralidad de células de otro tipo en proporciones de aproximadamente 100,000,000:1, 50,000,000:1, 20,000,000:1, 10,000,000:1, 5,000,000:1, 2,000,000:1, 1,000,000:1, 500,000:1, 200,000:1, 100,000:1, 50,000:1, 20,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 2,000:1, 1,000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1; 1:2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1,000; 1:2,000; 1:5,000; 1:10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1:500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000; o aproximadamente 1:100,000,000, comparando los números de las células nucleadas totales en cada población. Las células de una población de células madre placentarias aisladas pueden ser combinadas con una pluralidad de células de una pluralidad de tipos de células también.

En una modalidad, una población aislada de células madre placentarias se combina con una pluralidad de células madre hematopoyéticas . Estas células madre hematopoyéticas pueden estar, por ejemplo, contenidas dentro de una placenta no procesada, sangre de cordón umbilical o sangre periférica; en células nucleadas totales de sangre periférica, sangre de cordón umbilical o sangre periférica; en una población aislada de células CD34+ de sangre placentaria, sangre de cordón umbilical o sangre periférica; en médula ósea no procesada; en células nucleadas totales de médula ósea; en una población aislada de células CD34+ de médula ósea, o similares .

En otras modalidades, una población de las células madre placentarias que se describen en la presente, p. ej . , las PDAC descritas en la Sección 5.2.2, anterior, se combina con células adherentes placentarias osteoqénicas (las OPAC), p. ej . , las OPAC que se describen en la Solicitud de Patente U.S. No. 2010/0047214, la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En otras modalidades, una población de las células madre placentarias que se describen en la presente, p. ej . , las PDAC descritas en la Sección 5.2.2, anterior, se combina con perfundido placentario y/o células asesinas naturales, p. ej . , las células asesinas naturales del perfundido placentario, p. ej . , células asesinas naturales intermedias placentarias, p. ej . , como están descritas en la Publicación de la Solicitud de Patente U.S. No .2009/0252710 , la descripción de la cual se incorpora por este medio para referencia en su totalidad. 5.5 PRESERVACIÓN DE LAS CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS Las células madre placentarias aisladas, p. ej . , las células madre placentarias aisladas que se describen en lo anterior, pueden ser preservadas, es decir, colocadas en condiciones que permitan su almacenamiento durante largo plazo o condiciones que inhiban la muerte celular por, p. e . , apoptosis o necrosis.

Las células madre placentarias pueden ser preservadas empleando, p. ej . , una composición que contenga un inhibidor de la apoptosis, inhibidor de necrosis y/o un perfluorocarburo portador de oxigeno, como está descrito en la Publicación de la Solicitud U.S. relacionada No. 2007/0190042, la descripción de la cual se incorpora por este medio para referencia en su totalidad. En una modalidad, un método para preservar una población de células, p. ej . , las células madre placentarias, consiste en poner en contacto la población de las células con una composición para la recolección de las células que contenga un inhibidor de la apoptosis y un perfluorocarburo portador de oxigeno, en donde el inhibidor de apoptosis está presente en una cantidad y durante un tiempo suficiente para disminuir o evitar la apoptosis en la población de células, en comparación con una población de células que no se ponga en contacto con el inhibidor de la apoptosis. En una modalidad especifica, el inhibidor de la apoptosis es un inhibidor de caspasa. En otra modalidad especifica, el inhibidor de apoptosis es un inhibidor de JNK. En otra modalidad especifica, el inhibidor de JNK nom modula la diferenciación o proliferación de las células. En otra modalidad, la composición para la recolección de las células contiene el inhibidor de la apoptosis y el perfluorocarburo portador de oxigeno en fases separadas. En otra modalidad, la composición para la recolección de las células contiene el inhibidor de la apoptosis y el perfluorocarburo portador de oxigeno en una emulsión. En otra modalidad, la composición para la recolección de las células además contiene un emulsificador, p. ej . , lecitina. En otra modalidad, el inhibidor de apoptosis y el perfluorocarburo están a una temperatura entre aproximadamente 0°C y aproximadamente 25°C en el momento de hacer contacto con las células. En otra modalidad especifica, el inhibidor de la apoptosis y el perfluorocarburo están a una temperatura entre aproximadamente 2°C y 10°C, o entre aproximadamente 2°C y aproximadamente 5°C, en el momento de hacer contacto con las células. En otra modalidad especifica, el contacto se hace durante el transporte de la población de las células. En otra modalidad especifica, el contacto se hace durante la congelación y descongelación de la población de células, p. ej . , de las células madre placentarias .

Las poblaciones de placentarias [sic] útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente, las células pueden ser preservadas, p. ej . , por un método que consista en poner en contacto la población de las células con un inhibidor de apoptosis y un compuesto preservador 'de órganos, en donde el inhibidor de la apoptosis estará presente en una cantidad y durante un tiempo suficiente para disminuir o prevenir la apoptosis en la población de las células, en comparación con una población de células que no se ponga en contacto con el inhibidor de la apoptosis. En una modalidad especifica, el compuesto preservador de órganos es solución UW (p. ej . , como está descrito en la Patente U.S. No. 4,798,824; también conocida como ViaSpan; véase también Southard et al., Transplanta tion 49 (2) :251-257 (1990)) o una solución descrita en Stern et al., Patente U.S. No. 5,552,267, la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad. En otra modalidad, el compuesto preservador de órganos es hidroxietil almidón, ácido lactobiónico , rafinosa o una combinación de éstos. En otra modalidad, la composición para la recolección de las células además contiene un perfluorocarburo portador de oxigeno, en dos fases o como una emulsión.

En otra modalidad del método, las células madre placentarias se ponen en contacto con una composición para la recolección de las células que contenga un inhibidor de la apoptosis y perfluorocarburo portador de oxigeno, compuesto preservador de órganos o combinación de éstos, durante la perfusión. En otra modalidad, las células se ponen en contacto durante un proceso de rompimiento de tejido, p. ej . , durante la digestión enzimática. En otra modalidad, las células madre placentarias se ponen en contacto con el compuesto para la recolección de células después de la recolección por perfusión, o después de la recolección por rompimiento de tejido, p. ej . , digestión enzimática.

Por lo regular, durante la recolección de las célula madre placentarias, enriquecimiento y aislamiento, es preferible llevar al mínimo o eliminar el estrés de las células por hipoxia y estrés mecánico. En otra modalidad del método, por tanto, una célula o población de células, p. ej . , células madre placentarias, se expone a una condición hipóxica durante la recolección, enriquecimiento y aislamiento durante menos de seis horas durante la preservación, en donde la condición hipóxica es una concentración de oxígeno que sea menor que la concentración normal de oxígeno en sangre. En otra modalidad específica, la población de células se expone a la condición hipóxica durante menos de dos horas durante la preservación. En otra modalidad específica, la población de células se expone a condición hipóxica durante menos de una hora, o menos de treinta minutos, o no se expone a una condición hipóxica, durante la recolección, enriquecimiento o aislamiento. En otra modalidad específica, la población de células no se expone a estrés por cizallamiento durante la recolección, enriquecimiento o aislamiento.

Las células madre placentarias pueden ser criopreservadas, p. ej . , en un medio para criopreservación en envases pequeños, p. ej . , en ámpulas. El medio para criopreservación apropiado puede ser, más no se limita a, medios de cultivo que consistan en, p. ej . , medio de crecimiento o medio para la congelación de las células, por ejemplo medio para congelación de células disponible en el comercio, p. ej . , C2695, C2639 o C6039 (Sigma) . El medio para la criopreservación preferentemente contiene DMSO (dimetilsulfóxido) , a una concentración de aproximadamente 2% hasta aproximadamente 15% (v/v) , p. ej . , aproximadamente 10% (v/v) . El medio para la criopreservación puede contener otros compuestos, por ejemplo, metilcelulosa y/o glicerol. Preferentemente, las células madre placentarias se enfrían a aproximadamente l°C/min durante la criopreservación . La criopreservación se puede hacer poniendo las células a una temperatura de aproximadamente -80°C hasta aproximadamente -180°C, preferentemente aproximadamente -125°C hasta aproximadamente -140°C. Las células criopreservadas pueden pasarse a nitrógeno líquido antes de la descongelación para su uso. En algunas modalidades, por ejemplo, una vez que las ámpulas han alcanzado aproximadamente -90°C, estas se pasan a un área de almacenamiento de nitrógeno líquido. La criopreservación también se puede hacer utilizando un congelador con velocidad regulada. Las células criopreservadas preferentemente se descongelan a una temperatura de aproximadamente 25°C hasta aproximadamente 40°C, preferentemente a una temperatura de alrededor de 37°C.

Las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea pueden ser preservadas mediante cualquiera de los métodos antes mencionados también. 5.6 COMPOSICIONES QUE CONTIENEN CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS AISLADAS Las células madre placentarias que se describen en la presente, p. ej . , en la Sección 5.2.2, se pueden combinar con cualquier compuesto, composición o dispositivo aceptado para uso fisiológico o para uso médico para utilizarlo en los métodos y composiciones que se describen en la presente. En algunas modalidades, la composición es una composición aceptada para uso farmacéutico, p. ej . , una composición que contenga células madre placentarias en un portador aceptado para uso farmacéutico. Cualquiera de las composiciones que se describen en la presente además pueden contener células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea, aisladas, o médula ósea que contenga BM-MSC, p. ej . , las BM- SC descritas en la Patente U.S. No. 5,486,359.

En algunas modalidades, una composición que contenga las células madre placentarias aisladas además contiene una matriz, p. ej . , una matriz descelularizada o una matriz sintética. En otra modalidad especifica, la matriz es un andamio tridimensional. En otra modalidad especifica, la matriz consiste en colágeno, gelatina, laminina, fibronectina, pectina, ornitina o vitronectina . En otra modalidad especifica, la matriz es una membrana amniótica o un biomaterial obtenido de membrana amniótica. En otra modalidad especifica, la matriz consiste en una proteina de membrana extracelular . En otra modalidad especifica, la matriz consiste en un compuesto sintético. En otra modalidad especifica, la matriz consiste en un compuesto bioactivo. En otra modalidad especifica, el compuesto bioactivo es un factor de crecimiento, citocina, anticuerpo o molécula orgánica de menos de 5,000 daltons.

En otra modalidad, una composición útil en los métodos de tratamiento que se proporcionan en la presente consiste en un medio acondicionado por cualquiera de las células madre placentarias antes mencionadas, o cualquiera de las poblaciones de células madre placentarias antes mencionadas. 5.6.1 Células criopreservadas Las células madre placentarias aisladas útiles en los métodos y composiciones que se describen en la presente pueden ser preservadas, por ejemplo, criopreservadas para uso posterior. Los métodos para la criopreservación de las células, como pueden ser las células madre, son bien conocidos en la técnica. Las poblaciones de células madre placentarias aisladas pueden ser preparadas en una forma que se pueda administrar fácilmente a un individuo, p. ej . , una población de células madre placentarias aisladas que esté contenida dentro de un envase que sea apropiado para uso médico. Un envase como éste puede ser, por ejemplo, una jeringa, bolsa de plástico estéril, frasco, matraz u otro envase del cual se pueda dosificar fácilmente la población de células placentarias aisladas. Por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de sangre u otra bolas de plástico aceptada para uso médico apropiada para la administración intravenosa de un liquido a un recipiendario. El envase preferentemente es uno que permita la criopreservación de las células madre placentarias aisladas.

Las células madre placentarias aisladas, criopreservadas pueden contener células placentarias aisladas obtenidas de un solo donante o de múltiples donantes. La población de células madre placentarias aisladas puede ser completamente compatible con el HLA para un recipiendario propuesto, o parcial o completamente no compatible con el HLA.

Asi pues, en una modalidad, las células madre placentarias aisladas pueden utilizarse en los métodos que se describen en la presente en forma de una composición que contenga una población de células madre placentarias que se adhiera al plástico del cultivo de tejido en un envase. En una modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas son criopreservadas.

En otra modalidad especifica, el envase es una bolsa, matraz o frasco. En otra modalidad especifica, la bolsa es una bolsa de plástico estéril. En otra modalidad especifica, la bolsa es apropiada para, permite o facilita la administración intravenosa de la población de de células madre placentarias aisladas, p. ej . , por infusión intravenosa. La bolsa puede tener múltiples luces o compartimientos que estén interconectados para permitir el mezclado de las células madre placentarias aisladas y una o más de otras soluciones, p. ej . , un medicamento, antes de o durante la administración. En otra modalidad especifica, la composición contiene uno o más compuestos que faciliten la criopreservación de las células madre placentarias. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas están contenidas dentro de una solución acuosa aceptada para uso fisiológico. En otra modalidad especifica, la solución acuosa aceptada para uso fisiológico es una solución de NaCl al 0.9%. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas contienen células madre placentarias que son compatibles con el HLA para un recipiendario de las células madre placentarias. En otra modalidad especifica, la población de células combinada contiene células madre placentarias que sean al menos parcialmente no compatibles con el HLA del recipiendario de las células madre placentarias. En otra modalidad especifica, las células madre placentarias aisladas se obtienen de una pluralidad de donantes.

En algunas modalidades, las células madre placentarias aisladas en el envase son cualquiera de las células madre placentarias aisladas que se describen en la Sección 5.2.2 de la presente, en donde las células han sido criopreservadas y están contenidas dentro de un envase.

En una modalidad especifica de cualquiera de las células madre placentarias aisladas, criopreservadas antes mencionadas, el envase es una bolsa. En algunas modalidades especificas, el envase contiene alrededor, al menos o no más de 1 x 106 de las células madre placentarias aisladas, 5 x 106 de las células madre placentarias aisladas, 1 x 107 de las células madre placentarias, 5 x 107 de las células madre placentarias aisladas, 1 x 108 de las células madre placentarias aisladas, 5 x 108 de las células madre placentarias aisladas, 1 x 109 de las células madre placentarias aisladas, 5 x 109 de las células madre placentarias aisladas, 1 x 1010 de las células madre placentarias aisladas o 1 x 1010 de las células madre placentarias aisladas. En otras modalidades especificas de cualquiera de las poblaciones criopreservadas antes mencionadas, las células madre placentarias han sido pasadas alrededor, al menos o no más de 5 veces, no más de 10 veces, no más de 15 veces o no más de 20 veces. En otra modalidad especifica de cualquiera de las células madre placentarias aisladas, criopreservadas, antes mencionadas, las células madre placentarias aisladas han sido expandidas dentro del envase. 5.6.2 Células madre placentarias genéticamente modificadas Además se proporcionan en la presente células madre placentarias, en donde las células madre placentarias han sido genéticamente modificadas para producir citocinas recombinantes o exógenas asociadas con la supresión del tumor. Por ejemplo, en algunas modalidades, las células madre placentarias son modificadas para expresar cantidades detectables de proteina exógena, en donde la proteina exógena es una o más de las siguientes: una proteina morfogenética de hueso (BMP) , activina A, osteonectina, osteoprotegerina o una conexina. Las secuencias que codifican activina A pueden encontrarse, p. ej . , en el No. de acceso GenBank NM_002191. Las secuencias que codifican osteonectina pueden encontrarse, p. ej . , en el No. de acceso GenBank NM_0031 18. Las secuencias que codifican osteoprotegerina pueden encontrarse, p. e . , en el No. de acceso GenBank NM_002546.

En las modalidades especificas, la conexina es conexina 26 (Cx26) o conexina 43 (Cx43). Las secuencias que codifican Cx26 o Cx43 pueden encontrarse, p. ej . , en los Nos. de acceso de GenBank NM_004004 y NM_000165, respectivamente.

En las modalidades especificas, la proteina morfogenética de hueso es una o más de: BMP1 (proteina morfogenética de hueso 1), BMP2, BMP3, BMP4, B P5, BMP6, BMP7, BMP8a, B P8b, BMP9 (GDF2; Factor de diferenciación del crecimiento 2), BMF10, BMP11 (GDF11), BMP 12 (GDF7), BMP13 (GDF6), BMP14 (GDF5) , o BMP15, o cualquier combinación de éstos. Las secuencias que codifican las BMP pueden encontrase, p. ej . , en GenBank, p. ej . , en el No. de acceso GenBank NM_001199 (BMP1) , NM_001200 (BMP2) , NM_001201 (BMP3), NM_001202 (BMP4), NM_021073 (BMP5), NM_021073 (BMP6), NM_001719 (BMP7), NM_181809 (BMP8a) , NMJ301720 (BMP8b) , NM_016204 (BMP9/GDF2), NM_014482 (BMP10) , NM_005811 (BMP11/GDF11) , NM_182828 (BMP12/GDF7 ) , NM_001001557 (BMP13/GDF6) , NM 000557 (BMP14/GDF5) o NM 005448 (BMP15) .

En otras modalidades, en la presente se proporcionan las células madre placentarias aisladas, en donde las células madre placentarias se modifican para expresar IFN-ß o IL-2 exógenas. En una modalidad especifica, las células madre placentarias expresan IFN-ß o IL-2 exógenas en una cantidad que da como resultado una supresión mayor, p. ej . , detectablemente mayor de la proliferación de las células tumorales, en donde las células tumorales se ponen en contacto con las células madre placentarias, en comparación con las células madre placentarias que no expresan IFN-ß o IL-2 exógeno.

Es posible utilizar los métodos para la modificación genética de las células, por ejemplo con vectores retrovirales , vectores adenovirales , vectores virales adeno-asociados , polietilen glicol u otros métodos conocidos para los expertos en la técnica. Estos consisten en el uso de vectores de expresión que transporten y expresen moléculas de ácido nucleico en las células. (Véase Geoddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)). Un DNA vector puede ser introducido en células procariotas o eucariotas mediante técnicas tradicionales de transformación o transíección . Los métodos apropiados para transformación o transfección de células hospederas pueden encontrarse en Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989), y otros libros de texto de laboratorio.

Las células madre placentarias pueden ser genéticamente modificadas introduciendo DNA o RNA en la célula, p. e . , DNA o RNA que codifique para una proteina que interese, por los métodos que consisten en transferencia viral, incluido el uso de vectores virales de DNA o RNA, como pueden ser retrovirus (asi como lentivirus), virus de simio 40 (SV40), adenovirus, virus Sindbis y papilomavirus bovino, por ejemplo; transferencia química, que incluye los métodos de transfección de fosfato de calcio y transfección de DEAE dextrano; transferencia por fusión de membrana utilizando vesículas de membrana cargadas con DNA, como pueden ser liposomas, fantasmas de eritrocitos y protoplastos , por ejemplo; o técnicas de transferencia física, como puede ser la microinyección, electroporacion o transferencia de DNA desnudo. Las células madre placentarias pueden ser genéticamente alteradas por inserción de DNA exógeno o por sustitución de un segmento del genoma celular con DNA exógeno. La inserción de la(s) secuencia (s) de DNA exógeno se puede hacer, p. ej . , por recombinación homologa o por integración viral en el genoma de la célula hospedera, o por incorporación del DNA en la célula, particularmente en su núcleo, utilizando un vector de expresión plásmido y una secuencia de localización nuclear. El DNA puede contener uno o más promotores que permitan la inducción positiva o negativa de la expresión de la proteina que interese utilizando ciertas sustancias químicas/fármacos, p. e . , tetraciclina; los promotores pueden, en otras modalidades, ser constitutivos.

Puede utilizarse transfección de fosfato de calcio para introducir, p. ej . , DNA plásmido que contenga una secuencia de polinucleótidos que codifique la proteina que interesa, en una célula, p. ej . , una célula madre placentaria. En ciertas modalidades, el DNA se combina con una solución de cloruro de calcio, luego se adiciona a una solución amortiguada de fosfatos. Una vez que se ha formado un precipitado, la solución se adiciona directamente a las células cultivadas. El tratamiento con DMSO o glicerol puede utilizarse para mejorar la eficiencia de la transfección, y es posible mejorar los niveles de transíectantes estables empelando etansulfonato de bis-hidroxietilamino (BES) . En el comercio están disponibles sistemas de transfección de fosfato de calcio (p. e . , PROFECTION®, Promega Corp., Madison, is.). También es posible utilizar transfección de DEAE-dextrano.

Las células madre placentarias aisladas también pueden ser genéticamente modificadas por microinyección . En algunas modalidades, una micropipeta de vidrio es guiada hacia el núcleo de las células bajo un microscopio óptico para inyectar el DNA o RNA.

Las células madre placentarias también pueden ser genéticamente modificadas utilizando electroporación . En algunas modalidades, se adiciona DNA o RNA a una suspensión de células cultivadas, y la suspensión de DNA/RNA-célu 1 as se coloca entre dos electrodos y se somete a un impulso eléctrico ocasionando una permeabilidad transitoria en la membrana externa de las células que se manifiesta por la presencia de poros a través de la membrana.

El suministro liposomal de DNA o RNA para hacer la modificación genética de las células se puede hacer con liposomas catiónicos, como una opción, que contengan dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) o dioleoil fosfatidilcolina (DOPC), p. ej . , LIPOFECTIN® (Life Technologies, Inc.). Otros sistemas de suministro que están a la disposición en el comercio pueden ser EFFECTENE (TM) (Qiagen) , DOTAP (Roche Molecular Biochemicals) , FUGENE 6 (TM) . (Roche Molecular Biochemicals), y TRAN3FECTAM® (Promega).

Es posible utilizar vectores virales para alterar genéticamente las células madre placentarias mediante el suministro de, p. ej . , genes diana, polinucleótidos, moléculas antisentido o secuencias de ribozimas en las células. Los vectores retrovirales son eficaces para transducir células con división rápida, aunque se ha desarrollado un número de vectores retrovirales para transferir eficazmente DNA en células que no estén en división también. Las lineas de célula de empacado para vectores retrovirales son conocidas para los expertos en la técnica. En algunas modalidades, un vector DNA retroviral contiene dos LTR retrovirales, de modo que una primer LTR está ubicada 5' para el promotor SV40, el cual está ligado de manera operante a la secuencia génica diana clonada en un sitio de multiclonación, seguido por un segundo LTR 3'. Una vez formado, el vector DNA retroviral es transferido a una linea de células de empacado utilizando transfección en las que interviene fosfato de calcio, como se describe en lo anterior. Después de aproximadamente 48 horas de la producción del virus se cosecha el vector viral que ahora contiene la secuencia génica diana. Los métodos para transfectar células utilizando vectores lentivirales , virus de herpes recombinantes , vectores adenovirales o vectores alfavirus son conocidas en la técnica .

La transfección o transducción satisfactoria de las células diana se puede demostrar utilizando marcadores genéticos, en una técnica que es conocida para los expertos en la materia. La proteina fluorescente verde de Aequorea victoria, por ejemplo, ha demostrado ser un marcador eficaz para identificar y rastrear células hematopoyéticas con modificación genética. Los marcadores seleccionables alternativos pueden ser el gen de ß-Gal, el receptor del factor de crecimiento de nervio truncado o marcadores de selección de fármacos (que puede ser, más no se limita a NEO, MTX, o higromicina) .

Las células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea pueden ser genéticamente modificadas por cualquiera de los métodos y/o por cualquiera de los genes, descritos en lo anterior. 5.6.3 Composiciones farmacéuticas Las poblaciones de las células madre placentarias aisladas, o las poblaciones de las células que contienen las células madre placentarias aisladas, pueden formularse en composiciones farmacéuticas para utilizarlas in vivo, p. ej . , en los métodos de tratamiento que se proporcionan en la presente. Estas composiciones farmacéuticas contienen una población de células madre placentarias aisladas, o una población de células que contienen células madre placentarias aisladas, en un portador aceptado para uso farmacéutico, p. ej . , una solución salina u otra solución aceptada para uso en el medio fisiológico para administración in vivo. Las composiciones farmacéuticas que contienen las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente pueden contener cualquiera, o cualquier combinación, de células madre placentarias aisladas descritas en otra parte de la presente. Las composiciones farmacéuticas pueden contener células madre placentarias fetales, maternas, o fetales y maternas. Las composiciones farmacéuticas que se proporcionan en la presente además pueden contener células madre placentarias aisladas obtenidas de un solo individuo o de placenta, o de una pluralidad de individuos o placentas.

Las composiciones farmacéuticas que se proporcionan en la presente pueden contener cualquier número de células madre placentarias aisladas. Por ejemplo, una sola dosis unitaria de células madre placentarias aisladas puede contener, en diversas modalidades, alrededor, al menos o no más de 1 x 105, 5 x 105, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 10 5 x 107, 1 x 108, 5 x 108, 1 x 109, 5 x 109, 1 x 1010, 5 x 1010, 1 x 1011 o más células madre placentarias aisladas, o desde 1 x 105 hasta 5 x 105, 5 x 105 hasta 1 x 106, 1 x 106 hasta 5 x 106, 5 x 106 hasta 1 x 107, 1 x 107 hasta 5 x 107, 5 x 107 hasta 1 x 108, 1 x 108 hasta 5 x 108, 5 x 108 hasta 1 x 109, 1 x 109 hasta 5 x 109, 5 x 109 hasta 1 x 1010, 1 x 1010 hasta 5 x 1010, o 5 x 1010 hasta 1 x 1011 células madre placentarias aisladas.

Las composiciones farmacéuticas que se proporcionan en la presente contienen poblaciones de células madre placentarias que contienen 50% de células viables o más (es decir, al menos 50% de las células de la población son funcionales o vivas) . Preferentemente, al menos 60% de las células de la población son viables. Más preferentemente, al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las células de la población de la composición farmacéutica son viables.

Las composiciones farmacéuticas que se proporcionan en la presente pueden contener uno o más compuestos que, p. ej . , faciliten la integración y viabilidad del tejido trasplantado (p. ej . , los anticuerpos contra los receptores de células T, un inmunosupresor o similares); estabilizadores como albúmina, dextrano 40, gelatina, hidroxietil almidón, plasmalito, y similares.

Cuando se formula como una solución inyectable, en una modalidad, la composición farmacéutica contiene aproximadamente 1% hasta 1.5% de HSA y aproximadamente 2.5% de dextrano. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica contiene desde aproximadamente 5 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 2 x 107 células por mililitro en una solución que contenga 5% de HSA y 10% de dextrano, como una opción, que contenga un inmunosupresor, p. ej . , ciclosporina A, a una concentración de 10 mg/kg.

En otras modalidades, la composición farmacéutica, p. ej . , una solución, contiene células madre placentarias aisladas, en donde la composición farmacéutica contiene entre aproximadamente 1.0 ± 0.3 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 5.0 ± 1.5 x 106 células por mililitro. En otras modalidades, la composición farmacéutica contiene entre aproximadamente 1.5 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 3.75 x 106 células por mililitro. En otras modalidades, la composición farmacéutica contiene entre aproximadamente 1 x 106 células/mL hasta aproximadamente 50 x 106 células/mL, aproximadamente 1 x 106 células/mL hasta aproximadamente 40 x 106 células/mL, aproximadamente 1 x 106 células/mL hasta aproximadamente 30 x 106 células/mL, aproximadamente 1 x 106 células/mL hasta aproximadamente 20 x 106 células/mL, aproximadamente 1 x 106 células/mL hasta aproximadamente 15 x 106 células/mL, o aproximadamente 1 x 10° células/mL hasta aproximadamente 10 x 106 células/mL. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica no contiene agregados visibles de células (es decir, sin agregados macro celulares) , o prácticamente no contiene estos agregados visibles. Cuando se utiliza en la presente, "macro agregados de células" significa una agregación de células visible sin amplificación, p. e j . , visible a simple vista, y generalmente se refiere a una agregación celular mayor de aproximadamente 150 micrones. En algunas modalidades, la composición farmacéutica contiene alrededor de 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5% 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5% o 10% de dextrano, p. ej . , dextrano-40. En una modalidad especifica, la composición contiene alrededor de 7.5% hasta aproximadamente 9% de dextrano-40. En una modalidad especifica, la composición contiene alrededor de 5.5% de dextrano-40. En ciertas modalidades, la composición farmacéutica contiene desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 15% de albúmina sérica humana (HSA) . En las modalidades especificas, la composición farmacéutica contiene alrededor de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, '65, 75, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% o 15% de HSA. En una modalidad especifica, las células han sido criopreservadas y descongeladas. En otra modalidad especifica, las células han sido filtradas a través de un filtro de 70 µ? hasta 100 µ?. En otra modalidad especifica, la composición no contiene agregados visibles de células. En otra modalidad especifica, la composición contiene menos de aproximadamente 200 agregados de células por 106 células, en donde los agregados de células s on vi s ible s sólo en un microscopio, p. ej . , un microscopio óptico. En otra modalidad especifica, la composición contiene menos de aproximadamente 150 agregados de células por 106 células, en donde los agregados de las células son visible solo en un microscopio, p. ej . , un microscopio óptico. En otra modalidad especifica, la composición contiene menos de aproximadamente 100 agregados de células por 106 células, en donde los agregados de células son visibles sólo bajo un microscopio, p. ej . , un microscopio óptico.

En una modalidad especifica, la composición farmacéutica contiene aproximadamente 1.0 ± 0.3 x 106 células por mililitro, aproximadamente 5.5% de dextrano- 40 (p/v) , aproximadamente 10% de HSA (p/v) y aproximadamente 5% de DMSO (v/v) .

En otras modalidades, la composición farmacéutica contiene una pluralidad de células madre placentarias aisladas en una solución que contiene 10% de dextrano-40, en donde la composición farmacéutica contiene entre aproximadamente 1.0 ± 0.3 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 5.0 ± 1.5 x 106 células por mililitro, y en donde la composición no contiene agregados celulares visibles a simple vista (es decir, no contiene agregados macro celulares). En algunas modalidades, la composición farmacéutica contiene entre aproximadamente 1.5 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 3.75 x 106 células por mililitro. En una ' modalidad especifica, las células han sido criopreservadas y descongeladas. En otra modalidad específica, las células han sido filtradas a través de un filtro de 70 µ? hasta 100 µ?. En otra modalidad específica, la composición contiene menos de aproximadamente 200 micro agregados celulares · (es decir, agregados celulares visibles sólo con amplificación) por 106 células. En otra modalidad específica, la composición farmacéutica contiene menos de aproximadamente 150 micro agregados celulares por 106 células. En otra modalidad específica, la composición farmacéutica contiene menos de aproximadamente 100 micro agregados celulares por 106 células. En otra modalidad específica, la composición farmacéutica contiene menos de 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3% o 2% DMSO, o menos de han 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2% o 0.1% de DMSO.

Además se proporciona en la presente las composiciones que contienen células madre placentarias, en donde tales composiciones se producen por uno de los métodos que se describen en la presente. Por ejemplo, en una modalidad, la composición farmacéutica contiene células, p. ej . , células madre placentarias, en donde la composición farmacéutica se produce por un método que consiste en filtrar una solución que contenga células, p. ej . , células madre placentarias, para formar una solución que contenga células filtradas; diluir la solución que contiene células filtradas con una primera solución a alrededor de 1 hasta 50 x 106, 1 hasta 40 x 106, 1 hasta 30 x 106, 1 hasta 20 x 106, 1 hasta 15 x 106, o 1 hasta 10 x 106 células por mililitro, p. ej . , antes de la criopreservación; y diluir la solución que contiene células filtradas resultante con una segunda solución que contenga dextrano, pero que no contenga albúmina sérica humana (HSA) para producir tal composición. En ciertas modalidades, la dilución es a no más de aproximadamente 15 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, 1 la dilución es a no más de aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, la dilución es a no más de aproximadamente 7.5 x 106 células por mililitro. En algunas otras modalidades, si antes de la dilución la solución que contiene células filtradas, contiene menos de aproximadamente 15 x 106 células por mililitro, la filtración es optativa. En algunas otras modalidades, si la solución que contiene células filtradas, antes de la dilución, contiene menos de aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro, la filtración es optativa. En algunas otras modalidades, si la solución que contiene células filtradas, antes de la dilución, contiene menos de aproximadamente 7.5 x 106 células por mililitro, la filtración es optativa.

En una modalidad específica, las células, p. ej . , las células madre placentarias, son criopreservadas entre la dilución con una primera solución para dilución y la dilución con la segunda solución para dilución. En otra modalidad específica, la primera solución para dilución contiene dextrano y HSA. El dextrano de la primera solución para dilución o la segunda solución para dilución puede ser dextrano de cualquier peso molecular, p. e . , dextrano que tenga un peso molecular desde aproximadamente 10 kDa hasta aproximadamente 150 kDa. En algunas modalidades, la cantidad de dextrano en la primera solución para dilución o la segunda solución para dilución es aproximadamente 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5% 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5% o 10% de dextrano. En otra modalidad específica, el dextrano en la primera solución para dilución o la segunda solución para dilución es dextrano-40. En otra modalidad específica, el dextrano en la primera solución para dilución y la segunda solución para dilución es dextrano-40. En otra modalidad específica, el dextrano-40 en la primera solución para dilución es 5.0% de dextrano-40. En otra modalidad específica, el dextrano-40 en la primera solución para dilución es 5.5% dextrano-40. En otra modalidad específica, el dextrano-40 en la segunda solución para dilución es 10% dextrano-40. En otra modalidad específica, la HSA en la solución que contiene HSA es 1 a 15% HSA. En otra modalidad especifica, la HSA en la solución que contiene HSA es aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11 %, 12%, 13%, 14% o 15% HSA. En otra modalidad especifica, la HSA en la solución que contiene HSA es 10% HSA. En otra modalidad especifica, la primera solución para dilución contiene HSA. En otra modalidad especifica, la HSA en la primera solución para dilución es 10% HSA. En otra modalidad especifica, la primera solución para dilución contiene un crioprotector . En otra modalidad especifica, el crioprotector es DMSO. En otra modalidad especifica, el dextrano-40 en la segunda solución para dilución es aproximadamente 10% dextrano-40. En otra modalidad especifica, la composición que contiene células contiene aproximadamente 7.5% a aproximadamente 9% de dextrano. En otra modalidad especifica, la composición farmacéutica contiene desde aproximadamente 1.0 ± 0.3 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 5.0 + 1.5 x 106 células por mililitro. En otra modalidad especifica, la composición farmacéutica contiene desde aproximadamente 1.5 x 106 células por mililitro hasta aproximadamente 3.75 x 106 células por mililitro.

En otra modalidad, la composición farmacéutica se prepara mediante un método que consiste en: (a) filtrar una solución que contenga las células madre placentarias antes de la criopreservación para producir una solución que contenga células filtradas; (b) criopreservar las células en la solución que contiene células filtradas a alrededor de 1 hasta 50 x 106, 1 hasta 40 x 106, 1 hasta 30 x 106, 1 hasta 20 x 106, 1 hasta 15 x 106, o 1 hasta 10 x 106 células por mililitro; (c) descongelar las células; y (d) diluir la solución que contiene células filtradas alrededor de 1:1 hasta aproximadamente 1:11 (v/v) con solución de dextrano-40. En ciertas modalidades, si el número de células es menor de aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro antes del paso (a), la filtración es optativa. En otra modalidad especifica, las células en el paso (b) son criopreservadas a aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro. En otra modalidad especifica, las células en el paso (b) son criopreservadas en una solución que contenga aproximadamente 5% a aproximadamente 10% de dextrano-40 y HSA. En ciertas modalidades, la dilución del paso (b) es a no más de aproximadamente 15 x 106 células por mililitro.

En otra modalidad, la composición farmacéutica se prepara por un método que consiste en: (a) suspender las células madre placentarias en una solución de dextrano-40 al 5.5% que contenga 10% HSA para formar una solución que contenga células; (b) filtrar la solución que contiene células a través de un filtro de 70 µ?; (c) diluir la solución que contiene células con una que contenga 5.5% dextrano-40, 10% HSA y 5% DIVISO hasta aproximadamente 1 a 50 x 106, 1 a 40 x 106, 1 a 30 x 106, 1 a 20 x 106, 1 a 15 x 106, o 1 a 10 x 105 células por mililitro; (d) criopreservar las células; (e) descongelar las células; y (f) diluir la solución que contiene células 1:1 hasta 1:11 (v/v) con 10% de dextrano-40. En ciertas modalidades, la dilución del paso (c) es a no más de aproximadamente 15 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, la dilución en el paso (c) es a no más de aproximadamente 10 ± 3 x 106 células/mL. En ciertas modalidades, la dilución en el paso (c) es a no más de aproximadamente 7.5 x 106 células/mL.

En otra modalidad, la composición que contiene células se prepara por un método que consiste en: (a) la centrifugación de una pluralidad de células, p. ej . , las células madre placentarias , para recolectar las células; (b) resuspender las células en 5.5% dextrano-40; (c) centrifugar las células para recolectar las células; (d) resuspender las células en una solución de dextrano-40 al 5.5% que contenga 10% HSA; (e) filtrar las células a través de un filtro de 70 µ?; (f) diluir las células en una solución de dextrano-40 al 5.5%, HSA al 10% y DMSO al 5% a aproximadamente 1 hasta 50 x 106, 1 hasta 40 x 106, 1 hasta 30 x 106, 1 hasta 20 x 106, 1 hasta 15 x 106, o 1 hasta 10 x 106 células por mililitro; (g) criopreservar las células; (h) descongelar las células; y (i) diluir las células 1:1 hasta 1:11 (v/v) con dextrano-40 al 10%. En ciertas modalidades, la dilución del paso (f) es a no más de aproximadamente 15 x 106 células por mililitro. En ciertas modalidades, la dilución del paso (f) es a no más de aproximadamente 10 ± 3 x 106 células/mL. En ciertas modalidades, la dilución del paso (f) es a no más de aproximadamente 7.5 x 106 células/mL. En algunas otras modalidades, si el número de células es menor de aproximadamente 10 ± 3 x 106 células por mililitro, la filtración es optativa.

Es posible utilizar otras formulaciones inyectables apropiadas para la administración de los productos celulares .

Las composiciones farmacéuticas útiles en los métodos de la invención pueden contener cualquiera de las células madre placentarias que se describen en la presente, p. ej . , como se describe en la Sección 5.2.2, anterior. En una modalidad, la composición farmacéutica contiene células madre placentarias aisladas que son de origen práctica o completamente no materno, es decir, tienen el genotipo fetal; p. ej . , al menos alrededor de 90%, 95%, 98%, 99% o aproximadamente 100% son de origen no materno. En ciertas modalidades, una composición farmacéutica contiene una población de células madre placentarias aisladas que son, en los ejemplos no limitativos, CD10+, CD34", CD105+ y CD200+; CD200+ y HLA-G"; CD73+, CD105+, y CD200+; CD200+ y 0CT-4+; o CD73+, CD105+ y HLA-G"; o una combinación de las anteriores, en donde al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las células madre placentarias aisladas son de origen o no materno. En otra modalidad, una composición farmacéutica contiene una población de células madre placentarias aisladas que son CD10+, CD105+ y CD34~; CD10+, CD105+, CD200+ y CD34-; CD10+, CD105+, CD200+, CD34" y al menos una de CD90+ o CD45"; CD10+, CD90+, CD105+, CD200+, CD34 y CD45"; CD10+, CD90+, CD105+, CD200+, CD34" y CD45"; CD200+ y HLA-G"; CD73+, CD105+, y CD200+; CD200+ y 0CT-4+; CD73+, CD105+ y HLA-G-; una o más de CD117" , CD133", KDRT, CD80" , CD86" , HLA-A,B,C+, HLA-DP, DQ, DR" y/o PDL1+; o una combinación de las anteriores, en donde al menos 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de las células madre placentarias aisladas son de origen no materno. En una modalidad especifica, la composición farmacéutica además contiene una célula madre que no se obtiene de una placenta.

Las células madre placenterías aisladas en las composiciones, p. ej . , en las composiciones farmacéuticas, que se proporcionan en la presente, pueden contener células madre placentarias obtenidas de un solo donante, o de múltiples donantes. Las células madre placentarias aisladas pueden ser completamente compatibles con el HLA para un recipiendario propuesto, o parcial o completamente no compatibles con el HLA.

Las composiciones farmacéuticas que se proporcionan en la presente además pueden contener las BM-MSC. En ciertas modalidades, las células madre placentarias y BM-MSC están presentes en la composición farmacéutica en una proporción de, p. ej . , 99: 1, 95:5, 90: 10, 85: 15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 35:65, 30:70, 25:75, 20:80, 15:85, 10:90, 5:95 o 1:99 por números de células, o entre 99: 1 y 95:5, entre 95:5 y 90: 10, entre 90: 10 y 85: 15, entre 85: 15 y 80:20, entre 80:20 y 75:25, entre 75:25 y 70:30, entre 70:30 y 65:35, entre 65:35 y 60:40, entre 60:40 y 55:45, entre 55:45 y 50:50, entre 50:50 y 45:55, entre 45:55 y 40:60, entre 40:60 y 35:65, entre 35:65 y 30:70, entre 30:70 y 25:75, entre 25:75 y 20:80, entre 20:80 y 15:85, entre 10:90 y 5:95 o entre 5:95 y 1 :99, por números de células. 5.6.4 Matrices que contienen células madre placentarias aisladas Además se proporcionan en la presente las composiciones que contienen matrices, hidrogeles, andamios y similares que contienen células madre placentarias. Tales composiciones pueden utilizarse en lugar, o además, de las células en suspensión liquida. En ciertas modalidades, las células madre placentarias aisladas se combinan con plasma rico en plaquetas. En otras modalidades, las células madre placentarias aisladas se combinan con alginato.

Las células madre placentarias que se describen en la presente pueden ser sembradas sobre una matriz natural, p. ej . , un biomaterial placentario, como puede ser un material de membrana amniótica. Tal material de membrana amniótica puede ser, p. ej . , membrana amniótica disecada directamente de una placenta de mamífero; membrana amniótica termotratada o fijada, membrana amniótica considerablemente seca (es decir, <20% H20) , membrana coriónica, membrana coriónica considerablemente seca, membrana amniótica y coriónica considerablemente seca, y similares. Los biomateriales placentarios preferidos sobre los cuales se pueden sembrar las células madre placentarias aisladas están descritos en Hariri, Publicación de la Solicitud U.S. No. 2004/0048796, la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad.

Las células madre placenterías aisladas que se describen en la presente pueden ser suspendidas en una solución de hidrogel apropiada para, p. ej . , inyección. Los hidrogeles apropiados para tales composiciones pueden ser los péptidos auto-ensambladores, como puede ser RAD 16. En una modalidad, una solución de hidrogel que contenga las células puede dejarse endurecer, por ejemplo, en un molde, para formar una matriz que tenga células dispersadas en éste para la implantación. Las células madre placentarias aisladas en tal matriz también pueden ser cultivadas para que las células se expandan mitót icamente antes de la implantación. El hidrogel es, p. ej . , un polímero orgánico (natural o sintético) que se retícula por enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno para crear una estructura de retícula abierta tridimensional que atrape moléculas de agua para formar un gel. Los materiales formadores de hidrogel pueden ser polisacáridos como alginato y sales de éste, péptidos, polifosfazinas y poliacrilato , los cuales se reticulan iónicamente o polímeros en bloque como puede ser los copolímeros en bloque de óxido de polietileno- 251 polipropilen glicol los cuales se reticulan por temperatura o pH, respectivamente. En algunas modalidades, el hidrogel o la matriz son biodegradables.

En algunas modalidades, la formulación contiene un gel polimerizable in situ (véase., p. ej . , la Publicación de la Solicitud de Patente U.S. 2002/0022676, la descripción de la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad; Anseth et al., J. Control Reléase, 78(1- 3): 199-209 (2002); ang et al, Biomaterials, 24 (22 ): 3969-80 (2003).

En algunas modalidades, los polímeros son al menos parcialmente solubles en soluciones acuosas, como agua, soluciones salinas amortiguadas o soluciones alcohólicas acuosas, que tengan grupos laterales con carga o una sal iónica monovalente de éstos. Los ejemplos de los polímeros que tienen grupos laterales ácidos que pueden reaccionar con cationes con poli ( fosfazenos ) , poli (ácidos acrílicos), poli (ácidos metacrílieos ) , copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, poli (acetato de vinilo) y polímeros sulfonados, como puede ser poliestireno sulfonado. Los copolímeros que tienen grupos laterales ácidos formados por reacción de ácido acrílico o metacrílico y monómeros o polímeros de éter vinílico también pueden ser utilizados. Los ejemplos de los grupos ácidos son grupos ácido carboxilico, grupos ácido sulfónico, grupos alcohol halogenado (preferentemente fluorados) grupos OH fenólicos y grupos OH ácidos.

Las células madre placentarias aisladas que se describen en la presente o los co-cultivos de éstas pueden ser sembradas sobre una plataforma o andamio tridimensional e implantadas in vivo. Una plataforma como esta puede ser implantada en combinación con uno o más factores de crecimiento cualesquiera, células, fármacos u otros componentes que, p. ej . , estimulen la formación de te ido .

Los ejemplos de los andamios que pueden utilizarse pueden ser láminas de no tejidos, espumas porosas o péptidos auto ensambladores. Las laminillas de no tejidos pueden formarse utilizando fibras compuestas de un copolimero absorbible sintético de ácidos glicólico y láctico (p. ej . , PGA/PLA) (VICRYL, Ethicon, Inc., Somerville, N.J.). Las espumas, compuestas de, p. ej . , el copolimero de poli (e-caprolactona) /poli (ácido glicólico) (PCL/PGA), formadas por procesos como secado por congelación o liofilización (véase, p. ej . , la Patente U.S. No. 6,355,699) también pueden utilizarse como andamios.

En otra modalidad, las células madre placentarias aisladas pueden ser sembradas sobre, o se pueden poner en contacto con, un fieltro, el cual puede estar, p. ej . , compuesto de un hilo multifilamentoso fabricado de un material bioabsorbible como puede ser copolimeros o mezclas de PGA, PLA, PCL o ácido hialurónico.

Las células madre placentarias aisladas que se proporcionan en la presente pueden, en otra modalidad, ser sembradas sobre andamios de espuma que pueden ser estructuras compuestas. Tales andamios de espuma pueden ser moldeados en una configuración útil, como puede ser la de una parte de una estructura especifica, p. ej . , un hueso que contenga una lesión. En algunas modalidades, la plataforma es tratada, p. ej . , con ácido acético 0.1M seguido por incubación en polilisina, PBS y/o colágeno, antes de la inoculación de las células para mejorar la unión de las células. Las superficies externas de una matriz pueden ser modificadas para mejorar la unión o crecimiento de la célula y la diferenciación del tejido, como puede ser recubriendo con plasma la matriz, o la adición de una o más proteínas (p. ej . , colágenos, fibras elásticas, fibras reticulares), glicoproteínas , glicosaminoglicanos (p. ej . , sulfato de heparina, 4-sulfato de condroitina, 6-sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, sulfato de queratina, etc.), una matriz celular y/u otros materiales como pueden ser, más no se limitan a, gelatina, alginatos, agar, agarosa y gomas vegetales, y similares.

En algunas modalidades, el andamio consiste, o es tratado, con materiales que lo convierten en no trombógeno. Estos tratamientos y materiales también puede favorece y mantener el crecimiento endotelial, la migración y la depositación de la matriz extracelular . Los ejemplos de estos materiales y tratamientos pueden ser, más no se limitan a, materiales naturales como proteínas de la membrana basada como puede ser laminina y colágeno Tipo IV, materiales sintéticos como EPTFE y siliconas de poliuretanourea segmentadas, como puede ser PURSPAN™ (The Polymer Technology Group, Inc., Berkeley, Calif ) . El andamio también puede contener compuestos anti-trombóticos como heparina; los andamios también pueden ser tratados para alterar la carga superficial (p. ej . , recubrimiento con plasma) antes del sembrado con las células madre placentarias aisladas.

Las células madre placentarias que se proporcionan en la presente también pueden ser sembradas sobre, o pueden ponerse en contacto con, un material cerámico aceptado para uso en el medio fisiológico que puede ser, más no se limita a, fosfato de mono-, di-, tri-, alfa-tri-, beta-tri- y tetra-calcio, hidroxiapatita, fluoroapatitas, sulfatos de calcio, fluoruros de calcio, óxidos de calcio, carbonatos de calcio, fosfatos de magnesio y calcio, vidrios con actividad biológica como BIOGLASS® y mezclas de éstos. Los materiales cerámicos biocompatibles porosos que están en la actualidad en el comercio pueden ser SURGIBONE® (CanMedica Corp., Canadá), ENDOBON® (Merck Biomaterial France, Francia), CEROS® (Mathys, AG, Bettlach, Suiza) y productos de colágeno mineralizado para injertar hueso como puede ser HEALOS™ (DePuy, Inc., Raynham, MA) y VITOSS® RHAKOSS™ y CORTOSS® (Orthovita, Malvern, Pa.). La plataforma puede ser una mezcla, combinación o compuesto de materiales naturales y/o sintéticos.

En una modalidad, las células madre placentarias aisladas se siembran sobre, o se ponen en contacto con, un andamio apropiado a aproximadamente 0.5 x 106 hasta aproximadamente 8 x 106 células/mL. 5.7 LÍNEAS DE CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS INMORTALIZADAS Las células madre placentarias útiles en el tratamiento de un cáncer relacionado con el hueso, para la supresión de la proli eración de las células de cáncer relacionado con el hueso o para la supresión de la maduración de los progenitores de los osteoclastos pueden ser inmortalizadas condicionalmente por transfección con algún vector adecuado que contenga un gen que favorezca el crecimiento, es decir, un gen que codifique para una proteina que, en las condiciones apropiadas, promueva el crecimiento de las células transíectadas , de modo que la producción y/o actividad de las proteina que favorezca el crecimiento pueda ser regulada por un factor externo. En una modalidad preferida, el gen que favorece el crecimiento es un oncogen como puede ser, más no se limita a, v-myc, N-myc, c-myc, p53, antigeno T grande de SV40, antigeno T grande de polioma, adenovirus Ela o proteina E7 de papilomavirus humano.

La regulación externa de la proteina que promueve el crecimiento se puede lograr colocando el gen que favorece el crecimiento bajo el control de un promotor que se pueda regular de manera externa, p. ej . , un promotor, la actividad del cual se pueda controlar, por ejemplo, modificando la temperatura de las células transfectadas o la composición del medio en contacto con las células, en una modalidad, es posible emplear un sistema de expresión génica controlado con tetraciclina (tet) (véase Gossen et al, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 89:5547-5551, 1992; Hoshimaru et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 93: 1518-1523, 1995) . En ausencia de tet, un transactivador controlado con tet (tTA) dentro de este vector activa fuertemente la transcripción desde phCMv*-i/ un promotor mínimo obtenido de citomegalovirus humano fusionado a las secuencias operadoras tet. tTA es una proteína de fusión del represor (tetR) del operón de resistencia tet obtenido del transposon 10 de Escherichia coli y el dominio ácido de VP16 del virus herpes simple. Las concentraciones bajas, no tóxicas de tet (p. ej . , 0.01-1.0 anulan casi completamente la transactivación por tTA.

En una modalidad, el vector además contiene un gen que codifica un marcador de selección, p. e . , una proteína que confiere resistencia a fármacos. El gen bacteriano de resistencia a neomicina (neoR) es un marcador de éstos que puede ser empleado dentro de los métodos presentes. Las células que llevan neoR pueden ser seleccionadas por medios conocidos para los expertos en la técnica, como puede ser la adición de, p. e . , 100-200 yg/mL G418 al medio de crecimiento.

La transfección se puede lograr por cualquiera de una variedad de medios conocidos para los expertos en la técnica que pueden ser, más no se limitan a, infección retroviral. En general, un cultivo celular puede ser transfectado por incubación con una mezcla de medio acondicionado recolectado de la .linea de células productoras para el vector y DMEM/F12 con un contenido de suplementos N2. Por ejemplo, un cultivo de células madre placentarias preparado como se describe antes puede ser infectado después de, p. ej . , cinco días in vitro por incubación durante 20 horas en un volumen de medio acondicionado y dos volúmenes de DMEM F12 con un contenido de suplementos N2. Las células transfectadas que llevan un marcador de selección entonces pueden ser seleccionadas como se describe en lo anterior.

Luego de la transfeccion, las células se pasan sobre una superficie que permita la proliferación, p. ej . , que permita al menos 30% de las células duplicarse en un periodo de 24 horas. Preferentemente, el sustrato es un sustrato de poliornitina/laminina, consistente en plástico para cultivo de tejido recubierto con poliornitina (10 g/mL) y/o laminina (10 pg/mL) , un sustrato de polilisina/laminina o una superficie tratada con fibronectina . Luego los cultivos son alimentados cada 3-4 días con medio de crecimiento, el cual puede o no estar suplementado con uno o más factores que favorezcan la proliferación. Los factores que favorecen la proliferación pueden ser adicionados al medio de crecimiento cuando los cultivos son menos del 50% confluentes .

La linea de las células madre placentarias inmortalizadas por acondicionamiento pueden ser pasadas utilizando las técnicas normalizadas, como puede ser por tripsinización cuando sean 80-95% confluentes. Hasta aproximadamente el vigésimo pase, en algunas modalidades, es benéfico mantener la selección (por ejemplo, mediante la adición de G418 para células que contienen el gen de resistencia a neomicina) . Las células también pueden ser congeladas en nitrógeno liquido para su almacenamiento durante largo tiempo.

Las lineas de células clónales pueden ser aisladas de una linea de células madre placentarias humanas inmortalizadas por acondicionamiento, preparada como ya se describió. En general, estas lineas de células clónales pueden ser aisladas utilizando las técnicas normalizadas, como puede ser por dilución limitada o utilizando anillos donadores, y pueden ser extendidas. Las lineas de células clónales generalmente pueden ser alimentadas y pasadas como ya se describió.

Las lineas de células madre placentarias humanas inmortalizadas por acondicionamiento, las cuales pueden ser, pero no necesariamente, clónales, generalmente pueden ser inducidas a diferenciarse suprimiendo la producción y/o actividad de la proteina que favorece el crecimiento en las condiciones de cultivo que faciliten la diferenciación. Por ejemplo, si el gen que codifica la proteina que favorece el crecimiento está bajo el control de un promotor que puede regularse de manera externa, las condiciones, p. ej . , la temperatura o composición del medio, pueden ser modificadas para suprimir la transcripción del gen que favorece el crecimiento. Para el sistema de expresión génica controlado con tetraciclina antes descrito, la diferenciación se puede lograr mediante la adición de tetraciclina para suprimir la transcripción del gen que favorece el crecimiento. En general, 1 pg/mL de tetraciclina durante 4-5. días es suficiente para iniciar la diferenciación. Para favorecer más diferenciación, es posible incluir otros agentes en el medio de crecimiento.

Las BM-MSC también pueden ser inmortalizadas utilizando cualquiera de los métodos antes mencionados . 5.8 Equipos En otro aspecto, se proporcionan en la presente equipos apropiados para el tratamiento de un individuo que tenga un cáncer relacionado con el hueso, p. ej . , mieloma múltiple o condrosarcoma , o uno de los demás cánceres relacionados con el hueso enlistados en otra parte de la presente, que contienen, en un envase separado del contenido restante del equipo o kit, células madre placentarias en un plástico para cultivo de tejido, p. ej . , las células madre placentarias aisladas que se describen en la Sección 5.2.2, anterior, y/o células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea, aisladas, y las instrucciones para su uso. Preferentemente, las células madre placentarias y/o las BM-MSC se proporcionan en una solución aceptada para uso farmacéutico, p. ej . , una solución apropiada para administración intralesional o una solución apropiada para administración intravenosa.

En algunas modalidades, los kits contienen uno o más componentes que facilitan la entrega de las células madre placentarias y/o las BM-MSC a un individuo. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el kit contiene componentes que facilitan la entrega intralesional de las células al individuo. En tales modalidades, el kit puede contener, p. ej . , jeringas y agujas apropiadas para la entrega de las células al individuo, y similares. En tales modalidades, las células madre placentarias pueden estar contenidas en el kit en una bolsa, o en uno o más viales. En algunas otras modalidades, el kit contiene componentes que facilitan la entrega intravenosa o intra-arterial de las células placentarias al individuo. En tales modalidades, las células madre placentarias pueden estar contenidas, p. ej . , dentro de una botella o bolsa (por ejemplo, una bolsa de sangre o una bolsa semejante capaz de contener hasta aproximadamente 1.5 L de solución que contenga las células), y el kit además contiene tubería y agujas apropiadas para la entrega de las células al individuo .

Además, el kit puede contener uno o más componentes que disminuyan el dolor o la inflamación en el individuo (p. ej . , un analgésico, un compuesto anti-inflamatorio no esteroide o esteroide, o similares. El kit también puede contener un compuesto antibacteriano o antiviral (p. e . , uno o más antibióticos), un compuesto para disminuir la ansiedad en el individuo (p. ej . , alaprazolam) , un compuesto que disminuya una respuesta inmunitaria en el individuo (p. ej . , ciclosporina A), una antihistamina (difenhidramina, loratadina, desloratadina, quetiapina, fexofenadina, cetirizina, prometazina, clorfeniramina, levocetirizina, cimetidina, famotidina, ranitidina, nizatidina, roxatidina, lafutidina, o similares).

Además, el kit puede contener, p. ej . , paños estériles, productos de papel desechables, guantes desechables o similares, que faciliten la preparación del individuo para la administración, o que disminuya la probabilidad de infección en el individuo como resultado de la administración de las células madre placentarias . 6. EJEMPLOS 6.1 EJEMPLO 1: LAS CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS FAVORECEN LA FORMACIÓN DE HUESO IN VIVO Este Ejemplo demuestra la capacidad de las células madre placentarias que se adhieren al plástico para cultivo de tejido, aisladas, para favorecer la formación del hueso.

Las células madre placentarias fueron obtenidas como sigue. En resumen, el tejido placentario que media aproximadamente 1 x 2 x 1 cm se obtuvo y se picó en pedazos de aproximadamente 1 mm3. Estos pedazos fueron digeridos con colagenasa 1A (2 mg/mL, Sigma) durante 30 minutos, seguido por digestión con tripsina-EDTA (0.25%, GIBCO BRL) durante 10 minutos, a 37°C en un baño de agua.

La solución obtenida fue centrifugada a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido por la separación de la solución para digestión. El sedimento fue resuspendido a aproximadamente 10 volúmenes con PBS y se centrifugó a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. El sedimento de tejido/células fue resuspendido en 130 mL de medio de cultivo y las células fueron sembradas a 13 mL por frasco T-75 recubierto con fibronectina . Las células fueron incubadas a 37°C con atmósfera humidificada con 5% de C02. Las células utilizadas en los estudios que se describen en la presente, y en los siguientes Ejemplos, fueron cultivadas hasta el pase 6 antes de su uso. Estas células madre placentarias aisladas generalmente son CD34", CD10+, CD105+ y CD200+. El examen con anticuerpos para los marcadores CD44 y CD90 además mostraron que las células eran CD34", CD10+, CD44+, CD90+, CD105+ y CD200+.

Las ratas que se utilizaron en este estudio fueron aproximadamente de 6 semanas de nacidas en el momento del estudio y se asignó a cada grupo dieciséis ratas. Se crearon defectos craneales bilaterales (izquierdo y derecho; aproximadamente 3 mm x 5 mm) en 96 ratas atimicas macho Hsd : RH-Foxnrnu (Charles River, Wilmington, Massachusetts ) . En resumen, en el área craneal central entre las orejas se hizo una incisión transversa de la piel y se colocó un expansor de tejido en la región central del margen rostral de la incisión (el colgajo de la piel) . El expansor abrió la incisión y expuso el cráneo. Se retiró el periósteo de los huesos parietales después de que se hizo la incisión. Se marcaron los sitios defectuosos y se utilizó una broca Dremel a una velocidad media para escavar suavemente la orilla de ambos defectos, un área de aproximadamente 3mm por 5mm, en cada hueso parietal. Las orillas del defecto fueron verificadas y alisadas suavemente utilizando fórceps si era necesario. Una vez limpiado y retirado el exceso de fluido, el defecto fue tratado intralesionalmente, como se describe más adelante. Luego se retrajo la dermis sobre el cráneo y la incisión dérmica fue cerrada utilizando suturas.

Los grupos de tratamiento grupos los siguientes. Un defecto por rata fue reparado con HEALOS® (colágeno reticulado que contiene matriz biomimética tipo esponja e hidroxiapatita; DuPuy Spine, Inc., Raynham, Massachusetts ) sembrado con células madre placentarias (5 x 106 células en 500 µL, células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea (BM-MSC; obtenidas de aspirado fresco de médula ósea (AllCells, Emeryville, California) ) (5 x 106 células en 500 µ?,) , HEALOS© solo como testigo negativo, o HEALOS® suplementado con proteina morfogenética de hueso 2 (BMP-2) (5 µg por explante) como testigo positivo. En otras ratas testigo negativo no se reparó el defecto. El defecto restante en cada rata fue reparado utilizando HEALOS® solo.

Tres semanas después de la implantación, las ratas que recibieron HEALOS® + BMP-2 , HEALOS® + células madre placentarias y HEALOS® + BM-MSC todas mostraron aproximadamente el mismo nivel de curación y curación significativamente mayor del defecto craneal que las ratas que recibieron HEALOS® solo o en las que no se hizo una reparación. Véase la Figura 1.

Asi pues, las PDAC tienen la capacidad para favorecer la curación de las lesiones óseas, un síntoma del progreso de mieloma múltiple. 6.2 EJEMPLO 2: LAS CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS SUPRIMEN LA MADURACIÓN DE LOS OSTEOCLASTOS Este Ejemplo demuestra que las células madre placentarias que se adhieren al plástico para cultivo de tejido (las PDAC) inhiben la maturación de los precursores de los osteoclastos . La supresión de los o precursores de los osteoclastos proporcionaría un beneficio a pacientes con mieloma múltiple que sufren de lesiones óseas (y los síntomas asociados) causadas por la sobreproducción de los osteoclastos inducidos por mieloma.

Los precursores de los osteoclastos humanos, obtenidos enriqueciendo células CD14+ de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) utilizando un kit EASYSEP® Human CD14 Positive Selection Kit (# Cat . 18058), se prepararon en placas de 24 pozos y se cultivaron en el medio aMEM suplementado con factor estimulador de colonias de macrófagos (M-CSF) y el Ligando del Receptor Activador del Factor Nuclear ?? (RANKL; véase Yaccoby et al, Cáncer Research 64(6):2016-2023 (2004)). Las células madre placentarias , aisladas como se describe en el Ejemplo 1, o las célula madres mesenquimales fetales (las MSC) , fueron cultivadas con precursores de los osteoclastos en condiciones sin contacto sembrando las células en 1 L TRANSWELL® (COSTAR®; CORNING®, New York) (10,000 células/TRANSWELL®) y cultivando en forma concomitante las células madre placentarias o MSC con precursores de los osteoclastos durante 5-6 días. Al término del cultivo, el dispositivo TRANSWELL® fue retirado y se examinaron los precursores de los osteoclastos y/o los osteoclastos para buscar evidencia de apoptosis por tinción para anexina V y yoduro de propidio (PI) utilizando un kit anexin V/PI (Caltag Labs., Burlingame, California). La anexina V se une a la fosfatidilserina , la cual es transportada desde la capa interna de la membrana plasmática hacia la capa externa durante la apoptosis; las células con membranas plasmáticas intactas excluyen el yoduro de propidio. Asi pues, las células que son positivas para tinción de anexina, pero no para tinción de PI son células apoptósicas precoces; las células positivas para tinción de anexina y tinción de PI son células apoptósicas tardías .

Se encontró que las células madre placentarias inducen significativamente la apoptosis y disminuyen la viabilidad de los precursores de los osteoclastos en comparación con los testigos en los cuales las células de mieloma múltiple crecieron sin células madre placentarias, como se muestra por la tinción aumentada de Anexina V y yoduro de propidio.

Las células en el dispositivo TRANSWELL® fueron fijadas con formalina y teñidas para fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP; un marcador de los osteoclastos ) . De cada pozo se contó el número de osteoclastos que expresaban TRAP multinucleados . Las células madre placentarias , aisladas, como se describe en el Ejemplo 1, inhibieron la diferenciación de los osteoclastos, como se indica por una disminución de la tinción TRAP en secciones histológicas, y por una disminución significativa (p<0.05) en el número de osteoclastos positivos para TRAP (Figura 2).

Asi pues, las células madre placentarias no solo pueden reparar lesiones óseas, sino pueden disminuir el número y actividad de los osteoclastos que crearían o contribuirían a tales lesiones. 6.3 EJEMPLO 3: LAS CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS INHIBEN EL CRECIMIENTO DE LAS CÉLULAS DE MIELOMA MÚLTIPLE Este Ejemplo demuestra que las células madre placentarias que se adhieren al plástico para cultivo de tejido (las PDAC) son capaces de suprimir la proliferación de las células de mieloma múltiple in vitro e in vivo. 6.3.1 Supresión de la proliferación de las células de mieloma múltiple por las PDAC in vitro Líneas de células de mieloma múltiple humano BN, JB, DNC y HLE (véase Li et al, Br. J. Haematol. 138 ( 6) : 802-11 (2007)), y ARP1 fueron establecidas en el Instituto para Investigación y Tratamiento de Mieloma en la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas. La linea celular de múltiple célula U266 (Nilsson et al, Clin. Exp. Immunol. 7:477 (1970)) se obtuvo del Centro Norteamericano de Recolección de Cultivos tipo. Estas lineas de célula fueron transfectadas con un constructo luciferasa/GFP lentiviral siguiendo los métodos bien conocidos (véase Li et al, ibid. ) para facilitar el rastreo y análisis del crecimiento del tumor en presencia de células madre placentarias en condiciones de contacto célula a célula. Las células BN, JB y DNC son lineas de células dependientes del estroma. Las células madre placentarias, las MSG fetales (FB- SC) , y las MSC obtenidas a partir de médula ósea de pacientes con mieloma múltiple (Pt-MSC) fueron cultivadas en placas de 96 pozos a aproximadamente 10,000 células/pozo) . Las células de mieloma múltiple (10,000 células/pozo) fueron co-cultivadas con células madre placentarias o MSC durante una semana en medio RPMI suplementado con 10% FBS y antibióticos. Al término del cultivo se pudo determinar el crecimiento de las células de mieloma múltiple por la medición de la actividad de la luciferasa.

Los resultados de este estudio se resumen en la Figura 3 que muestra el crecimiento múltiple de células de mieloma múltiple en presencia de las células madre placentarias en comparación con el crecimiento en presencia de FB-MSC y Pt-MSC. El crecimiento de las células de mieloma múltiple en presencia de las células madre placentarias fue variable dependiendo de la linea celular especifica, pero el crecimiento de cada linea celular fue significativamente menor en las lineas de célula cultivadas en forma concomitante con las células madre placentarias en comparación con las linea de células cultivadas en forma concomitante con las MSC fetales o MSC del paciente.

Las MSC y las células madre placentarias aisladas como se describe en el Ejemplo 1, fueron también inducidas para diferenciarse en osteoblastos mediante la incubación con DMEM/10% suero fetal bovino (FBS) acondicionado por factores de osteogénesis de los osteoblastos (p. ej . , ácido ascórbico, beta glicerofosfato y dexametasona ) durante aproximadamente 3-3.5 semanas (véase Yaccoby et al, Haematologica 91(2): 192-199 (2006) ) . Para probar los efectos sobre el crecimiento de las lineas de células de mieloma múltiple, las placas fueron lavadas con PBS para separar los factores osteoblásticos . El crecimiento de las células de mieloma múltiple en co-cultivo con los osteoblastos generados a partir de las FB-MSC o Pt-MSC disminuyó en comparación con el crecimiento de las células de mieloma múltiple en co-cultivo con FB-MSC o Pt-MSC. La diferenciación de las células madre placentarias en osteoblastos no tuvo efecto sobre el crecimiento de, o disminuyó levemente el crecimiento de, las lineas de células de mieloma múltiple en comparación con el co-cultivo con las células madre placentarias. Se repitió el experimento 3 veces para la mayor parte de las lineas celulares .

Para estudiar el posible efecto del contacto célula-célula, las células fueron cultivadas en un sistema en el que se impidió el contacto célula-célula, en particular, las MSC (FB-MSC o BM-MSC) , o las células madre placentarias aisladas como se describe en el Ejemplo 1, fueron cultivadas en un sistema TRANSWELL1']) sobre el lado posterior de las membranas TRANSWELL® de 24 pozos, mientras que las células plasmáticas de mieloma múltiple células fueron cultivadas sobre la cámara superior del dispositivo TRANSWELL®. Véase la Figura 4. Las células primarias de mieloma múltiple de 6 pacientes fueron aisladas utilizando separación de perlas inmunomagnéticas-CD138 y fueron co-cultivada a 500,000 células de mieloma múltiple/pozo con MSC o células madre placentarias (100,000 células /TRANSWELL®) durante 6-10 días. CD138 es un marcador de las células plasmáticas .

Los efectos de los co-cultivos sobre la viabilidad de las células de mieloma múltiple se determinaron por exclusión del azul de tripano y por un ensayo con MTT (bromuro de 3- ( 4 , 5-dimetiltiazol-2-ol) -2 , 5-difeniltetrazolio ) . El ensayo MTT es un ensayo colorimétrico para medir la actividad de las enzimas que reducen MTT a formazan, dando un color púrpura. Esta reducción toma lugar solamente cuando las enzimas reductasa mitocondriales son activas, y por tanto, muchas veces se utiliza la conversión como una medida de las células vi abl e s . En un experimento, las células de mieloma múltiple también fueron sometidas a análisis de flujo con anexina V/PI, como se describe en el Ejemplo 2, anterior. La supervivencia de las células primarias de mieloma múltiple se disminuyó en el co-cultivo de TRANSWETL® con células madre placentarias en comparación con la supervivencia en el co-cultivo con TRANSWELL® con MSC fetales, para las células de mieloma de la mayoría de los pacientes analizados. Véase la Figura 5. 6.3.2 Supresión de la proliferación de células de mieloma múltiple y aumento de la masa ósea in vivo con células madre placenterías El vector retroviral pLEGFP que contenía una secuencia codificante de la Proteína Fluorescente Verde Mejorada (EGFP) (Clontech, Palo Alto, California, EUA) se utilizó para transfectar de manera transitoria la línea de células empacadoras Phoenix Eco (ecotropic) utilizando el equipo SuperFect (QIAGEN Inc., Valencia, California, EUA) . La proteína EGFP es una variante roja ( red-shifted) de la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria tipo silvestre que se ha utilizado para dar fluorescencia más brillante y mayor expresión en células de mamífero. Los sobrenadantes que contenían partículas retrovirales fueron recolectados 24-48 horas después de la transfección . Para facilitar el rastreo, las células madre placentarias fueron infectadas con partículas retrovirales en presencia de 8 iq/m de polibreno durante 12 horas en cuyo momento los medios fueron sustituidos con medio de cultivo nuevo. En algunos experimentos, las células fueron expuestas a los sobrenadantes que contenían las partículas virales una vez más antes de ser seleccionadas cultivándolas en presencia de 200-400 g/mL de G438 durante 2-3 semanas.

Como alternativa al uso de tejido de hueso humano en un modelo SCID-hu de mieloma humano primario, se utilizó un sistema en el cual huesos de conejo fueron implantados en ratones SCID (ratones SCID-rab) , seguido por la introducción de células de mieloma directamente en el hueso implantado. Se construyeron ratones SCID-rab mielomatosos como se describió anteriormente. Véase Yata, y Yaccoby, S., et al, Leukemia 2004/18: 1891-1897. Los ratones CB.17/Icr-SCID (de 6-8-semanas) se obtuvieron de Harían Sprague Dawley ( Indianápolis , IN, EUA) y conejas Nueva Zelanda cargadas se obtuvieron de Myrtle Rabbitry (Thompson Station, TN, EUA) . Las conejas de 3-4 semanas fueron anestesiadas profundamente con una dosis alta de pentobarbital sódico y se sacrificaron por dislocación cervical. Los huesos fémur y tibias de las conejas fueron cortados en dos pedazos, manteniendo cerrados los extremos proximal y distal, mientras que las vertebras fueron cortadas en fragmentos pequeños (1 x 2 cm2) .

Para la implantación del hueso, el lado derecho o izquierdo de los ratones SCID fue enjuagado con alcohol y se secó con gasa estéril. El hueso del conejo fue insertado subcutáneamente a través de una pequeña incisión (5 mm) . Después la incisión fue cerrada con grapas quirúrgicas estériles y se dejó que se llevara a cabo la integración y viabilidad del tejido trasplantado durante 6-8 semanas. En algunos ratones experimentales se implantaron simultáneamente dos huesos contralaterales en el mismo ratón. Para cada experimento, 10-50 x 106 células de médula ósea de mieloma obtenidas de paciente humano que contenían 17 ± 8% de células plasmáticas (PC) o 3.3 ± 1.6 x 106 PC en 50 µ]_. de salina amortiguada con fosfatos (PBS) fueron inyectadas directamente en el hueso de conejo implantado. Al menos dos ratones se utilizaron para cada experimento. Los ratones fueron sangrados periódicamente de la vena de la cola para medir los cambios en los niveles de la inmunoglobulina humana circulante (Ig) del isotipo de la proteína M.

Se demostró el crecimiento de células de mieloma por los niveles aumentados de inmunoglobulinas monoclonales humanas (hlg) en los sueros de los ratones, como se puede observar por ELISA, y por la evaluación radiográfica de las lesiones óseas líticas. 5xl05 células madre placentarias que expresan EGFP, aisladas como se describe en el Ejemplo 1 antes de la transformación, fueron recolectadas utilizando tripsina-EDTA y fueron resuspendidas en 50 uL de PBS. Las células madre placentarias fueron inyectadas directamente en los huesos implantados de los ratones SCID-rab. Se continuaron los experimentos durante 8-16 semanas después de la inyección. Se determinaron los cambios de la densidad mineral ósea (BMD) de los huesos implantados utilizando el densitómetro PIXImus DEXA (GE Medical Systems LUNAR, Madison, WI) . Se determinó el efecto de las células madre placentarias sobre la proliferación de las células de mieloma múltiple rastreando los niveles de las inmunoglobulinas monoclonal humanas (hlg) en los sueros de los ratones, como se puede ver por el ensayo ELISA.

Se encontró que las células de mieloma múltiple de un paciente (denominado Paciente 1) crecieron en ratones SCID-rab/SCID-hu y fue posible pasarlas a ratones SCID-rab/SCID-hu recién construidos; sin embargo, éstas no pudieron crecer independientemente o sobre la capa estromal in vitro. A seis ratones SCID-rab injertados satisfactoriamente con las células de mieloma múltiple se les administró células madre placentarias transfectadas por vía intralesional , y a seis se les administró un testigo (salina amortiguada con fosfato) .

Se encontró que el crecimiento de las células de mieloma múltiple se inhibió significativamente a las dos y cuatro semanas después de la inyección de las células madre placentarias, pero no de la PBS, por detección de las inmunoglobulinas monoclonales humanas (hlg) en los sueros de los ratones, como se puede observar por el ensayo ELISA (p<0.007; Figura 6). El análisis de bioluminíscencia en los animales vivos detectó células madre placentarias que expresaran luciferasa en estos ratones; la intensidad de la bioluminiscencia a los 14 días disminuyó en todos los ratones que recibieron células madre placentarias (Tabla IB) . Además, el análisis por rayos X tomado antes de la administración de las células madre placentarias y 4 semanas después del tratamiento reveló masa ósea aumentada después de la inyección de las células madre placentarias en los huesos mielomatosos, sino masa ósea reducida en los huesos tratados con PBS, testigo (Figura 7).

Tabla IB: Resultados de los ensayos de bioluminiscencia en vivo - número de recuentos por animal.

Para probar el efecto de las células madre placentarias sobre la densidad de la masa ósea del hueso no mielomatoso, las células madre placentarias (1 x 105 células/ratón) o vehículo fueron inyectados directamente en los huesos no mielomatosos implantados en ratones SCID-rab. La inyección de las células madre placentarias, más no del vehículo, dio un aumento notable de la BMD del hueso implantado respecto a los niveles anteriores al tratamiento. Estos datos indican que la inyección de las células madre placentarias en hueso mielomatoso o no mielomatoso aumentó la masa ósea local y que la formación ósea aumentada por las células madre placentarias fue asociada con reducida carga de mieloma.

Después se utilizaron células de mieloma de un segundo paciente, denominado Paciente 2, las cuales fueron clasificadas por métodos moleculares como un subtipo de MMSET de alto riesgo (asociado con mieloma múltiple agresivo y un mal pronóstico) y expresan un nivel moderado de DKK1. Las células de mieloma del Paciente 2 no crecieron en cultivo pero fueron pasadas satisfactoriamente en el modelo SCID-rab antes descrito. Se inició el tratamiento cuando el crecimiento del mieloma fue bien establecido y fueron evidentes las lesiones osteolíticas . Las células madre placentarias fueron inyectadas por vía intralesional en el hueso implantado (0.1-1 x 106 células madre placentarias/hueso, 7 hospederos/grupo) o por vía subcutánea utilizando un portador hidrogel HyStem-C (5 x 106 células madre placentarias/ratón, 6 ratones) . Analizadas 4 semanas después del tratamiento, la inyección intralesional de 0.5 y 1 x 106 células madre placentarias dio la BMD aumentada de los huesos implantados respecto a los niveles anteriores al tratamiento (p<0.01) o la prevención de la pérdida ósea en comparación con el grupo testigo (p<0.02) (Figura 8). La masa ósea aumentada con inyección de 1 x 106 células madre placentarias además fue asociada con crecimiento disminuido del mieloma a un nivel casi significativo (p<0.08, Figura 9).

También se comparó el efecto de las células madre placentarias y las MSC fetales humanas sobre la enfermedad ósea de mieloma y el crecimiento de tumor. Las células fueron inyectadas (1 x 106 células/ratón) directamente en los huesos implantados de los ratones SCID-rab injertados con células de mieloma del Paciente 2 (7 hospedero/grupo) . El tratamiento con las células madre placentarias y las MSC produjo BMD aumentada del hueso implantado en comparación con el nivel anterior al tratamiento, sin embargo, el efecto de las células madre placentarias fue más intenso (Figura 10). El tratamiento con las células madre placentarias y las MSC inhibió significativamente el crecimiento de las células de mieloma del paciente #2 en el modelo de ratones SCID-rab (Figura 11). Estos resultados sugieren que, aunque las MSC y las células madre placentarias son eficaces para aumentar la BMD de los huesos afectados con mieloma, las células madre placentarias tienen potencial anabólico óseo mayor que las MSC fetales .

Asi pues, este Ejemplo demuestra que las células madre placentarias pueden disminuir significativamente la viabilidad de las células de mieloma múltiple, particularmente cuando se administran por via intralesional en los individuos mielomatosos . Las células madre placentarias también pueden disminuir la viabilidad de las células de mieloma múltiple in vítro en condiciones que permitan el contacto célula-célula y en condiciones que impidan el contacto célula-célula. Junto con la capacidad de las células madre placentarias para reparar el hueso, p. ej . , las lesiones óseas que son sintomáticas de mieloma múltiple, y para inhibir la maduración de los osteoclastos , una causa importante del desarrollo de lesiones óseas relacionadas con mieloma múltiple, estos resultados indican que las células madre placentarias pueden ser una terapéutica útil contra mieloma múltiple. 6.4 EJEMPLO 4: LAS CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS FAVORECEN LA DETENCIÓN DEL CICLO DE LAS CELULAS DE MIELOMA MÚLTIPLE Este Ejemplo demuestra que las células madre placentarias que se adhieren al plástico para cultivo de tejido (las PDAC) suprimen el crecimiento de las células de mieloma múltiple. 6.4.1 Las células madre placentarias suprimen la proliferación de las célula de mieloma múltiple Para estudiar el efecto de las células madre placentarias sobre el crecimiento de las células de mieloma múltiple, las células madre placentarias, aisladas como se describe en el Ejemplo 1, fueron co-cultivadas con 6 lineas de células de mieloma múltiple (las MMCL) , denominadas U-266 (American Type Culture Collection (ATCC) No. Catálogo TIB-196) , RPMI-8226 (ATCC No. Catálogo CCL-155), L-363 (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) No. Catálogo ACC49), H929 (Gazdar, Blood 67: 1542-1549 (1986)), LP-1 ( DSMZ No. Catálogo ACC41) y OPM-2 ( DSMZ No. Catálogo ACC-50) . Las cuatro lineas de células de mieloma múltiple seleccionadas para estos experimentos representan la heterogeneidad de las células de mieloma múltiple, como se puede observar por las diferencias en la producción de inmunoglobulinas (véase la Tabla 2) y las diferencias en la expresión de los marcadores celulares (véase las Tablas 3A-3C) .

Tabla 2: Producción de tipos de inmunoglobulina por las lineas de células de mieloma múltiple Tabla 3A-3C: Marcadores celulares expresados por lineas de células de mieloma múltiple (expresadas porcentaje de células que expresan un marcador).

Tabla 3A.

Tabla 3B.

Tabla 3C.

Células madre placentarias del pase 6, aisladas como se describe en el Ejemplo 1, fueron descongeladas con DMEM + 10% de suero fetal bovino (FCS) . 5 x 104 células madre placentarias por pozo fueron sembradas en placas de 24 pozos. Después de que las células madre placentarias crecieron hasta confluencia, con un cambio de medio, 5 x 104 células M CL por pozo fueron sembradas en la parte superior de las células madre placentarias, y se incubaron a 37°C con 5% C02 durante 4-5 días. Las células MMCL fueron cosechadas en los días 1, 2 y 5 del cultivo para otro análisis. Las células fueron contadas utilizando el sistema EASYCOUNT™ System (Immunicon) .

Los resultados indicaron que las células madre placentarias obtuvieron inhibición de crecimiento significativo de las lineas de células de mieloma múltiple U266 (p<0.001 en el día 5 del co-cultivo), RPMI-8226 (p<0.03 en el día 5 del co-cultivo), H929 (p<0.003 en el día 4 del co-cultivo), y OPM-2 (p<0.01 en el día 5 del co-cultivo) , en comparación con aquellas células de mieloma múltiple cultivadas solas. Véase la Figura 12. En otros experimentos, el co-cultivo de células L-363 con células madre placentarias dio como resultado una inhibición considerable del crecimiento (p<0.06 en el día 5 del co-cultivo) , y el co-cultivo de células LP-1 con células madre placentarias también dio como resultado inhibición del crecimiento. 6.4.2 Las células madre placentarias provocan la regulación descendente de la expresión de las células de mieloma múltiple de los genes que codifican las proteínas que desempeñan funciones importantes en la señalización de NF-?? y la activación de las células B Para caracterizar mas la inhibición del crecimiento de las células madre placentarias sobre las líneas de las células de mieloma múltiple, las células madre placentarias, aisladas como se describe en el Ejemplo 1, fueron co-cultivadas con células U-266, RPMI-8226, OP -2 y H929 durante 4 días, luego las células de mieloma múltiple co-cultivadas con las células madre placentarias, o las células de mieloma múltiple cultivadas solas fueron recolectadas pipeteando suavemente sin romper las células madre placentarias seguido por la preparación del RNA y el análisis de la PCR en tiempo real, cuantitativa (qRT-PCR) . El análisis qRT-PCR se hizo utilizando tarjetas microfluídicas de 384 pozos (TAQMAN® Custom Array, Applied Biosystems), las cuales permiten hacer reacciones de PCR en tiempo real simultáneas. Las tarjetas contenían 300 genes implicados en la regulación del ciclo celular, el crecimiento y proliferación celular, y la respuesta inmunitaria hormonal, incluidos los genes implicados en la señalización de las células B y la señalización de NF-KB. El análisis qRT-PCR se hizo utilizando el sistema 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems), y se analizaron los datos utilizando el programa informático REALTIME STATMINER®.

El co-cultivo ccn células madre placentarias reguló significativamente en forma descendente los genes que codifican los componentes clave de la activación de las células B, incluido^ TRAFl (Factor asociado a los receptores de TNF 1), TRAF6, y genes que codifican componentes importantes de la vía de señalización de NF-KB, incluida TIRAP (proteina adaptadora que contiene el dominio TIR de los receptores de Toll-Interleucina 1 ) ; p65/RelA y RelB. Véase la Tabla 4, más adelante.

La proteina DKK1, una proteina producida por las células de mieloma múltiple, inhibe la actividad de los osteoblastos e inclina el equilibrio entre osteoblastos y osteoclastos en favor de la resorción ósea. Después del co-cultivo con las células madre placentarias como se indica en lo anterior, la expresión de DKK1 en células OPM-2 fue regulada en descenso también. Véase la Tabla 4.

Tabla 4. Relación de los cambios de la expresión génica en células OPM-2 co-cultivadas con células madre placentarias en comparación con células OPM-2 solas. Se calculó la desviación estándar para la media de la relación de cambios en 2 réplicas. 6.4.3 Las células madre placentarias provocan la regulación descendente de la expresión de las células de mieloma múltiple de los genes que codifican ciclinas y los CDK, y regulan en forma ascendente los genes que codifican los inhibidores de CDK El efecto de las células madre placentarias (las PDAC) , aisladas como se describe en el Ejemplo 1, sobre la expresión de las ciclinas (las CCN) y las cinasas dependientes de ciclina (CDK) se analizó utilizando qRT-PCR utilizando tarjetas microfluidicas de 384 pozos que contenían genes implicados en la regulación del ciclo celular, como ya se describió, y fueron analizadas utilizando el análisis Ingenuity Pathways Analysis (INGENUITY® Systems, www.ingenuity.com) . Se encontró que las células madre placentarias disminuyen la expresión en las lineas de células de mieloma múltiple célula de los genes que codifican ciertas CCN y CDK, y aumentan la expresión de los genes para ciertos inhibidores de CDK en una forma especifica para el tipo de célula. Por ejemplo, en la linea de células de mieloma múltiple OPM-2, los marcadores CDK: CDK3, CDK5, y CDK7 fueron regulados en forma descendente; en las lineas de células de mieloma múltiple RPM1-8226 y U-266, CDK4 fue regulado en forma descendente. Por el contrario, en la linea de células de mieloma múltiple OPM-2, los inhibidores de CDK, pl6 y pl9, y el inhibidor de CDK 3 fueron regulados en forma ascendente; en la linea de células de mieloma múltiple RPMI-8226, el inhibidor de CDK pl9 fue regulado en forma ascendente; en la linea de células de mieloma múltiple U266, p21 fue regulado en forma ascendente; y en la linea de células de mieloma múltiple H929, pl9, p21 y p27 fueron regulados todos en forma ascendente.

Un resumen de los cambios en la expresión de los genes que regulan el ciclo celular se presenta más adelante en las Tablas 5A-5D.

Tablas 5A-5D. Relación del cambio de la expresión génica en células de mieloma múltiple co-cultivadas con células madre placentarias en comparación con células de mieloma múltiple solas para las lineas de células de mieloma múltiple célula OPM-2, U-266, RPMI-8226 y H929. Se calculó la desviación estándar para la media de la relación del cambio en 2 réplicas.

Tabla 5A. OPM-2 Tabla 5C. RPMI-8226 Tabla 5D. H929 También se encontró que las células madre placentarias, aisladas como se describe en el Ejemplo 1, disminuyen la expresión en las lineas de células de mieloma múltiple de los genes que codifican los miembros de la familia E2F 3, 4, 5 y 6 (proteínas que desempeñan una función importante en la transición de la fase d a la S) y Rb fosforilada (proteina de retinoblastoma) . Este hallazgo es significativo porque en el estado hipofosforilado, Rb actúa como supresor de tumor inhibiendo los factores de la familia E2F; sin embargo, Rb fosforilada tiene poca función inhibidora sobre el progreso del ciclo celular.

Para investigar más el efecto de las células madre placentarias sobre la proliferación de las células de mieloma múltiple, el estado de fosforilación de la proteína de Retinoblastoma (Rb) fue analizado por citometría de flujo utilizando el anticuerpo monoclonal J146-35 (BD Pharmingen, # Cat . 558549) y el anticuerpo monoclonal J112-906 (# Cat. 558549, BD) . El anticuerpo J146-35 reconoce la Rb fosforilada en serina 780 (pS780), la cual afecta la unión de Rb a E2F, y el anticuerpo J112-906 reconoce la proteína Rb fosforilada en las serinas 807 y 811 (pS807/pS811) , las cuales regulan la unión de c-Abl y el progreso del ciclo celular. Las células H929, LP1 y OPM2 co-cultivadas con las células madre placentarias mostraron fosforilación de Rb disminuida en pS780, y en pS807/pS811, respecto a las células cultivadas solas. Véase las Figuras 13A-13C.

El efecto de las células madre placentarias sobre la proliferación de las lineas de células de mieloma múltiple además fue ensayado utilizando los colorantes fluorescentes BrdU y 7-AAD con un kit APC BrdU flow (#Cat. 552598, BD biosciences ) . El co-cultivo con las células madre placentarias dio como resultado un porcentaje aumentado de células de mieloma múltiple en la fase G0/G1, y un porcentaje disminuido de estas células en la fase S, para las lineas de células RPMI-8226, OPM-2 y U266, en comparación con las células de mieloma múltiple cultivadas solas. Véase la Tabla 6.

Tabla 6. Análisis celular de las MMCL: co-cultivo con células madre placentarias Las células de mieloma múltiple secretan en forma aberrante niveles elevados de inmunoglobulinas . Para estudiar el efecto de las células madre placentarias sobre la producción de inmunoglobulina por las lineas de células de mieloma múltiple, se analizó por citometria de flujo la producción de inmunoglobulina superficial o intracelular por parte de las MMCL co-cultivadas con las células madre placentarias, o las MMCL cultivadas solas. Se observó producción disminuida de inmunoglobulinas a partir de las lineas de células de mieloma múltiple H929, OPM2 y LP1 cuando fueron co-cultivadas con células madre placentarias en comparación con las células de mieloma múltiple cultivadas solas. Por ejemplo, las células H929 co-cultivadas mostraron producción disminuida de inmunoglobulina Kappa (?) ; las células OPM2 co-cultivadas mostraron producción disminuida de la inmunoglobulina Lambda (?) ; y las células LP1 co-cultivadas mostraron producción disminuida de la inmunoglobulina Lambda superficial e intracelular y de la IgG y de la inmunoglobulina Kappa intracelular, en comparación con las células solas. Véase la Tabla 7.

Tabla 7. Cambio de la media geométrica de la producción de Ig en el sistema de co-cultivo de MMCL: células madre placentarias Ig: tipo de inmunoglobulina Los resultados anteriores demostraron que la disminución de la proliferación de las células de mieloma múltiple por las células madre placentarias no se debió a un efecto general del co-cultivo de las células madre placentaria con otros tipos de células, sino fue especifica para las células de mieloma múltiple. Por ejemplo, se encontró que las células madre placentarias aumentan la expansión de las células hematopoyét icas CD34+ cuando se co-cult ivaron en diferentes proporciones (10:1, 1:1 y 1:10) durante 7 días.

Así pues, los estudios anteriores demuestran que las células madre placentarias , cuando se co-cultivan con líneas de células de mieloma múltiple, disminuyen la velocidad de crecimiento de las células de mieloma múltiple, regulan de manera descendente la expresión de los genes de la línea de células de mieloma múltiple que codifican las proteínas del ciclo celular necesarias para la progresión a lo largo del ciclo celular, y regulan de manera ascendente los genes que codifican los inhibidores de la progresión del ciclo celular. Como tales, las células madre placentarias serían útiles para disminuir la proliferación de células de mieloma múltiple in vivo. 6.5 EJEMPLO 5: USO DE LAS CÉLULAS MADRE PLACENTARIAS PARA SUPRIMIR EL CRECIMIENTO DE CÉLULAS DE CONDROSARCOMA Este Ejemplo demuestra que las células madre placentarias (PDAC) suprimen la proliferación de células de condrosarcoma en cultivo.

Cultivo TRANSWELL®: Para examinar los efectos de las células madre placentarias, aisladas como se describe en el Ejemplo 1, sobre el crecimiento de las células tumorales en un sistema de co-cultivo TRANSWELL®, 1 x 104 o 5 x l4 PDAC fueron sembradas sobre la cámara inferior del sistema TRANS ELL® en 600 de medio de crecimiento y 1 x 104 células de condrosarcoma (ATCC® No. CRL-7891; 400 µ?? en medio de crecimiento) fueron sembradas sobre la cámara alta del sistema TRANSWELL® (3 ym de diámetro). Las células de condrosarcoma fueron cultivadas solas sin células madre placentarias como testigo. Todos los co-cultivos TRANSWELL® fueron preparados en placas de 24 pozos y cada condición fue establecida por triplicado. Después de 7 días de cultivo en el incubador del cultivo de células a 37°C bajo 5% de 0?2, las células de condrosarcoma de la cámara superior fueron examinadas utilizando un microscopio Leica.

El condrosarcoma es un cáncer caracterizado por la producción de matriz de cartílago alrededor de las células tumorales. De acuerdo con esta sintomatología, en el experimento con el sistema TRANSWELL®, las células de condrosarcoma crecieron como agregados separados, claramente visibles bajo el microscopio, en ausencia de células madre placentarias. En presencia de células madre placentarias en ambas proporciones analizadas, hubo visiblemente menos células de condrosarcoma y las células fueron caracterizadas por una ausencia completa de agregados celulares que caracterizaron el crecimiento solo de las células de tumor. Como tales, las células madre placentarias claramente inhibieron el crecimiento de las células de condrosarcoma . 6.6 EJEMPLO 6: INHIBICIÓN DE LA OSTEOCLASTOGENESIS UTILIZANDO LENALIDOMIDA Este Ejemplo demuestra que para suprimir la osteoclastogénesis es posible utilizar lenalidomida molécula pequeña (comercializada con la marca REVLIMID®; 3- ( 4-amino-l-oxo 1, 3-dihidro-2H-isoindol-2-il ) piperidin-2, 6-diona) .

El compuesto lenalidomida tiene un intenso efecto anti-osteoclastogénico en concentraciones alrededor de 1 µ?, generando una declinación progresiva en el número de los osteoclastos que se forman (Figura 14) . Cuando los precursores de los osteoclastos cultivados con las células madre placentarias, aisladas como se indica en el Ejemplo 1, con 0.1 µ? o 1 µ? de lenalidomida, se compararon con los osteoclastos que crecieron con células madre placentarias o células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea (BM- SC) , se encontró que lenalidomida disminuye más el número de los osteoclastos que se diferenciaron a partir de los precursores de los osteoclastos. Figura 15. Por tanto, existe un posible efecto sinérgico o aditivo anti-osteoclastogénico de las PDAC y lenalidomida en la concentración de entre aproximadamente 0.1 µ hasta 1 µ?.

Por tanto, lenalidomida sola y lenalidomida en combinación con células madre placentarias son eficaces para disminuir el número de los precursores de los osteoclastos, y por tanto, debe ser terapéutica para disminuir el número y/o gravedad de las lesiones óseas asociadas con cáncer relacionado con el hueso, como puede ser mieloma múltiple.

Equivalentes : La presente descripción no está limitada en su alcance por las modalidades especificas que se describen en la presente. En realidad, diversas modificaciones del tema que se proporciona en la presente, además de los descritos, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción antes mencionada y las figuras acompañantes. Tales modificaciones están destinadas a entrar dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

Diversas publicaciones, patentes y solicitudes de patente se mencionan en la presente, las descripciones de las cuales se incorporan para referencia en su totalidad.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para suprimir la proliferación de las células de un cáncer relacionado con el hueso, que consiste en poner en contacto las células de un cáncer relacionado con el hueso con una pluralidad de células madre placentarias durante un tiempo suficiente para que las células madre placentarias supriman la proliferación de las células del cáncer relacionado con el hueso, en comparación con una pluralidad de células de un cáncer relacionado con el hueso que no entren en contacto con las células madre placentarias, en donde las células madre placentarias son adherentes al plástico para cultivo de tejido, son CD34", CD10+, CD105+ y CD200+, tal y como se puede detectar por citometria de flujo, y no son trofoblastos , citotrofoblastos ni células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea.

2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las células de un cáncer relacionado con el hueso son células de mieloma múltiple.

3. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las células de un cáncer relacionado con el hueso son células de condrosarcoma .

4. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las células de un cáncer relacionado con el hueso son células de cáncer de hueso, células de neuroblastoma, células de osteosarcoma , células de sarcoma de Ewing, células de cordoma, células de un histiocitoma fibroso maligno de hueso, células de cáncer de próstata o células de un fibrosarcoma de hueso.

5. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las células de un cáncer relacionado con el hueso no son células de cáncer de próstata.

6. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las células placentarias son CD34~, CD45", CD10+, CD90+, CD105+ y CD200"1", tal y como se pueden detectar po9r citometria de flujo.

7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las células placentarias son CD34~, CD45", CD10+, CD80", CD86", CD90+, CD105+ y CD200", como se puede detectar por citometria de flujo.

8. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el contacto se hace in vitro.

9. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque el contacto se hace in vivo.

10. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque el contacto consiste en administrar las células madre placentarias a un individuo humano que tenga células de un cáncer relacionado con el hueso.

11. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque el contacto consiste en administrar las células madre placentarias al individuo en o junto a una lesión ósea ocasionada por el cáncer relacionado con el hueso.

12. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque el contacto consiste en administrar al menos 1 x 108 de las células madre placentarias al individuo .

13. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque las células placentarias suprimen la proliferación de las células de un cáncer relacionado con el hueso en al menos 50% en comparación con la proliferación de un número equivalente de células de un cáncer relacionado con el hueso en ausencia de las células placentarias.

14. Un método para tratar a un individuo humano que tenga un cáncer relacionado con el hueso, que consiste en administrar al individuo una cantidad terapéutica eficaz de las células madre placentarias durante un tiempo suficiente para que las células madre placentarias mejoren uno o más síntomas de, o disminuyan la progresión de, el cáncer relacionado con el hueso, en donde las células madre placentarias son adherentes al plástico del cultivo de tejido, son CD34", CD10+, CD105+ y CD200+ como se puede detectar por citometría de flujo; no son trofoblastos, citotrofoblastos ni células madre mesenquimales obtenidas de médula ósea, y tienen la capacidad para diferenciarse en células osteogénicas o condrogénicas .

15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque el cáncer relacionado con el hueso es mieloma múltiple.

16. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque el cáncer relacionado con el hueso es condrosarcoma .

17. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque el relacionado con el hueso es cáncer óseo, neuroblastoma , osteosarcoma , sarcoma de Ewing, cordoma, hist iocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer prostático o fibrosarcoma de hueso.

18. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque las células de un cáncer relacionado con el hueso no son células de cáncer prostático.

19. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque las células madre placentarias son CD34", CD45", CD10+, CD90+ , CD105+ y CD200+, como se puede detectar por citometria de flujo.

20. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque las células madre placentarias son CD34", CD45", CD10+ , CD8CT, CD86", CD90+ , CD105+ y CD200+, como se puede detectar por citometria de f luj o .

21. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque las células madre placentarias se administran al individuo por vía intravenosa.

22. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque las células madre placentarias se administran al individuo en o junto a una lesión ósea ocasionada por cáncer relacionado con el hueso.

23. El método de la reivindicación 14, que consiste en administrar al menos 1 x 108 células placentarias al individuo .

24. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque las células placentarias suprimen la proliferación de las células del cáncer relacionado con el hueso en al menos 50%, en comparación con la proliferación de un número equivalente de células de cáncer relacionado con el hueso en ausencia de células placentarias .