KR20080097190A

KR20080097190A - 태반 줄기세포의 수집과 보존을 위한 개선된 조성물과 이조성물의 이용 방법

Info

Publication number: KR20080097190A
Application number: KR1020087018724A
Authority: KR
Inventors: 제임스 더블유. 에딘져; 모하메드 헤이다란; 울프강 호프가르트너
Original assignee: 안트로제네시스 코포레이션
Priority date: 2005-12-29
Filing date: 2006-12-28
Publication date: 2008-11-04
Also published as: US10590381B2; WO2007079185A3; JP2009521931A; US20070190042A1; ZA200804717B; US20100291679A1; US9725694B2; US9598669B2; US20190376027A1; IL191771A; EP1974013A2; CN101374941A; IL191771A0; US20170327788A1; PE20071015A1; CA2633980A1; AU2006332680A1; WO2007079185A2

Abstract

본 발명은 태반 등의 장기로부터 줄기세포를 수집하기 위한 개선된 조성물과 방법을 제공한다. 본 발명은 세포 자멸사 억제제를 포함하는 줄기세포 수집용 조성물로서, 선택적인 성분으로는 단백질 분해 효소 또는 점액 분해효소 등의 효소, 단백질 분해효소, 혈관 확장제, 세포 괴사 억제제, 산소 운반 퍼플루오로카본 또는 장기 저장용 화합물을 포함할 수 있다. 본 발명은 이 줄기세포 수집용 조성물을 이용하여 줄기세포를 수집하고 줄기세포군을 보존하는 방법을 제공한다.

태반, 줄기세포, 세포 자멸사, 보존

Description

태반 줄기세포의 수집과 보존을 위한 개선된 조성물과 이 조성물의 이용 방법{Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition}

본 발명은 태반 줄기세포의 수집, 예를 들어 관류 또는 태반 혹은 태반 일부의 물리적 및/또는 효소 파괴에 의한 수집을 위한 개선된 방법과 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 이들 줄기세포를 수집하는 방법에 관련된다. 본 명세서에서 개시하는 조성물은 식염수처럼 생리적으로 허용되는 수용액, 하나 이상의 단백질 분해 효소, 하나 이상의 JNK(c-Jun-N-말단 키나아제) 억제제를 포함한다. 선택적으로 본 조성물은 TNF-α의 활성을 조절(예를 들어 억제)하는 화합물, 면역 조절 화합물, 혈관 확장제, 세포 괴사(necrosis) 억제제, 산소 운반 퍼플루오로카본 또는 이 모든 성분의 조합을 더 포함할 수 있다. 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 줄기세포와 줄기세포군을 수집하고 보존하는 방법을 제공한다.

사람 줄기세포는 다양한 종류의 성숙한 사람 세포 계통을 발생할 수 있는 전능(全能 totipotent) 또는 다능성(多能性 pluripotent) 전구세포(precursor cell)들이다. 줄기세포를 이용하여 전체는 아니더라도 다수의 조직을 재생하고, 생리적 기능과 해부적 기능을 복원할 수 있다는 증거가 나온 바 있다.

포유류 줄기세포에 대해서는 많은 다른 유형이 특성화된 바 있다. 예를 들어 Caplan 외, 미국 특허 제 5,486,359호(사람 중간엽 줄기세포); Hu 외, WO 00/73421(사람 양막 상피세포의 분리, 냉동보존과 치료 이용법); Beltrami 외, Cell 114(6):763~766(2003)(심장 줄기세포); Forbes 외, J. Pathol. 197(4):510~518(2002)(간 줄기세포)를 참조하라. 제대혈과 제대혈 유래 전체 유핵세포는 절제 치료를 겪은 환자들의 조혈 기능을 전부 혹은 부분적으로 복원하는데 쓰여 왔다.

태반은 특히 매력적인 줄기세포원이다. 예를 들어 Hariri의 미국 특허 출원 공개 공보 제 2002/0123141와 2003/0032179호를 참조하라. 비록 태반을 손쉽게 얻을 수는 있지만 각 태반에서 얻는 줄기세포의 수를 최대화하는 것이 바람직하다. 다른 세포 유형처럼 줄기세포는 수집과 저장 과정에서 일어나는 환경 변화에 민감하다. 이러한 변화는 줄기세포의 세포 자멸사(apoptosis) 또는 괴사(necrosis)를 불러올 수 있다. 따라서 하나의 태반으로부터 더 많은 수의 줄기세포를 회수하기 위하여 출산 후 포유류 태반으로부터 줄기세포를 수집하는 더 향상된 방법과 조성물에 대한 필요성이 존재한다.

발명의 요약

본 발명은 태반 등의 장기를 관류하고 보존하여 줄기세포의 회수를 용이하게 하는 개선된 방법과 조성물 및 이 조성물을 이용하여 줄기세포를 수집하는 방법을 제공한다.

한 실시 태양에서 본 발명은 줄기세포의 분리 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포를 세포 자멸사 억제제를 포함하는 용액에 접촉시키고, 상기 줄기세포를 분리하는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서 본 발명은 줄기세포의 분리 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포 괴사 억제제를 함유하는 용액에 줄기세포를 접촉시키는 단계와 상기 줄기세포를 분리하는 단계를 포함한다.

상기 실시 태양들 중 한 구체적인 태양에서는 상기 세포 자멸사 억제제가 카스파제(caspase) 억제제이다. 다른 구체적 태양에서는, 상기 자멸사 억제제가 c-Jun N-말단 키나아제(JNK) 억제제이다. 더 구체적인 실시 태양에서는, 상기 JNK 억제제는 상기 줄기세포의 분리 전에 상기 줄기세포의 분화 또는 증식을 조절하지 않는다. 다른 구체적 태양에서 상기 방법은 세포 괴사를 억제하는 화합물에 상기 줄기세포를 접촉하는 단계를 더 포함한다. 다른 구체적 태양에서는 상기 줄기세포를 포유류 태반, 탯줄, 태반 혈액 또는 제대혈에서 분리한다. 다른 구체적 실시 태양에서, 이 방법은 상기 줄기세포를 산소 운반 퍼플루오로카본과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 다른 구체적 실시 태양에서, 이 방법은 상기 줄기세포를 단백질 분해효소와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 더 구체적인 실시 태양에서 상기 단백 분해효소는 매트릭스 금속단백 분해효소 또는 중성 단백 분해효소이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 매트릭스 금속단백 분해효소는 콜라게나아제이다. 다른 구체적인 실시 태양에서, 상기 중성 단백 분해효소는 써모리신 또는 디스파제이다. 다른 특정 실시 태양에서, 이 방법은 상기 줄기세포를 점액 분해 효소에 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 더 구체적인 태양에서, 상기 점액 분해효소는 히알루로니다제(hyaluronidase)이다. 상기 방법의 다른 특정 실시 태양에서, 상기 용액은 식염수 또는 배양액이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 용액은 히드록시에틸 녹말, 락토비온산 음이온과 라피노스를 더 포함할 수 있다. 다른 구체적 실시 태양에서 상기 용액은 UW 용액을 포함한다.

다른 구체적 실시 태양에서 상기 줄기세포는 조직을 효소 소화를 포함하는 방식으로 물리적 파괴함으로써 상기 조직으로부터 분리된다. 더 구체적인 실시 태양에서 상기 줄기세포는 태반의 적어도 일부를 효소 소화함으로써 상기 태반으로부터 분리된다.

다른 특정 태양에서, 상기 포유류 태반은 상기 물리적 파괴 전에 실혈된다. 다른 특정 태양에서, 상기 줄기세포는 상기 포유류 태반으로부터 분리되고, 이 분리 작업은 관류액으로 상기 포유류 태반을 관류함으로써 이루어진다. 더 구체적인 태양에서, 상기 관류는 상기 포유류 태반에서 관측 가능한 수의 줄기세포를 얻는데 충분한 시간 동안 충분한 양의 상기 관류액으로 상기 포유류 태반을 관류함으로써 이루어진다. 더 구체적인 실시 태양에서 상기 포유류 태반은 상기 관류 전에 방혈된다. 더 구체적인 태양에서 상기 관류는 상기 관류액을 상기 태반의 제대 동맥과 제대 정맥 중 어느 한쪽이나 양쪽으로 통과시킴으로써 이루어진다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 관류액은 0.9％ NaCl 용액 또는 인산 완충액이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 관류는 상기 관류액을 약 500 mL 내지 약 2000 mL 사용하거나 약 750 mL 사용한다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 관류는 여러 차례 이루어진다.

다른 특정 태양에서 상기 줄기세포는 분만 후에 저산소 조건하에 놓이는 시간이 72시간 미만인데, 여기서 저산소 조건이란 정상적 혈액 산소 농도보다 낮은 산소 농도를 말한다. 더 구체적인 태양에서 상기 줄기세포는 상기 저산소 조건에 노출되는 시간이 24 시간 미만이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 줄기세포는 상기 저산소 조건에 노출되는 시간이 6시간 미만이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 줄기세포는 저산소 조건에 노출되지 않는다.

다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 상기 분리 과정에서 전단 응력을 받지 않는다.

다른 특정 태양에서 상기 JNK 억제제는 인다졸(indazole)이다. 다른 특정 태양에서 상기 JNK 억제제는

의 구조를 가지는데, 여기서

A는 직접 결합, -(CH₂) _a -, -(CH₂) _b CH=CH(CH₂) _c -, 또는 -(CH₂) _b C≡C(CH₂) _c -;

R₁은 아릴, 헤테로아릴 또는 페닐기에 융합한 헤테로고리로서, 각각 R₃에서 독립적으로 선택된 하나 내지 네 개의 치환기로 선택적 치환이 가능하며,;

R₂는 -R₃, -R₄, -(CH₂) _b C(=O)R₅, -(CH₂) _b C(=O)OR₅, -(CH₂) _b C(=O)NR₅R₆, -(CH₂) _b C(=O)NR₅(CH₂) _c C(=O)R₆, -(CH₂) _b NR₅C(=O)R₆,-(CH₂) _b NR₅C(=O)NR₆R₇, -(CH₂) _b NR₅R₆, -(CH₂) _b OR₅, -(CH₂) _b SO _d R₅또는 -(CH₂) _b SO₂NR₅R₆이고;

a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6;

b와 c는 0, 1, 2, 3 또는 4 중에서 독립적으로 선택되며, 각각의 경우 서로 같거나 다를 수 있고;

d는 각 경우에 0, 1 또는 2;

R₃은 각각의 경우 독립적으로 할로겐, 히드록시, 카르복시, 알킬, 알콕시, 할로알킬, 아실옥시, 티오알킬, 술핀일알킬, 술폰일알킬, 히드록시알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 헤테로고리알킬, -C(=O)OR₈, -OC(=O)R₈, -C(=O)NR₈R₉, -C(=O)NR₈OR₉, -SO₂NR₈R₉, -NR₈SO₂R₉, -CN, -NO₂, -NR₈R₉, -NR₈C(=O)R₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b OR₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b R₉, -O(CH₂) _b NR₈R₉, 또는 페닐기에 융합된 헤테로고리;

R₄는 각각 R₃에서 독립적으로 선택되는 치환기 하나 내지 네 개로 선택적으로 치환될 수 있는 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이거나, R₄는 할로겐 또는 히드록시이며;

R₅, R₆과 R₇은 같거나 다르며, 각각의 경우 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이고, 이때 R₅, R₆과 R₇각각은 선택적으 로 R₃로부터 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 치환될 수 있으며,

R₈과 R₉는 같거나 다르며, 각각의 경우 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이거나, R₈과 R₉가 모두 이들과 결합한 원자와 함께 헤테로고리를 이루며, 이때 R₈과 R₉가 각각인 경우, 또 R₈과 R₉가 함께 헤테로고리를 이룬 경우에 이들은 R₃에서 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다.

다른 특정 실시 태양에서 상기 JNK 억제제는

의 구조를 가지는데 여기서,

R₁은 R₇에서 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있는 아릴 또는 헤테로아릴;

R₂는 수소;

R₃은 수소 또는 저급 알킬;

R₄는 하나 내지 네 개의 선택적 치환기를 나타내는데, 여기서 각 치환기는 같거나 다르며, 할로겐, 히드록시, 저급 알킬과 저급 알콕시의 군으로부터 독립적으로 선택되고;

R₅와 R₆은 같거나 다르며, 독립적으로 -R₈, -(CH₂) _a C(=O)R_9, -(CH₂) _a C(=O)OR₉, -(CH₂) _a C(=O)NR₉R₁₀, -(CH₂) _a C(=O)NR₉(CH₂) _b C(=O)R₁₀, -(CH₂) _a NR₉C(=O)R₁₀, (CH₂) _a NR₁₁C(=O)NR₉R₁₀, -(CH₂) _a NR₉R₁₀, -(CH₂) _a OR₉, -(CH₂) _a SO _c R₉또는 -(CH₂ ) _a SO₂NR₉R₁₀이거나; 혹은

R₅와 R₆이 모두 그들에 결합한 질소 원자와 더불어 헤테로고리 또는 치환 헤테로고리를 이루며;

R₇은 각 경우에 독립적으로 할로겐, 히드록시, 시아노, 니트로, 카르복시, 알킬, 알콕시, 할로알킬, 아실옥시, 티오알킬, 술핀일알킬, 술폰일알킬, 히드록시알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 치환 헤테로고리, 헤테로고리알킬, -C(=O)OR₈, -OC(=O)R₈, -C(=O)NR₈R₉, -C(=O)NR₈OR₉, -SO_cR₈, -SO_cNR₈R₉, -NR₈SO _c R₉, -NR₈R₉, -NR₈C(=O)R₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b OR₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b R₉, -O(CH₂) _b NR₈R₉, 또는 페닐기에 융합한 헤테로고리이고;

R₈, R₉, R₁₀과 R₁₁은 같거나 다르며, 각 경우에 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 헤테로고리알킬이거나; 혹은

R₈과 R₉가 모두 그들과 결합한 원자(들)과 더불어 헤테로고리를 이루며;

a와 b는 서로 같거나 다를 수 있고 각 경우에 0, 1, 2, 3 또는 4 중에서 독립적으로 선택되며,

c는 각 경우에 0, 1 또는 2이다.

다른 특정 태양에서 상기 JNK 억제제는

의 구조를 가지는데, 여기서

R₀은 -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, NH 또는 -CH₂-이고;

상기 구조 (III)의 화합물은 (i) 무치환, (ii) 모노치환물이고 제1 치환기가 있거나, 또는 (iii) 이중치환물이고 제1과 제2 치환기가 있으며;

상기 제1 또는 제2 치환기는 존재할 경우 3, 4, 5, 7, 8, 9, 또는 10 위치에 있는데, 이때 제1과 제2 치환기는 존재할 경우 독립적으로 알킬, 히드록시, 할로겐, 니트로, 트리플루오로메틸, 술폰일, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬옥시, 사이클로알킬옥시, 알콕시알킬, 알콕시알콕시, 아미노알콕시, 모노-알킬아미노알콕시, 디-알킬아미노알콕시 또는 구조 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)로 나타낸 작용기이고,

이때 R₃과 R₄는 모두 알킬리덴이거나 헤테로원자를 포함하는 고리형 알킬리덴이고, 혹은 R₃과 R₄는 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 아릴옥시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 모노-알킬아미노알킬 또는 디-알킬아미노알킬이며;

R₅는 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 아미노, 모노-알킬아미노, 디-알킬아미노, 아릴아미노, 아릴알킬아미노, 사이클로알킬아미노, 사이클로알킬알킬아미노, 아미노알킬, 모노-알킬아미노알킬 또는 디-알킬아미노알킬이다.

더 구체적인 실시 태양에서 본 방법은 상기 줄기세포를 면역 조절 화합물에 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 더 구체적인 태양에서 상기 면역 조절 화합물은 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온; 3-(4'-아미노이소인돌린-1'-온)-1-피페리딘-2,6-디온; 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온; 또는 α-(3-아미노프탈이미도)글루타르이미드이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 면역 조절 화합물은

의 구조를 가지는데, 여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고, 나머지는 C=O 또는 CH₂이며, R²는 수소 또는 저급 알킬 또는 약학적으로 허용되는 염류, 수화물(hydrate), 용매화물(solvate), 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물 또는 이들 입체 이성질체의 혼합물이다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 면역 조절 화합물은

의 구조를 가지는데, 여기서

X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂ 또는 C=O ;

R¹은 H, (C₁~C₈) 알킬, (C₃~C₇)사이클로알킬, (C₂~C₈)알켄일, (C₂~C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₀~C₄)알킬-(C₁~C₆)헤테로고리알킬, (C₀~C₄)알킬-(C₂~C₅)헤테로아릴, C(O)R³, C(S)R³, C(O)OR⁴, (C₁~C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁~C₈)알킬-OR⁵, (C₁~C₈)알킬-C(O)OR⁵, C(O)NHR³, C(S)NHR³, C(O)NR³R^3', C(S)NR³R^3' 또는 (C₁~C₈)알킬-O(CO)R⁵;

R²는 H, F, 벤질, (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, 또는 (C₂-C₈)알킨일;

R³과 R^3'은 독립적으로 (C₁-C₈)알킬, (C₃-C₇)사이클로알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로고리알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, (C₀-C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬-C(O)OR⁵, (C₁-C₈)알킬-O(CO)R⁵, 또는 C(O)OR⁵;

R⁴는 (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, (C₁-C₄)알킬-OR⁵, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로고리알킬, 또는 (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴;

R⁵는 (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, 또는 (C₂-C₅)헤테로아릴이고;

각 경우에 R⁶은 독립적으로 H, (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₂-C₅)헤테로아릴, 또는 (C₀-C₈)알킬-C(O)OR⁵이거나, 상기 R⁶ 작용기들 이 모여 헤테로고리알킬을 이룰 수 있으며;

n은 0 또는 1이고;

*은 키랄 탄소 중심을 나타내는데, 이외에도

상기 물질들의 약학적으로 허용되는 염류, 수화물(hydrate), 용매화물(solvate), 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물 또는 이들 입체 이성질체의 혼합물일 수 있다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 면역 조절 화합물은

의 구조를 가지는데 여기서,

X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂또는 C=O;

R은 H 또는 CH₂OCOR'이고;

(i) R¹, R², R³ 또는 R⁴ 각각은 서로 무관하게 할로겐, 탄소 수 1~4의 알킬, 또는 탄소 수 1~4의 알콕시이거나 (ii) R¹, R², R³ 또는 R⁴중 하나는 니트로 혹은 -NHR⁵이고 R¹, R², R³ 또는 R⁴중 나머지는 수소이며;

R⁵는 수소 또는 탄소 수 1~8의 알킬;

R⁶은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 벤조, 염소 또는 플루오르;

R'는 R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹);

R⁷은 m-페닐렌 또는 p-페닐렌 또는 -(C_nH_2n)-이고 여기서 n은 그 값이 0~4이고;

R⁸과 R⁹는 각각 서로에 무관하게 수소이거나 탄소 수 1~8의 알킬이든가, R⁸과 R⁹가 함께 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌 또는 -CH₂CH₂X₁CH₂CH₂-인데 여기서 X₁은 -O-, -S- 또는 -NH-이고;

R¹⁰은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 또는 페닐이며;

*은 키랄 탄소 중심을 나타내는데, 이외에도

상기 물질들의 약학적으로 허용되는 염류, 수화물(hydrate), 용매화물(solvate), 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물 또는 이들 입체 이성질체의 혼합물일 수 있다.

본 방법의 다른 구체적 태양에서 상기 용액은 혈관 확장제를 더 포함한다. 더 구체적인 태양에서 상기 혈관 확장제는 혈압 강하제 약물이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 혈관 확장제는 구아닐릴 고리화 효소, ADP-리보오스 전달 효소 또는 사이클로옥시게나아제를 활성화하거나 지질옥시게나아제를 억제한다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 혈관 확장제는 심방 나트륨 이뇨펩티드(ANP), 아드레노 코르티코트로핀, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 니트로프러시드나트륨, 히드랄라진(hydralazine), 아데노신 삼인산, 아데노신, 인도메타신 또는 황산마그네슘이다. 더 구체적인 태양에서 상기 히드랄라진은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 농도로 존재한다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 아데노신은 약 0.001 mM 내지 약 10.0 mM 농도로 존재한다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 아데노신 삼인산은 약 0.1 mM 내지 약 1000 mM 농도로 존재한다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 인도메타신은 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg 농도로 존재하는데, 여기서 "kg"은 태반의 무게를 나타낸다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 황산마그네슘은 약 0.1 mM 내지 약 20 mM 농도로 존재한다.

본 발명의 다른 구체 태양에서, 상기 줄기세포는 CD34⁺ 줄기세포이다. 더 구체적인 태양에서 CD34⁺ 줄기세포는 CD34⁺CD38^- 줄기세포이다. 더 구체적인 태양에서, 상기 CD34⁺CD38^-줄기세포는 CD34⁺CD38^-줄기세포군의 일부인데, 이 CD34⁺CD38^- 세포군은 전체 유핵 세포 중 차지하는 비율이 제대혈 속에서보다 태반 관류물 속에서 더 높다. 본 발명의 다른 구체 태양에서 상기 줄기세포는 CD34^-줄기세포이다. 더 구체적인 실시 태양에서 상기 CD34^- 줄기세포는 CD31⁺, CD33⁺, CD44^- CD117⁺, KDR⁺, HLA-ABC^weak 또는 HLA-DR^weak인 특징을 더 가진다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 CD34^-줄기세포는 ABC-p⁺, SSEA3⁺, SSEA4⁺인 특성을 더 나타낸다.

본 발명은 줄기세포의 수집, 예를 들어 관류에 의한 수집 및/또는 효소 소화 등을 이용한 조직 파괴에 의한 수집을 위한 조성물, 예를 들어 용액을 또한 제공한다. 한 실시 태양에서 본 발명은 세포 자멸사 억제제와 단백질 분해 효소를 생리적으로 허용되는 용액 형태로 포함하는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 조성물은 줄기세포군과 접촉하였을 때 상기 줄기세포군의 세포 자멸사를 상기 조성물에 접촉하지 않은 다른 줄기세포군과 비교하였을 때 줄이거나 억제한다. 한 구체 태양에서 상기 조성물은 자연계에 존재하는 조성물이 아니다. 다른 구체 태양에서 상기 세포 자멸사 억제제는 카스파제 억제제이다. 다른 구체 태양에서 상기 자멸사 억제제는 JNK 억제제이다. 더 구체적인 실시 태양에서 상기 JNK 억제제는 상기 줄기세포의 분화나 증식을 조절하지 않는다. 다른 구체 태양에서 상기 단백질 분해 효소는 상기 줄기세포가 유래할 수 있는 조직으로부터 상기 세포들을 관찰할 수 있는 수준으로 떼어내기에 충분한 양으로 존재한다. 다른 실시 태양에서 이 조성물은 세포 괴사 억제제를 더 포함한다. 더 구테적인 실시 태양에서 상기 괴사 억제제는 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노-말레이미드이다. 다른 특정 태양에서 이 조성물은 산소 운반 퍼플루오로카본을 더 포함한다. 다른 특정 태양에서 상기 생리적으로 허용되는 용액은 식염수 또는 배양액이다. 더 구체적인 태양에서 상기 식염수는 0.9％ NaCl 용액 또는 인산 완충 식염수이다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 단백질 분해 효소는 매트릭스 금속단백 분해 효소 또는 중성 단백 분해 효소이다. 더 구체적인 실시 태양에서 상기 매트릭스 금속단백 분해 효소는 콜라게나아제이다. 다른 구체 태양에서 상기 중성 단백 분해 효소는 써모리신 또는 디스파제이다. 다른 구체 태양에서 상기 조성물은 점액 분해 효소를 더 포함한다. 더 구체적인 태양에서 상기 점액 분해 효소는 히알루로니다제이다.

다른 특정 태양에서 상기 조성물은 히드록시에틸 녹말, 락토비온산과 라피노스를 더 포함한다. 다른 특정 태양에서 이 조성물은 UW 용액을 더 포함한다.

본 조성물의 특정 실시 태양에서 상기 JNK 억제제는 인다졸이다. 다른 특정 태양에서 상기 JNK 억제제는

의 구조를 가지는데, 여기서

R₂는 -R₃, -R₄, -(CH₂) _b C(=O)R₅, -(CH₂) _b C(=O)OR₅, -(CH₂) _b C(=O)NR₅R₆,-(CH₂) _b C(=O)NR₅(CH₂) _c C(=O)R₆, -(CH₂) _b NR₅C(=O)R₆,-(CH₂) _b NR₅C(=O)NR₆R₇, -(CH₂) _b NR₅R₆, -(CH₂) _b OR₅, -(CH₂) _b SO _d R₅또는 -(CH₂) _b SO₂NR₅R₆이고;

a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6;

d는 각 경우에 0, 1 또는 2;

R₅, R₆과 R₇은 같거나 다르며, 각각의 경우 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이고, 이때 R₅, R₆과 R₇각각은 선택적으로 R₃로부터 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 치환될 수 있으며,

R₈과 R₉는 같거나 다르며, 각각의 경우 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이거나, R₈과 R₉가 모두 이들과 결합한 원자 와 함께 헤테로고리를 이루며, 이때 R₈과 R₉가 각각인 경우, 또 R₈과 R₉가 함께 헤테로고리를 이룬 경우에 이들은 R₃에서 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있는데, 이외에도

본 조성물의 다른 특정 태양에서, 상기 JNK 억제제는

의 구조를 가지는데 여기서,

R₂는 수소;

R₃은 수소 또는 저급 알킬;

R₄는 하나 내지 네 개의 선택적 치환기를 나타내는데, 여기서 각 치환기는 같거나 다르며, 할로겐, 히드록시, 저급 알킬과 저급 알콕시의 군으로부터 독립적 으로 선택되고;

a와 b는 서로 같거나 다를 수 있고 각 경우에 0, 1, 2, 3 또는 4 중에서 독 립적으로 선택되며,

c는 각 경우에 0, 1 또는 2인데, 이외에도

본 조성물의 다른 특정 태양에서 상기 JNK 억제제는

의 구조를 가지는데, 여기서

R₀은 -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, NH 또는 -CH₂-이고;

상기 제1 또는 제2 치환기는 존재할 경우 3, 4, 5, 7, 8, 9, 또는 10 위치에 있는데, 이때 제1과 제2 치환기는 존재할 경우 독립적으로 알킬, 히드록시, 할로겐, 니트로, 트리플루오로메틸, 술폰일, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬옥시, 사이클로알킬옥시, 알 콕시알킬, 알콕시알콕시, 아미노알콕시, 모노-알킬아미노알콕시, 디-알킬아미노알콕시 또는 구조 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)로 나타낸 작용기이고,

R₅는 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 아미노, 모노-알킬아미노, 디-알킬아미노, 아릴아미노, 아릴알킬아미노, 사이클로알킬아미노, 사이클로알킬알킬아미노, 아미노알킬, 모노-알킬아미노알킬 또는 디-알킬아미노알킬인데, 이외에도

더 구체적인 실시 태양에서 본 발명의 조성물은 면역 조절 화합물을 더 포함한다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 면역 조절 화합물은 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온; 3-(4'-아미노이소인돌린-1'-온)-1-피페리딘-2,6-디온; 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온; 또는 α-(3-아미노프탈이미도)글루타르이미드이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 면역 조절 화합물은

의 구조를 가지는데, 여기서

X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂ 또는 C=O;

R¹은 H, (C_1-8)알킬, (C_3-7)사이클로알킬, (C_2-8)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로고리알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, C(O)R³, C(S)R³, C(O)OR⁴, (C₁-C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬-C(O)OR⁵, C(O)NHR³, C(S)NHR³, C(O)NR³R^3', C(S)NR³R^3'또는 (C₁-C₈)알킬-O(CO)R⁵;

각 경우에 R⁶은 독립적으로 H, (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₂-C₅)헤테로아릴, 또는 (C₀-C₈)알킬-C(O)OR⁵이거나, 상기 R⁶ 작용기들이 모여 헤테로고리알킬을 이룰 수 있으며;

n은 0 또는 1이고;

*은 키랄 탄소 중심을 나타내거나;

약학적으로 허용되는 염류, 수화물(hydrate), 용매화물(solvate), 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물 또는 이들 입체 이성질체의 혼합물이다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 면역 조절 화합물은

의 구조를 가지는데 여기서,

X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂또는 C=O;

R은 H 또는 CH₂OCOR'이고;

R⁵는 수소 또는 탄소 수 1~8의 알킬;

R⁶은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 벤조, 염소 또는 플루오르;

R'는 R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹);

R¹⁰은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 또는 페닐이며;

*은 키랄 탄소 중심을 나타내는데, 이외에도

상기 물질들의 약학적으로 허용되는 염류, 수화물(hydrate), 용매화물(solvate), 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물 또 는 이들 입체 이성질체의 혼합물일 수 있다.

본 방법의 다른 구체적 태양에서 상기 조성물은 혈관 확장제를 더 포함한다. 더 구체적인 태양에서 상기 혈관 확장제는 혈압 강하제 약물이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 혈관 확장제는 구아닐릴 고리화 효소, ADP-리보오스 전달 효소 또는 사이클로옥시게나아제를 활성화하거나 지질옥시게나아제를 억제한다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 혈관 확장제는 심방 나트륨 이뇨펩티드(ANP), 아드레노코르티코트로핀, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 니트로프러시드나트륨, 히드랄라진(hydralazine), 아데노신 삼인산, 아데노신, 인도메타신 또는 황산마그네슘이다. 더 구체적인 태양에서 상기 히드랄라진은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 농도로 존재한다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 아데노신은 약 0.001 mM 내지 약 10.0 mM 농도로 존재한다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 아데노신 삼인산은 약 0.1 mM 내지 약 1000 mM 농도로 존재한다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 인도메타신은 약 1 mg/kg 내지 약 20 mg/kg 농도로 존재하는데, 여기서 "kg"은 태반의 무게를 나타낸다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 황산마그네슘은 약 0.1 mM 내지 약 20 mM 농도로 존재한다.

또 다른 측면에서 본 발명은 줄기세포군의 보존 방법을 제공하는데, 이 방법은 줄기세포를 세포 자멸사 억제제와 산소 운반 퍼플루오로카본에 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 자멸사 억제제는 상기 억제제와 접촉하지 않은 다른 줄기세포군과 비교하였을 때 상기 줄기세포군의 자멸사를 줄이거나 억제하기에 충분한 시간과 분량으로 존재한다. 다른 구체 태양에서 상기 세포 자멸사 억제제는 카 스파제 억제제이다. 다른 구체 태양에서 상기 자멸사 억제제는 JNK 억제제이다. 더 구체적인 실시 태양에서 상기 JNK 억제제는 상기 줄기세포의 분화나 증식을 조절하지 않는다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 JNK 억제제와 퍼플루오로카본은 상기 접촉 전에 하나의 용액 속에 함유된다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 접촉 단계 전에 상기 JNK 억제제는 제1 용액, 상기 퍼플루오로카본은 제2 용액 속에 함유된다. 다른 특정 태양에서 상기 용액, 제1 용액 또는 제2 용액은 히드록시에틸 녹말, 락토비온산 음이온과 라피노스를 더 포함한다. 제95항에 있어서 상기 JNK 억제제와 상기 퍼플루오로카보은 상기 접촉시 약 0℃에서 25℃ 사이이다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 JNK 억제제와 상기 퍼플루오로카본은 상기 접촉시 약 2℃에서 10℃ 사이 또는 약 2℃에서 약 5℃ 사이에 있다. 다른 더 특정한 실시 태양에서 상기 접촉은 상기 줄기세포군의 운반 도중 이루어진다. 다른 더 특정한 실시 태양에서 상기 접촉은 상기 줄기세포군의 냉동과 해동 도중 이루어진다.

다른 특정 태양에서 상기 방법은 상기 줄기세포군을 세포 괴사 억제제에 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 더 특정한 태양에서 상기 괴사 억제제는 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노 말레이미드이다.

본 발명의 다른 특정 태양에서 상기 줄기세포군은 상기 보존 도중 저산소 조건하에 놓이는 시간이 72시간 미만인데, 여기서 저산소 조건이란 정상적 혈액 산소 농도보다 낮은 산소 농도를 말한다. 더 구체적인 태양에서 상기 줄기세포군은 상기 보존 도중 상기 저산소 조건에 노출되는 시간이 48시간 미만이다. 다른 더 구 체적인 태양에서, 상기 줄기세포군은 이 보존 과정에서 상기 저산소 조건에 노출되는 시간이 24시간 미만, 또는 6시간 미만이거나 저산소 조건에 노출되지 않는다. 다른 특정 태양에서 상기 줄기세포군은 상기 보존 과정에서 전단 응력을 받지 않는다.

다른 특정 태양에서 상기 모든 용액은 UW 용액을 포함할 수 있다.

본 방법의 다른 특정 태양에서 상기 줄기세포군은 태반 속에 포함되거나 이로부터 분리된다.

본 방법의 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 JNK 억제제는

의 구조를 가지는데, 여기서

a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6;

d는 각 경우에 0, 1 또는 2;

본 방법의 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 JNK 억제제는

의 구조를 가지는데 여기서,

R₂는 수소;

R₃은 수소 또는 저급 알킬;

c는 각 경우에 0, 1 또는 2이다.

의 구조를 가지는데, 여기서

R₀은 -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, NH 또는 -CH₂-이고;

더욱 더 구체적인 실시 태양에서 본 방법은 상기 줄기세포를 면역 조절 화합물에 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 더 구체적인 태양에서 상기 면역 조절 화합물은 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온; 3-(4'-아미노이소인돌린-1'-온)-1-피페리딘-2,6-디온; 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온; 또는 α-(3-아미노프탈이미도)글루타르이미드이 다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 면역 조절 화합물은

의 구조를 가지는데, 여기서

X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂ 또는 C=O;

R1은 H, (C1~C8) 알킬, (C3~C7)사이클로알킬, (C2~C8)알켄일, (C2~C8)알킨일, 벤질, 아릴, (C0~C4)알킬-(C1~C6)헤테로고리알킬, (C0~C4)알킬 - (C2~C5)헤테로아릴, C(O)R3, C(S)R3, C(O)OR4, (C1~C8)알킬-N(R6)2, (C1~C8)알킬-OR5, (C1~C8) 알킬-C(O)OR5, C(O)NHR3, C(S)NHR3, C(O)NR3R3', C(S)NR3R3' 또는 (C1~C8)알킬-O(CO)R5;

n은 0 또는 1이고;

*은 키랄 탄소 중심을 나타내는데, 이외에도

의 구조를 가지는데 여기서,

X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂또는 C=O;

R은 H 또는 CH₂OCOR'이고;

R⁵는 수소 또는 탄소 수 1~8의 알킬;

R⁶은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 벤조, 염소 또는 플루오르;

R'는 R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹);

R¹⁰은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 또는 페닐이며;

*은 키랄 탄소 중심을 나타내는데, 이외에도

상기 본 발명의 모든 방법 또는 조성물의 다른 한 특정 실시 태양에서 상기 JNK 억제제는 약 0.5 μM 내지 약 10 μM 농도로 존재한다. 상기 방법 또는 조성물의 다른 구체적인 태양에서 상기 단백질 분해효소는 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL 농도로 존재한다. 상기 방법 또는 조성물의 다른 구체적인 태양에서 상기 점액 분해효소는 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL 농도로 존재한다. 상기 방법 또 는 조성물의 다른 구체적인 태양에서 상기 면역 조절 화합물은 약 0.5 μM 내지 약 10 μM 농도로 존재한다. 상기 방법 또는 조성물의 다른 구체적인 태양에서 상기 혈관 확장제는 심방 나트륨 이뇨펩티드(ANP), 아드레노코르티코트로핀, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 니트로프러시드나트륨, 히드랄라진(hydralazine), 아데노신 삼인산, 아데노신, 인도메타신 또는 황산마그네슘이다. 더욱 더 구체적인 태양에서 상기 히드랄라진은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM 농도로 존재한다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 아데노신은 약 0.001 mM 내지 약 10.0 mM 농도로 존재한다. 다른 더 구체적인 태양에서 상기 아데노신 삼인산은 약 0.1 mM 내지 약 1000 mM 농도로 존재한다.

다른 특정 태양에서, 본 명세서에 설명하는 모든 조성물은 염화나트륨, 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화칼슘, 황산나트륨, 황산칼륨, 탄산나트륨과 포도당을 생리학적으로 허용되는 형태로 함유하는 용액을 포함할 수 있다. 상기 모든 조성물은 하나 이상의 필수 또는 비필수 아미노산을 단독으로 혹은 조합하여 포함할 수 있다.

용어의 정의

본 명세서에서 "배아 줄기세포"란 포배(예를 들어 4 내지 5일 된 사람 배아)의 내부 세포 덩이에서 유래한 세포로서 다능성인 것을 일컫는다.

본 명세서에서, "태반 줄기세포"란 포유류 태반에서 유래한 줄기세포 또는 전구세포를 가리키며, 세포 형태, 세포 표면 표지, 1차 배양으로부터 몇 대를 이었는지 여부 등은 상관하지 않는다. 이 용어는 그러나 태반 혈액 또는 제대혈 등의 다른 조직으로부터 오로지 유래한 줄기세포를 포함하지는 않는다.

본 명세서에서, "방혈된" 또는 "방혈"이라는 용어는 태반에 관련하여 쓰였을 때, 태반에서 실질적으로 제대혈을 전부 제거 및/또는 방류하는 것을 가리킨다.

본 명세서에서, "관류물"은 어느 장기 또는 조직을 통과하여 수집한 유체를 가리킨다. 바람직한 실시 태양에서 이 관류물은 하나 이상의 항응고제를 포함한다.

본 명세서에서, "줄기세포"라는 용어는 다능성 세포와 중복성(multipotent) 세포와 수임 전구세포(committed progenitor cell)를 포함하는 전구세포를 망라한다. 중복성과 다능성 줄기세포는 배양했을 때 증식하고 증폭할 수 있는 능력을 지닌다.

"알킬"은 1 내지 10 개의 탄소 원자를 가지는 곧은 사슬 또는 가지친 사슬의 비고리형 탄화수소를 의미한다. "저급 알킬"은 앞서 정의한 알킬 중 탄소 수가 1 내지 4개인 것을 의미한다. 대표적인 포화 곧은 사슬 알킬에는 -메틸, -에틸, -n-프로필, -n-부틸, -n-펜틸, -n-헥실, -n-헵틸, -n-옥틸, -n-노닐과 -n-데실이 포함되며, 포화 가지친 알킬에는 -이소프로필, -sec-부틸, -이소부틸, -tert-부틸, -이소펜틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, 2,3-디메틸부틸, 2,3-디메틸펜틸, 2,4-디메틸펜틸, 2,3-디메틸헥실, 2,4-디메틸헥실, 2,5-디메틸헥실, 2,2-디메틸펜틸, 2,2-디메틸헥실, 3,3-디메틸펜틸, 3,3-디메틸헥실, 4,4-디메틸헥실, 2-에틸펜틸, 3-에틸펜틸, 2-에틸헥실, 3-에틸헥실, 4-에틸헥실, 2-메틸-2-에틸펜틸, 2-메틸-3- 에틸펜틸, 2-메틸-4-에틸펜틸, 2-메틸-2-에틸헥실, 2-메틸-3-에틸헥실, 2-메틸-4-에틸헥실, 2,2-디에틸펜틸, 3,3-디에틸헥실, 2,2-디에틸헥실, 3,3-디에틸헥실 등이 포함된다.

"알켄일 작용기" 또는 "알킬리덴(알킬idene)"은 탄소 수 2 내지 10의 곧은 사슬이거나 가지친 사슬인 비고리형 탄화수소로서 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 포함하는 것을 의미한다. 대표적인 곧은 사슬과 가지친 사슬의 (C₂~C₁₀)알켄일에는 -비닐, -알릴, -1-부텐일, -2-부텐일, -이소부틸렌일, -1-펜텐일, -2-펜텐일, -3-메틸-1-부텐일, -2-메틸-2-부텐일, -2,3-디메틸-2-부텐일, -1-헥센일, -2-헥센일, -3-헥센일, -1-헵텐일, -2-헵텐일, -3-헵텐일, -1-옥텐일, -2-옥텐일, -3-옥텐일, -1-노넨일, -2-노넨일, -3-노넨일, -1-데센일, -2-데센일, -3-데센일 등이 포함된다. 알켄일 작용기는 비치환이거나 치환될 수 있다. "고리형 알킬리덴"은 탄소 수가 3 내지 8이고 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 가지는 고리로서, 이 고리는 1 내지 3 개의 헤테로원자를 가질 수 있다.

"알킨일 작용기"는 탄소 수 2 내지 10의 곧은 사슬이거나 가지친 사슬인 비고리형 탄화수소로서 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 포함하는 것을 의미한다. 대표적인 곧은 사슬과 가지친 사슬의 (C₂~C₁₀)알킨일에는 -아세틸렌일, -프로핀일, -1-부틴일, -2-부틴일, -1-펜틴일, -2-펜틴일, -3-메틸-1-부틴일, -4-펜틴일, -1-헥신일, -2-헥신일, -5-헥신일, -1-헵틴일, -2-헵틴일, -6-헵틴일, -1-옥틴일, -2-옥틴일, -7-옥틴일, -1-노닌일, -2-노닌일, -8-노닌일, -1-데신일, -2-데신 일, -9-데신일 등이 포함된다. 알킨일 작용기는 치환 또는 무치환일 수 있다.

용어 "할로겐"과 "할로"는 플루오르, 염소, 브롬 또는 요오드를 뜻한다.

"할로알킬"은 앞서 정의한 바의 알킬기에 하나 이상의 할로겐 원자가 치환된 것을 의미한다.

"케토"는 카르보닐기(예를 들어 C=O)를 의미한다.

"아실"은 -C(O)알킬기를 의미하는데, 여기서 알킬은 앞서 정의한 바와 같으며, -C(O)CH₃, -C(O)CH₂CH₃, -C(O)(CH₂)₂CH_3, -C(O)(CH₂)₃CH_3,-C(O)(CH₂)₄CH₃, -C(O)(CH₂)₅CH₃ 등이 포함된다.

"아실옥시"는 -OC(O)알킬기를 의미하는데, 여기서 알킬은 앞서 정의한 바와 같으며, -OC(O)CH₃, -OC(O)CH₂CH₃, -OC(O)(CH₂)₂CH_3,-OC(O)(CH₂)₃CH_3,-OC(O)(CH₂)₄CH₃, -OC(O)(CH₂)₅CH₃ 등이 포함된다.

"에스테르"는 -C(O)O알킬기를 의미하는데, 여기서 알킬은 앞서 정의한 바와 같으며, -C(O)OCH₃, -C(O)OCH₂CH₃, -C(O)O(CH₂)₂CH_3,-C(O)O(CH₂)₃CH_3,-C(O)O(CH₂)₄CH₃, -C(O)O(CH₂)₅CH₃ 등이 포함된다.

"알콕시"는 -O-(알킬)기를 의미하는데, 여기서 알킬은 앞서 정의한 바와 같으며, -OCH₃, -OCH₂CH₃, -O(CH₂)₂CH_3,-O(CH₂)₃CH_3,-O(CH₂)₄CH₃, -O(CH₂)₅CH₃ 등이 포함된다. "저급 알콕시"는 -O-(저급 알킬)을 의미하는데, 여기서 저급 알킬은 앞서 정의한 바와 같다.

"알콕시알콕시"는 -O-(알킬)-O-(알킬)을 의미하는데, 여기서 각 알킬은 독립적으로 앞서 정의한 어느 한 알킬 작용기이며, -OCH₂OCH₃, -OCH₂CH₂OCH₃, -OCH₂CH₂OCH₂CH₃ 등이 포함된다.

"알콕시카르보닐"은 -C(=O)O-(알킬)을 의미하는데, 여기서 알킬은 앞서 정의한 바와 같으며, -C(=O)O-CH₃, -C(=O)O-CH₂CH₃, -C(=O)O-(CH₂)₂CH₃, -C(=O)O-(CH₂)₃CH₃, -C(=O)O-(CH₂)₄CH₃, -C(=O)O-(CH₂)₅CH₃ 등이 포함된다.

"알콕시카르보닐알킬"은 -(알킬)-C(=O)O-(알킬)을 의미하는데, 여기서 각 알킬은 독립적으로 앞서 정의한 어느 한 알킬 작용기이며, -CH₂-C(=O)O-CH₃, -CH₂-C(=O)O-CH₂CH₃, -CH₂-C(=O)O-(CH₂)₂CH₃, -CH₂-C(=O)O-(CH₂)₃CH₃, -CH₂-C(=O)O-(CH₂)₄CH₃, -CH₂-C(=O)O-(CH₂)₅CH₃ 등이 포함된다.

"알콕시알킬"은 -(알킬)-O-(알킬)을 의미하는데, 여기서 각 알킬은 독립적으로 앞서 정의한 어느 한 알킬 작용기이며, -CH₂OCH₃, -CH₂OCH₂CH₃, -(CH₂)₂OCH₂CH₃, -(CH₂)₂O(CH₂)₂CH₃ 등이 포함된다.

"아릴"은 5~10 개의 고리 원자를 함유하는 방향족 탄소고리 작용기이다. 대표적인 예로는 페닐, 톨릴, 안트라센일, 플루오렌일, 인덴일, 아줄렌일, 피리딘일과 나프틸과 함께 5,6,7,8-테트라하이드로나프틸과 같이 벤조-융합 탄소고리를 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 방향족 탄소고리 작용기는 치환되거나 무 치환일 수 있다. 한 실시 태양에서 상기 방향족 탄소고리 작용기는 페닐기이다.

"아릴옥시"는 -O-아릴 작용기를 의미하는데, 여기서 아릴은 앞서 정의한 바와 같다. 아릴옥시기는 치환되거나 무치환일 수 있다. 한 실시 태양에서 아릴옥시기의 아릴 고리는 페닐기이다.

"아릴알킬"은 -(알킬)-(아릴)을 의미하는데, 여기서 알킬과 아릴은 앞서 정의한 바와 같으며, -(CH₂)페닐, -(CH₂)₂페닐, -(CH₂)₃페닐, -CH(페닐)₂, -CH(페닐)₃, -(CH₂)톨릴, -(CH₂)안트라센일, -(CH₂)플루오렌일, -(CH₂)인덴일, -(CH₂)아줄렌일, -(CH₂)피리딘일, -(CH₂)나트틸 등이 포함된다.

"아릴알킬옥시"는 -O-(알킬)-(아릴)을 의미하는데, 여기서 알킬과 아릴은 앞서 정의한 바와 같으며, -O-(CH₂)₂페닐, -O-(CH₂)₃페닐, -O-CH(페닐)₂, -O-CH(페닐)₃, -O-(CH₂)톨릴, -O-(CH₂)안트라센일, -O-(CH₂)플루오렌일, -O-(CH₂)인덴일, -O-(CH₂)아줄렌일, -O-(CH₂)피리딘일, -O-(CH₂)나프틸 등이 포함된다.

"아릴옥시알킬"은 -(알킬)-O-(아릴)을 의미하는데, 여기서 알킬과 아릴은 앞서 정의한 바와 같으며, -CH₂-O-(페닐), -(CH₂)₂-O-페닐, -(CH₂)₃-O-페닐, -(CH₂)-O-톨릴, -(CH₂)-O-안트라센일, -(CH₂)-O-플루오렌일, -(CH₂)-O-인덴일, -(CH₂)-O-아줄렌일, -(CH₂)-O-피리딘일, -(CH₂)-O-나프틸 등이 포함된다.

"사이클로알킬"은 탄소-탄소 다중결합을 가지고 있지 않은, 탄소와 수소 원 자를 함유하는 단일 고리 또는 다중 고리형 포화 고리이다. 사이클로알킬의 예로는 (C₃~C₇)사이클로알킬 작용기, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸과 포화 고리형 또는 포화 이중 고리형 테르펜을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 사이클로알킬기는 치환되거나 무치환일 수 있다. 한 실시 태양에서 사이클로알킬기는 단일 고리이거나 이중고리이다.

"사이클로알킬옥시"는 -O-(사이클로알킬)을 의미하는데, 여기서 사이클로알킬은 앞서 정의한 바와 같으며, -O-사이클로프로필, -O-사이클로부틸, -O-사이클로펜틸, -O-사이클로헥실, -O-사이클로헵틸 등이 포함된다.

"사이클로알킬알킬옥시"는 -O-(알킬)-(사이클로알킬)을 의미하는데, 여기서 사이클로알킬과 알킬은 앞서 정의한 바와 같으며, -O-CH₂-사이클로프로필, -O-(CH₂)₂-사이클로프로필, -O-(CH₂)₃-사이클로프로필, -O-(CH₂)₄-사이클로프로필, O-CH₂-사이클로부틸, O-CH₂-사이클로펜틸, O-CH₂-사이클로헥실, O-CH₂-사이클로헵틸 등이 포함된다.

"아미노알콕시"는 -O-(알킬)-NH₂, 여기서 알킬은 앞서 정의한 바와 같으며, such as -O-CH₂-NH₂, -O-(CH₂)₂-NH₂, -O-(CH₂)₃-NH₂, -O-(CH₂)₄-NH₂, -O-(CH₂)₅-NH₂ 등이 포함된다.

"모노-알킬아미노"는 -NH(알킬)을 의미하는데, 여기서 알킬은 앞서 정의한 바와 같으며, -NHCH₃, -NHCH₂CH₃, -NH(CH₂)₂CH₃, -NH(CH₂)₃CH₃, -NH(CH₂)₄CH₃, -NH(CH₂)₅CH₃ 등이 포함된다.

"디-알킬아미노"는 -N(알킬)(알킬)을 의미하는데, 여기서 각 알킬은 독립적으로 앞서 정의한 어느 한 알킬 작용기이며, -N(CH₃)₂, -N(CH₂CH₃)₂, -N((CH₂)₂CH₃)₂, -N(CH₃)(CH₂CH₃) 등이 포함된다.

"모노-알킬아미노알콕시"는 -O-(알킬)-NH(알킬)을 의미하는데, 여기서 각 알킬은 독립적으로 앞서 정의한 어느 한 알킬 작용기이며, -O-(CH₂)-NHCH₃, -O-(CH₂)-NHCH₂CH₃, -O-(CH₂)-NH(CH₂)₂CH₃, -O-(CH₂)-NH(CH₂)₃CH₃, -O-(CH₂)-NH(CH₂)₄CH₃, -O-(CH₂)-NH(CH₂)₅CH₃, -O-(CH₂)₂-NHCH₃ 등이 포함된다.

"디-알킬아미노알콕시"는 -O-(알킬)-N(알킬)(알킬)을 의미하는데, 여기서 각 알킬은 독립적으로 앞서 정의한 어느 한 알킬 작용기이며, -O-(CH₂)-N(CH₃)₂, -O-(CH₂)-N(CH₂CH₃)₂, -O-(CH₂)-N((CH₂)₂CH₃)₂, -O-(CH₂)-N(CH₃)(CH₂CH₃) 등이 포함된다.

"아릴아미노"는 -NH(아릴)을 의미하는데, 여기서 아릴은 앞서 정의한 대로이며, -NH(페닐), -NH(톨릴), -NH(안트라센일), -NH(플루오렌일), -NH(인덴일), -NH(아줄렌일), -NH(피리딘일), -NH(나프틸) 등이 포함된다.

"아릴알킬아미노"는 -NH-(알킬)-(아릴)을 의미하는데, 여기서 알킬과 아릴 은 앞서 정의한 바와 같으며, -NH-CH₂-(페닐), -NH-CH₂-(톨릴), -NH-CH₂-(안트라센일), -NH-CH₂-(플루오렌일), -NH-CH₂-(인덴일), -NH-CH₂-(아줄렌일), -NH-CH₂-(피리 딘일), -NH-CH₂-(나프틸), -NH-(CH₂)₂-(페닐) 등이 포함된다.

"알킬아미노"는 -N(알킬)(알킬)처럼 앞서 정의한 바의 모노-알킬아미노 또는 디-알킬아미노를 의미하는데, 여기서 각 알킬은 독립적으로 앞서 정의한 대로의 어느 한 알킬 작용기이며, -N(CH₃)₂, -N(CH₂CH₃)₂, -N((CH₂)₂CH₃)₂, -N(CH₃)(CH₂CH₃)와 -N(알킬)(알킬)을 포함하는데, 각 알킬은 독립적으로 앞서 정의한 바 있는 어느 한 알킬 작용기이고, -N(CH₃)₂, -N(CH₂CH₃)₂, -N((CH₂)₂CH₃)₂, -N(CH₃)(CH₂CH₃) 등을 포함할 수 있다.

"사이클로알킬아미노"는 -NH-(사이클로알킬)을 의미하는데, 여기서 사이클로알킬은 앞서 정의한 바 있으며, -NH-사이클로프로필, -NH-사이클로부틸, -NH-사이클로펜틸, -NH-사이클로헥실, -NH-사이클로헵틸 등이 포함된다.

"카르복실"과 "카르복시"는 -COOH를 의미한다.

"사이클로알킬알킬아미노"는 -NH-(알킬)-(사이클로알킬)을 의미하는데 여기서 알킬과 사이클로알킬은 앞서 정의한 대로이며, -NH-CH₂-사이클로프로필, -NH-CH₂-사이클로부틸, -NH-CH₂-사이클로펜틸, -NH-CH₂-사이클로헥실, -NH-CH₂-사이클로헵틸, -NH-(CH₂)₂-사이클로프로필 등이 포함된다.

"아미노알킬"은 -(알킬)-NH₂를 의미하는데, 여기서 알킬은 앞서 정의한 바와 같으며, CH₂-NH₂, -(CH₂)₂-NH₂, -(CH₂)₃-NH₂, -(CH₂)₄-NH₂, -(CH₂)₅-NH₂ 등을 포함한다.

"모노-알킬아미노알킬"은 -(알킬)-NH(알킬)을 의미하는데, 여기서 각 알킬은 독립적으로 앞서 정의한 어느 한 알킬 작용기이며, -CH₂-NH-CH₃, -CH₂-NHCH₂CH₃, -CH₂-NH(CH₂)₂CH₃, -CH₂-NH(CH₂)₃CH₃, -CH₂-NH(CH₂)₄CH₃, -CH₂-NH(CH₂)₅CH₃, -(CH₂)₂-NH-CH₃ 등이 포함된다.

"디-알킬아미노알킬"은 -(알킬)-N(알킬)(알킬)을 의미하는데, 여기서 각 알킬은 독립적으로 앞서 정의한 어느 한 알킬 작용기이며, -CH₂-N(CH₃)₂, -CH₂-N(CH₂CH₃)₂, -CH₂-N((CH₂)₂CH₃)₂, -CH₂-N(CH₃)(CH₂CH₃), -(CH₂)₂-N(CH₃)₂ 등이 포함된다.

"헤테로아릴"은 질소, 산소, 황 중 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 적어도 하나의 탄소 원자를 가지는 5~10원 방향족 헤테로고리를 의미하는데, 단일 고리와 이중 고리를 모두 포함한다. 대표적인 헤테로아릴은 트리아졸릴, 테트라졸릴, 옥사디아졸릴, 피리딜, 퓨릴, 벤조퓨란일, 티오페닐, 벤조티오페닐, 퀴놀린일, 피롤릴, 인돌릴, 옥사졸릴, 벤즈옥사졸릴, 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 티아졸릴, 벤조티아졸릴, 이소옥사졸릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 피리다진일, 피리미딘일, 피라진일, 트리아진일, 시놀린일, 프탈라진일, 퀴나졸린일, 피리미딜, 옥세탄일, 아제핀일, 피페라진일, 모르폴린일, 디옥산일, 티에탄일(thietanyl)과 옥사졸릴이다.

"헤테로아릴알킬"은 -(알킬)-(헤테로아릴)을 의미하는데, 여기서 알킬과 헤테로아릴은 앞서 정의한 바와 같으며, -CH₂-트리아졸릴, -CH₂-테트라졸릴, -CH₂-옥사디아졸릴, -CH₂-피리딜, -CH₂-퓨릴, -CH₂-벤조퓨란일, -CH₂-티오페닐, -CH₂-벤조티 오페닐, -CH₂-퀴놀린일, -CH₂-피롤릴, -CH₂-인돌릴, -CH₂-옥사졸릴, -CH₂-벤조옥사졸릴, -CH₂-이미다졸릴, -CH₂-벤즈이미다졸릴, -CH₂-티아졸릴, -CH₂-벤조티아졸릴, -CH₂-이소옥사졸릴, -CH₂-피라졸릴, -CH₂-이소티아졸릴, -CH₂-피리다진일, -CH₂-피리미딘일, -CH₂-피라진일, -CH₂-트리아진일, -CH₂-시놀린일, -CH₂-프탈라진일, -CH₂-퀴나졸린일, -CH₂-피리미딘일, -CH₂-옥세탄일, -CH₂-아제핀일, -CH₂-피페라진일, -CH₂-모르폴린일, -CH₂-디옥산일, -CH₂-티에탄일, -CH₂-옥사졸릴, -(CH₂)₂-트리아졸릴 등이 포함된다.

"헤테로고리"란 질소, 산소와 황에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 가지는 포화 또는 불포화 5~7원 단일 고리형 혹은 7~10원 이중고리형 헤테로고리를 의미한다. 여기서 상기 질소와 황 헤테로원자는 선택적으로 산화될 수 있고, 상기 질소 헤테로원자는 선택적으로 4급화(quaternization)될 수 있는데, 여기에는 상기 헤테로고리가 벤젠 고리에 융합된 모든 이중고리가 포함된다. 대표적인 헤테로고리에는 모르폴린일, 피롤리디논일, 피롤리딘일, 피페리딘일, 하이단토인일, 발레로락탐일, 옥시란일, 옥세탄일, 테트라하이드로퓨란일, 테트라하이드로피란일, 테트라하이드로피리딘일, 테트라하이드로피리미딘일, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피란일, 테트라하이드로피리미딘일, 테트라하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오피란일 등이 포함된다.

"페닐에 융합된 헤테로고리"는 페닐 고리의 두 이웃한 탄소 원자에 결합된 헤테로고리를 의미하는데, 여기서 헤테로고리는 앞서 정의한 바와 같다.

"헤테로고리알킬"은 -(알킬)-(헤테로고리)를 의미하는데, 여기서 알킬과 헤테로고리는 앞서 정의한 바 있으며, -CH₂-모르폴린일, -CH₂-피롤리디논일, -CH₂-필롤리딘일, -CH₂-피페리딘일, -CH₂-하이단토인일, -CH₂-발레로락탐일, -CH₂-옥시란일, -CH₂-옥세탄일, -CH₂-테트라하이드로퓨란일, -CH₂-테트라하이드로피란일, -CH₂-테트라하이드로피리딘일, -CH₂-테트라하이드로피리미딘일, -CH₂-테트라하이드로티오페닐, -CH₂-테트라하이드로티오피란일, -CH₂-테트라하이드로피리미딘일, -CH₂-테트라하이드로티오페닐, -CH₂-테트라하이드로티오피란일 등이 포함된다.

본 명세서에서 "치환"이란 상기 모든 작용기(예를 들어 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리와 헤테로고리알킬)를 의미하는데, 여기서 치환될 물질 중 적어도 하나의 수소 원자가 치환기로 치환된다. 한 실시 태양에서 치환되는 물질의 각 탄소 원자는 두 개보다 더 많은 치환기로 치환되지 않는다. 다른 실시 태양에서, 치환되는 물질의 각 탄소 원자는 하나보다 더 많은 치환기로 치환되지 않는다. 케토 치환기의 경우 이중결합으로 탄소에 연결된 산소가 수소 원자 두 개와 치환된다. 치환기에는 할로겐, 히드록시, 알킬, 할로알킬, 모노- 또는 디-치환아미노알킬, 알킬옥시알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 헤테로사이클로알킬, -NR_aR_b, -NR_aC(=O)R_b, -NR_aC(=O)NR_aR_b, -NR_aC(=O)OR_b -NR_aSO₂R_b, -OR_a, -C(=O)R_a C(=O)OR_a -C(=O)NR_aR_b, -OC(=O)R_a, -OC(=O)OR_a, -OC(=O)NR_aR_b, -NR_aSO₂R_b, 또는 화학식 -Y-Z-R_a의 치환기가 포함되는데, 여기서 Y는 알칸디일 또는 직접적인 화학 결합이고, Z는 -O-, -S-, -N(R_b)-, -C(=O)-, -C(=O)O-, -OC(=O)-, -N(R_b)C(=O)-, -C(=O)N(R_b)- 또는 직접적인 화학 결합인데, 여기서 R_a와 R_b는 같거나 다르고, 독립적으로 수소, 아미노, 알킬, 할로알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 또는 헤테로고리알킬이거나, R_a와 R_b는 모두 그들과 결합한 질소 원자와 함께 헤테로고리를 이룬다.

"할로알킬"은 하나 이상의 수소 원자가 할로겐으로 치환된 알킬을 의미하는데, 알킬과 할로겐의 정의는 앞서 본 바 있으며, -CF₃, -CHF₂, -CH₂F, -CBr₃, -CHBr₂, -CH₂Br, -CCl₃, -CHCl₂, -CH₂Cl, -CI₃, -CHI₂, -CH₂I, -CH₂-CF₃, -CH₂-CHF₂, -CH₂-CH₂F, -CH₂-CBr₃, -CH₂-CHBr₂, -CH₂-CH₂Br, -CH₂-CCl₃, -CH₂-CHCl₂, -CH₂-CH₂Cl, -CH₂-CI₃, -CH₂-CHI₂, -CH₂-CH₂I 등이 포함된다.

"히드록시알킬"은 하나 이상의 수소 원자가 히드록시로 치환된 알킬을 의미하는데, 여기서 알킬은 앞서 정의한 바 있으며, -CH₂OH, -CH₂CH₂OH, -(CH₂)₂CH₂OH, -(CH₂)₃CH₂OH, -(CH₂)₄CH₂OH, -(CH₂)₅CH₂OH, -CH(OH)-CH₃, -CH₂CH(OH)CH₃ 등이 포함된다.

"히드록시"는 -OH를 의미한다. "술폰일"은 -SO₃H을 의미한다. "술폰일알 킬"은 -SO₂-(알킬)을 의미하는바, 여기서 알킬은 앞서 정의한 바와 같으며, -SO₂-CH₃, -SO₂-CH₂CH₃, -SO₂-(CH₂)₂CH₃, -SO₂-(CH₂)₃CH_3,-SO₂-(CH₂)₄CH₃, -SO₂-(CH₂)₅CH₃ 등이 포함된다.

"술핀일알킬"은 -SO-(알킬)을 의미하는바, 여기서 알킬은 앞서 정의한 바와 같으며, -SO-CH₃, -SO-CH₂CH₃, -SO-(CH₂)₂CH₃, -SO-(CH₂)₃CH_3,-SO-(CH₂)₄CH₃, -SO-(CH₂)₅CH₃ 등이 포함된다.

"술폰아미도알킬"은 -NHSO₂-(알킬)을 의미하는바, 여기서 알킬은 앞서 정의한 대로이며, -NHSO₂-CH₃, -NHSO₂-CH₂CH₃, -NHSO₂-(CH₂)₂CH₃, -NHSO₂-(CH₂)₃CH_3,-NHSO₂-(CH₂)₄CH₃, -NHSO₂-(CH₂)₅CH₃ 등이 포함된다.

"티오알킬"은 -S-(알킬)을 의미하는바, 여기서 알킬은 앞서 정의한 바와 같으며, -S-CH₃, -S-CH₂CH₃, -S-(CH₂)₂CH₃, -S-(CH₂)₃CH_3,-S-(CH₂)₄CH₃, -S-(CH₂)₅CH₃ 등이 포함된다.

본 명세서에서 "JNK 억제제"는 본 명세서에서 개시하는 화합물을 망라하지만 이에 한정되는 것은 아니다. JNK 억제제는 약학적으로 허용되는 염류, 자유 염기, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 클라트레이트 또는 이들의 전구물질의 형태를 할 수 있다. 이러한 억제 활성은 이하 발명의 내용란에서 설명할 방법을 포함한 공지의 분석 방법 또는 동물 모형으로 평가할 수 있다. 한 실시 태양에서 상기 JNK 억제제는 (I)~(III)의 구조를 가지는 화합물이다.

달리 언급이 없으면, 본 명세서에서 "약학적으로 허용되는 염(류)"는 이 용어가 가리키는 화합물의 산 또는 염기 부가염으로서 무독성인 것을 망라한다. 무독성 산 부가염으로서 허용되는 것으로는 공지된 유무기 산 또는 염기에서 유래한 것이 있는데, 예를 들면 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산, 메탄술폰산, 아세트산, 타르타르산, 락트산, 숙신산, 시트르산, 말산, 말레산, 소르브산(sorbic acid), 아코틴산(acotinic acid), 살리실산, 프탈산, 색전산(embolic acid), 에난트산(enanthic acid) 등이다.

본래 산성인 화합물은 약학적으로 허용되는 다양한 염기와 염을 형성할 수 있다. 이들 산성 화합물의 약학적으로 허용되는 염기 부가염을 만드는데 이용할 수 있는 염기에는 무독성 염기 부가염을 낳는 염기, 즉 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염, 칼슘, 마그네슘, 특히 나트륨 또는 칼륨과 같이 약학적으로 허용되는 양이온을 함유하는 염기가 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다. 적절한 유기 염기에는 N,N-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인(chloroprocaine), 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루마인(N-메틸글루카민), 리신과 프로카인이 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 달리 특정하지 않는 경우에, "전구약물(prodrug)"이란 용어는 생물학적 조건(시험관내 또는 생체내)에서 가수분해, 산화 혹은 그밖에 방식으로 반응하여 해당 화합물을 생성할 수 있는, 상기 화합물의 유도체(derivative)를 의미한다. 전구약물의 비제한적인 예로는 생가수분해성 아미드, 생가수분해성 에스테르, 생가수분해성 카르밤산화물(carbamate), 생가수분해성 탄산화물, 생가수분 해성 유레이드(ureide)와 생가수분해성 인산화물 유사물(analogue)과 같은 생가수분해성 부위를 포함하는 JNK 억제제 유도체를 들 수 있다. 전구약물의 다른 예로는 -NO, -NO₂, -ONO 또는 -ONO₂ 작용기를 갖춘 JNK 억제제 유도체가 포함된다. 전구약물은 공지된 방법을 통하여 제조되는 것이 전형적인데, 이러한 방법의 예로 Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery의 172~178쪽, 949~982쪽(5판 1995년 Manfred E. Wolff 편집)과 Design of Prodrugs(뉴욕 소재 Elsevier간, 1985년 H. Bundgaard 편집) 기재 내용을 들 수 있다.

본 명세서에서, 달리 특정이 없는 경우에, "생가수분해성 아미드" "생가부순해성 에스테르", "생가수분해성 카르밤산화물(biohydrolyzable carbamate)", "생가수분해성 탄산화물", "생가수분해성 유레이드"와 생가수분해성 인산화물"이란 용어는 각각 특정 화합물의 아미드, 에스테르, 카르밤산화물, 탄산화물, 유레이드와 인산화물을 의미하는데, 이들 각각의 화합물은 1) 상기 특정 화합물의 생물학적 활성에 간섭하지 않으면서 상기 특정 화합물에 흡수, 작용 시간, 작용 개시 등의 생체 내에서 유리한 특성을 부여하거나, 2) 생물학적으로 불활성이지만 생체 내에서 생물학적으로 활성인 화합물로 변환되는 것을 가리킨다. 생가수분해성 에스테르의 예로는 저급 알킬 에스테르, 저급 아실옥시알킬 에스테르(아세톡시메틸, 아세톡시에틸, 아미노카르보닐옥시메틸, 피발로일옥시메틸, 피발로일옥시에틸 에스테르 등), 락톤 에스테르(프탈리딜과 티오프탈리딜 에스테르 등), 저급 알콕시아실옥시알킬 에스테르(메톡시카르보닐옥시메틸, 에톡시카르보닐옥시에틸, 이소프로폭시카르 보닐옥시에틸 에스테르 등), 알콕시알킬 에스테르, 콜린 에스테르와 아실아미노 알킬 에스테르(아세트아미도메틸 에스테르 등)이 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 생가수분해성 아미드의 예로는 저급 알킬 아미드, α-아미노산 아미드, 알콕시아실 아미드, 알킬아미노알킬카르보닐 아미드가 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 생가수분해성 카르밤산화물의 예로는 저급 알킬아민, 치환된 에틸렌디아민, 아미노산, 수산화알킬아민, 헤테로고리 아민과 헤테로방향족 아민, 폴리에테르 아민이 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다.

많은 JNK 억제제와 면역 조절 화합물은 하나 이상의 키랄 중심을 가지며 거울상 이성질체의 라세미 혼합물로 또는 부분입체 이성질체의 혼합물로 존재할 수있다. 본 발명은 이러한 화합물을 상기 입체이성질체 혼합물로 사용하는 것은 물론 입체이성질적으로 순수한 형태로 사용하는 것을 망라한다. 예를 들어

본 명세서에서, 달리 특정이 없는 경우, "입체이성질체"라는 용어는 모든 거울상이성질/입체이성질적으로 순수하고 거울상이성질/입체이성질적으로 농축된, 본 발명에 따른 화합물을 망라한다. 예를 들어 JNK 억제제 또는 면역 조절 화합물의 거울상 이성질체들을 같은 양 또는 서로 다른 양으로 함유하는 혼합물을 본 발명의 방법 또는 조성물에 이용할 수 있다. 본 명세서에서 개시한 특정 화합물의 정제된 (R) 또는 (S) 거울상 이성질체는 그 나머지 이성질체를 실질적으로 포함하지 않는 형태로 이용될 수 있다.

본 명세서에서, 달리 가리키는 바가 없으면, "입체이성질적으로 순수"라는 용어는 한 화합물의 한 종류 입체이성질체를 포함하며, 상기 화합물의 다른 입체 이성질체를 실질적으로 가지고 있지 않은 조성물을 의미한다. 예를 들어, 한 키랄 중심을 가지는 화합물의 입체이성질적으로 순수한 조성물은 이 화합물의 반대 거울상이성질체를 거의 가지지 않을 것이다. 두 키랄 중심을 가지는 화합물의 입체이성질적으로 순수한 조성물은 이 화합물의 다른 부분입체이성질체를 거의 가지지 않을 것이다. 전형적인 입체이성질적으로 순수한 화합물은 그 화합물의 한 입체이성질체를 약 80 중량％ 넘게 가지고, 그 화합물의 다른 입체이성질체를 약 20 중량％ 못 미치게 가지며, 더 바람직하게는 그 화합물의 한 입체이성질체를 약 90 중량％ 넘게, 다른 입체이성질체를 약 10 중량％ 미만으로 가진다. 더더욱 바람직하게는 그 화합물의 한 입체이성질체를 약 95 중량％ 넘게, 그리고 다른 입체이성질체를 5 중량％ 미만으로 가지며, 가장 바람직하게는 그 화합물의 한 입체이성질체를 약 97 중량％ 넘게, 다른 입체이성질체를 약 3 중량％ 미만으로 가진다.

본 명세서에서, 달리 가리키는 바가 없으면, "입체이성질적으로 농축된"이란 용어는 화합물의 한 입체이성질체를 약 60 중량％ 넘게, 바람직하게는 한 입체이성질체를 약 70 중량％ 넘게, 더욱 바람직하게는 한 입체이성질체를 약 80 중량％ 넘게 가지는 포함하는 조성물을 의미한다.

보 명세서에서, 달리 가리키는 바가 없으면, "거울상이성질적으로 순수한"이란 용어는 하나의 키랄 중심을 가지는 화합물의 입체이성질적으로 순수한 조성물을 의미한다. 마찬가지로, "거울상이성질적으로 농축된"이란 용어는 하나의 키랄 중심을 가지는 화합물의 입체이성질적으로 농축된 조성물을 의미한다.

발명의 내용

이하 이 발명을 더 상세하게 설명한다.

이 출원은 2005년 12월 29일자 미국 예비 출원 제 60/754,969호의 우선권을 향유하며, 이 예비 출원의 내용 전체를 본 출원의 참고 문헌으로 삼고 있다.

1. 줄기세포 수집용 조성물

한 측면에서 본 발명은 다능성과 중복성 줄기세포와 수임 전구 세포를 포함하는 줄기세포를 장기, 예를 들어 포유류 태반으로부터 효소 소화 등의 물리적 파괴 또는 관류를 통하여 수집하기 위한 조성물을 제공한다. 이 조성물은 줄기세포의 수집을 촉진하고 줄기세포의 자멸사 및/또는 괴사를 억제하며, 바람직하게는 이러한 효과를 세포 수집과 이어지는 보관 과정 모두에서 발휘한다. 이 줄기세포 수집용 조성물을 이용하여 태반 줄기세포등의 줄기세포를 수집하는 방법은 이하 설명한다.

한 측면에서 본 발명은 장기로부터 태반 줄기세포 등의 줄기세포를 수집하는 조성물을 제공하는데, 이 조성물은 생리학적으로 허용되는 수용액과 세포 자멸사 억제제를 함유하며, 여기서 상기 조성물은 줄기세포군과 접촉하였을 때 상기 줄기세포군의 세포 자멸사를 상기 조성물에 접촉하지 않은 다른 줄기세포군과 비교하였을 때 줄이거나 억제한다. 한 구체 태양에서 상기 조성물은 자연계에 존재하는 조성물이 아니다. 상기 생리학적으로 허용되는 수용액은 줄기세포의 유지에 적합한 것이 바람직하다. 이 생리학적으로 허용되는 수용액은 예를 들어 등장 수용액과 같은 생리학적으로 허용되는 수용액일 수 있는데, 이러한 수용액으로는 0.9％ NaCl 용액 등의 완충 식염수, 인산 완충액, Dulbecco 변형 Eagle 배지(DMEM), 고포도당 Dulbecco 변형 Eagle 배지(h. DMEM), Krebs 용액 등이 있다. 이 생리학적으로 허용되는 수용액은 배양액, 즉 포유류의 배양을 위하여 통상적으로 쓰이는 모든 배양액일 수 있는데, 이러한 배양액은 항생제 또는 혈청을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 특정 실시 태양에서, 상기 생리학적으로 허용되는 수용액은 염화나트륨, 염화칼륨, 황산마그네슘, 염화칼슘, 황산나트륨, 황산칼륨, 탄산나트륨과 포도당을 함유한다. 이 생리학적으로 허용되는 수용액은 또한 모든 필수 또는 비필수 아미노산 또는 이들 아미노산의 조합을 함유하거나 결여할 수 있다.

상기 줄기세포 수집용 조성물은 조직을 파괴할 수 있는 효소, 예를 들어 단백질 분해 효소, 이를테면 아래 1.1. 장에서 기술하는 분해 효소를 함유하는 것이 바람직하다. 이 줄기세포 수집용 조성물은 자멸사 억제제를 함유하는데, 이 억제제는 공지된 모든 억제제, 예를 들어 카스파제 억제제, 이를테면 아래 1.2.1에서 기술하는 억제제를 사용할 수 있다. 바람직하게, 이 자멸사 억제제는 JNK 억제제, 예를 들어 아래 1.2.2.에서 기술하는 JNK 억제제이다. 다른 태양에서 이 생리학적으로 허용되는 수용액은 면역 조절 화합물, 예를 아래 1.3.에서 기술하는 면역 조절 화합물을 함유할 수 있다. 이 생리학적으로 허용되는 수용액은 또한 혈관 확장제, 예를 들어 아래 1.4.에서 기술하는 확장제를 또한 포함할 수 있다. 이 생리학적으로 허용되는 수용액은 세포 괴사 억제제, 예를 들어 아래 1.5. 장에서 기술하는 억제제를 함유할 수 있다. 상기 생리학적으로 허용되는 수용액은 산소 운반 퍼플루오로카본, 예를 들어 아래 1.6장에서 기술하는 퍼플루오로카본을 함유할 수 있다. 이 생리학적으로 허용되는 수용액은 상기 모든 화합물의 어떠한 조합이라도 함유할 수 있다.

관류 용액을 사용하였을 때, 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 헤파린, 시트르산, 인산시트르산, 인산시트르산 포도당, CPDA(인산시트르산 포도당 아데닌) 등의 항응고제를 남아 있는 어떠한 태반 혈액 또는 제대혈의 응고를 방지하기에 충분한 양으로 함유하는 것이 바람직하다. 한 특정 태양에서는 한 포유류 태반에서 줄시세포를 수집하기 위하여 mL 당 약 1 내지 약 100 단위의 헤파린, 바람직하게는 약 1 내지 약 10 단위의 헤파린을 사용한다.

1.1 효소

본 발명의 조성물은 조직 및/또는 세포 사이 연접부(junction) 또는 세포와 기저막(basement membrane) 사이의 연접부를 파괴하는 효소를 하나 이상 함유할 수 있다. 한 태양에서, 이 효소는 해당 줄기세포가 유래하는 태반과 같은 한 장기 또는 조직으로부터 관측 가능한 정도로 다수의 줄기세포를 떼어내기에 충분한 양으로 존재한다.이러한 효소는 예를 들어 단백질 분해 효소 또는 그러한 단백 분해 활성이 있는 폴리펩티드이다. 이 단백질 분해 효소는 사람, 포유류, 세균 등에서 유래할 수 있으며, 자연 유래 단백질 분해 효소 폴리펩티드이거나 이러한 분해 활성이 있는 변형 폴리펩티드(예를 들어 서열 변형, 서열 단축, 융합 단백질, 유사체)일 수 있다. 다양한 태양에서 이 단백질 분해 효소는 매트릭스 금속단백 분해 효소 또는 중성 단백 분해 효소이다. 다른 태양에서 상기 효소는 콜라겐나아제(에를 들어 콜라게나아제 I, 콜라게나아제 IV Clostridium histolyticum에서 콜라게나아 제 등), 트립신(예를 들어 트립신-EDTA), 써모리신, 엘라스타제, 디스파제, LIBERASE(상표) 또는 이들의 조합이다. 이러한 효소는 상업적인 경로로 입수할 수있는데, 예를 들어 SigmaAldrich (St. Louis, Missouri); Roche Diagnostics (LIBERASE, Indianapolis, Indiana); Clinalfa (Bloomington, Indiana)社가 있다. 효소는 유효한 어떤 농도로도 사용할 수 있는데, 예를 들어 약 0.1 mg/mL에서 약 10 mg/mL로 쓰일 수 있다. 다양한 특정 실시 태양에서 트립신-EDTA(GibcoBRL)을 약 0.25％(w/v); 콜라게나아제-IA(Sigma)를 약 1 mg/mL; 콜라게나아제-I(Worthington)을 약 0.5 mg/mL; 엘라스타제를 약 1 mg/mL; 콜라게나아제-IV를 약 0.5 mg/mL, 디스파제(Worthington)를 약 0.1 mg/mL 농도로 사용할 수 있다. 바람직한 효소 조합은 콜라게나아제 I + 트립신; 콜라게나아제 IA + 트립신 또는 엘라스타제 + 콜라게나아제 1 + 콜라게나아제 IV + 디스파제이다. 당업자는 여기에 나타낸 예시 농도가 특정 소화 혹은 관류 실험 방법을 최적화하기 위하여 늘어나거나 줄어들 수 있다는 점을 이해할 것이다.

본 조성물은 또한 핵산 분해효소, 예를 들어 DNase 또는 RNase를 함유한다. 본 조성물은 또한 점액 분해 효소를 더 포함할 수 있다. 특정 태양에서 상기 점액 분해 효소는 히알루로니다제이다.

1.2 세포 자멸사 억제제

본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 태반 세포 특히 수집할 줄기세포의 자멸사를 줄이거나 억제 또는 제거하는 약제, 예를 들어 세포 자멸사 억제제를 포함한다. 이 약제는 바람직하게는 세포 수집과 후속 저장 단계 도중의 태반 줄기세포 의 자멸사를 줄이고 억제하거나 제거한다. 이 자멸사 억제제는 카스파제 억제제와 같은 모든 공지의 자멸사 억제제여도 되지만, JNK 억제제인 것이 바람직하다.

1.2.1 카스파제 억제제

본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 카스파제 억제제를 포함할 수 있다. 이 카스파제 억제제는 특정 카스파제, 예를 들어, 카스파제 1, 카스파제 2, 카스파제 3, 카스파제 4, 카스파제 5, 카스파제 6, 카스파제 7, 카스파제 8, 카스파제 9, 카스파제 10, 카스파제 11, 카스파제 12 또는 카스파제 13의 억제제일 수 있다. 이 카스파제 억제제는 여러 종류의 카스파제를 억제하거나, 알려진 모든 카스파제를 억제할 수 있다(예를 들어, 범-카스파제 억제제). 이 카스파제 억제제는 카스파제 단백질의 억제제이거나, 카스파제 활성화의 억제제, 예를 들어, 카스파제 암호화 유전자의 억제제일 수 있다. 카스파제 억제제의 예로는 2,2'-메틸렌비스(1,3-사이클로헥산디온), Z-Val-Ala-Asp(OMe)-CH₂F 서열을 가지는 펩티드, 바이오틴-X-Val-Ala-Asp(OMe)-CH₂F 서열을 가지는 펩티드(X는 링커), Ac-Val-Ala-Asp-CHO 서열을 가지는 펩티드, Boc-Asp(OMe)-CH₂F , Z-Val-Asp(OMe)-Val-Ala-Asp(OMe)-CH₂F 서열을 가지는 펩티드, Ac-Asp-Glu-Val-Asp-CHO 서열을 가지는 펩티드, Ac-Leu-Glu-Cal-Asp-CHO 서열을 가지는 펩티드, Z-Trp-Glu(OMe)-His-Asp(OMe)-CH₂F 서열을 가지는 펩티드 등을 들 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 카스파제 억제제는 예를 들어 CalBiochem (San Diego, CA), BioVision (Mountain View, CA); Clontech (Mountain View, CA), or R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN)로부터 입수할 수 있다.

1.2.2 JNK 억제제

본 발명의 줄기세포 수집용 조성물의 자멸사 억제제는 JNK 억제제인 것이 바람직하며, 본 명세서에서 개시한 화합물인 JNK 억제제가 더 바람직하다. 특정한 이론에 구애되고자 하는 것은 아니지만, 세포 자멸사 억제제, 특히 JNK 억제제를 가하면, 수집할 수 있는 생존 가능한 줄기세포의 수를 늘리고 이러한 줄기세포의 세포내 환경을 수집과 분리 과정에서 더 철저하게 유지함으로써 포유류 태반으로부터 줄기세포를 수집하는 것이 용이해진다.

특정 실시 태양에서 상기 JNK 억제제는 줄기세포 또는 세포군을 상기 억제제를 함유하는 줄기세포 수집용 조성물에 접촉시켰을 때 상기 세포 또는 세포군의 분화 또는 증식을 조절하지 않는다. 즉 이 JNK 억제제는 JNK 억제제에 접촉하지 않은 줄기세포와 비교하였을 때, 줄기세포 또는 줄기세포군의 증식 또는 분화에 관측 가능한 차이를 일으키지 않는다.

본 발명의 조성물과 방법에 쓰이는 JNK 억제제는 라세미 혼합물인 JNK 억제제의 입체이성질적으로 순수한 억제제와 농축된 억제제, 선택적 JNK 억제 활성을 지니는 입체이성질과 거울상 이성질적으로 순수한 화합물, 그리고 이들의 약학적으로 허용되는 염류, 용매화물, 수화물, 입체이성질체, 클라트레이트, 전구약물을 포함한다. 이러한 JNK 억제제는 시중에서 구입하거나, 본 명세서에서 개시하는 특허 또는 특허 공보에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다. 나아가, 광학적으로 순수한 조성물을 공지의 이성질체 분리 시약 또는 키랄 컬럼과 기타 표준적인 유기 합 성 방법을 이용하여 비대칭 합성하거나 광학 이성질체 분리를 할 수 있다.

한 실시 태양에서 JNK 억제제는

의 (I) 구조를 가진다.

의 구조를 가지는데, 여기서

a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6;

d는 각 경우에 0, 1 또는 2;

R₅, R₆과 R₇은 같거나 다르며, 각각의 경우 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이고, 이때 R₅, R₆과 R₇각각은 선택적으로 R₃으로부터 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 치환될 수 있으며,

한 실시 태양에서 -A-R₁은 페닐인데, 할로겐, 알콕시, -NR₈C(=O)R₉, -C(=O)NR₈R₉와 -O(CH₂)_bNR₈R₉로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되는 치환기로 1번 내지 4번 치환이 가능한데, 여기서 b는 2 또는 3이고, R₈과 R₉는 앞서 정의하였다.

다른 실시 태양에서 R₂는 -R₄, -(CH₂)_bC(=O)R₅, -(CH₂)_bC(=O)OR₅, -(CH₂)_bC(=O)NR₅R₆, -(CH₂)_bC(=O)NR₅(CH₂)_cC(=O)R₆, -(CH₂)_bNR₅C(=O)R₆, -(CH₂)_bNR₅C(=O)NR₆R₇, -(CH₂)_bNR₅R₆, -(CH₂)_bOR₅, -(CH₂)_bSO_dR₅또는 -(CH₂)_bSO₂NR₅R₆이고 b 는 0~4의 정수이다.

다른 실시 태양에서, R₂는 -(CH₂)_bC(=O)NR₅R₆, -(CH₂)_bNR₅C(=O)R₆, 3-트리아졸릴 또는 5-테트라졸릴이며, 여기서 b는 0이고, R₈과 R₉는 앞서 정의하였다.

다른 실시 태양에서, R₂는 3-트리아졸릴 또는 5-테트라졸릴이다.

다른 실시 태양에서:

(a) -A-R₁ 은 페닐인데, 할로겐, 알콕시, -NR₈C(=O)R₉, -C(=O)NR₈R₉와 -O(CH₂) _b NR₈R₉로 이루어지는 군에서 독립적으로 선택되는 치환기로 1회~4회 선택적으로 치환될 수 있으며, b 는 2 또는 3이고,

(b) R₂ 는 -(CH₂) _b C(=O)NR₅R₆, -(CH₂) _b NR₅C(=O)R₆, 3-트리아졸릴 또는 5-테트라졸릴인데, 여기서 b는 0이고 R₈ 과 R₉는 앞서 정의하였다.

다른 실시 태양에서:

(a) -A-R₁ 은 페닐인데, 할로겐, 알콕시, -NR₈C(=O)R₉, -C(=O)NR₈R₉와 -O(CH₂) _b NR₈R₉로부터 독립적으로 선택되는 치환기로 1회 내지 4회 선택적으로 치환될 수 있으며, 여기서 b 는 2 또는 3;이고

(b) R₂ 는 3-트리아졸릴 또는 5-테트라졸릴이다.

다른 실시 태양에서, R₂ 는 R₄이고, R₄는 3-트리아졸릴이며, 선택적으로 5번 위치에 다음 치환기로 치환될 수 있다:

(a) C₁-C₄인 곧은 사슬 또는 가지친 사슬 알킬기로서 히드록시, 메틸아미노, 디메틸아미노 또는 1-피롤리딘 작용기로 선택 치환될 수 있는 것이거나;

(b) 2-피롤리딘 작용기.

다른 실시 태양에서, R₂ 는 R₄이고, R₄는 3-트리아졸릴이며, 선택적으로 5번 위치에 메틸, n-프로필, 이소프로필, 1-히드록시에틸, 3-히드록시프로필, 메틸아미노메틸, 디메틸아미노메틸, 1-(디메틸아미노)에틸, 1-피롤리딘일메틸 또는 2-피롤리딘일로 선택적으로 치환될 수 있다.

다른 실시 태양에서, 구조 (I)의 화합물은 A가 직접 결합이면 구조 (IA)를, A가 -(CH₂) _a -이면 구조 (IB)를 취한다:

다른 실시 태양에서, 구조 (I)의 화합물은 A가 -(CH₂) _b CH=CH(CH₂)_c-일 때 구조 (IC)를, A가 -(CH₂) _b C= C(CH₂) _c -일 때 구조 (ID)를 취한다:

또 다른 본 발명의 실시 태양에서, 구조 (I)의 R₁은 아릴 또는 치환 아릴인데, 예를 들어 페닐이거나 아래 구조 (IE)로 나타낸 치환 페닐이다:

다른 실시 태양에서, 구조 (I)의 R₂는 -(CH₂) _b NR₄(C=O)R₅이다. 본 발명의 한측면에서, b =0이고 상기 화합물들은 아래 구조 (IF)를 취한다:

구조 (I)인 화합물의 대표적인 R₂작용기로는 알킬 (메틸과 에틸 등의), 할로겐(염소와 플루오르 등), 할로알킬 (트리플루오로메틸 등), 히드록시, 알콕시 (메톡시, 에톡시 등), 아미노, 아릴알킬옥시(벤질옥시), 모노- 또는 디-알킬아민 (-NHCH₃, -N(CH₃)₂와 -NHCH₂CH₃등), -NHC(=O)R₄가 포함되는데, 여기서R₆은 치환 또는 무치환 페닐 또는 헤테로아릴(예를 들어 히드록시, 카르복시, 아미노, 에스테르, 알콕시, 알킬, 아릴, 할로알킬, 할로겐, -CONH₂와 -CONH알킬로 치환된 페닐 또는 헤테로아릴), -NH(헤테로아릴알킬)(예를 들어, -NHCH₂(3-피리딜), -NHCH₂(4-피리딜)), 헤테로아릴(예를 들어 피라졸로, 트리아졸로와 테트라졸로), -C(=O)NHR₆(여기서 R₆은 수소, 알킬, 또는 앞서 정의한 것과 같은(예를 들어 -C(=O)NH₂, -C(=O)NHCH₃, -C(=O)NH(H-카르복시페닐), -C(=O)N(CH₃)₂), 아릴알켄일 (예를 들어 페닐비닐, 3-니트로페닐비닐, 4-카르복시페닐비닐), 헤테로아릴알켄일 (예를 들어 2-피리딜비닐, 4-피리딜비닐)이다.

구조 (I)인 화합물의 대표적인 R₃작용기로는 할로겐 (예를 들어 염소와 플루오르), 알킬 (예를 들어 메틸, 에틸과 이소프로필), 할로알킬 (예를 들어 트리플루오로메틸), 히드록시, 알콕시 (예를 들어 메톡시, 에톡시, n-프로필옥시와 이소부틸옥시), 아미노, 모노- 또는 디-알킬아미노 (예를 들어 디메틸아민), 아릴 (예를 들어 페닐), 카르복시, 니트로, 시아노, 술핀일알킬 (예를 들어 메틸술핀일), 술폰 일알킬 (예를 들어 메틸술폰일), 술폰아미도알킬 (예를 들어 -NHSO₂CH₃), -NR₈C(=O)(CH₂)_bOR₉ (예를 들어 NHC(=O)CH₂OCH₃), NHC(=O)R₉(예를 들어 -NHC(=O)CH₃, -NHC(=O)CH₂C₆H₅, -NHC(=O)(2-퓨란일))과 -O(CH₂) _b NR₈R₉(예를 들어 -O(CH₂)₂N(CH₃)₂)가 있다.

구조 (I)의 화합물은 당업자에게 알려진 유기 합성 방법에 의하거나 2002년 2월 7일에 공개된 국제 특허 공보 WO 02/10137 (특히 35쪽 첫째 줄에서 396쪽 12째 줄까지의 실시예 1~430)의 기재 내용에 따라 만들 수 있는데, 후자는 그 내용 전부가 본 명세서의 참고 문헌이다. 나아가, 이러한 화합물의 특정한 실시예를 상기 공보에서 찾을 수 있다.

구조 (I)의 대표적인 JNK 억제제로는:

;

들과 이들의 약학적으로 허용되는 염이 있다.

다른 실시 태양에서, 상기JNK 억제제는 다음 구조 (II)를 취한다:

여기서,

R₂는 수소;

R₃은 수소 또는 저급 알킬;

R₅와 R₆이 모두 그들에 결합한 질소 원자와 더불어 헤테로고리 또는 치환 헤 테로고리를 이루며;

c는 각 경우에 0, 1 또는 2이다.

한 실시 태양에서, R₁은 치환 또는 무치환 아릴 또는 헤테로아릴이다. R₁ 이 치환된 경우는 이하 정의하는 하나 이상의 치환기로 치환된다. 한 실시 태양에서, 치환된 경우, R₁은 할로겐, -SO₂R₈ 또는 -SO₂R₈R₉로 치환된다. 다른 실시 태양에서, R₁은 치환 또는 무치환 아릴, 퓨릴, 벤조류란일, 티오페닐, 벤조티오페닐, 퀴놀 린일, 피롤릴, 인돌릴, 옥사졸릴, 벤즈옥사졸릴 이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴, 티아졸릴, 벤조티아졸릴, 이소옥사졸릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 피리다진일, 피리미딘일, 피라진일, 트리아진일, 시놀린일, 프탈라진일 또는 퀴나졸린일이다.

다른 실시 태양에서 R₁은 치환 또는 무치환 아릴 또는 헤테로아릴이다. . R₁ 이 치환된 경우는 이하 정의하는 하나 이상의 치환기로 치환된다. 한 실시 태양에서, 치환된 경우, R₁은 할로겐, -SO₂R₈ 또는 -SO₂R₈R₉로 치환된다.

다른 실시 태양에서, R₁ 은 치환 또는 무치환 아릴이고, 바람직하게는 페닐이다. R₁이 치환 아릴일 때 그 치환기들은 아래 정의하는 바와 같다. 한 실시 태양에서, 치환된 경우, R₁은 할로겐, -SO₂R₈ 또는 -SO₂R₈R₉로 치환된다.

다른 실시 태양에서, R₅와 R₆ 모두는 그들이 연결된 질소 원자와 함께 치환 또는 무치환 질소 함유 비방향족 헤테로고리를 고리를 이루는데, 한 실시 태양에서, 이들은 피페라진일, 피페리딘일 또는 모르폴린일이다.

R₅와 R₆ 양쪽이 그들과 연결된 질소 원자와 더불어 치환된 피페라진일, 피페리딘일 또는 모르폴린일을 이룰 때, 이 피페라진일, 피페린딘일 또는 모르폴린일은 아래에서 정의하는 하나 이상의 치환기로 치환된다. 한 실시 태양에서, 치환된 경우 그 치환기는 알킬, 아미노, 알킬아미노, 알콕시알킬, 아실, 피롤리딘일 또는 피페리딘일이다.

한 실시 태양에서, R₃은 수소이고 R₄는 존재하지 않으며, 상기 JNK 억제제 아래 구조 (IIA)를 가지거나:

이의 약학적으로 허용되는 염의 구조이다.

더 구체적인 실시 태양에서, R₁은 선택적으로 R₇으로 치환된 페닐이며, 다음 구조 (IIB)와

그 약학적으로 허용되는 염의 구조를 가진다.

더 진전된 실시 태양에서, R₇은 페닐 고리에서 피리미딘 기준으로 파라 위치에 놓이는데, 다음 구조 (IIC):

그리고 이의 약학적으로 허용되는 염 형태를 취한다.

구조 (II)의 JNK 억제제는 당업자에게 알려진 유기 합성 방법에 의하거나 2002년 6월 13일에 공개된 국제 특허 공보 WO 02/46170 (특히 23쪽 다섯째 줄에서 183쪽 25째 줄까지의 실시예 1~27)의 기재 내용에 따라 만들 수 있는데, 후자는 그 내용 전부가 본 명세서의 참고 문헌이다. 나아가, 이러한 화합물의 특정한 실시예를 상기 공보에서 찾을 수 있다.

구조 (II)에 따른 JNK 억제제를 도시하자면 아래 화합물들과:

그리고 약학적으로 허용되는 이들의 염을 들 수 있다.

다른 실시 태양에서, 상기JNK 억제제는 다음 구조 (III)를 취한다:

여기서 R₀은 -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, NH 또는 -CH₂-이고;

상기 제1 또는 제2 치환기는 존재할 경우 3, 4, 5, 7, 8, 9, 또는 10 위치에 있는데, 이때 제1과 제2 치환기는 존재할 경우 독립적으로 알킬, 히드록시, 할로겐, 니트로, 트리플루오로메틸, 술폰일, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬옥시, 사이클로알킬옥시, 알콕시알킬, 알콕시알콕시, 아미노알콕시, 모노-알킬아미노알콕시, 디-알킬아미노알콕시 또는 구조 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)로 나타낸 작용기인데;

다른 실시 태양에서, 상기JNK 억제제는 다음 구조 (IIIA)를 취하는데:

이들은 (i) 무치환, (ii) 모노치환물이고 제1 치환기가 있거나, 또는 (iii) 이중치환물이고 제1과 제2 치환기가 있으며;

상기 제1 또는 제2 치환기는 존재할 경우 3, 4, 5, 7, 8, 9, 또는 10 위치에 있는데, 이때 제1과 제2 치환기는 존재할 경우 독립적으로 알킬, 히드록시, 할로겐, 니트로, 트리플루오로메틸, 술폰일, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬옥시, 사이클로알킬옥시, 알콕시알킬, 알콕시알콕시, 아미노알콕시, 모노-알킬아미노알콕시, 디-알킬아미노알콕시 또는 구조 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)로 나타낸 작용기인데:

구조 (IIIA)의 화합물의 소분류는 상기 제1 치환기 또는 제2 치환기가 5, 7, 또는 9번 위치에 있는 것들이다. 한 실시 태양에서, 제1 또는 제2 치환기는 5 또는 7 번 위치에 자리 잡는다.

구조 (IIIA)의 화합물의 두번째 소분류는 상기 제1 또는 제2 치환기가 5,7 또는 9번 위치에 자리잡은 것들인데;

제1 또는 제2 치환기는 독립적으로 알콕시, 아릴옥시, 아미노알킬, 모노-알킬아미노알킬, 디-알킬아미노알킬, 또는 (a), (c), (d), (e), 또는 (f) 구조로 나타낸 작용기이고;

R₃과 R₄는 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 또는 사이클로알킬알킬이며;

R₅는 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 또는 사이클로알킬알킬이다.

다른 실시 태양에서, 상기 JNK 억제제는 아래 구조 (IIIB)를 취하는데:

구조 (IIIB)의 화합물의 소분류는 상기 제1 치환기 또는 제2 치환기가 5, 7, 또는 9번 위치에 있는 것들이다. 한 실시 태양에서, 제1 또는 제2 치환기는 5 또는 7 번 위치에 자리 잡는다.

구조 (IIIB)의 화합물의 두번째 소분류는 상기 제1 또는 제2 치환기가 독립 적으로 알콕시, 아릴옥시, 또는 (a), (c), (d), (e), 또는 (f) 구조로 나타낸 화합물로서;

R₃과 R₄는 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 또는 사이클로알킬알킬이고;

다른 실시 태양에서, 상기 JNK 억제제는 아래 구조 (IIIC)를 취하는데:

구조 (IIIC)의 화합물의 소분류는 상기 제1 치환기 또는 제2 치환기가 5, 7, 또는 9번 위치에 있는 것들이다. 한 실시 태양에서, 제1 또는 제2 치환기는 5 또는 7 번 위치에 자리 잡는다.

구조 (IIIC)의 화합물의 두번째 소분류는 상기 제1 또는 제2 치환기가 독립 적으로 알콕시, 아릴옥시, 아미노알킬, 모노-알킬아미노알킬, 디-알킬아미노알킬 또는 (a), (c), (d), (e), 또는 (f) 구조로 나타낸 화합물로서;

다른 실시 태양에서, 상기JNK 억제제는 다음 구조 (IIID)를 취하며;

이 때 이들은 (i) 모노치환되었고 제1 치환기가 5, 7 또는 9 번 위치에 있거나 (ii) 이중치환되고 제1 치환기가 5번 위치, 제2 치환기가 7번 위치에 있거나, (iii) 이중 치환되고 제1 치환기가 5번 위치에 있고 제2 치환기가 9번 위치에 있거나, (iv) 이중치환되고 제1 치환기가 7번, 제2 치환기가 9번 위치에 있으며,

이때 상기 제1과 제2 치환기는, 존재할 경우, 독립적으로 알킬, 할로겐, 히드록시, 니트로, 트리플루오로메틸, 술폰일, 카르복시l, 알콕시카르보닐, 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬옥시, 사이클로알킬옥 시, 알콕시알킬, 알콕시알콕시, 아미노알콕시, 모노-알킬아미노알콕시, 디-알킬아미노알콕시, 또는 (a), (b), (c), (d), (e), 또는 (f)로 나타낸 화합물이다:

구조 (IIID)의 화합물의 소분류는 상기 제1 치환기 또는 제2 치환기가 5 또는 7번 위치에 있는 것들이다.

구조 (IIID)의 화합물의 두번째 소분류는 상기 제1 또는 제2 치환기가 독립적으로 알킬, 트리플루오로메틸, 술폰일, 카르복시l, 알콕시카르보닐, 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬옥시, 사이클로알킬옥시, 알콕시알킬, 알콕시알콕시, 아미노알콕시, 모노-알킬아미노알콕시, 디-알킬아미노알콕시이거나 (a), (c), (d), (e) 또는 (f) 구조로 나타낸 화합물이다.

구조 (IIID)의 화합물의 다른 소분류는 상기 제1 또는 제2 치환기가 독립적으로 알콕시, 아릴옥시 또는 (a), (c), (d), (e), 또는 (f) 구조로 나타낸 화합물로서;

다른 실시 태양에서, 상기 JNK 억제제는 아래 구조 (IIIE)를 취하며:

이 때 이들은 (i) 모노치환되었고 제1 치환기가 5, 7 또는 9 번 위치에 있거나 (ii) 이중치환되고 제1 치환기가 5번 위치, 제2 치환기가 7번 위치에 있거나, (iii) 이중 치환되고 제1 치환기가 5번 위치에 있고 제2 치환기가 9번 위치에 있거 나, (iv) 이중치환되고 제1 치환기가 7번, 제2 치환기가 9번 위치에 있으며,

이때 상기 제1과 제2 치환기는, 존재할 경우, 독립적으로 알킬, 할로겐, 히드록시, 니트로, 트리플루오로메틸, 술폰일, 카르복시l, 알콕시카르보닐, 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬옥시, 사이클로알킬옥시, 알콕시알킬, 알콕시알콕시, 아미노알콕시, 모노-알킬아미노알콕시, 디-알킬아미노알콕시, 또는 (a), (b), (c), (d), (e), 또는 (f)로 나타낸 화합물이다:

구조 (IIIE)의 화합물의 소분류는 상기 제1 치환기 또는 제2 치환기가 5 또는 7번 위치에 있는 것들이다.

구조 (IIIE)의 화합물의 두번째 소분류는 이중치환되고 적어도 하나의 치환기가 (d) 또는 (f) 구조로 나타낸 작용기이다.

구조 (IIIE)의 화합물의 다른 소분류는 모노치환된 것들이다. 또 다른 소분류는 모노치환되고 (e) 또는 (f) 구조로 나타낸 작용기를 5 또는 7번 위치에 가지는 화합물이다.

다른 실시 태양에서, 상기 JNK 억제제는 다음 구조 (IIIF)를 가지며:

한 실시 태양에서, 구조 (IIIF)의 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용되는 염는 3, 4, 5, 7, 8, 9 또는 10번 위치에 무치환이다.

구조 (III)의 JNK 억제제는 당업자에게 잘 알려진 유기 합성 방법은 물론, 2001년 2월 22일 발행된 국제 특허 공보 제 WO 01/12609호(특히 24쪽 6째줄부터 49쪽 16째줄까지의 실시예 1~7) 와 2002년 8월 29일 발행된 국제 특허 공보 제 WO 02/066450호(특히 59~108쪽의 화합물 AA~HG)의 기재 내용에 따라 제조할 수 있는데, 이들 공보는 각각 그 전문이 본 명세서의 참고 무헌이다. 나아가 이들 화합물의 특정 실시예도 이들 공보에서 찾을 수 있다.

구조 (III)에 따른 JNK 억제제의 예를 도시하면 아래 화합물과:

;

이들의 약학적으로 허용되는 염을 들 수 있다.

본 발명의 조성물과 방법에 유용한 JNK 억제제의 다른 예를 들자면 국제 특허 공보 제 WO 00/39101호(특히 2쪽 10째 줄부터 6쪽 12째줄까지); 국제 특허 공보 제 WO 01/14375호(특히 2쪽 4째 줄부터 4쪽 4째 줄까지); 국제 특허 공보 제 WO 00/56738호(특히 3쪽 25째 줄부터 6쪽 13째 줄까지); 국제 특허 공보 제 WO 01/27089호(특히 3쪽 7째 줄부터 5쪽, 29째 줄까지); 국제 특허 공보 제 WO 00/12468호(특히 2쪽 10째 줄부터 4쪽 14째 줄까지); 유럽 특허 공보 제1 110 957 호(특히 19쪽 52째 줄부터 21쪽 9째 줄); 국제 특허 공보 제 WO 00/75118호(특히8쪽 10째줄부터 11쪽 26째 줄까지); 국제 특허 공보 제 WO 01/12621호(특히8쪽 10째 줄에서 10쪽 7째 줄까지); 국제 특허 공보 제 WO 00/64872호(특히 9쪽 첫째 줄에서 106쪽 2째 줄까지); 국제 특허 공보 제 WO 01/23378호(특히 90쪽 첫째 줄부터 91쪽 11째 줄까지); 국제 특허 공보 제 WO 02/16359호(특히 163쪽 첫째 줄부터 164쪽 25째 줄까지); 미국 특허 제6,288,089호(특히 컬럼 22의 25째 줄부터 컬럼 25의 35째 줄); 미국 특허 제6,307,056호(특히 컬럼 63의 29째 줄부터 컬럼 66의 22째 줄까지); 국제 특허 공보 제 WO 00/35921호(특히 23쪽 5째 줄부터 26쪽 14째 줄까지); 국제 특허 공보 제 WO 01/91749호(특히 29쪽 1~22째 줄); 국제 특허 공보 제 WO 01/56993호(특히 43쪽에서 45쪽)와 국제 특허 공보 제 WO 01/58448호(특히in at page 39)에 기재된 억제제가 있으나, 이들에 국한되는 것은 아니며, 이들 공보는 그 전문이 본 발명의 참고 문헌이다.

본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 JNK 억제제의 용매화를 촉진하기 위하여 하나 이상의 용매 또는 보조 용매를 포함할 수 있다. 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물에 포함될 수 있는 용매 또는 보조 용매의 예로는 디메틸술폭사이드, 에탄올, 디메틸포름아미드, 에틸렌글리콜, 프로필글리콜과 폴리에틸렌글리콜을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 일반적으로 용매 또는 보조 용매는 어느 JNK 억제제의 특정 농도를 달성하는데 필요한 양만큼만 사용한다. 바람직하게는 수집한 줄기세포와 배양물에 친화적인 용매 또는 보조 용매 그리고 용매 또는 보조 용매를 친화적인 농도로 사용하여야 한다.

만일 본 명세서에서 도시한 화학 구조와 그 구조에 붙인 이름이 일치하지 않을 때에는 도시한 화학 구조를 우선시하여야 한다는 점을 밝혀 둔다. 여기에 덧붙여, 어느 화학 구조 또는 화학 구조의 일부분에서 입체화학이 표시, 예를 들어 굵은 글씨 또는 점선으로 표시되어 있지 않다면, 그 구조 또는 일부분은 모든 입체이성질체를 망라하는 것으로 이해하여야 한다.

1.2.3. 다른 세포 자멸사 억제제

본 발명의 줄기세포 조성물에는 모든 다른 세포 자멸사도 포함될 수 있다. 예를 들어, 많은 실시 태양에서 세포 자멸사 억제제는 2,2'-메틸렌비스(1,3-사이클로헥산디온)(CalBiochem社); 세포 자멸사 억제제 3 단백질(apoptosis inhibitor 3 protein, 즉 XIAP, 바큘로바이러스 IAP 반복부 함유 단백질 4, API3, 포유류 IAP 동족체 A, MIHA, 세포 자멸사 단백질 3의 억제자, X-연관 세포 자멸사 단백질의 억제자, X-연관 IAP, HILP, IAP 유사 단백질, ILP); Mcl-1 단백질 등이 있다.

1.3. TNF 알파 억제제 / 면역 조절 화합물

본 발명의 조성물은 TNF-α억제제, 예를 들어 면역 조절 화합물을 하나 이상 포함할 수 있다. 이러한 면역 조절 화합물은 예를 들어 탈리도이미드 또는 탈리도이미드 유도체일 수 있다.

면역 조절 화합물의 구체적 예로는 미국 특허 제5,929,117호에 기재된 것과 같은 치환 스티렌의 시아노-와 카르복시 유도체; 미국 특허 제5,874,448 and 5,955,476호에 기재된 것과 같은 1-옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3-일) 이소인돌린과 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3-일) 이소인돌린; 미 국 특허 제5,798,368호에 기재된 것과 같은 4중치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-옥소이소인돌린; 1-옥소-와 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일) 이소인돌린들 (예를 들어 탈리도이미드의 4-메틸 유도체)으로서 미국 특허 제5,635,517, 6,476,052, 6,555,554와 6,403,613호에서 개시하는 화합물과 그 밖의 화합물; 미국 특허 제6,380,239호에서 기재하고 있는, 인돌린 고리의 4 또는 5번 위치에 치환된 1-옥소-와 1,3-디옥소이소인돌린(예를 들어 4-(4-아미노-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-4-카바모일부탄산); 2번 위치에 2,6-디옥소-3-히드록시피페리딘-5-일 기로 치환된 미국 특허 제6,458,810호에 기재된 이소인돌린-1-온과 이소인돌린-1,3-디온(예를 들어, 2-(2,6-디옥소-3-히드록시-5-플루오로피페리딘-5-일)-4-아미노이소인돌인-1-온); 미국 특허 제5,698,579와 5,877,200호에서 개시한 비폴리펩티드 고리형 아미드의 일종; 미국 특허 제6,281,230와 6,316,471호에 기재된 것과 같은 아미노탈리도이미드와 그 유사체, 가수분해 산물, 대사물, 유도체와 전구물질, 그리고 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)프탈이미드와 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-옥소이소인돌; 그리고 2001년 10월 5일 자의 미국 특허 출원 제09/972,487 호, 2001년 12월 21일자의 미국 특허 출원 제10/032,286호와 국제 출원 제 PCT/US01/50401(국제 특허 공보 제 WO 02/059106)에 기재된 것과 같은 이소인돌-이미드 화합물을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 언급한 특허와 특허 출원은 본 명세서의 참고 문헌으로 포함되어 있다. 면역 조절 화합물은 탈리도이미드를 포함하지 않는다.

다른 특정한 면역 조절 화합물로는, 미국 특허 제5,635,517호에서 설명하는, 벤조 고리의 아미노기가 치환된 1-옥소-와 1,3 디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린들이 있지만 이들로 한정되지는 않으며, 상기 특허는 본 명세서의 참고 문헌이다. 이들 화합물은 구조 I을 따른다:

여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고, 나머지는 C=O 또는 CH₂이며, R²는 수소 또는 저급 알킬이고, 특히 메틸이다. 구체적인 면역 조절 화합물로는

1-옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-아미노이소인돌린;

1-옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-5-아미노이소인돌린;

1-옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-6-아미노이소인돌린;

1-옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-7-아미노이소인돌린;

1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-아미노이소인돌린;과

1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-5-아미노이소인돌린을 들 수 있지만 이들에 한정되지는 않는다.

본 발명의 다른 구체적인 면역 조절 화합물은 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)프탈이미드와 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-옥소이소인돌 계열인데, 이들은 미국 특허 제6,281,230; 6,316,471; 6,335,349와 6,476,052호, 그리고 국제 특허 출원 제PCT/US97/13375호(국제 특허 공보 제 WO 98/03502호)에 기재된 것들을 포함하며, 이들 특허 문헌들은 본 발명의 참고 문헌이다. 대표적인 분자들은 아래 구조를 취하는데:

여기서, X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 C=O 또는 CH₂이며;

(i) 각 R¹, R², R³과 R⁴는 서로에 무관하게 할로겐, 탄소 수 1 내지 4의 알킬 또는 탄소 수 1 내지 4의 알콕시이거나 (ii) R¹, R², R³과 R⁴ 중 하나는 -NHR⁵이고 R¹, R², R³과 R⁴ 중 나머지는 수소이며;

R⁵는 수소 또는 탄소 수 1 내지 8의 알킬이고;

R⁶은 수소, 탄소 수 1 내지 8의 알킬, 벤질 또는 할로겐인데, 단 R⁶은 X와 Y가 C=O이고 (i) 각 R¹, R², R³과 R⁴가 플루오르이거나 (ii) R¹, R², R³ 또는 R⁴ 중 하나가 아미노기일 때는 수소가 아니다.

이 계열을 대표하는 화합물은 다음 구조식을 가진다:

여기서 R¹은 수소 또는 메틸이다. 별도의 실시 태양에서, 본 발명은 이들 화합물의 거울상이성질적으로 순수한 형태(예를 들어 광학적으로 순수한 (R) 또는 (S) 거울상이성질체)도 망라하고 있다.

본 발명의 또 다른 구체적인 면역 조절 화합물들은 미국 특허 출원 공보 제US 2003/0096841호와 US 2003/0045552호 및 국제 출원 제 PCT/US01/50401호(국제 특허 공보 제 WO 02/059106호)에서 개시하는 이소인돌-이미드 계열에 속하는데, 이들 특허 문헌은 본 발명의 참고 문헌이다.

대표적인 화합물은 화학식 II의 화합물과 그 약학적으로 허용되는 염류, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합 물과 이들 입체이성질체의 혼합물인데:

여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고, 나머지는 C=O 또는 CH₂이며,

R¹은 H, (C1~C8) 알킬, (C3~C7)사이클로알킬, (C2~C8)알켄일, (C2~C8)알킨일, 벤질, 아릴, (C0~C4)알킬-(C1~C6)헤테로고리알킬, (C0~C4)알킬 - (C2~C5)헤테로아릴, C(O)R³, C(S)R³, C(O)OR⁴, (C1~C8)알킬-N(R⁶)₂, (C1~C8)알킬-OR⁵, (C1~C8)알킬-C(O)OR⁵, C(O)NHR³, C(S)NHR³, C(O)NR³R^3', C(S)NR³R^3' 또는 (C1~C8)알킬-O(CO)R⁵;

n은 0 또는 1이고;

*은 키랄 탄소 중심을 나타낸다.

화학식 II의 특정 화합물 중 n이 0이면 R¹은 (C₃-C₇)사이클로알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로사이클로알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, C(O)R³, C(O)OR⁴, (C₁-C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬-C(O)OR⁵, C(S)NHR³, 또는 (C₁-C₈)알킬-O(CO)R⁵이고;

R²는 수소 또는 (C₁-C₈)알킬이며;

R³은 (C₁-C₈)알킬, (C₃-C₇)사이클로알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로사이클로알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, (C₅-C₈)알킬-N(R⁶)₂; (C₀-C₈)알킬-NH-C(O)O-R⁵; (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬-C(O)OR⁵, (C₁-C₈)알킬-O(CO)R⁵, 또는 C(O)OR⁵이며, 다른 변수들의 정의는 앞서 본 바와 같다.

화학식 II의 특정 화합물 중, R² 는 H이거나 (C₁-C₄)알킬이다.

화학식 II의 특정 화합물 중에서, R¹은 (C₁-C₈)알킬 또는 벤질이다.

화학식 II의 특정 화합물 중에서, R¹은 H, (C₁-C₈)알킬, 벤질, CH₂OCH₃, CH₂CH₂OCH₃ 또는

이다.

화학식 II에 따른 화합물의 다른 실시 태양에서, R¹은

이고, Q는 O 또는 S이며, 각 경우에 R⁷은 독립적으로 H,(C₁~C₈)알킬, (C₃~C₇)사이클로알킬, (C₂~C₈)알켄일, (C₂~C₈)알킨일, 벤질, 아릴, 할로겐, (C₀~C₄)알킬-(C₁~C₆)헤테로사이클로알킬, (C₀~C₄)알킬-(C₂~C₅)헤테로아릴, (C₀~C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁~C₈)알킬-OR⁵, (C₁~C₈)알킬-C(O)OR⁵, (C₁~C₈)알킬-O(CO)R⁵, 또는 C(O)OR⁵이거나 이웃하는 R⁷끼리 모여 이중고리 알킬 또는 아릴 고리를 이룰 수 있다.

화학식 II의 특정 화합물 중에서, R¹은 C(O)R³이다.

화학식 II의 특정 화합물 중에서, R³은 (C₀~C₄)알킬-(C₂~C₅)헤테로아릴, (C1~C8)알킬, 아릴 또는 (C₀-C₄)알킬-OR⁵이다.

화학식 II의 특정 화합물 중에서, 헤테로아릴기는 피리딜, 퓨릴 또는 티에닐(theinyl)이다.

화학식 II의 특정 화합물 중에서, R¹은 C(O)OR⁴이다.

화학식 II의 다른 특정 화합물 중에서, C(O)NHC(O)의 수소는 (C₁-C₄)알킬, 아릴, 또는 벤질로 치환될 수 있다.

이 계열 화합물의 추가적인 예로는 [2-(2,6-디옥소-피페리딘-3-일)-1,3-디옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-일메틸]-아미드; (2-(2,6-디옥소-피페리딘-3-일 )-1,3-디옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-일메틸)-카르밤산 3급-부틸 에스테르; 4-(아미노메틸)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온; N-(2-(2,6-디옥소-피페리딘-3-일)-1,3-디옥소-2,3-디하이드로-1H-이소인돌-4-일메틸)-아세트아미드; N-{(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜)-1,3-디옥이소인돌린-4-일)메틸)사이클로프로필-카르복스아미드; 2-클로로-N-{(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥이소인돌린-4-일)메틸}아세트아미드; N-(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥이소인돌린-4-일)-3-피리딜카르복스아미드; 3-{1-옥소-4-(벤질아미노)이소인돌in-2-일}피페리딘-2,6-디온; 2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-4-(벤질아미노)이소인돌린-1,3-디온; N-{(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥이소인돌린-4-일)메틸}프로판아미드; N-{(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥이소인돌린-4-일)메틸}-3-피리딜카르복스아미드; N-{(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥이소인돌린-4-일)메틸}헵탄아미드; N-{(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥이소인돌린-4-일)메틸}-2-퓨릴카르복스아미드; 아세트산{N-(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)카바모일}메틸; N-(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥이소인돌린-4-일)펜탄아미드; N-(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥이소인돌린-4-일)-2-티에닐카르복스아미드; N-{[2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥이소인돌린-4-일] 메틸}(부틸아미노)카르복스아미드; N-{[2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥이소인돌린-4-일] 메틸}(옥틸아미노)카르복스아미드와 N-{[2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥이소인돌린-4-일]메틸}(벤질아미노)카르복스아미드를 들 수 있지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

또 다른 구체적인 본 발명의 면역 조절 화합물은 이소인돌이미드 계열에 속하는데, 이들은 미국 특허 출원 공보 제US 2002/0045643호, 국제 특허 공보 제 WO 98/54170호와 미국 특허 제6,395,754호에서 기술하고 있으며, 이들 각 공보는 본 발명의 참고 문헌이다.

이러한 화합물로 대표적인 것은 화학식 III

과 그 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물과 이들 입체이성질체의 혼합물인데, 여기서:

X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂또는 C=O;

R은 H 또는 CH₂OCOR'이고;

R⁵는 수소 또는 탄소 수 1~8의 알킬;

R⁶은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 벤조, 염소 또는 플루오르;

R'는 R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹);

R¹⁰은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 또는 페닐이며;

*은 키랄 탄소 중심을 나타낸다.

다른 대표적인 화합물들은 아래 화학식의 구조를 가지는데,

여기서, X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂또는 C=O;

R은 H 또는 CH₂OCOR'이고;

(i) R¹, R², R³ 또는 R⁴ 각각은 서로 무관하게 할로겐, 탄소 수 1~4의 알킬, 또는 탄소 수 1~4의 알콕시이거나 (ii) R¹, R², R³ 또는 R⁴중 하나는 -NHR⁵이고 R¹, R², R³ 또는 R⁴중 나머지는 수소이며;

R⁵는 수소 또는 탄소 수 1~8의 알킬;

R⁶은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 벤조, 염소 또는 플루오르;

R'는 R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹);

R¹⁰은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 또는 페닐이다.

다른 대표적인 화합물은 아래의 구조를 취하는데:

여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂또는 C=O;

각 R¹, R², R³과 R⁴는 서로 무관하게 할로겐, 탄소 수 1 내지 4의 알킬 또는 탄소 수 1 내지 4의 알콕시이거나 (ii) R¹, R², R³과 R⁴ 중 하나는 니트로 또는 보호된 아미노기이며 나머지 R¹, R², R³과 R⁴는 수소이고;

R⁶은 수소, 탄소 수 1 내지 8의 알킬, 벤조, 염소 또는 플루오르이다.

다른 대표적인 화합물들은 아래의 구조를 취하는데:

여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂또는 C=O;

각 R¹, R², R³과 R⁴는 서로 무관하게 할로겐, 탄소 수 1 내지 4의 알킬 또는 탄소 수 1 내지 4의 알콕시이거나 (ii) R¹, R², R³과 R⁴ 중 하나는 -NHR⁵이고 나머지 R¹, R², R³과 R⁴는 수소이며;

R⁵는 수소, 탄소 수 1 내지 8의 알킬 또는 CO-R⁷-CH(R¹⁰)NR⁸R⁹인데, 이때 R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰은 수소이고,

예시하는 구체적인 화합물들은 아래 구조를 취하는데:

여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂또는 C=O;

R⁶은 수소, 탄소 수 1 내지 8의 알킬, 벤조, 염소 또는 플루오르이고

R⁷은 m-페닐렌, p-페닐렌 또는 -(C_nH_2n)- 인데 여기서 n은 0 내지 4이고;

각 R⁸ 과 R⁹는 서로 독립적으로 수소 또는 탄소 수 1~ 8의 알킬이거나, R⁸과 R⁹가 함께 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌 또는 -CH₂CH₂X¹CH₂CH₂- 을 이루는데, 이때 X¹은 -O-, -S- 또는 -NH-이며;

R¹⁰ 은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬 또는 페닐이다.

본 발명의 면역 조절 화합물로서 바람직한 것은 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온과 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온이다. 이들 화합물은 표준적인 유기 합성법(예를 들어, 본 명세서의 참고 문헌인 미국 특허 제5,635,517호 참조)을 이용하여 얻을 수 있다. 이 화합물들은 미국의 뉴저지주 Warren의 Celgene Corporation으로부터 얻을 수 있다. 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온은 다음 화학 구조를 가진다:

다른 실시 태양에서, 본 발명에 따른 구체적인 면역 조절 화합물에는 2003년 9월 4일자 미국 예비 출원 제60/499,723호와 그에 대응하는 2004년 9월 3일자 미국 정규 출원에서 개시하는 A, B, C, D, E, F, G와 H형과 같이 다형태(polymorphic)인 3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온을 망라하는데, 이 특허 문헌은 본 명세서의 참고 문헌이다. 예를 들어, 3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 A형은 용매화되지 않은 결정성 물질로서, 비수성 용매로부터 얻을 수 있다. A 형은 X-선 분말 회절 무늬에서 약 8, 14.5, 16, 17.5, 20.5, 24와 26도 지점에서 두드러진 2θ값을 가지며, 시차 주사 열계량법의 녹는점 최대값이 약 270℃이다. A형은 약하게 흡습성이거나 비흡습성이며 지금까지 발견된 3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디하이드로-이소인돌-2-일)-피 페리딘-2,6-디온의 무수 다형태 중 가장 열역학적으로 한정하다. 3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 B형은 반(半)수화된(hemihydrated) 결정성 물질로서 다양한 용매로부터 얻을 수 있는데, 이들 용매를 일부만 들어 예시하면 헥산, 톨루엔과 물이 있다. B형은 X-선 회절 무늬에서 약 16, 18, 22와 27도 지점에서 중요한 2θ값을 보이며 시차 주사 열계량법에서 약 146도와 268℃에서 흡열 곡선을 나타내는데, 이는 고온 현미경 실험(hot stage microscopy experiments)에서 탈수와 용융으로 드러났다. 변환 실험 결과, B형은 수용액에서 E형으로 변환되고, 아세톤과 다른 비수 용매에서는 다른 형태로 변환된다는 것이 알려졌다.

3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 C형은 반용매화된 결정성 물질로서 아세톤과 같은 용매로부터 얻을 수 있는데, 아세톤에 국한되는 것은 아니다. C 형은 X-선 분말 회절 무늬에서 약 15.5와 25도 지점에서 두드러진 2θ값을 가지며, 시차 주사 열계량법의 녹는점 최대값이 약 269℃이다. C형은 상대습도 약 85％ 이하에서는 흡습성이지만 더 높은 습도에서는 B형으로 바뀔 수 있다.

3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 D형은 결정성의 용매화된 형태로서 아세토니트릴과 물의 혼합 용매로부터 얻을 수 있다. D형은 X-선 회절 무늬에서 약 27과 28도 지점에서 두드러진 2θ값을 나타내며, 시차 열 주사 계량법의 녹는점 최대값이 약 270℃이다. D형은 비흡습성이거나 약하게 흡습성이지만, 더 높은 상대 습도에서는 B형으로 변환하는 것이 전형적 이다.

3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 E형은 결정성 이수화물로서 3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온을 물 속에서 슬러리로 만든 다음, 3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온을 아세톤:물 비율이 약 9:1인 용매 속에서 서서히 증발시켜 얻을 수 있다. E형은 X-선 회절 무늬에서 약 20, 24.5와 29도 지점에서 두드러진 2θ값을 나타내며, 시차 열 주사 계량법의 녹는점 최대값이 약 269℃이다. E형은 아세톤 용매 속에서 C형으로, THF 용매 속에서 G형으로 변환할 수 있다. 물 용매 속에서 E형은 가장 안정한 형태로 여기고 있다. E형에 대한 탈용매화(Desolvation) 실험 결과 약 5분 동안 대략 125℃로 가열하면, E 형은 B형으로 변환할 수 있다. 약 5분 동안 175℃에서 가열하면 B형은 F형으로 바뀌었다.

3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 F 형은 용매화되지 않은 결정성 물질로서 E형을 탈수시켜 얻을 수 있다. F 형은 X-선 회절 무늬에서 약 19, 19.5와 25도 지점에서 두드러진 2θ값을 나타내며, 시차 열 주사 계량법의 녹는점 최대값이 약 269℃이다.

3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 G형은 무용매화 결정성 물질로서 테트라하이드로퓨란 등의 용매 속에서 B형과 E형을 슬러리하여 얻을 수 있는데, THF 용매에 국한된 것은 아니다. G형은 X-선 회절 무늬에서 약 21, 23과 24.5도 지점에서 중요한 2θ값을 보이며 시차 주사 열계량법에서 약 267℃에서 녹는점 최대값을 나타낸다.

3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디하이드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 H형은 부분적으로 수화(약 0.25 mol)된 결정성 물질로서 E형을 상대습도 약 0％인 환경에 노출시켜 얻을 수 있다. H 형은 X-선 회절 무늬에서 약 15, 26과 31도 지점에서 중요한 2θ값을 보이며 시차 주사 열계량법에서 약 269℃에서 녹는점 최대값을 나타낸다.

본 발명에 따른 다른 구체적 면역 조절 화합물로는 미국 특허 제5,874,448호와 5,955,476호에 기재된 1-옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3-일)이소인돌린과 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3-일)이소인돌린들을 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니며, 상기 특허 문헌은 본 발명의 참고 문헌이다. 대표적인 화합물들은 다음 화학식 형태를 취하는데:

여기서 Y는 산소 또는 H²이고

각 R¹, R², R³과 R⁴는 서로 무관하게 수소, 할로겐, 탄소 수 1~4의 알킬, 탄소 수 1~4의 알콕시 또는 아미노이다.

본 발명에 따른 다른 구체적 면역 조절 화합물로는 미국 특허 제5,798,368호에 기재된 4중치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-옥소이소인돌린들을 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니며, 상기 특허 문헌은 본 발명의 참고 문헌이다. 대표적인 화합물들은 다음 화학식 형태를 취하는데:

여기서 각 R¹, R², R³과 R⁴는 서로 무관하게 수소, 할로겐, 탄소 수 1~4의 알킬, 탄소 수 1~4의 알콕시이다.

본 발명에 따른 다른 구체적 면역 조절 화합물로는 미국 특허 제6,403,613호에 기재된 1-옥소와 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린들을 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니며, 상기 특허 문헌은 본 발명의 참고 문헌이다. 대표적인 화합물들은 다음 화학식 형태를 취하는데:

여기서 Y는 산소 또는 CH₂,

R¹과 R² 중 첫번째는 할로겐, 알킬, 알콕시, 알킬아미노, 디알킬아미노, 시아노, 또는 카바모일이고, 그 두번째는, 상기 첫번째 작용기와 무관하게, 수소, 할로겐, 알킬, 알콕시, 알킬아미노, 디알킬아미노, 시아노, 또는 카바모일이며

R³은 수소, 알킬, 또는 벤질이다.

구체적인 예로는 아래 화학식의 화합물이 있는데:

여기서 R¹과 R² 중 첫번째 작용기는 할로겐, 탄소 수 1 내지 4의 알킬, 탄소 수 1 내지 4의 알콕시, 알킬기가 탄소 수 1 내지 4인 디알킬아미노, 시아노 또는 카바모일이고,

상기 R¹과 R²중 두번째 작용기는 첫번째 무관하게 수소, 할로겐, 탄소 수 1 내지 4의 알킬, 탄소 수 1 내지 4의 알콕시, 알킬이 탄소 수 1 내지 4인 알킬아미노, 알킬이 탄소 수 1 내지 4인 디알킬아미노, 시아노, 또는 카바모일이며,

R³은 수소, 탄소 수 1 내지 4인 알킬 또는 벤질이다.

구체적인 예로는 1-옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-메틸이소인돌린을 들 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.

다른 대표적인 화합물들은 아래 구조를 취하는데:

R³은 수소, 탄소 수 1 내지 4인 알킬 또는 벤질이다.

다른 구체적인 면역 조절 화합물의 예로는 미국 특허 제6,380,239호와 2004년 7월 28일자의 동시 출원 중인 미국 출원 제10/900,270호에 기재된, 인돌린 고리 4번 또는 5번 위치에 치환된 1-옥소와 1,3-디옥소이소인돌린을 들 수 있지만 이러한 예에 한정되는 것은 아니며, 상기 특허 문헌은 본 발명의 참고 문헌이다. 대표적인 화합물들은 아래 구조 또는 이들의 염인 구조를 가지는데:

여기서 C^*로 나타낸 탄소는 키랄 중심(n은 0이 아니고 R¹은 R²와 같지 않음)이고; X¹과 X² 중 하나는 아미노, 니트로, 탄소 수 1 내지 6의 알킬 또는 NH-Z이고, X¹과 X² 중 나머지는 수소이며; 각 R¹과 R²은 서로 무관하게 히드록시 또는 NH-Z이며; R³은 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬, 할로겐, 또는 할로알킬; Z 는 수소, 아릴, 탄소 수 1 내지 6의 알킬, 포르밀 또는 탄소 수 1 내지 6의 아실이고; n은 0, 1, 또는 2의 값을 가지는데, 단 X¹이 아미노이고 n이 1 또는 2일 때는 R¹과 R²가 동시에 히드록시는 아니다.

대표적인 화합물들은 아래 화학식의 구조를 가지는데:

여기서 C^*로 나타낸 탄소는 n이 0이 아니고 R¹은 R²와 같지 않을 때 키랄 중심이고; X¹과 X² 중 하나는 아미노, 니트로, 탄소 수 1 내지 6의 알킬 또는 NH-Z이고, X¹과 X² 중 나머지는 수소이며; 각 R¹과 R²은 서로 무관하게 히드록시 또는 NH-Z이며; R³은 수소, 탄소 수 1 내지 6의 알킬, 할로겐; Z 는 수소, 아릴, 알킬 또는 탄소 수 1 내지 6의 아실이고; n은 0, 1 또는 2의 값을 가진다.

구체적인 예로는, 아래 구조를 각각 가지는 2-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일)-4-카바모일-부티르산과 4-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일)-4-카바모일-부티르산, 그리고 이들의 약학적으로 허용되는 염, 용 매화물, 전구약물과 입체이성질체를 들 수 있지만 이에 한정되지는 않는다:

과

.

다른 대표적인 화합물은 아래 화학식에 따르는 화합물과 그들의 염으로서,

구체적인 예로는 각각 아래 구조를 가지는 4-카바모일-4-{4-[(퓨란-2-일-메틸)-아미노]-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일}-부티르산, 4-카바모일-2-{4-[(퓨란-2-일-메틸)-아미노]-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일}-부티르산, 2-{4-[(퓨란-2-일-메틸)-아미노]-1,3-디옥소-1,3-디하이드로-이소인돌-2-일}-4-페닐카바모일-부티르산과 2-{4-[(퓨란-2-일-메틸)-아미노]-1,3-디옥소-1,3-디하 이드로-이소인돌-2-일}-펜탄디온산과 이들의 약학적으로 허용되는 염, 용매화물, 전구약물과 이들의 입체이성질체를 들 수 있지만 여기에 한정되는 것은 아니다:

,

,

과

.

상기 화합물의 다른 구체적인 예로는 아래 화학식을 따르는 것들이 있는데:

여기서 X¹과 X² 중 하나는 니트로 또는 NH-Z이고 X¹과 X² 의 나머지는 수소이고;

각 R¹과 R²는 서로에 무관하게 히드록시 또는 NH-Z;

R³은 탄소 수 1~6의 알킬, 할로겐 또는 수소;

Z는 수소, 페닐, 탄소 수 1~6인 아실 또는 탄소 수 1~6인 알킬이고;

n의 값은 0, 1, 또는 2이되;

단 X¹과 X² 중 하나가 니트로이고 n이 1 또는 2이면, R¹과 R²는 히드록시가 아니며;

-COR²와 -(CH₂) _n COR¹이 서로 다를 때는 C^*으로 표시된 탄소가 키랄 중심이다.

다른 대표적인 화합물은 아래 화학식의 구조를 따르는데:

여기서 X¹과 X² 중 하나는 탄소 수 1~6의 알킬이고;

각 R¹과 R²는 서로에 무관하게 히드록시 또는 NH-Z;

R³은 탄소 수 1~6의 알킬, 할로겐 또는 수소;

n의 값은 0, 1, 또는 2이되;

본 발명에 따른 구체적인 면역 조절 화합물의 예로서 또 다른 것을 들자면 미국 특허 제6,458,810 호에 기재된, 2번 위치에 2,6-디옥소-3-히드록시피페리딘-5-일로 치환된 이소인돌린-1-온과 이소인돌린-1,3-디온을 들 수 있지만 이러한 예에 한정되는 것은 아니며, 상기 특허 문헌은 본 발명의 참고 문헌이다. 대표적인 화합물들은 아래 구조 또는 이들의 염인 구조를 가지는데:

여기서 ^*로 표시한 탄소는 키랄 중심이고;

X는 -C(O)- 또는 -CH₂-;

R¹은 탄소 수 1 내지 8의 알킬 또는 -NHR³;

R²는 수소, 탄소 수 1~8의 알킬 또는 할로겐이고;

R³ 은 수소,

탄소 수 1~8의 알킬로서 무치환이거나, 할로겐, 아미노, 탄소 수 1 내지 8인 알콕시 또는 탄소 수 1 내지 4인 알킬아미노로 치환된 알킬,

탄소 수 3~18인 사이클로알킬,

무치환 페닐 또는 치환 페닐로서, 탄소 수 1 내지 8인 알킬, 탄소 수 1 내지 8인 알콕시, 할로겐, 아미노 또는 탄소 수 1 내지 4인 알킬아미노로 치환된 페닐,

무치환 벤질, 또는 치환 벤질로서, 탄소 수 1 내지 8인 알킬, 탄소 수 1 내지 8인 알콕시, 할로겐, 아미노 또는 탄소 수 1 내지 4인 알킬아미노 또는 -COR⁴로 치환된 벤질이고, 이때

R⁴ 는 수소, 탄소 수 1 내지 8의 알킬이고, 이때 상기 알킬은 무치환이거나 할로겐, 아미노, 탄소 수 1 내지 8인 알콕시 또는 탄소 수 1 내지 4인 알킬아미노로 치환된 알킬, 탄소 수 3~18인 사이클로알킬 또는 무치환 페닐 또는 치환 페닐로서, 탄소 수 1 내지 8인 알킬, 탄소 수 1 내지 8인 알콕시, 할로겐, 아미노 또는 탄소 수 1 내지 4인 알킬아미노로 치환된 페닐,

무치환 벤질, 또는 치환 벤질로서, 탄소 수 1 내지 8인 알킬, 탄소 수 1 내지 8인 알콕시, 할로겐, 아미노 또는 탄소 수 1 내지 4인 알킬아미노이다.

본 발명에 따른 화합물은 시중에서 구입하거나 본 명세서에서 개시하는 특허 또는 특허 문헌에 따라 제조할 수 있다. 나아가 광학적으로 수누수한 호합물을 비대칭 합성하거나 공지의 이성질체 분리 시약 또는 키랄 컬럼과 다른 표준 유기 합성 방법을 사용하여 광학 이성질체들로 분리할 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 미국 특허 출원 제2003/0235909호에 기재된 면역 조절 화합물을 더 포함할 수 있는데, 이 특허 문헌은 그 내용 전부가 본 명세서의 참고 문헌이다.

1.4. 혈관 확장제

다른 실시 태양에서, 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 혈관 확장제를 포함한다. 혈관 확장제를 함유하는 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 포유류 태반을 관류하여 태반 유래 줄기세포를 수집하는데 특히 유용하다. 이 혈관 확장제는 공지 기술에서 알려진 모든 확장제여도 무방한데, 여기에는 자연계에 존재하는 혈관 확장제와 인공 혈관 확장제가 포함된다. 한 실시 태양에서, 이 혈관 확장제는 혈압 강하제이다. 이러한 혈압 강하제는 구아닐릴 고리화 효소, ADP-리보오스 전달 효소 또는 사이클로옥시게나아제 또는 이들 셋 모두를 활성화 및/또는 지질 옥시게나아제를 억제한다. 이들 혈관 확장제는 유기 또는 무기 화합물, 예를 들어 심방 나트륨 이뇨펩티드(ANP), 아드레노코르티코트로핀, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 니트로프러시드나트륨, 히드랄라진(hydralazine), 아데노신 삼인산, 아데노신, 인도메타신 또는 황산마그네슘 등이다. 다른 실시 태양에서, 이 혈관 확장제는 인산디에스테르 가수분해 효소 억제제(예를 들어 디부티릴아데노신, 이소부틸메틸크산틴, 인돌리단, 롤리프람(rolipram), 2-오르토-프로폭시페닐-8-아자퓨린-6-온, 트레퀀신(trequensin), 암린온(amrinone), 밀리논(milrinon), 아미노필린(aminophylline) 또는 디피리다몰(dipyridamole))이다.

관류에 의한 줄기세포 수집에서 히드랄라진은 약 0.1 mM 내지 약 10 mM의 농도로 쓰일 수 있다. 마찬가지로 아데소신은 약 0.001 mM 내지 약 10.0 mM; 아데노신 삼인산은 약 0.1 mM 내지 약 1000 mM; 인도메타신은 약 1 mg/kg에서 약 20 mg/kg의 농도로 쓰일 수 있는데, 여기서 "kg"은 장기, 예를 들어 태반의 무게를 가리킨다. 황산마그네슘은 약 0.1 mM 내지 약 20 mM의 농도로 쓰일 수 있다.

1.5. 세포 괴사 억제제

본 발명은 나아가 세포 괴사 억제제를 함유하는 줄기세포 수집용 조성물을 제공한다. 이 세포 괴사 억제제는 공지 기술에 알려진 모든 생리학적으로 허용되는 세포 괴사 억제제이면 무방하다. 따라서 한 실시 태양에서, 본 발명은 생리학 적으로 허용되는 용액의 형태로 세포 괴사 억제제를 함유하는 줄기세포 수집용 조성물을 제공한다. 다른 실시 태양에서, 본 발명은 생리학적으로 허용되는 용액의 형태로 세포 괴사 억제제와 세포 자멸사 억제제를 함유하는 줄기세포 수집용 조성물을 제공한다. 특정 실시 태양에서, 상기 세포 괴사 억제제는 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노-말레이미드, 디티오카르밤산피롤리딘 또는 클론아제팜이다. 다른 특정 실시 태양에서, 세포 괴사 억제제 또는 세포 괴사 억제제와 세포 자멸사 억제제를 함유하는 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 하나 이상의 효소, 예를 들어 앞서 1.1.에서 기술한 효소와 앞서 1.2에서 기술한 세포 자멸사 억제제, 면역 조절 화합물, 즉 예를 들어 앞서 1.3에서 기술한 면역 조절 화합물; 혈관 확장제, 예를 들어 앞서 1.4에서 기술한 혈관 확장제 또는 산소 운반 퍼플루오로카본, 예를 이하 1.6에서 기술할 산소 운반 퍼플루오로카본을 포함할 수 있다.

한 실시 태양에서, 본 발명은 줄기세포의 분리 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포를 세포 괴사 억제제를 함유하는 용액과 접촉하는 단계와 상기 줄기세포를 분리하는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 본 발명은 줄기세포의 분리 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포를 세포 괴사 억제제와 세포 자멸사 억제제를 함유하는 용액과 접촉하는 단계와 상기 줄기세포를 분리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시 태양에서는, 상기 세포 괴사 억제제가 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노-말레이미드, 디티오카르밤산피롤리딘, 클론아제팜 등이다.

1.6. 산소 운반 퍼플루오로카본

본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 하나 이상의 산소 운반 퍼플루오로카본을 더 포함할 수 있다. 일반적으로, 산소 운반 퍼플루오로카본은 물과 섞이지 않는데, 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 특별한 경우가 아니면 생리학적으로 허용되는 수용액인 것이 일반적이다. 따라서 산소 운반 퍼플루오로카본을 함유하는 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 수성층과 퍼플루오로카본층을 별도의 상으로 포함하거나, 상기 두 가지 상을 포함하는 하나의 유탁액일 수 있다. 줄기세포를 수집 과정에서 2상 또는 유탁액 조성물로 접촉시키거나 , 줄기세포를 수성층과 접촉시키고 퍼플루우로카본층과 이어서 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 태반과 같은 장기의 줄기세포는 효소 소화 같은 조직 파괴나 관류 과정에서 JNK 억제제와 같은 자멸사 억제제를 함유하는 생리학적으로 허용되는 수용액과 접촉한 다음, 이때 생기는 세포 현탁액을 퍼플루오로카본과 혼합할 수 있다. 세포 자멸사 억제제와 퍼플루오로카본을 함유하는 상기 생리학적으로 허용되는 용액은 상기 줄기세포의 수집 전에 혼합 예를 들어 유탁액으로 만들어질 수 있다. 이 유탁액을 예를 들어 관류 용액으로 사용하거나, 파괴된 장기 또는 장기의 일부분에서 유래한 세포가 저장되는 용액으로 사용할 수 있다.

따라서 한 실시 태양에서, 저장할 줄기세포에 접촉시키기 전에 상기 세포 자멸사 억제제와 상기 퍼플루오로카본은 하나의 용액, 예를 들어 유탁액 속에 담긴다. 다른 실시 태양에서, 상기 접촉 단계 전에 상기 세포 자멸사 억제제는 제1 용액에 담기고, 상기 퍼플루오로카본은 제2 용액 속에 담긴다.

상기 산소 운반 퍼플루오로카본은 하나의 퍼플루오로카본 화학종으로 이루어 지거나 여러 종류의 화학종으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 상기 산소 운반 퍼플루오로카본은 퍼플루오로알킬 또는 퍼플루오로에테르를 포함할 수 있다. 특정 실시 태양에서 상기 산소 운반 퍼플루오로카본은 다음과 같은 성분을 포함할 수 있다. 하나 이상의 지방족 퍼플루오로카본으로서 일반식이 C_nF_2n+1R 또는or C_nF_2nR₂,(여기서 n은 8에서 12인 정수이고 R은 친지질성 부위이다)인 것, 퍼플루오로에테르로서 일반식이 C_nF_2n+1-O-C_n′F_2n′+1인 것, 퍼플루오로옥틸에탄, 퍼플루오로옥틸데칸, 퍼플루오로데칼린, 퍼플루오로메틸바이사이클로 [3.3.1]-노난, 퍼플루오로디메틸 바이사이클로노난, 퍼플루오로-2,2,4,4-테트라메틸펜탄, 퍼플루오로트리프로필아민, 비스(F-부틸)에텐, (F-이소프로필) (F-헥실) 에텐, 퍼플루오로메틸아다만탄, 퍼플루오로디메틸아다만탄, F-N-메틸데카하이드로이소퀴놀린, F-4-메틸옥타하이드퀴놀리디진, 브롬화퍼플루오로옥틸, 브롬화퍼플루오로데실, α,ω-디클로로-F-데칸, α,ω-디브로모-F-데칸, C₁₀F₂₁CH=CH₂, C₁₀F₂₁CH₂CH₃등.

상기 산소 운반 퍼플루오로카본은 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물 속에 유탁액 형태로 존재하되, 상기 유탁액 부피에 대하여 약 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 100％, 105％, 110％, 115％, 120％, 또는 약 125％ 무게(weight/volume)로 함유될 수 있다. 바람직하게는 산소 운반 퍼플루오로카본을 함유하는 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 유화제(예를 들어 계면활성제)를 더 포함한다. 상기 유화제는 생리학적으로 허용되는 모든 유화제를 쓸 수 있으며, 바 람직하게는 레시틴이다. 이 유화제는 약 0.1％ 에서 약 7％(w/v)의 양으로 함유될 수 있다.

바람직한 실시 태양에서 , 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 제1 퍼플루오로카본과 상기 제1 퍼플루오로카본보다 분자량이 더 큰 제2 퍼플루오로카본을 함유한다. 퍼플루오로카본의 총 부피 중 제1 퍼플루오로카본이 약 50％에서 99.9％를, 제2퍼플루오로카본이 약 0.1％에서 약 50％를 차지하는 것이 전형적이다. 한 실시 태양에서, 제1 퍼플루오로카본은 브롬화퍼플루오로옥틸이고, 제2 퍼플루오로카본은 브롬화퍼플루오로데실이다.

본 발명의 줄기세포 수집용 조성물의 산소 운반 퍼플루오로카본과 수성층은 표준적인 유화 방법, 예를 들어 미국 특허 제4,987,154호에 기재된 고압 균질화, 플라스크에서 흔들어 주기, Manton-Gaulin 믹서 또는 마이크로플루이다이저(Microfluidizer , 미국 매사추세츠주 Newton의 Microfluidics Corp.) 등의 방법을 이용하여 유탁액으로 할 수 있다. 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물이 둘 이상의 서로 다른 퍼플루오로카본을 함유할 때에는 이들을 유화제와 함께 원하는 비율로 수성층과 혼합할 수 있다. 보통 다양한 성분을 단순히 혼합하는 것만으로 예비 유탁액 혼합물을 제조할 수 있다. 이 예비 유탁액 혼합물을 이어서 원하는 유화 처리 장치 속에서 유화 처리한다. 2상(相) 용액으로부터 줄시세포를 수집하는 이러한 유화법은 줄기세포에 대한 파괴를 최소화하기 위하여 선택하는 것이 바람직하다.

줄기세포 수집용 조성물에 포함하시키는 것과 별개로, 산소 운반 퍼플루오로 카본은 태반의 수집 장소(예를 들어 분만실)로 부터 줄기세포 수집 장소로 태반을 운반하는 동안 태반의 보존을 위하여 쓰일 수 있다. 한 실시 태양에서, 줄기세포를 수집한 태반은 태반 수집과 줄기세포 사이의 시간 중 적어도 일부분 동안 하나 이상의 산소 운반 퍼플루오로카본을 함유하는 조성물에 접촉하게 된다. 이 태반은 줄기세포 수집과 태반 수집 사이 시간의 대부분 동안을 산소 운반 퍼플루오로카본에 접촉하게 된다. 다른 실시 태양에서, 태반 수집과 줄기세포 수집 사이의 시간 중 적어도 일부분 동안을 하나 이상의 산소 운반 퍼플루오로카본과 하나 이상의 장기 보존 배지(예를 들어, UW 용액; 이하 3절 참조)를 함유하는 조성물에 접촉하게 된다.

1. 7. 다른 성분들

본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 저장, 개체 오염 둥의 측면에 의한 세포 손상을 줄일 수 있는 다른 성분 또는 줄기세포의 수집을 촉진하는 다른 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 줄기세포 이동제(mobilizer) 및/또는 조혈 촉진제를 포함할 수 있는데, 여기에는 태반 1 kg당 1~10 mg의 VLA-4 (Very Late Antigen) 작용제(예를 들어 항체 등의 알파-4 인테그린 길항제로서 항체(이를 테면 Natalizumab 또는 항-인산화인테그린 α4(Ser988), 클론 6.33 (Upstate Cell Signaling Solutions社), 또는 항체(이를 테면 페닐아세틸-leu-asp-phe-D-프롤린아미드 (Cytel Corp.社, San Diego CA))), G-CSF와 함께 또는 단독으로 태반 1 kg당 0.0~10 mg의 CXCR-4 작용제 (예를 들어 MOZOBIL^TM(AMD3100으로도 알 려져 있음, 캐나다 BC, Langley 소재 AnorMED社), 0.01~10 mg/kg의 SDF-1 유사체(stromal cell-derived factor analog,예를 들어, Chemokine Therapeutics Corp. 社제의 CTCE-0214) 또는 항-SDF-1 항체 등이 있다.

본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 항생제를 살균 용도로(bacteriocidally) 또는 정균 용도로(靜菌 bacteriostatically ) 유효한 분량으로 함유할 수 있다. 일부 비제한적 태양에서는 이 항생제가 마크롤리드(예를 들어 토브라마이신), 세팔로스포린 (예를 들어 세팔렉신, 세프라딘(cephradine), 세프록심(cefuroxime), 세프프로질(cefprozil), 세파클로(cefaclor), 세픽심(cefixime) 또는 세파드록실(cefadroxil)), 클라리트로마이신(clarithromycin), 에리드로마이신, 페니실린(예를 들어 페니실린 V) 또는 퀴놀론(예를 들어, 오플록사신(ofloxacin), 시프로플락신(ciprofloxacin) 또는 노르플록사신(norfloxacin)), 테트라사이클린 등이다. 특정 태양에서는 이 항생제가 그램 양성 및/또는 그램 음성 세균, 예를 들어, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus 등에 유효하다.

본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 하나 이상의 다음 화합물을 포함할 수 있다: 아데노신(약 1 mM에서 약 50 mM); D-포도당(약 20 mM에서 약 100 mM); 마그네슘 이온(약 1 mM에서 약 50 mM); 분자량 20,000 달톤 초과의 거대 분자로서 한 실시 태양에서는 내피의 구조의 손상을 방지하고 세포 생존능을 유지하기에 충분한 분량의 거대 분자(예를 들어 약 25 g/l에서 약 100 g/l, 또는 약 40 g/l에서 약 60 g/l으로 존재하는 합성 또는 천연 콜로이드, 덱스트란 등의 다당류 또는 폴리에틸렌글리콜), 항산화제(예를 들어, 약 25 μM에서 약 100 μM 농도의 부틸화 히드록 시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 글루타티온, 비타민 C 또는 비타민 E); 환원제(예를 들어, 약 0.1 mM에서 약 5 mM의 N-아세틸시스테인); 세포로의 칼슘 유입을 막는 약제 (예를 들어, 약 2 μM에서 약 25 μM의 베라파밀(verapamil)); 니트로글리세린(예를 들어 약 0.05 g/L에서 약 0.2 g/L); 항응고제로서, 한 실시 태양에서는, 잔류 혈액의 응고를 방지하기에 충분한 분량으로 함유되는 응고제(예를 들어 1000 단위/L로 존재하는 히루딘 또는 헤파린); 또는 아밀로리드(amiloride) 함유 화합물(예를 들어 약 1.0 μM에서 약 5 μM로 존재하는 아밀로리드, 에틸 이소프로필 아밀로리드, 헥사메틸렌 아밀로리드, 디메틸 아밀로리드 또는 이소부틸 아밀로리드).

2. 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물을 이용한 줄기세포의 수집 방법

본 발명은 앞서 기술한 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물을 이용하여 태반 줄기세포를 수집하고 분리하는 방법을 또한 제공한다.

한 실시 태양에서, 본 발명은 줄기세포를 분리하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포를 세포 괴사 억제제, 예를 들어 앞서 1.5절에서 기술한 괴사 억제제를 함유하는 용액에 접촉시키고, 상기 줄기세포를 분리하는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 본 발명은 줄기세포를 분리하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포를 세포 자멸사 억제제, 예를 들어 앞서 1.2절에서 기술한 자멸사 억제제를 함유하는 용액에 접촉시키고, 상기 줄기세포를 분리하는 단계를 포함한다 다른 실시 태양에서, 본 발명은 줄기세포를 분리하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포를 세포 자멸사 억제제, 예를 들어 앞서 1.2절에서 기술한 자멸사 억제제와 세포 괴사 억제제, 예를 들어 앞서 1.5절에서 기술한 괴사 억제제 를 함유하는 용액에 접촉시키고, 상기 줄기세포를 분리하는 단계를 포함한다. 특정 태양에서, 상기 세포 괴사 억제제는 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노-말레이미드, 디티오카르밤산피롤리딘, 클론아제팜 등이다. 특정 실시 태양에서, 상기 자멸사 억제제는 카스파제 억제제 또는 c-Jun N-말단 키나아제(JNK) 억제제이다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 JNK 억제제는 상기 줄기세포의 분리 단계 전에 줄기세포의 분화 또는 증식을 조절하지 않는다. 즉 상기 억제제는 상기 줄기세포와 접촉하는 동안 줄기세포의 분화 또는 증식에 측정 가능한 정도의 변화를 일으키지 않는다. 본 발명의 방법에서 줄기세포는 포유류 태반, 탯줄, 태반 혈액 또는 제대혈로부터 분리할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 상기 줄기세포를 산소 운반 퍼플루오로카본, 예를 들어 1.6.절에서 기술한 산소 운반 퍼플루오로카본과 접촉하는 단계를 더 포함한다. 다른 실시 태양에서, 본 방법의 발명은 상기 줄기세포를 효소, 예를 들어 단백질 분해 효소와 접촉하는 단계를 더 포함한다. 이 단백질 분해 효소는 예를 들어 매트릭스 금속 단백 분해 효소 또는 중성 단백 분해 효소일 수 있으며, 도한 예를 들어 콜라게나아제, 써모리신 또는 시스파제일 수 있다. 상기 줄기세포는, 다른 실시 태양에서, 히알루로니다제 같은 점액 분해 효소와 접촉할 수 있다.

본 발명에 쓰이는 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 용액, 예를 들어 식염수 용액 또는 배양액을 포함할 수 있다. 몇몇 실시 태양에서, 이 용액은 히드록시에틸 녹말, 락토비온산 음이온과 라피노스 및/또는 UW 용액을 함유한다.

바람직한 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 분리 도중 저산소 스트레스 또는 전단 응력을 받지 않거나 이러한 응력 또는 스트레스를 가능한 한 최소화한다. 예를 들어, 한 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 분리 도중 저산소 조건하에서 6시간 미만, 2시간 미만, 1시간 미만 또는 30분 미만 동안 처하게 되는데, 여기서 저산소 조건은 혈중 정상 산소 농도보다 낮은 산소 농도를 말한다.

2.1. 물리적 파괴

한 실시 태양에서, 줄기세포는 포유류 장기로부터 얻는데, 예를 들어 태반을 물리적 파괴, 이를 테면 효소 소화시켜 얻는다. 본 발명에 따른 줄기세포 수집용 조성액에 접촉하고 있는 채로 이 장기 또는 그 일부분을 예를 들어, 갈거나, 잡아 떼거나, 저미거나, 네모난 조각으로 썰거나, 잘게 썰거나, 액체에 담그어 연화시키는 등으로 처리할 수 있고 이어서 하나 이상의 효소로 조직을 소화할 수 있다. 이러한 장기 또는 그 일부분을 하나 이상의 효소로 물리적으로 파괴하고 소화하여, 얻은 물질을 본 발명의 상기 줄기세포 수집용 조성액에 담그거나 섞을 수 있다. 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 효소를 함유할 수 있다. 예를 들어 트리판블루 배제법에 의하여 측정한 상기 장기 속의 세포 중 생존 세포 비율이 다수인 한, 바람직하게는 과반수인 한, 더욱 바람직하게는 적어도 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％ 또는 99％인 한 어떠한 물리적 파괴법도 사용할 수 있다. 예를 들어 트리판블루 배제법에 의하여 측정한 상기 장기 속의 줄기세포 중 생존 비율이 다수인 한, 바람직하게는 과반수인 한, 더욱 바람직하게는 적어도 50％, 60％, 70％, 80％,90％, 95％, 98％ 또는 99％인 한 어떠한 물리적 파괴법도 사용할 수 있다.

조직 소화 효소의 모든 조합을 역시 사용할 수 있는데, 예를 들어 앞선 1.1.절에 기술한 하나 이상의 단백질 분해 효소 및/또는 점액 분해 효소를 사용할 수 있다. 예를 들어 태반 조직을 콜라게나아제(예를 들어 콜라게나아제 I, II, III 또는 IV), 디스파제, 엘라스타제, 트립신 등으로 소화할 수 있다. 조직 소화 효소의 전형적인 농도로는 예를 들어 콜라겐 분해 효소 I과 IV의 경우 50~200 단위/mL, 디스파제의 경우 1~10 단위/mL, 엘라스타제의 경우 10~100 단위/mL을 들 수 있다. 태반 줄기세포를 방출하기 위하여 단백질 분해 효소를 조합, 즉 둘 이상의 단백질 분해 효소를 같은 효소 소화 반응에 사용하거나, 순서대로 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 실시 태양에서는 태반 또는 그 일부분을 30 분 동안 적절한 양의 2 mg/mL 콜라겐 분해 효소 I로 먼저 소화시킨 다음, 37℃에서 10 분 동안 0.25％ 트립신으로 소화한다.

다른 실시 태양에서 상기 줄기세포를 함유하는 상기 줄기세포 수집용 조성액 또는 줄기세포 수집용 조성액에서 줄기세포를 분리하기 전 단계에서 이 조직을 파괴 및/또는 소화한 용액 속에, 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌글리콜 비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 가하여 이 조직을 더 파괴할 수 있다.

2.2. 관류

세포, 예를 들어 줄기세포는 관류, 이를 테면 관류 용액으로서 본 발명의 줄기세포 수집용 조성액을 이용하여 태반 혈관계를 관통시켜 장기, 이를테면 포유류 태반으로부터 얻을 수 있다. 한 실시 태양에서는 배꼽 동맥과 배꼽 정맥 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 관류 용액을 흘려보냄으로써 포유류 태반을 관류할 수 있다(도 1, 도 2a~2d). 관류 용액을 태반에 흘려보내는 것은 예를 들어 중력을 이용하여 태반으로 흐르게 함으로써 이룰 수 있다. 바람직하게는, 이 관류 용액을 연동(連動 peristaltic) 펌프 등의 펌프를 이용하여 강제로 태반에 주입한다. 배꼽 정맥은 예를 들어 멸균 도관(tubing)과 같은 살균된 연결부에 이어진 테플론 또는 플라스틱 재질 카뉼라 등의 카뉼라로 삽관될 수 있다. 이러한 살균된 연결부는 도 3에 나타낸 것처럼 관류 매니폴드(manifold)에 연결된다.

관류는 압력 체임버, 예를 들어 관류 도중 태반을 둘러싼 분위기의 압력이 대기압보다 더 높은 체임버의 도움을 받아 이루어질 수 있다. 한 실시 태양에서, 이 압력 체임버 또는 탱크는 다수의 튜브의 유입과 출입을 위한 다수의 포트를 갖추고 있다. 이러한 튜브는 상기 태반 정맥과 동맥에 연결되어 태반 관류물로부터의 분비물(exudates)을 수집하거나 태반 혈관계를 통해서만 순환한 관류물의 수집을 도움으로서 관류를 촉진한다. 이 탱크는 또한 탱트 내부 기압을 조절하는 펌프에 연결된 포트를 또한 갖추고 있다. 특정 실시예에서, 관류 용액은 한 펌프를 통하여 태반(태아) 혈관계로 주입되고, 다른 펌프는 태반에 대한 기압을 조절하는 데, 예를 들어 관류물을 수집하는 것을 돕기 위한 가압을 하거나 또는 태반이 생체 내에 있을 때의 자연적 압력을 근사할 수 있다.

관류를 준비하면서 태반은 배꼽 동맥과 배꼽 정맥이 태반의 가장 높은 지점에 자리하도록 놓는(예를 들어 매달아 두는) 것이 바람직하다. 이 태반은 본 발명의 줄기세포 수집용 조성액 등의 관류 용액을 태반 혈관계 또는 태반 혈관계와 주 변 조직에 통과시켜 관류할 수 있다. 관류 용액은 태반 혈관 중 어느 곳이라도, 어떤 조합이라도 통하여 흐를 수 있다. 관류 용액은 태반 혈관계를 따라 양쪽 방향(즉 태반 용액은 태반 동맥을 통하여 혹은 태반 정맥을 통하여 관류될 수 있으며, 태반 동맥 또는 태반 정맥 또는 태반 조직에서 스며나옴으로써 수집될 수 있다)으로 흘러갈 수 있다. 한 실시 태양에서는 배꼽 동맥과 배꼽 정맥이 도 1에 나타낸 것처럼 동시에 피펫에 연결되어 있는데, 이 피펫은 유연한 연결부를 통하여 관류 용액 저장소에 이어져 있다. 이 관류 용액은 배꼽 정맥과 동맥으로 흘러간다. 이 관류 용액은 상기 혈관들로부터 태반 주변 조직으로 스며나오고/스며나오거나 이들 혈관을 따라 주변 조직으로 흘러들어가며, 태반 표면으로부터 임신 도중 자궁에 붙인 적당한 열린 용기 속에 모이게 된다. 이 관류 용액은 한편 탯줄의 구멍을 통하여 주입할 수도 있으며, 모체 자궁벽에 접하고 있는 태반의 벽에 있는 구멍 속으로 흘러들어가거나 구멍으로부터 걸러나올 수 있다. 다른 실시 태양에서는 이 관류 용액으로 하여금 배꼽 정맥을 지나게 하여 배꼽 동맥에서 모으거나 배꼽 동맥을 지나게 하여 배꼽 정맥에서 모을 수 있다.

한 실시 태양에서 태아쪽 탯줄은 관류 동안 집게로 집히게 되며, 더 바람직하게는 태반 원반에 탯줄이 삽입되는 지점에서 4~5 cm 이내 위치에서 집게로 집히게 된다.

실혈(exsanguination) 과정에서 포유류 태반으로부터 처음 얻은 관류액, 예를 들어 본 발 명의 줄기세포 수집용 조성물은 제대혈 및/또는 태반 혈액의 잔류 적혈구 때문에 색깔을 띠는 것이 일반적이다. 이 관류액은 관류가 진행됨에 따라 서 색깔이 옅어지며, 잔류 제대혈 세포들은 태반에서 씻겨 나간다. 일반적으로 태반을 처음에 실혈하는데는 30에서 100 mL의 관류액이면 충분하지만 관측된 결과에 따라 관류액의 양을 가감할 수 있다.

태반 줄기세포를 수집하는데 쓰이는 관류액의 양은 수집할 줄기세포의 수, 태반의 크기, 한 태반에서 수집할 회수 등에 따라 달라진다. 많은 실시 태양에서, 관류액의 양은 50 mL 내지 5000 mL, 50 mL 내지 4000 mL, 50 mL 내지 3000 mL, 100 mL 내지 2000 mL, 250 mL 내지 2000 mL, 500 mL 내지 2000 mL 또는 750 mL 내지 2000 mL이다. 실혈 후 700~800 mL의 관류액으로 태반을 관류하는 것이 전형적인 경우이다. 본 발명에서는 모든 포유류 태반의 관류를 염두에 두고 있기 때문에, 적어도, 1.0 mL, 2.0 mL, 3.0 mL, 4.0 mL, 5.0 mL, 6.0 mL, 7.0 mL, 8.0 mL, 9.0 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 25 mL, 30 mL, 35 mL, 40 mL, 45 mL, 50 mL, 55 mL, 60 mL, 65 mL, 70 mL, 75 mL, 80 mL, 85 mL 90 mL, 95 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL, 1000 mL, 1500 mL, 2000 mL, 2500 mL, 3000 mL, 3500 mL, 4000 mL, 4500 mL, 5000 mL, 5500 mL, 6000 mL, 6500 mL, 7000 mL, 7500 mL, 8000 mL, 8500 mL, 9000 mL, 9500 mL 또는 10,000 mL의 관류 용액 또는 상기 부피 만큼의 관류 용액으로 태반을 관류하여 태반 유래 줄기세포를 수집할 수 있다.

상기 장기, 예를 들어 태반을 여러 시간 또는 여러 날에 걸쳐서 여러 번 관류할 수 있다. 여러 번 태반을 관류하는 경우, 무균 조건하의 용기 또는 적절한 담체 속에서 태반을 유지하고 배양하고 항응고제(예를 들어 헤파린, 워페린나트륨, 쿠마린, 비스히드록시쿠마린, 시트르산, 시트르산 인산 덱스트로스 아데닌(CPDA-1))를 포함하거나 포함하지 않은 줄기세포 수집용 조성액 또는 표준 관류 용액(예를 들어 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 정상적인 식염수)으로 관류할 수 있는데, 이 조성액 또는 관류 용액은 항생제(예를 들어 스트렙토마이신(예를 들어 40~100 μg/mL 농도로), 페니실린(예를 들어 40 단위/mL), 암포테리신 B(예를 들어 0.5 μg/mL))를 더 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 한 실시 태양에서 분리된 장기, 예를 들어 태반은 관류된 액체를 수집하지 않은 채로 일정 기간 유지되거나 배양되는데, 여기서 이 태반은 관류와 관류물 수집 이전에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 동안, 혹은 이틀, 사흘 또는 더 오랜 동안 유지되거나 배양된다. 이렇게 관류된 장기는 한 번 또는 여러 번에 걸쳐 유지될 수 있는데, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 동안 혹은 더 오랜 동안 유지할 수 있고, 이어서 두 번째 관류, 예를 들어 700~800 mL의 관류액으로 관류될 수 있다. 이 장기를 1, 2, 3, 4, 5회 또는 더 많이 관류할 수 있는데, 예를 들어 매 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간마다 관류할 수 있다. 바람직한 실시 태양에서 이러한 태반의 관류와 관류 용액, 예를 들어 줄기세포 수집용 조성액의 수집은 회수한 유핵 세포 수가 100 세포/mL보다 아래로 떨어질 때까지 반복된다. 서로 다른 시점에서 얻은 관류물을 개별적으로 더 처리하여 시간 의존적인 세포군, 예를 들어 줄기세포군을 회수할 수도 있다. 서로 다른 시점에서 얻은 관류물을 한 데 모을 수도 있다.

태반을 본 명세서에서 기술한 하나 이상의 줄기세포 수집용 조성물 속에서 배양할 수 있는데, 여기서는 상기 줄기세포 수집용 조성물을 곧바로 수집하지 않고 태반 유래 줄기세포를 수집하기 전에 태반 혈관계 속에 머무르도록 한다. 예를 들어, 한 실시 태양에서는 태반 혈관계를 채우기에 충분한 양의 줄기세포 수집용 조성물로 태반을 관류할 수 있는데, 이때 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물은 예를 들어 후속 단계의 줄기세포 수집을 용이하게 하는 혈관 확장제를 함유할 수 있다. 다른 실시 태양에서, 태반을 예를 들어 하나 이상의 단백질 분해 효소를 함유하는 줄기세포 수집용 조성물로 관류할 수 있다. 이 태반을 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물 속에서 하나 이상의 단백질 분해 효소가 태반 조직을 소화하기에 충분한 시간, 예를 들어 1~5 시간 동안 배양할 수 있는데, 그 줄기세포는 후속 관류를 통하여 수집하게 된다.

태반을 다른 줄기세포 수집용 조성물로 관류하여도 좋다. 예를 들어 태반을 먼저 혈관 확장제를 함유하는 줄기세포 수집용 조성물로 상기 혈관 확장제가 태반 혈관을 확장하기에 충분한 시간 동안 관류할 수 있다. 이때 태반 혈관계를 채우기에 꼭 필요할 만큼의 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물을 이용하는 것이 바람직하다. 선택적으로 이 태반을 본 발명의 줄기세포 수집용 조성물 속에서 앞서 기술한 것처럼 줄기세포 수집 전까지 배양할 수도 있다. 상기 태반을 이어서 하나 이상의 단백질 분해 효소를 함유하는 두번째 줄기세포 수집용 조성물로 관류한다. 선택적으로 이 태반을 이 줄기세포 수집용 조성물 속에서 효소가 태반 조직을 소화하기에 충분한 시간 동안 배양할 수 있다. 이어서 이 태반을 추가적인 줄기세포 수집용 조성물 또는 세번째 줄기세포 수집용 조성물, 이를테면 하나 이상의 세포 자멸사 및/또는 괴사 억제제를 함유하는 조성물로 관류할 수 있다. 서로 다른 줄기세포 수집용 조성물을 순차적으로 조합하는 다른 방법은 당업자에 자명할 것이다.

한 실시 태양에서는 자연스런 질내 분만(SVD)을 위하여 태반 혈관계를 본 발명의 수집용 조 성물로 채우고 태반을 용액 속에 세척(예를 들어 담금)함으로써 줄기세포를 분만 후 약 20 내지 약 24시간 후에 이를테면 관류하여 수집할 수 있다. 다른 실시 태양에서는 태반을 분만과 줄기세포 수집 사이의 기간의 적어도 일부분 동안 수집용 조성물 속에 담가 둔다. 다른 실시 태양에서는 태반 혈관계를 분만과 줄기세포 수집 사이의 기간의 적어도 일부분 동안 수집용 조성물로 채워 둔다. 다른 실시 태양에서는 분만 직후와 관류, 효소 소화 또는 태반 조직 배양 등을 통하여 줄기세포를 수집하기 전까지 태반을 냉장(예를 들어 약 0℃ 내지 약 5℃)한다. 특정 실시 태양에서, 줄기세포는 냉장 태반으로부터 분만 후 약 20 내지 24시간 후에 수집된다.

특정 이론에 구애받고자 하는 것은 아니지만, 태반을 실혈하 충분한 시간 동안 관류한 다음에 태반 줄기세포는 실혈되고 관류된 태반의 미세혈액순환 속으로 옮겨가서 본 발명의 방법에 따라 채집되는 것으로 생각되는데, 채집은 관류에 의하여 수집 용기 속으로 씻어넣는 방식이 바람직하다. 분리된 태반을 관류하면 잔류 제대혈을 제거할 수 있을 뿐 아니라 태반에 산소를 포함하는 적절한 양분을 공급할 수 있다. 이 태반은 배양되거나 제대혈을 제거하는데 쓰인 것과 유사한 용액으로 관류될 수 있는데, 이 용액에는 항응고제를 넣지 않는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법으로 관류하면 포유류 태반을 상기 용액으로 관류하지 않고, 줄기세포를 얻기 위하여 다른 처리(예를 들어 효소 소화 등의 조직 파괴)를 하지도 않은 경우와 견주었을 때보다 유의미하게 더 많은 수의 줄기세포를 포유류 태반에서 얻을 수 있다. 여기서 "유의미하게 더 많은"이란 적어도 10％ 이상 더 많은 것을 뜻한다. 본 발명에 따라 관류하면 유의미하게 더 많은 태반 줄기세포를 얻을 수 있는데, 예를 들어 태반 또는 그 일부분이 배양된 배양 배지로부터 djedfm 수 있는 태반 줄기세포 수보다 더 많다.

줄기세포는 하나 이상의 단백 분해 효소 또는 다른 조직 파괴성 효소를 갖추고 있는 용액으로 관류하여 분리할 수 있다. 특정 실시 태양에서, 태반 또는 그 일부분(예를 들어 양막, 양막과 융모막, 태반 소엽(placental lobule) 또는 태반엽 혹은 이들의 모든 조합)의 온도는 25~37℃로 조절되고, 이를 200 mL의 배양 배지 속에서 하나 이상의 조직 파괴성 효소와 30 분 동안 배양하게 된다. 이 관류물로부터 세포를 수집하고, 4℃로 식힌 다음, 5 mM EDTA, 2 mM 디티오트레이톨과 2 mM 베타메르캅토에탄올을 함유하는 차가운 억제제 혼합물로 세척한다. 몇 분 후 줄기세포를 찬(예를 들어 4℃) 본 발명의 줄기세포 수집용 조성액으로 세척한다.

2.3. 줄기세포의 분리, 분류와 특성 파악

효소 소화 방식이건 관류에 의하여 얻은 것이건 관계 없이, 포유류 태반 등의 장기로부터 얻은 세포는 처음에 피콜(Ficoll) 농도구배 원심분리를 하여 다른 세포로부터 정제할 수 있다. 이러한 원심분리는 원심분리 속도 등에 관한 모든 표준적인 실험 방법에 따라 이루어질 수 있다. 한 실시 태양에서는 태반 등의 장 기에서 수집한 세포를 약 400 내지 약 1000×g로 10~30분 동안 실온에서 원심분리하여 관류물로부터 회수한다. 다른 실시 태양에서는 관류물을 약 200 mL로 농축하여, 피콜, 퍼콜(Percoll) 또는 헤타녹말(hetastarch)의 농도 구배 위에 하나의 층으로 가하고, 22℃에서 20분 동안 약 400~3000×g로 원심분리하여, 세포의 저밀도 계면층을 후속 처리를 위하여 수집한다.

세포 펠렛은 신선한 줄기세포 수집용 조성액 또는 줄기세포 유지에 적합한 배지, 예를 들어 2 단위/mL 헤파린과 2 mM EDTA(미국 뉴욕주 GibcoBRL), DMEM 등을 함유한 IMDM 무혈청 배지에 재현탁된다. 한 실시 태양에서는 관류 또는 파괴 예를 들어, 효소 소화를 통하여 수집한 태반 세포를 예를 들어, DMEM-LG, MCDB-201[ITS(인슐린, 트랜스퍼린, 셀렌), LA-BSA(리놀레산-소 혈청 알부민), 덱사메타손, 표피 성장 인자(EGF), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF)] 및 페니실린 및/또는 스트렙토마이신 등의 항생물질로 이루어진 배지 속에서 선별할 수 있다. 단핵 세포 총분획은 Lymphoprep(노르웨이 오슬로 Nicomed Pharma사) 등을 이용하여 제조사의 설명에 따라 얻을 수 있고, 이 총분획을 재현탁한다. 줄기세포가 재현탁된 이 줄기세포 조성물 또는 배지는 줄기세포와 양립할 수 있는 단백질, 예를 들어 사람 알부민 등의 알부민을 함유하는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 태반 줄기세포의 "분리"란 처리하지 않은 장기, 예를 들어 포유류 태반 속에서 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 세포를 적어도 50％ 제거하는 것을 뜻한다. 한 장기에서 얻은 줄기세포는 처리하지 않은 상태의 그 장기 속에서 그 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 다른 세포가 전체 세포의 50％ 미 만일 때 "분리"되었다고 할 수 있다.

관류나 소화에 의하여 얻은 태반 세포는 차등 트립신 처리(differential trypsinization)로 더 분리되거나, 처음에 이를 이용하여 분리할 수 있는데, 예를 들어 0.2％ EDTA(미국 미주리주 세인트루이스 Sigma사)를 함유한 0.05％ 트립신 용액을 사용한다. 차등 트립신 처리는 예를 들어 태반으로부터 얻은 섬유모세포 유형세포(fibroblastoid)가 플라스틱 표면으로부터 약 5분 이내에 탈착하는데 반하여 다른 부착 세포군은 20~30 분보다 더 많은 배양 시간을 요하는 것이 전형적인 경우이기 때문에 가능하다. 탈착된 섬유모세포 유형세포는 트립신 처리와 트립신 중화 용액(Cambrex사의 TNS) 등을 이용한 트립신 중화 처리 후에 수집할 수 있다. 부착 세포를 분리하는 한 실시 태양에서는 예를 들어, 5~10×10⁶ 개의 세포를 담은 분액을 여러 개의 T-75 플라스크에 각각 나누어 담게 되는데, 피브로넥틴 피복 T-75 플라스크가 바람직하다. 이 실시 태양에서는 세포를 시판되는 중간엽 줄기세포 성장 배지(Cambrex사의 MSCGM)으로 배양하고 조직 배양기(37℃, 5％ CO₂) 속에 놓아 둔다. 10~15 일 후 PBS 세척으로 비부착 세포를 상기 플라스크로부터 제거한다. 이어 PBS를 MSCGM으로 대체한다. 바람직하게는 플라스크를 날마다 점검하여 다양한 부착 세포 유형을 확인하는데, 특히, 섬유모세포 유형의 세포를 확인하고 세포군의 증폭 여부를 점검한다.

장기, 예를 들어 태반에서 수집한 세포의 수와 종류는 예를 들어 흐름세포 측정법, 세포 분류법, 면역세포화학(예를 들어 조직 특이적 또는 세포 표지 특이적 항체로 세포를 염색하는 것), 형광표지 세포 분리(FACS), 자기 활성화 세포 분류(magnetic activated cell sorting, MACS)와 같은 표준적인 세포 검출법을 통한 세포 형태와 세포 표면 표지의 변화를 측정함으로써, 빛이나 공초점 현미경을 이용한 세포 형태 분석 및/또는 PCR과 유전자 발현 분석(profiling) 등의 공지 기술을 이용한 유전자 발현 변화 측정으로써 관측할 수 있다. 이러한 방법은 하나 또는 그 이상 의 특정 표지에 대하여 양성인 세포를 확인하는데에도 쓰일 수 있다. 태반 세포, 특히 피콜 분리, 차등 부착 또는 이들을 조합하여 분리한 세포는 형광표지 세포 분리 장치(FACS)를 이용하여 분류할 수 있다. FACS는 세포를 포함한 입자를 분류하는 공지의 방법으로서, 입자의 형광 특성에 바탕을 두고 있다(Kamarch의 Methods Enzymol, 151:150~165(1987)). 개별 입자의 형광부를 레이저로 들뜨게 하면 작은 전하가 발생하여 양과 음의 입자를 혼합물로부터 전자기적으로 분리할 수 있다. 한 실시 태양에서는 세포 표면 표지에 특이적인 항체 또는 리간드를 서로 다른 형광 표지로 표지한다. 이어서 사용된 항체에 결합하는지 여부에 따라 세포를 세포 분리기로 처리하여 분리한다. FACS로 분류된 입자들은 분리와 클로닝을 더 용이하게 하기 위하여 곧바로 96-웰 또는 384-웰 플레이트의 개별 웰 속으로 운반될 수 있다.

한 세포 분류법에서는 태반에서 온 줄기세포를 도 4에 나타낸 것처럼 AC133, CD34, CD38, CD90, CD117, HLA-DR, CD10, CD4, CD71, CD38, CD45와 CD61 표지의 발현 여부에 따라 분류한다. 다른 실시 태양에서는 태반에서 얻은 세포를 CD200 및/또는 HLA-G 표지의 발현 여부에 따라 분류한다. 한 실시 태양에서는 이들 표지 중 어느 하나라도 나타내는 세포는 후속 용도를 위하여 분리한다. 예를 들어 CD200 및/또는 HLA-G를 발현하는 세포는, 특정 실시 태양에서 CD73 및/또는 CD105의 발현 여부 혹은 항체 SH2, SH3 또는 SH4가 인식하는 항원 결정기의 존부 또는 CD34, CD38 또는 CD45의 미발현 여부에 따라 추가적으로 분류된다. 한 실시 태양에서는 예를 들어, 태반 세포를 CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38과 CD45의 발현 또는 미발현에 의거하여 분류하고, CD200⁺, HLA-G⁺, CD73⁺, CD105⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-인 태반 세포를 후속 용도를 위하여 다른 태반 세포로부터 분리한다.

한 실시 태양에서는 자기 비드를 이용하여 세포를 분리한다. 입자가 자기 비드(지름 0.5~100 ㎛)에 결합하는 능력에 따라 입자를 분리하는 방법인 자기 활성화 세포 분류(MACS)에 의하여 이 세포들을 분류할 수 있다. 이 자성의 미세구에는 유용한 변형을 다양하게 가할 수 있는데, 특정 세포 표면 분자 또는 불완전 항원(hapten)을 인식하는 항체를 공유 결합으로 연결하는 것 역시 이 변형에 포함된다. 이어서 이러한 비드를 세포와 섞어 주어 결합을 유도한다. 이 세포를 자기장 속에 통과시켜 특정 세포 표면 표지를 가지는 세포를 분리해 낸다. 한 실시 태양에서는 이들 세포를 이어서 분리한 다음 다른 세포 표면 표지들에 특이적인 항체와 결합한 자기 비드와 다시 섞어주게 된다. 이들 세포를 다시 자기장 속에 통과시켜 상기 항체 양쪽에 결합한 세포를 분리한다. 이러한 세포는 클론 분리를 위하여 각각의 미량역가판(microtiter dish)에 희석해 넣을 수 있다.

한편 세포 형태와 성장 특성을 바탕으로 하여 태반 세포, 예를 들어 태반 줄기세포를 특성화 및/또는 분류할 수 있다. 예를 들어 태반 세포는 배양시 자갈 모양 또는 섬유모세포 유사(fibroblastoid) 형상을 나타내느냐에 따라서 특성 분류 및/또는 선별될 수 있다. 태반 줄기세포는 또한 배아유사체(embryoid body) 형성 능력에 따라 특성 파악 및/또는 선별할 수 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서는, 섬유모세포 유사 형상이고, CD73 및CD105를 발현하며, 배양시 하나 또는 그 이상의 배아유사체를 형성하는 태반 세포를 나머지 태반 세포로부터 분리한다. 다른 실시 태양에서는, 배양시 하나 이상의 배아유사체를 생성하는 OCT-4⁺ 태반 세포를 나머지 태반 세포로부터 분리한다.

다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 콜로니 형성 단위 분석(colony forming unit assay)를 이용하여 확인하고 특성 파악하게 된다. 콜로니 형성 단위 분석은 이 분야에서 널리 알려져 있는데, Mesen Cult(캐나다 브리티시 콜럼비아 주 밴쿠버의 Stem Cell Technologies, Inc.의 상표) 배양 배지를 예로 들 수 있다.

줄기세포, 예를 들어 태반 줄기세포의 생존능, 증식 잠재성과 수명은 이 분야에 알려진 표준적인 기법을 이용하여 평가할 수 있는데, 이들 기법의 예는 다음과 같다: 트리판블루 배제 분석, 디아세트산플루오레사인 흡수 분석, (생존능 평가를 위한)요오드화프로피듐 흡수 분석, 티미딘 흡수 분석, (증식을 평가하는)MTT 세포 증식 분석. 세포의 수명도 장기 배양시 세포군 배증의 최대값을 측정하는 등의 이 분야에 잘 알려진 방법으로 알아낼 수 있다.

2.4. 줄기세포 저장

다른 실시 태양에서, 태반에서 수집한 세포는 장래에 사용하기 위하여 냉동 보존될 수 있다. 줄기세포와 같은 세포의 냉동 보존을 위한 방법은 공지 기술로 잘 알려져 있는데, 예를 들어 Hu 외 특허 공보(WO 00/73421, 2000년 12월 7일 간행)를 보라.

2.5. 줄기세포군의 역가(potency)

본 명세서에서 기술하는 태반 유래 줄기세군 또는 태반 유래 줄기세포를 포함하는 분리된 세포군에 대하여 콜로니 형성 단위 분석법을 이용하여 역가(potency), 즉 생존능이 있는 세포의 수를 분석할 수 있다. 바람직한 실시 태양에서는, 콜로니 형성 단위 분석을 이용하여 태반의 최초 관류물로부터 또는 태반 조직의 최초 효소 소화로 얻은 태반 줄기세포군의 역가를 평가한다. 태반 유래 줄기세포군 또는 세포 배양하여 적어도 1회, 적어도 5회, 10회, 15회, 20회 또는 더 많이 계대한 태반 유래 줄기세포를 함유하는 분리된 태반세포군에 대해서도 콜로니 형성 단위 분석을 할 수 있다. 모든 표준적인 콜로니 형성 단위 분석법을 쓸 수 있는데, 예를 들어 StemCell Technologies, Inc.사가 제공하는 콜로니 형성 분석이 있다. 이러한 분석법은 예를 들어, MesenCult^TM배지(캐나다 브리티시 콜럼비아 주 Stem Cell Technologies, Inc.사)를 이용할 수 있다.

콜로니 형성 단위 분석을 태반 유래 줄기세포의 개별 세포군(예를 들어 관류물 또는 소화물의 개개의 단위) 또는 태반 유래 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군에 시행하여 세포군의 역가를 평가할 수 있다. 예를 들어, 콜로니 형성 단 위 분석을 단독 또는 생존능 검사 등의 다른 검사와 병행하여 태반 유래 세포군 속의 유용한 세포의 수를 측정할 수 있다. 이러한 콜로니 형성 단위 분석은 세포군으로부터 취한 적은 시료 세포에 대하여 행하고, 그 결과를 남아 있는 세포군에 대하여 외삽하는 것이 전형적이다.

상기한 콜로니 형성 단위 분석법은 다양하게 조제된 줄기세포 수집용 조성물들에 대하여 그 효능을 평가하는데 쓰일 수 있는데, 즉 상기 분석법을 이용하여 다양한 상황에서의 줄기세포 수집능이 향상되었거나 최적인지를 확인하는데 쓰일 수 있다.　 이러한 상황에는 예를 들어 줄기 세포 수집 전에 태반을 획득하고, 운반하고 배양하고 취급하는 상황, 줄기세포를 수집하는 상황, 태반 수집과 줄기세포 수집 사이의 상황, 줄기세포 수집 과정의 일부 또는 그 사전 단계로서 태반 배양 단계의 존재 또는 부존재 등이 있다.　 예를 들어 본 발명의 한 실시 태양에서는 태반 유래 줄기세포군 또는 태반 유래 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군의 역가를 평가하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 세포군을 줄기세포 수집용 조성물과 접촉시키는 단계; 상기 세포군이 낳는 콜로니 형성 단위의 수를 콜로니 형성 분석법으로 세는 단계를 포함하며, 여기서 상기 콜로니 형성 단위의 수는 세포군의 역가와 상관 관계가 있다.　 특정 태양에서는 콜로니 형성 단위의 수를 대조군과 비교할 수 있다.　 예를 들어, 이 대조군은 일정한 수의 태반 유래 줄기세포로부터 예상되는 콜로니 형성 단위의 절대치와 같은 역가의 기준값일 수 있다.　 다른 사례에서, 이 대조군은 제2의 줄기세포 수집용 조성물로 접촉시킨, 동일한 수의 태반 유래 줄기세포로부터 생성된 콜로니 형성 단위의 수일 수 있다.　 이 사례에서 콜로니 형성 단위 분석법은 두 가지 조성물을 비교하여 어느 쪽이 생존능 있는 태반 유래 줄기세포를 더 잘 보존하고, 더 많이 생성하는지 평가하게 하여준다.　 다른 특정 태양에서 이 대조군은 분만 장소로부터 줄기세포 수집 장소로 특정 방법을 이용하여 옮겼을 때 얻을 수 있는 콜로니 형성 단위의 수 또는 평균이다.　 다른 특정 태양에서, 상기 대조군은 줄기세포 수집 장소에서 태반을 취급하는 특정 방법을 사용하였을 때 얻을 수 있는 콜로니 형성 단위의 수이다.

본 발명의 다른 태양에서는, 태반 유래 줄기세포 또는 태반 유래 줄기세포를 포함하는 분리된 태반 세포군을 보존하기 위한 줄기세포 수집용 조성물의 선별 방법을 제공하는데, 이 방법은 소정의 수의 태반 유래 줄기세포를 함유하는 제1 세포군을 제1 줄기세포 수집용 조성물에 접촉시키는 단계, 상기 소정의 수의 태반 줄기세포를 함유하는 제2 세포군을 제2 줄기세포 수집용 조성물에 접촉시키는 단계, 제1세포군의 콜로니 형성 단위 수를 제2세포군의 콜로니 형성 단위 수와 비교하는 단계와 이들 양 콜로니 형성 단위 수 중 어느 쪽이 더 큰지 선별하는 단계를 포함하며, 이때 상기 제1 세포군과 제2 세포군은 각각 콜로니 형성 단위 분석에서 콜로니 형성 단위를 생성한다.

3. 줄기세포 보존

본 발명의 다른 측면에서는 줄기세포군을 보존하는 조성물과 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 줄기세포군의 보존 방법은 분리된 줄기세포군과 줄기세포 분리와 수집 과정 이전 또는 도중에 장기 또는 조직내 제 위치에 있는 줄기세포군을 모두 망라한다. 예를 들어, 본 발명의 방법과 조성물은 분리된 태반 줄기세포군 또 는 태반 내에 있는 태반 줄기세포군의 보호에 쓰일 수 있는데, 예를 들어 태반을 운반 중이거나, 줄기세포의 분리와 수집을 위한 후속 단계를 기다리고 있는 경우이다.

나아가 본 발명은 줄기세포군의 보존 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포 자멸사 억제제와 산소 운반 퍼플루오로카본, 예를 들어 앞선 1.5.절에서 기술한 퍼플루오로카본을 함유하는 줄기세포 수집용 조성물을 이용한다. 한 실시 태양에서 본 발명은 줄기세포군의 보존 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포군을 세포 자멸사 억제제와 산소 운반 퍼플루오로카본에 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 자멸사 억제제는 상기 억제제와 접촉하지 않은 다른 줄기세포군과 비교하였을 때 상기 줄기세포군의 자멸사를 줄이거나 억제하기에 충분한 시간과 분량으로 존재한다. 다른 구체 태양에서 상기 세포 자멸사 억제제는 카스파제 억제제이다. 다른 구체 태양에서 상기 자멸사 억제제는 JNK 억제제인데, 예를 들어 앞선 1.2.2.절에서 기술한 억제제이다. 더 구체적인 실시 태양에서 상기 JNK 억제제는 상기 줄기세포의 분화나 증식을 조절하지 않는다. 다른 실시 태양에서 상기 줄기세포 수집용 조성물은 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반 퍼플루오로카본을 각각 별개의 층에 함유한다. 다른 실시 태양에서 상기 줄기세포 수집용 조성물은 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반 퍼플루오로카본을 하나의 유탁액으로 함유한다. 다른 실시 태양에서 상기 줄기세포 수집용 조성물은 유화제, 예를 들어 레시틴을 더 함유한다. 다른 실시 태양에서, 상기 세포 자멸사 억제제와 상기 퍼플루오로카보은 상기 줄기세포와 접촉시 약 0℃에서 25℃ 사이에 있다. 다른 더 구체 적인 실시 태양에서 상기 세포 자멸사 억제제와 상기 퍼플루오로카본은 상기 줄기세포 접촉시 약 2℃에서 10℃ 사이 또는 약 2℃에서 약 5℃ 사이에 있다. 다른 더 특정한 실시 태양에서 상기 접촉은 상기 줄기세포군의 운반 도중 이루어진다. 다른 더 특정한 실시 태양에서 상기 접촉은 상기 줄기세포군의 냉동과 해동 도중 이루어진다.

본 발명의 다른 태양에서는 줄기세포군을 보존하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포군 또는 상기 줄기세포를 함유하는 장기(예를 들어, 태반)를 세포 자멸사 억제제와 장기 보존용 화합물에 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 자멸사 억제제는 상기 억제제와 접촉하지 않은 다른 줄기세포군과 비교하였을 때 상기 줄기세포군의 자멸사를 줄이거나 억제하기에 충분한 시간과 분량으로 존재한다. 특정 실시 태양에서 이 장기 보존용 화합물은 UW 용액(ViaSpan으로도 알려져 있으며, 미국 특허 제4,798,824호 기재됨. 또한 Southard 외, Transplantation 49(2):251~257(1990)을 보라) 또는 Stern 외 미국 특허 제5,552,267호에 기재된 용액이다. 다른 태양에서, 상기 장기 보존용 화합물은 히드록시에틸녹말, 락토비온산, 라피노스 또는 이들의 조합이다. 다른 실시 태양에서, 상기 줄기세포 수집용 조성물은 산소 운반 퍼플루오로카본을 한 유탁액 속에 또는 두 개의 상으로 더 포함한다.

본 발명 방법의 다른 태양에서, 상기 줄기세포는 관류 도중에 세포 자멸사 억제제 및 산소 운반 퍼플루오로카본, 장기 보존용 화합물 또는 이들의 조합을 함유하는 줄기세포 수집용 조성물에 접촉하게 된다. 다른 태양에서, 상기 줄기세포 는 조직 탈착(dissociation) 과정에서 접촉하게 된다. 다른 태양에서, 상기 줄기세포는 관류에 의한 줄기세포 수집 후 또는 조직 파괴, 예를 들어 효소 소화에 의한 줄기세포 수집 후에 상기 줄기세포 수집용 화합물과 접촉하게 된다.

전형적인 경우에, 태반 줄기세포를 수집, 농축하고 분리하는 동안은 저산소 환경과 기계적 응력에 의한 세포 스트레스를 최소화하거나 없애는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 다른 태양에서는 상기 줄기세포 또는 줄기세포군의 상기 보존 과정에서 세포의 수집, 농축 또는 분리 도중 저산소 조건하에 놓이는 시간이 72시간 미만인데, 여기서 저산소 조건이란 정상적 혈액 산소 농도보다 낮은 산소 농도를 말한다. 더 구체적인 태양에서 상기 줄기세포군은 상기 보존 도중 상기 저산소 조건에 노출되는 시간이 48시간 미만이다. 다른 더 구체적인 태양에서, 상기 줄기세포군은 수집, 농축 또는 분리 과정에서 상기 저산소 조건에 노출되는 시간이 24시간 12 시간, 6시간 또는 2시간 미만이거나 저산소 조건에 노출되지 않는다. 다른 특정 태양에서 상기 줄기세포군은 수집, 농축 또는 분리 과정에서 전단 응력을 받지 않는다.

4. 태반의 취급

일반적으로 사람 태반은 출산 후 태반을 압박 방출한 직후에 회수된다. 바람직한 실시 태양에서 이러한 태반은 환자의 완전한 병력을 얻은 후 이를 그 태반에 연관지은 다음 환자에게 충분한 설명 이후 동의를 받아서 회수된다. 이러한 병력 기록은 분만 이후에도 계속 기록되는 것이 바람직하다. 이러한 병력 기록은 태반 또는 그로부터 얻은 줄기세포의 후속 이용을 조화시키는데 쓰일 수 있다. 예를 들어, 사람 태반 줄기세포는 병력을 감안하여, 상기 태반에 관련된 신생아 또는 그 신생아의 부모, 형제나 다른 친척의 개인화된 의료(personalized medicine)에 쓰일 수 있다.

태반 줄기세포의 회수 전에 제대혈과 태반 혈액을 제거하게 된다. 몇몇 실시 태양에서 분만 후 태반 속 제대혈을 제거하게 된다. 이러한 태반에 대해서는 통상적인 제대혈 회수 방법을 사용할 수 있다. 중력을 이용한 태반의 실혈(exsanguination)에는 바늘 또는 카뉼라(cannula)를 이용하는 것이 전형적이다(Anderson의 미국 특허 제5,372,581호, Hessel 외 미국 특허 제5,415,665호를 보라). 이 바늘 또는 카뉼라는 탯줄 정맥 속에 대개 놓이고 되고, 태반은 부드럽게 마사지되어 제대혈이 태반으로부터 빠져나오는 것을 돕는다. 이러한 제대혈 회수법은 상업적으로, 예를 들어 미국 뉴저지주 Cedar Knolls의 LifeBank Inc., ViaCord, Cord Blood Registry나 Cryocell을 통하여 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 이러한 태반을 다른 조작 없이 중력만으로 방혈시켜 제대혈 회수 과정에서의 조직 손상을 최소화한다. 몇몇 실시 태양에서 태아에 가까운 쪽 탯줄을 집게로 집게 되는데, 이때 제대혈 회수 전에 태반 원반(placental disk)의 삽입 지점으로부터 4~5 cm 내 위치를 집는 것이 바람직하다. 다른 실시 태양에서 태아에 가까운 쪽 탯줄은 제대혈 회수 후이지만 태반의 후속 처리 전에 집게로 집히게 된다.

태반은 제대혈을 회수하고 줄기세포를 수집하기 위한 예를 들어 관류 또는 조직 탈착(dissociation)을 위하여 분만 장소나 분만실로부터 다른 장소, 예를 들어 실험실로 운반되는 것이 전형적인 경우이다. 한 실시 태양에서는 태반을 바람 직하게는 멸균되고, 단열된 운반 장비(태반 온도를 20~28℃로 유지) 속에 담아서 운반하는데, 예를 들어 태아에 가까운 부위의 탯줄이 집게로 집힌 태반을 멸균 플라스틱 백 속에 담은 다음 이를 다시 단열 용기에 담아서 운반한다. 다른 실시 태양에서 이러한 태반은 2005년 9월 19일 출원 미국 특허 출원 제11/230,760호에 기술된 것과 실질적으로 같은 제대혈 수집 키트에 담겨 운반된다. 이 태반은 분만 후 4~24 시간 안에 실험실로 운반되는 것이 바람직하다.

줄기세포 수집 전에 태반을 실온 또는 5~25℃ 온도의 멸균 조건에서 저장할 수 있다. 이러한 태반은 48 시간보다 더 긴 기간 동안 저장될 수도 있으며, 바람직하게는 잔류 제대혈을 모두 제거하기 위한 태반 관류 단계 4~24 시간 전까지 저장하게 된다. 이 태반은 5~25℃ 온도에서 항응고제 용액 속에 저장되는 것이 바람직하다. 적절한 항응고제 용액은 이 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 헤파린 또는 워페린나트륨(warfarin sodium)을 쓸 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 이 항응고제 용액은 헤파린 용액(예를 들어 1:1000 희석 용액에서 1％ w/w)을 포함한다. 이렇게 실혈된 태반의 저장 시간은 태반 줄기세포를 수집하기 36 시간 전을 넘기지 않는 것이 바람직하다.

(예를 들어 분만실에서) 줄기세포 수집 단계를 대기 중인 태반을 태반 수집과 줄기세포 수집 사이 시간 중 적어도 일부분 동안 하나 이상의 산소 운반 퍼플루오로카본을 함유하는 용액에 접촉시킬 수 있다. 이 태반은 산소 운반 퍼플루오로카본에 태반 수집과 줄기세포 수집 사이 시간 중 대부분을 접촉하게 되는 것이 바람직하다. 이 태반은 하나 이상의 산소 운반 퍼플루오로카본과 하나 이상의 장기 보존용 배지(예를 들어 UW 용액. 상기 3장을 보라)을 함유하는 조성물에 태반 수집과 줄기세포 수집 사이 시간 중 적어도 일부분 동안 접촉할 수 있다.

5. 태반 줄기세포

본 발명의 방법에 따라 얻을 수 있는 태반 줄기세포에는 다능성과 중복성 세포, 배아 줄기세포의 특징을 하나 이상 가지는 줄기세포와 수임 전구 세포가 포함된다.

제대혈과 태반 혈액의 대부분은 CD34⁺CD38⁺ 조혈 전구세포로 이루어진다. 실혈시키고 태반에서 실질적으로 모든 제대혈과 태반 혈액을 제거한 후의 첫 24시간 안에는, 제대혈과 골수 속에서 찾을 수 있는 해당 세포 숫자와 상대적으로 비교하여, CD34⁺CD38^-조혈 전구세포를 CD34^-CD38⁺ 조혈 전구세포와 함께 분리할 수 있다. CD34^-CD38^-세포 역시 태반에서 분리할 수 있는데, 예를 들어 조직 배양 기질에 대한 차별적인 부착성을 이용할 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제7,045,148호를 보라.

바람직한 실시 태양에서, 본 발명의 방법에 의하여 얻은 줄기세포는 생존능이 있고, 정지 상태이며, 중복성 또는 다능성이다.

적어도 한 유형의 사람 태반 줄기세포는 발생학적으로 항원에 노출되지 않아 비활성인(naive) 상태이다. 예를 들어, 이러한 줄기세포는 SSEA3^-(단계 특이적 배아 항원 3, stage-specific embryonic antigen 3), SSEA4^- OCT-4⁺ (줄기세포 전사 인자)이고 ABC-p⁺ (ATP-결합성 카세트(ABC) 운반 단백질), 이들은 발생학적으로 항원 미노출 비활성을 나타내는 표지이다. 특정 실시 태양에서, 이 줄기세포는 비배아성 줄기세포이고 SSEA3^-SEA4^-OCT-4⁺ABC-p⁺이다. 다른 실시 태양에서, 이 사람 태반 줄기세포는 MHC 클래스 2 항원을 발현하지 않는다. 다른 실시 태양에서, 이 줄기세포는 내배엽, 외배엽 또는 중배엽 세포를 분화할 수 있다.

한 실시 태양에서, 본 발명의 방법으로 얻은 태반 줄기세포는 OCT-4와 ABC-p 표지의 존재로써 확인할 수 있다. 나아가 본 발명은 세포 표지 CD10, CD29, CD44, CD54, CD90, CD105 (SH2), CD73 (SH3, SH4), OCT-4와 ABC-p를 나타내거나 세포 표지 CD34, CD38, CD45, SSEA3 또는 SSEA4를 나타내지 않거나 결여하는 태반 줄기세포를 수집한 세포군도 포함한다. 특정 실시 태양에서, 상기 태반 줄기세포는 CD10⁺, CD29⁺, CD34^- CD38^- CD44⁺, CD45^-, CD54⁺, CD73⁺, CD90⁺, CD105⁺, SSEA3^- SSEA4^- OCT-4⁺이고 ABC-p⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서, 이 태반 줄기세포는 CD200⁺이고 HLA-G⁺이다. 다른 특정 태양에서, 이 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺이고 CD200⁺이다. 다른 특정 태양에서, 이 태반 줄기세포는 CD200⁺이고 OCT-4⁺이다. 다른 특정 태양에서, 이 태반 줄기세포는 CD73⁺이고 CD105⁺이며, 이 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군은 배아 유사체의 형성을 허용하는 조건하에서 배아 유사체를 형성한다. 다른 특정 태양에서, 이 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺이 다. 다른 특정 태양에서, 이 태반 줄기세포는 OCT-4⁺이고 배아 유사체의 형성을 허용하는 조건하에서 배아 유사체를 형성한다.

상기 세포 표면 표지는 이 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 흐름 세포 측정에 이은 세척과 항세포표면표지 항체로 염색하는 방법에 의하여 일상적으로 검출할 수 있다. 예를 들어 CD34 또는 CD38의 존재를 검출하려는 경우, 세포를 PBS에 세척한 다음 항-CD34 피코에리트린과 항-CD38 이소티오시안산플루오레사인(미국 캘리포니아주 Mountain View 의 Becton Dickinson사)로 이중염색하면 된다.

본 발명의 조성물과 방법을 통하여 수집하는 태반 줄기세포는 체내의 조직 또는 장기를 보강, 수리하거나 이식으로 대체하거나, 또는 이 조직 또는 장기에 바람직한 세포군, 예를 들어 줄기세포나 전구세포군을 이식 또는 수혈하는 다양한 치료 방법에 쓰일 수 있다. 본 발명의 태반 줄기세포는 기존 조직을 수리하고 보강하거나, 신규 조직 또는 변형 조직을 도입하거나 생체 조직 또는 구조를 연결하는데 쓰일 수 있다. 본 발명의 태반 줄기세포는 배야 줄기세포가 쓰이는 것이 전형적인 치료 방법에서 배아 줄기세포를 대체할 수 있다.

도 1은 태반을 관류하여 그 관류물을 수집하기 위하여 태반의 동맥과 정맥을 삽관하는 것을 나타낸 단면도이다.

도 2a~2e는 방혈되고 관류된 태반을 수집하고, 집게로 조이고, 관류하고 숩집·저장하는 것을 나타낸 모식도이다.

도 3은 생반응기로 쓰이는 장치 속에 있는 관류된 태반의 단면을 그린 모식도이다.

＜실시예 1: 줄기세포 수집용 조성물＞

다음 실시예는 줄기세포 수집용 조성물의 구성을 기술한다. 다른 실시 태양은 이 분야의 당업자에게 자명할 것이다.

실시예 1.1. 세포 자멸사 억제제와 단백질 분해 효소를 갖춘 조성물

0.9％ NaCl과 최종 농도가 50~100 μM인 카스파제 억제제 Ac-Val-Ala-Asp-CHO, 최종 농도 약 0.25％의 트립신--EDTA를 함유하는 관류 용액을 제조하였다.

실시예 1에 나타낸 변형 Krebs 용액을 함유하는 관류 용액을 제조하였는데, 카스파제 억제제 Ac-Val-Ala-Asp-CHO의 최종 농도는 50~100 μM이고, 트립신-EDTA의 최종 농도는 약 0.25％였다.

실시예 1에 나타낸 DMEM-기반 용액을 함유하는 관류 용액을 제조하였는데, 카스파제 억제제 Ac-Val-Ala-Asp-CHO를 최종 농도 50-100 μM로, 트립신-EDTA를 최종 농도 약 0.25％로 함유하였다.

1.2. 세포 자멸사 억제제와 단백질 분해 효소를 함유하는 조성물

0.9％ NaCl, 최종 농도 50~100 μM의 카스파제 억제제 Ac-Val-Ala-Asp-CHO, 최종 농도 약 0.25％의 트립신-EDTA와 아래 어느 한 구조를 가지는 JNK 억제제를 함유하는 관류 용액을 제조하였다.

]

또는

여기서 상기 JNK 억제제는 약 0.5 μM에서 약 10 μM 농도로 존재한다.

실시예 1에 나타낸 DMEM-기반 용액을 함유하는 관류 용액을 제조하였는데, 카스파제 억제제 Ac-Val-Ala-Asp-CHO를 최종 농도 50~100 μM로 하여, 본 실시예의 JNK 억제제와 트립신-EDTA를 최종 농도 약 0.25％로 함유하였다.

실시예 1에 나타낸 변형 Krebs 용액을 함유하는 관류 용액을 제조하였는데, 카스파제 억제제 Ac-Val-Ala-Asp-CHO를 최종 농도 50~100 μM로 하여, 본 실시예의 JNK 억제제와 트립신-EDTA를 최종 농도 약 0.25％로 함유하였다.

실시예 1.3. JNK 억제제와 단백질 분해 효소 조합을 함유하는 조성물

0.9％ NaCl과 최종 농도 1.0 mg/mL의 엘라스타제, 최종 농도 1.0 mg/mL의 콜라게나아제 I, 최종 농도 0.5 mg/mL의 콜라게나아제 IV, 최종 농도 0.1 mg/mL의 디스파제를 포함하는 단백질 분해 효소 칵테일 및 다음 중 어느 한 구조를 가지는JNK 억제제를 함유하는 관류 용액을 제조하였다:

또는

여기서 상기 JNK 억제제는 약 0.5 μM에서 약 10 μM의 농도로 존재한다.

실시예 1에 나타낸 DMEM-기반 용액을 함유하는 관류 용액을 제조하였는데, 최종 농도 1.0 mg/mL의 엘라스타제, 최종 농도 1.0 mg/mL의 콜라게나아제 I, 최종 농도 0.5 mg/mL의 콜라게나아제 IV, 최종 농도 0.1 mg/mL의 디스파제를 포함하는 단백질 분해 효소 칵테일 및 본 실시예에 나타낸 JNK 억제제를 함유하는 관류 용액을 제조하였다.

실시예 1에 나타낸 변형 Krebs 용액을 함유하는 관류 용액을 제조하였는데, 최종 농도 1.0 mg/mL의 엘라스타제, 최종 농도 1.0 mg/mL의 콜라게나아제 I, 최종 농도 0.5 mg/mL의 콜라게나아제 IV, 최종 농도 0.1 mg/mL의 디스파제를 포함하는 단백질 분해 효소 칵테일 및 본 실시예에 나타낸 JNK 억제제를 함유하는 관류 용액을 제조하였다.

실시예 1.4. JNK 억제제와 효소 조합을 함유하는 조성물

0.9％ NaCl과 최종 농도 1.0 mg/mL의 엘라스타제, 최종 농도 1.0 mg/mL의 콜라게나아제 I, 최종 농도 0.5 mg/mL의 콜라게나아제 IV, 최종 농도 0.1 mg/mL의 디스파제와 최종 농도 약 0.1 내지 10.0 mg/mL의 히알루로니다제를 포함하는 단백질 분해 효소 칵테일 및 다음 구조들 중 적어도 하나 이상의 구조를 가지는 JNK 억제제를 두 가지 이상 함유하는 관류 용액을 제조하였다:

또는

여기서 상기JNK 억제제는 약 0.5 μM에서 약 10 μM의 농도로 존재한다.

실시예 1에 나타낸 DMEM-기반 용액을 함유하는 관류 용액을 제조하였는데, 최종 농도 1.0 mg/mL의 엘라스타제, 최종 농도 1.0 mg/mL의 콜라게나아제 I, 최종 농도 0.5 mg/mL의 콜라게나아제 IV, 최종 농도 0.1 mg/mL의 디스파제와 최종 농도약 0.1 내지 10.0 mg/mL의 히알루로니다제를 포함하는 단백질 분해 효소 칵테일 및 본 실시예에 나타낸 JNK 억제제 두 가지 이상을 함유하는 관류 용액을 제조하였다.

실시예 1에 나타낸 변형 Krebs 용액을 함유하는 관류 용액을 제조하였는데, 최종 농도 1.0 mg/mL의 엘라스타제, 최종 농도 1.0 mg/mL의 콜라게나아제 I, 최종 농도 0.5 mg/mL의 콜라게나아제 IV, 최종 농도 0.1 mg/mL의 디스파제와 최종 농도 약 0.1 내지 10.0 mg/mL의 히알루로니다제를 포함하는 단백질 분해 효소 칵테일 및 본 실시예에 나타낸 JNK 억제제 두 가지 이상을 함유하는 관류 용액을 제조하였다.

실시예 1.5. JNK 억제제와 단백질 분해 효소와 혈관 확장제를 함유하는 조성물

0.9％ NaCl, 약 0.15 mM 내지 약 6 mM의 황산마그네슘 혈관 확장제와 최종 농도 약 0.25％의 트립신-EDTA 및 다음 어느 한 구조를 가지는 JNK 억제제를 함유하는 관류 용액을 제조하였다:

또는

실시예 1에 나타낸 DMEM-기반 용액을 함유하는 관류 용액을 제조하였는데, 최종 농도 약 0.25％의 트립신-EDTA, 약 0.15 mM 내지 약 6 mM 농도의 황산마그네슘 혈관 확장제 및 본 실시예에 나타낸 JNK 억제제를 함유하는 관류 용액을 제조하였다.

실시예 1에 나타낸 변형 Krebs 용액을 함유하는 관류 용액을 제조하였는데, 최종 농도 약 0.25％의 트립신-EDTA, 약 0.15 mM 내지 약 6 mM 농도의 황산마그네슘 혈관 확장제 및 본 실시예에 나타낸 JNK 억제제를 함유하는 관류 용액을 제조하였다.

실시예 1.6. JNK 억제제, 단백질 분해 효소와 항괴사제를 함유하는 조성물

0.9％ NaCl과 최종 농도 약 0.25％의 트립신-EDTA, 약 0.5 μM 내지 약 100.0 μM 농도의 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노말레이미드 및 다음 중 어느 한 구조를 가지는 JNK 억제제를 함유하는 관류 용액을 제조하였다:

또는

실시예 1에 나타낸 DMEM-기반 용액을 함유하는 관류 용액을 제조하였는데, 최종 농도 약 0.25％의 트립신-EDTA, 약 0.5 μM 내지 약 100.0 μM 농도의 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노말레이미드 및 본 실시예에 나타낸 JNK 억제제를 함유하는 관류 용액을 제조하였다.

실시예 1에 나타낸 변형 Krebs 용액을 함유하는 관류 용액을 제조하였는데, 최종 농도 약 0.25％의 트립신-EDTA, 약 0.5 μM 내지 약 100.0 μM 농도의 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노말레이미드 및 본 실시예에 나타낸 JNK 억제제를 함유하는 관류 용액을 제조하였다.

실시예 1.7 JNK 억제제, 단백질 분해 효소와 산소 운반 퍼플루오로카본을 함유하는 조성물

0.9％ NaCl과 최종 농도 약 0.25％의 트립신-EDTA 및 다음 중 어느 한 구조를 가지는 JNK 억제제를 함유하는 관류 용액을 제조하였다:

또는

여기서 상기JNK 억제제는 약 0.5 μM에서 약 10 μM의 농도로 존재한다. 이 용액은 또한 무게/부피 기준으로 50％~100％의 브롬화퍼플루오로옥틸을, 브롬화퍼플루오로옥틸 부피 기준 10％의 브롬화퍼플루오로데실과 유화제로 무게/부피 기준 4％의 레시틴을 함유한다. 이 용액은 사용 전에 유화 처리한다.

앞선 사례와 같이 관류 용액을 만들었는데, 0.9％ NaCl 대신 실시예 1에 나타낸 DMEM-기반 용액을 함유하였다. 또 앞선 사례와 같이 관류 용액을 제조하였는데, 0.9％ NaCl 대신 실시예 1에 나타낸 변형 Krebs 용액을 함유하였다.

＜실시예 2: 태반 줄기세포 배양＞

태반 줄기세포는 분만 후 포유류 태반으로부터 관류 또는 물리적 파괴, 예를 들어 효소 소화 중의 하나를 이용하여 얻을 수 있다. 이 세포는 60％ DMEM-LG(Gibco사), 40％ MCDB-201(Sigma사), 2％ 송아지 태아 혈청(FCS, Hyclone Laboratories사), 1×인슐린-트랜스페린-셀렌(ITS), 1×레놀렌산-소 혈청 알부민(LA-BSA), 1 nM 덱사메타손(Sigma사), 0.1 mM 아스코르브산 2-인산(Sigma사), 표피 성장 인자(EGF) 10 ng/mL(R&D Systems사), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF-BB) 10 ng/mL(R&D Systems사)와 페니실린 100 단위/스트렙토마이신 1000 단위를 함유하는 배지 속에서 배양한다.

세포를 배양하는 접시는 아래와 같이 마련할 수 있다. T75 플라스크는 5 ng/mL 사람 피브로넥틴(FN)을 함유하는 PBS 5 mL를 이 플라스크에 가하여 피브로넥틴으로 피복할 수 있다. FN 용액을 담은 플라스크는 37℃에서 30분 동안 방치된다. 이어서 세포 배양 전에 FN 용액을 제거한다. 피복 후 플라스크를 건조할 필요는 없다. 혹은 대안적으로 이 플라스크를 하룻밤 또는 더 오랫 동안 섭씨 4도에 서 FN 용액과 접촉하도록 놓아 둘 수도 있다. 이 경우, 세포 배양 전 이 플라스크들을 덥힌 다음 FN 용액을 제거한다.

관류에 의한 태반 줄기세포의 분리

태반 관류물로부터 태반 줄기세포를 아래와 같이 수립할 수 있다. 피콜 농도 구배로 얻은 세포를 앞서 기술한 것과 같이 하여 얻은 FN-피복 T75 플라스크 당 50~100×10^-6세포를 15 mL 배양 배지 속에 접종한다. 5 내지 10 개의 플라스크를 접종하는 것이 전형적인 경우이다. 이 플라스크를 37℃에서 12~18 시간 동안 배양하여 부착성 세포가 부착하게 한다. 부유 세포를 제거하기 위하여 각 플라스크에 따뜻한 PBS 10 mL를 가한 다음, 부드럽게 섞어 준다. 배지에서 15 mL를 덜어낸 다음, 새 배양 배지 15 mL를 가하여 준다. 모든 배지는 배양 시작 후 3~4일 후 갈아 준다. 이후로는 배지의 50％ 또는 7.5 mL를 갈아주게 된다. 12일째에 배양물을 현미경으로 관찰하여 부착성 세포가 성장하는지 확인한다. 배양된 세포가 대략 80％ 컨플루언스(confluence) 수준에 이르면, 트립신 소화로 부착성 세포를 수확하는데, 이는 13일째와 18일째 사이인 것이 전형적이다. 이러한 1차 배양물에서 얻은 세포를 제0계대(zero)로 표시한다.

효소 소화로 분리한 태반 줄기세포

효소 소화된 태반 조직으로부터 태반 줄기세포를 아래와 같이 수립할 수 있다. 관류된 태반을 모체 쪽을 위로 하여 멸균지 위에 올려 놓는다. 태반의 모체쪽 표면층을 0.5 cm 정도 칼날로 긁어낸 다음, 이 칼날로 대략 1×2×1 cm 크기의 조각을 떼어 낸다. 이 태반 조직을 대략 1 입방mm 크기 조각이 되도록 저민다. 이 조각들을 모아 50 mL Falcon 튜브에 넣고 콜라게나아제 IA(2 mg/mL, Sigma사)로 30분 동안, 이어서 트립신-EDTA(0.25％, GIBCO BRL사)로 10 분 동안 37℃의 물 중탕 속에서 소화한다. 이렇게 하여 얻은 용액을 400 g의 실온에서 10 분 동안 원심분리하여 소화 용액을 제거한다. 이 펠렛을 대략 10 부피의 PBS 현탁액이 되도록 현탁하고(예를 들어 5 mL의 펠렛은 45 mL의 PBS로 재현탁한다), 이 튜브들은 400 g의 실온에서 약 10 분 동안 원심분리한다. 이 조직/세포 펠렛을 130 mL 정도의 배양 배지 속에 재현탁하고, 피브로넥틴-피복 T-75 플라스크 당 13 mL의 세포를 접종한다. 세포는 5％ 이산화탄소를 가지는 37℃의 가습 대기 속에서 배양한다. 태반 줄기세포를 선택적으로 이 단계에서 냉동보존할 수도 있다.

태반 줄기세포의 서브컬쳐와 증폭

냉동보존된 세포는 37℃의 물 중탕에서 재빨리 해동된다. 태반 줄기세포를 10 mL의 따뜻한 배지를 가하여 냉동바이얼로부터 즉시 15 mL 튜브로 옮긴다. 이 세포를 실온에서 5분 동안 400 ×g로 원심분리한다. 이 세포를 부드럽게 10 mL의 따뜻한 배양 배지 속에 피펫질하여 재현탁하고, 트리판블루 배제법으로 생존한 세포 수를 측정한다. 이어서 FN-피복 플라스크의 제곱 센티미터 당 6000~7000개 정도의 세포를 접종한다. 이 FN-플라스크는 앞서 설명한 대로 준비할 수 있다(대략 T-75 플라스크 당 세포 5×10^-5세포). 이 세포를 37℃, 5％ 이산화탄소와 상대습도 90％에서 배양한다. 세포가 75~85％ 컨플루언스 수준에 이르면, 모든 사용된 배지를 멸균 방식으로 플라스크에서 제거한 다음 버린다. 0.25％ 트립신-EDTA 용액 3 mL를 가하여 세포층을 덮어 주고, 세포를 37℃, 5％ 이산화탄소와 상대습도 90％에서 5분 동안 배양한다. 세포 탈착을 돕기 위하여 플라스크를 한 두 번 가볍게 건드려준다. 95％를 넘는 수의 세포가 구형이 되고 탈착하면 7 mL의 따뜻한 배양 배지를 각 T-75 플라스크에 가하고 이 용액을 세포층 너머로 여러 번 피펫하여 분산시킨다.세포 수와 생존률을 앞서와 같이 관찰한 다음, 이 세포를 실온에서 5분 동안 1000 rpm으로 원심분리한다. 세포 펠렛을 한 T-75 플라스크 속에서 배양 배지로 부드럽게 재현탁한 다음 다른 FN-피복 T-75 플라스크 2개로 고르게 발라주어 계대한다. 이와 같은 방법을 사용하여 세포 표지 CD105, CD117, CD33, CD73, CD29, CD44, CD10, CD90과 CD133을 발현하는 부착성 태반 줄기세포군을 동정하였다. 이 세포군은 CD34 또는 CD45를 발현하지 않았다. 이 태반 줄기세포 배양물 중 전체가 아닌 일부는 HLA-ABC 및/또는 HLA-DR을 발현하였다.

＜실시예 3: 태반 줄기세포의 분화＞

3.1 뉴런으로의 분화 유도

태반 줄기세포를 뉴런으로 분화시키는 것은 예를 들어 이하와 같이 이루어질 수 있다:

1. 태반 줄기세포를 24시간 동안 DMEM/20％ FBS와 1 mM 베타-메르캅토에탄올로 이루어지는 유도 준비 배지(preinduction medium) 속에서 배양한다.

2. 상기 유도 준비 배지를 덜어 내고 세포를 PBS로 세척한다.

3. DMEM과 1~10 mM의 베타-메르캅토에탄올을 함유하는 뉴런 유도 배지를 세 포에 가해준다. 혹은 DMEM/2％ DMSO/200 μM 부틸화 히드록시아니솔로 이루어지는 뉴런 유도 배지를 세포에 가해 줄 수도 있다.

4. 몇몇 실시 태양에서는 무형청 배지와 베타-메르캅토에탄올에 노출된 후 60분만에 형태적, 분자적 변화가 나타날 수도 있다. RT/PCR을 이용하여 예를 들어, 신경 성장 인자 수용체와 신경필라멘트 중사슬 유전자의 발현을 평가할 수 있다.

3.2 지방세포로의 분화 유도

태반 줄기세포를 지방세포로 분화시키는 것은 예를 들어 이하와 같이 이루어질 수 있다:

1. 태반 줄기세포를 MSCGM (Cambrex사) 또는 15％ 제대혈 혈청이 보강된 DMEM 속에서 생장시킨다.

2. 유도/유지 순환을 3회 반복한다. 각 순환은 태반 줄기세포에 지방 생성 유도 배지(Adipogenesis Induction Medium, Cambrex사)를 가하고 세포를 3일 동안 배양(37℃, 5％ 이산화탄소)하고, 이어서 1~3일 동안 지방 생성 유도 배지(Adipogenesis Maintenance Medium, Cambrex사) 속에서 배양하는 것으로 이루어진다. 혹은 유도 배지로서 1 μM 덱사메타손, 0.2 mM 인도메타신, 0.01 mg/mL 인슐린, 0.5 mM IBMX5, DMEM-고포도당, FBS와 항생제를 함유하는 다른 배지를 이용할 수도 있다.

3. 완전한 유도/유지 순환을 3회 시행한 다음, 이 세포들을 7일 동안 지방 생성 유지 배지 속에서 더 배양하여 주는데, 배지를 이틀에서 사흘마다 갈아준다.

4. 지방 생성의 징표는 친지질성 염색유인 레드 O(red O)를 이용하여 쉽게 관찰할 수 있는 여러 개의 세포질내 지질 소낭(intracytoplasmic lipid vesicles)의 발달이다. 지방세포로 분화하기 시작한 태반 줄기세포 속 리파아제 및/또는 지방산 결합 단백질(fatty acid binding protein) 유전자의 발현은 RT/PCR로 확인할 수 있다.

3.3 연골세포로의 분화 유도

태반 줄기세포를 연골세포로 분화시키는 것은 예를 들어 이하와 같이 이루어질 수 있다:

2. 태반 줄기세포를 멸균 폴리프로필렌 튜브들 속에 나눠 넣는다. 이 세포를 원심분리(5분 동안 150×g)하고 미완성 연골 생성 배지(Incomplete Chondrogenesis Medium, Cambrex사)로 두 차례 세척한다.

3. 마지막 세척 후, 세포를 0.01 g/mL TGF-베타-3을 함유하는 완성 연골 생성 배지(Complete Chondrogenesis Medium, Cambrex사) 속에 5×10^-5세포/mL의 농도로 재현탁한다.

4. 0.5 mL의 세포를 15 mL 폴리프로필렌 배양 튜브 하나에 담는다. 이 세포를 150 x g에서 5분 동안 펠렛으로 가라앉힌다. 펠렛은 이 배지 속에 그대로 놓아 둔다.

5. 튜브의 뚜껑을 느슨히 하여 24 시간 동안 37℃, 5％ 이산화탄소 속에서 배양한다.

6. 이 세포 펠렛에 2~3일마다 새로이 마련한 완전 연골 생성 배지를 보태어 준다.

7. 매일 저속 보르텍스(vortex) 처리하여 펠렛이 배지 속에 현탁되어 있도록 한다.

8. 연골 생성된 세포 펠렛은 배양 14~28일째에 수확한다.

9. 연골 생성은 예를 들어, 호산성 바탕질(eosinophilic ground substance) 생성의 관찰, 세포 형태 평가 및/또는 RT-PCR에 의한 콜라겐 2와 콜라겐 9 유전자 발현 확인과 같은 방법으로 특성 파악할 수 있다.

3.4 골세포 분화 유도

태반 줄기세포를 골세포로 분화시키는 것은 예를 들어 이하와 같이 이루어질 수 있다:

1. 부착성 태반 줄기세포는 MSCGM(Cambrex사) 또는 15％ 제대혈 혈청이 보강된 DMEM 속에서 배양할 수 있다.

2. 조직 배양 플라스크 속에서 세포를 24시간 동안 배양한다.

3. 골 생성 분화 유도는 MSCGM을 0.1 μM 덱사메타손, 0.05 mM 아스코르브산-2-인산, 10 mM 베타-글리세로인산을 함유하는 골 생성 유도 배지(Osteogenic Induction Medium, Cambrex사)로 바꾸어 줌으로써 이루어진다.

4. 2~3 주 동안 3~4일마다 세포에 골 생성 유도 배지를 가하여 준다.

5. 세포 분화는 칼슘 특이적 염색법과 알칼리성 인산 분해 효소와 오스테오폰틴(osteopontin) 유전자 발현의 RT-PCR 검출을 이용하여 분석할 수 있다.

3.5 이자 세포로의 분화 유도

이자 세포로의 분화는 예를 들어, 다음과 같이 이루어질 수 있다:

1. 태반 줄기세포는 다음 성분들이 보강된 DMEM/20％ CBS 속에서 배양한다: 염기성 섬유모세포 성장 인자(10 ng/mL), 니코틴아미드(10 mM), B27(1×), N2 (1×), 전환 성장 인자 베타-1(2 ng/mL). CBS 대신 녹아웃 혈청 대체액(KnockOut Serum Replacement, 미국 캘리포니아 Carlsbad의 Invitrogen사)을 사용할 수도 있다.

2. 네스틴-양성 뉴런 세포 배양물에서 얻은 조건 배지(conditioned medium)을 상기 세포 배지에 50:50 농도로 가한다.

3. 세포를 14~28일 동안 배양하되, 3~4일 마다 배지를 갈아 준다.

4. 세포 분화는 인슐린 단백질을 분석하거나 인슐린 유전자 발현을 RT-PCR로 분석함을써 특성 파악할 수 있다.

3.6 심근 세포로의 분화 유도

근육 세포(심근 세포)로의 분화도 예를 들어, 아래와 같이 이루어질 수 있다:

1. 태반 줄기세포는 다음 성분들이 보강된 DMEM/20％ CBS 속에서 배양한다: 레티노산(1 μM), 염기성 섬유모세포 성장 인자(10 ng/mL), 표피 성장 인자(100 ng/mL), 전환 성장 인자 베타-1(2 ng/mL). CBS 대신 녹아웃 혈청 대체액(KnockOut Serum Replacement, 미국 캘리포니아 Carlsbad의 Invitrogen사)을 사용할 수도 있다.

2. 혹은 태반 줄기세포를 24시간 동안 50 ng/mL 카르디오트로핀-1(Cardiotropin-1)이 보강된 DMEM/20％ CBS 속에서 배양할 수도 있다.

3. 혹은 태반 줄기세포를 무단백질 배지 속에서 5~7 동안 유지한 다음, 사람 심근층 추출물(myocardium extract)로 자극(용량 증강 분석법 escalating dose analysis)한다. 심근층 추출물은 1 g의 사람 심근층을 1％ 제대혈 혈청이 보강된 1％ HEPES 완충액 속에서 균질화 처리하여 얻을 수 있다. 이 현탁액을 60 분 동안 배양한 다음 원심분리하여 상청액을 취한다.

4. 세포를 10~14일 동안 배양하는데, 3~4일 마다 배지를 갈아준다.

5. 세포 분화는 심근 액틴 유전자 발현을 RT-PCR로 관측하여 확인할 수 있다.

본 발명은 여기서 기술한 구체적인 실시예에 의하여 그 범위를 제한받아서는 아니된다. 실제로 앞서 논의한 내용을 바탕으로 할 때 본 명세서에서 기술한 것 외에 본 발명에 대한 다양한 변형이 있을 수 있다는 것은 이 분야의 평균적 기술자에게 자명할 것이다. 이러한 발명의 변형 역시 이하 청구 범위에 속하는 것은 물론이다.

본 명세서에서 인용하는 참고 문헌은 그 내용 전부를 참고 문헌으로 삼고 있으며, 이는 참고 문헌인 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원 각각을 구체적으로 들 어 그 내용 전부를 참고 문헌으로 한다고 표시하였건 그렇지 않았건 간에 모든 경우와 용도에 있어서 마찬가지로 해당된다.

인용한 모든 간행물은 출원일 전 개시를 위함이지만, 이 사실이 상기 간행물 때문에 본 발명이 선행 발명일 수 없다고 인정하는 의미는 아니다.

Claims

세포 자멸사 억제제를 함유하는 용액에 줄기세포를 접촉시키는 단계 및 상기 줄기세포를 분리하는 단계를 포함하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포 자멸사 억제제는 카스파제 억제제인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 세포 자멸사 억제제는 c-Jun N-말단 키나아제(JNK) 억제제인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제3항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 상기 줄기세포의 분리 단계 전에 상기 줄기세포의 분화와 증식을 조절하지 않는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포를 세포 괴사를 억제하는 화합물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 포유류 태반, 탯줄, 태반 혈액 또는 제대혈로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포를 산소 운반 퍼플루오로카본과 접촉하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포를 단백질 분해 효소와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제8항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 매트릭스 금속단백 분해 효소 또는 중성 단백질 분해 효소인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제9항에 있어서, 상기 매트릭스 금속단백 분해 효소는 콜라게나아제인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제9항에 있어서, 상기 중성 단백질 분해 효소는 써모리신(thermolysin) 또는 디스파제인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포를 점액 분해 효소에 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제12항에 있어서, 상기 점액 분해 효소는 히알루로니다제(hyaluronidase)인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 용액은 식염수 또는 배양 배지인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 용액은 히드록시에틸녹말, 락토비온산 음이온 및 라피노스(raffinose)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 용액은 UW 용액을 함유하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 한 조직을 물리적으로 파괴하여 분리하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제17항에 있어서, 상기 물리적 파괴는 상기 조직을 효소 소화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제6항에 있어서, 상기 태반 중 적어도 일부분을 물리적으로 파괴하여 상기 줄기세포를 분리하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제19항에 있어서, 상기 물리적인 파괴는 상기 조직을 효소 소화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제6항에 있어서, 상기 줄기세포는 상기 포유류 태반으로부터 분리되고, 상기 분리는 상기 포유류 태반을 관류 용액으로 관류하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제21항에 있어서, 상기 관류는 상기 포유류 태반으로부터 측정 가능한 수의 줄기세포를 얻기에 충분한 양과 시간에 걸쳐서 상기 관류 용액으로 상기 포유류 태반을 관류함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제21항에 있어서, 상기 포유류 태반은 상기 관류 전에 실혈(exsanguination)되는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제21항에 있어서, 상기 관류는 상기 태반의 탯줄 동맥과 탯줄 정맥 중 어느 한쪽 또는 양쪽으로 상기 관류 용액을 통과시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제22항에 있어서, 상기 측정 가능한 수의 줄기세포는 상기 용액으로 관류하지 않은 포유류 태반으로부터 얻을 수 있는 줄기세포 수보다 현저하게 더 많은 것 을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제21항에 있어서, 상기 관류 용액은 0.9％ NaCl 용액 또는 인산 완충 식염수를 함유하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제21항에 있어서, 상기 관류는 상기 관류 용액을 대략 1 mL 내지 대략 10,000 mL 사용하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제21항에 있어서, 상기 관류는 상기 관류 용액을 대략 750 mL 사용하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제21항에 있어서, 상기 관류는 복수로 이루어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 상기 분리 도중 저산소 조건하에 72 시간 미만으로 노출되며, 이때 저산소 조건은 정상적인 혈액 산소 농도보다 낮은 산소 농도인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제30항에 있어서, 상기 줄기세포는 상기 저산소 조건하에 48시간 미만으로 노출되는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제30항에 있어서, 상기 줄기세포는 상기 저산소 조건하에 24시간 미만으로 노출되는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제30항에 있어서, 상기 줄기세포는 상기 저산소 조건하에 6시간 미만으로 노출되는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제30항에 있어서, 상기 줄기세포는 저산소 조건하에 노출되지 않는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 상기 분리 도중 전단 응력을 받지 않는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제3항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 인다졸인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제3항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 아래 화학식의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.

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단, 여기서 A는 직접 결합, -(CH₂) _a -, -(CH₂) _b CH=CH(CH₂) _c -, 또는 -(CH₂) _b C≡ C(CH₂) _c -;

R₁은 아릴, 헤테로아릴 또는 페닐기에 융합한 헤테로고리로서, 각각 R₃에서 독립적으로 선택된 하나 내지 네 개의 치환기로 선택적으로 치환되며;

R₂는 -R₃, -R₄, -(CH₂) _b C(=O)R₅, -(CH₂) _b C(=O)OR₅, -(CH₂) _b C(=O)NR₅R₆, -(CH₂) _b C(=O)NR₅(CH₂) _c C(=O)R₆, -(CH₂) _b NR₅C(=O)R₆,-(CH₂) _b NR₅C(=O)NR₆R₇, -(CH₂) _b NR₅R₆, -(CH₂) _b OR₅, -(CH₂) _b SO _d R₅또는 -(CH₂) _b SO₂NR₅R₆이고;

a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6;

b와 c는 0, 1, 2, 3 또는 4 중에서 독립적으로 선택되며, 각각의 경우 서로 같거나 다를 수 있고;

d는 각 경우에 0, 1 또는 2;

R₃은 각각의 경우 독립적으로 할로겐, 히드록시, 카르복시, 알킬, 알콕시, 할로알킬, 아실옥시, 티오알킬, 술핀일알킬, 술폰일알킬, 히드록시알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 헤테로고리알킬, -C(=O)OR₈, -OC(=O)R₈, -C(=O)NR₈R₉, -C(=O)NR₈OR₉, -SO₂NR₈R₉, -NR₈SO₂R₉, -CN, -NO₂, -NR₈R₉, -NR₈C(=O)R₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b OR₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b R₉, -O(CH₂) _b NR₈R₉, 또는 페닐기에 융합된 헤테로고리;

R₄는 각각 R₃에서 독립적으로 선택되는 치환기 하나 내지 네 개로 선택적으로 치환되는 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이거나, R₄는 할로겐 또는 히드록시이며;

R₅, R₆과 R₇은 같거나 다르며, 각각의 경우 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이고, 이때 R₅, R₆과 R₇각각은 선택적으로 R₃으로부터 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 치환되며,

R₈과 R₉는 같거나 다르며, 각각의 경우 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이거나, R₈과 R₉는 이들과 결합한 원자 또는 원자들과 함께 헤테로고리를 이루며, 이때 R₈과 R₉가 각각인 경우, 또 R₈과 R₉가 함께 헤테로고리를 이룬 경우에 이들은 R₃에서 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 선택적으로 치환된다.
제3항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 아래 화학식의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.

단, R₁은 R₇에서 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 선택적으로 치환되는 아릴 또는 헤테로아릴;

R₂는 수소;

R₃은 수소 또는 저급 알킬;

R₄는 하나 내지 네 개의 선택적 치환기를 나타내는데, 여기서 각 치환기는 같거나 다르며, 할로겐, 히드록시, 저급 알킬과 저급 알콕시의 군으로부터 독립적으로 선택되고;

R₅와 R₆은 같거나 다르며, 독립적으로 -R₈, -(CH₂) _a C(=O)R_9, -(CH₂) _a C(=O)OR₉, -(CH₂) _a C(=O)NR₉R₁₀, -(CH₂) _a C(=O)NR₉(CH₂) _b C(=O)R₁₀, -(CH₂) _a NR₉C(=O)R₁₀, (CH₂) _a NR₁₁C(=O)NR₉R₁₀, -(CH₂) _a NR₉R₁₀, -(CH₂) _a OR₉, -(CH₂) _a SO _c R₉또는 -(CH₂ ) _a SO₂NR₉R₁₀이거나; 혹은

R₅와 R₆이 그들에게 연결된 질소 원자와 함께 헤테로고리 또는 치환 헤테로고리를 이루며;

R₇은 각 경우에 독립적으로 할로겐, 히드록시, 시아노, 니트로, 카르복시, 알킬, 알콕시, 할로알킬, 아실옥시, 티오알킬, 술핀일알킬, 술폰일알킬, 히드록시알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 치환 헤테로고리, 헤테로고리알킬, -C(=O)OR₈, -OC(=O)R₈, -C(=O)NR₈R₉, -C(=O)NR₈OR₉, -SO_cR₈, -SO_cNR₈R₉, -NR₈SO _c R₉, -NR₈R₉, -NR₈C(=O)R₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b OR₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b R₉, -O(CH₂) _b NR₈R₉, 또는 페닐기에 융합한 헤테로고리이고;

R₈, R₉, R₁₀과 R₁₁은 같거나 다르며, 각 경우에 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 헤테로고리알킬이거나; 혹은

R₈과 R₉는 그들에게 연결된 원자 또는 원자들과 함께 헤테로고리를 이루며;

a와 b는 서로 같거나 다를 수 있고 각 경우에 0, 1, 2, 3 또는 4 중에서 독립적으로 선택되며,

c는 각 경우에 0, 1 또는 2이다.
제3항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 아래 화학식의 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.

단, R₀은 -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, NH 또는 -CH₂-이고;

상기 구조 (III)의 화합물은 (i) 무치환, (ii) 모노치환물이고 제1 치환기가 있거나, 또는 (iii) 이중치환물이고 제1과 제2 치환기가 있으며;

상기 제1 또는 제2 치환기는 존재할 경우 3, 4, 5, 7, 8, 9, 또는 10 위치에 있는데, 이때 제1과 제2 치환기는 존재할 경우 독립적으로 알킬, 히드록시, 할로겐, 니트로, 트리플루오로메틸, 술폰일, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬옥시, 사이클로알킬옥시, 알콕시알킬, 알콕시알콕시, 아미노알콕시, 모노-알킬아미노알콕시, 디-알킬아미노알콕시 또는 아래 구조 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)로 나타낸 작용기인데;

이때 R₃과 R₄는 함께 알킬리덴 또는 헤테로원자를 포함하는 고리형 알킬리덴을 이루고, 혹은 R₃과 R₄는 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 아릴옥시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 모노-알킬아미노알킬 또는 디-알킬아미노알킬이며;

R₅는 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 아미노, 모노-알킬아미노, 디-알킬아미노, 아릴아미노, 아릴알킬아미노, 사이클로알킬아미노, 사이클로알킬알킬아미노, 아미노알킬, 모노-알킬아미노알킬 또는 디-알킬아미노알킬이다.
제3항에 있어서, 상기 줄기세포를 면역 조절성 화합물과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 줄기세포의 분리 방법.
제40항에 있어서,

상기 면역 조절성 화합물은 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온, 3-(4'-아미노이소인돌린-1'-온)-1-피페리딘-2,6-디온, 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌-1,3-디온 또는 α-(3-아미노프탈이미도)글루타르이미드인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제40항에 있어서, 상기 면역 조절성 화합물은 아래 화학식 구조를 가지는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물과 이들 입체이성질체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.

단, 여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고, 나머지는 C=O 또는 CH₂이며, R²는 수소 또는 저급 알킬이다.
제40항에 있어서, 상기 면역 조절성 화합물은 아래 화학식 구조를 가지는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물과 이들 입체이성질체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.

단, 여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고, 나머지는 C=O 또는 CH₂이며,

R¹ 은 H, (C₁-C₈)알킬, (C₃-C₇)사이클로알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로고리알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, C(O)R³, C(S)R³, C(O)OR⁴, (C₁-C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬-C(O)OR⁵, C(O)NHR³, C(S)NHR³, C(O)NR³R^3', C(S)NR³R^3' 또는 (C₁-C₈)알킬-O(CO)R⁵;

R²는 H, F, 벤질, (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, 또는 (C₂-C₈)알킨일;

R³과 R^3'은 독립적으로 (C₁-C₈)알킬, (C₃-C₇)사이클로알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로고리알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, (C₀-C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬-C(O)OR⁵, (C₁-C₈)알킬-O(CO)R⁵ 또는 C(O)OR⁵;

R⁴는 (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, (C₁-C₄)알킬-OR⁵, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로고리알킬, 또는 (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴;

R⁵는 (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, 또는 (C₂-C₅)헤테로아릴이고;

각 경우에 R⁶은 독립적으로 H, (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₂-C₅)헤테로아릴, 또는 (C₀-C₈)알킬-C(O)OR⁵이거나, 상기 R⁶ 작용기들이 모여 헤테로고리알킬을 이룰 수 있으며;

n은 0 또는 1이고;

*은 키랄 탄소 중심을 나타낸다.
제40항에 있어서, 상기 면역 조절성 화합물은 아래 화학식 구조를 가지는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물과 이들 입체이성질체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.

단, 여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂또는 C=O;

R은 H 또는 CH₂OCOR'이고;

(i) R¹, R², R³ 또는 R⁴ 각각은 서로 무관하게 할로겐, 탄소 수 1~4의 알킬, 또는 탄소 수 1~4의 알콕시이거나 (ii) R¹, R², R³ 또는 R⁴중 하나는 니트로 혹은 -NHR⁵이고 R¹, R², R³ 또는 R⁴중 나머지는 수소이며;

R⁵는 수소 또는 탄소 수 1~8의 알킬;

R⁶은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 벤조, 염소 또는 플루오르;

R'는 R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹);

R⁷은 m-페닐렌 또는 p-페닐렌 또는 -(C_nH_2n)-이고 여기서 n은 그 값이 0~4이고;

R⁸과 R⁹는 각각 서로에 무관하게 수소이거나 탄소 수 1~8의 알킬이든가, R⁸과 R⁹가 함께 결합하여 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌 또는 -CH₂CH₂X₁CH₂CH₂-인데 여기서 X₁은 -O-, -S- 또는 -NH-이고;

R¹⁰은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 또는 페닐이며;

*은 키랄 탄소 중심을 나타낸다.
제1항에 있어서, 상기 용액은 혈관 확장제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제45항에 있어서, 상기 혈관 확장제는 혈압 강하제인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제45항에 있어서, 상기 혈관 확장제는 구아닐릴 고리화 효소, ADP-리보오스 전달 효소 또는 사이클로옥시게나아제를 활성화하거나, 지질옥시게나아제(lipoxygenase)를 억제하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제45항에 있어서, 상기 혈관 확장제는 심방 나트륨 이뇨펩티드(ANP), 아드레노코르티코트로핀, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 니트로프러시드나트륨, 히드랄라진(hydralazine), 아데노신 삼인산, 아데노신, 인도메타신 또는 황산마그네슘인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제45항에 있어서, 상기 히드랄라진은 대략 0.1 mM 내지 대략 10 mM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제45항에 있어서, 상기 아데노신은 대략 0.001 mM 내지 대략 10.0 mM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제45항에 있어서, 상기 아데노신 삼인산은 대략 0.1 mM 내지 대략 1000 mM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제45항에 있어서, 상기 인도메타신은 대략 1 mg/kg 내지 대략 20 mg/kg 농도로 존재하며, 이때 상기 kg은 태반의 무게를 나타내는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제45항에 있어서, 상기 황산마그네슘은 대략 0.1 mM 내지 대략 20 mM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 CD34⁺ 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제54항에 있어서, 상기 CD34⁺ 줄기세포는 CD34⁺CD38 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제55항에 있어서, 상기 CD34⁺CD38^-줄기세포는 태반 관류물 속 CD34⁺CD38^-줄기세포군의 일부이며, 상기 CD34⁺CD38^- 줄기세포군이 태반 관류물 속 전체 유핵 세포 중에서 차지하는 비율은 제대혈 속 비율보다 더 높은 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 CD34^- 줄기세포인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제57항에 있어서, 상기 CD34^-줄기세포는 또한 HLA-G⁺ 또는 CD200⁺인 것을 특 징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제58항에 있어서, 상기 CD34^-줄기세포는 또한 OCT-4⁺, CD73⁺ 또는 CD105⁺인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
세포 자멸사 억제제와 단백질 분해 효소를 생리적으로 허용되는 용액 형태로 함유하는 조성물로서,

상기 조성물은 천연적으로 존재하지 않는 조성물이며,

줄기세포군과 접촉하였을 때 접촉한 줄기세포군의 세포 자멸사를 상기 조성물에 접촉하지 않은 다른 줄기세포군과 비교하였을 때 줄이거나 방지하는 조성물.
제60항에 있어서, 상기 세포 자멸사 억제제는 카스파제 억제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제60항에 있어서, 상기 세포 자멸사 억제제는 JNK 억제제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제62항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 상기 줄기세포의 분화나 증식을 조절하지 않는 것을 특징으로 하는 조성물.
제60항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 상기 줄기세포가 유래할 수 있는 조직으로부터 줄기세포를 관측 가능한 수준으로 탈착시키기에 충분한 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제60항에 있어서, 세포 괴사 억제제를 더 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제65항에 있어서, 상기 세포 괴사 억제제는 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노말레이미드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제60항에 있어서, 산소 운반 퍼플루오로카본을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제60항에 있어서, 상기 생리학적으로 허용되는 용액은 식염수 또는 배양 배지인 것을 특징으로 하는 조성물.
제68항에 있어서, 상기 식염수는 0.9％％NaCl 용액 또는 인산 완충 식염수인 것을 특징으로 하는 조성물.
제60항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 매트릭스 금속단백 분해 효소 또는 중성 단백질 분해 효소인 것을 특징으로 하는 조성물.
제70항에 있어서, 상기 매트릭스 금속단백 분해 효소는 콜라게나아제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제70항에 있어서, 상기 중성 단백질 분해 효소는 써모리신(thermolysin) 또는 디스파제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제60항에 있어서, 점액 분해 효소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제73항에 있어서, 상기 점액 분해 효소는 히알루로니다제(hyaluronidase)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제60항에 있어서, 상기 조성물은 히드록시에틸녹말, 락토비온산 음이온 및 라피노스(raffinose)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제60항에 있어서, UW 용액을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제60항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 인다졸인 것을 특징으로 하는 조성물.
제60항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 아래 화학식 구조를 가지는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물과 이들 입체이성질체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 조성물.

단, 여기서 A는 직접 결합, -(CH₂) _a -, -(CH₂) _b CH=CH(CH₂) _c -, 또는 -(CH₂) _b C≡C(CH₂) _c -;

R₁은 아릴, 헤테로아릴 또는 페닐기에 융합한 헤테로고리로서, 각각 R₃에서 독립적으로 선택된 하나 내지 네 개의 치환기로 선택적으로 치환되며,;

R₂는 -R₃, -R₄, -(CH₂) _b C(=O)R₅, -(CH₂) _b C(=O)OR₅, -(CH₂) _b C(=O)NR₅R₆, -(CH₂) _b C(=O)NR₅(CH₂) _c C(=O)R₆, -(CH₂) _b NR₅C(=O)R₆,-(CH₂) _b NR₅C(=O)NR₆R₇, -(CH₂) _b NR₅R₆, -(CH₂) _b OR₅, -(CH₂) _b SO _d R₅또는 -(CH₂) _b SO₂NR₅R₆이고;

a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6;

b와 c는 0, 1, 2, 3 또는 4 중에서 독립적으로 선택되며, 각각의 경우 서로 같거나 다를 수 있고;

d는 각 경우에 0, 1 또는 2;

R₃은 각각의 경우 독립적으로 할로겐, 히드록시, 카르복시, 알킬, 알콕시, 할로알킬, 아실옥시, 티오알킬, 술핀일알킬, 술폰일알킬, 히드록시알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 헤테로고리알킬, -C(=O)OR₈, -OC(=O)R₈, -C(=O)NR₈R₉, -C(=O)NR₈OR₉, -SO₂NR₈R₉, -NR₈SO₂R₉, -CN, -NO₂, -NR₈R₉, -NR₈C(=O)R₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b OR₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b R₉, -O(CH₂) _b NR₈R₉, 또는 페닐기에 융합된 헤테로고리;

R₄는 각각 R₃에서 독립적으로 선택되는 치환기 하나 내지 네 개로 선택적으로 치환되는 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이거나, R₄는 할로겐 또는 히드록시이며;

R₅, R₆과 R₇은 같거나 다르며, 각각의 경우 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이고, 이때 R₅, R₆과 R₇각각은 선택적으로 R₃으로부터 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 치환되며,

R₈과 R₉는 같거나 다르며, 각각의 경우 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이거나, R₈과 R₉는 이들에 연결된 원자 또는 원자들과 함께 헤테로고리를 이루며, 이때 R₈과 R₉가 각각인 경우, 또 R₈과 R₉가 함께 헤테로고리를 이룬 경우에 이들은 R₃에서 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 선택적으로 치환된다.
제60항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 아래 화학식 구조를 가지는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물과 이들 입체이성질체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 조성물.

단, 여기서 R₁은 R₇에서 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 선택적으로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴;

R₂는 수소;

R₃은 수소 또는 저급 알킬;

R₄는 하나 내지 네 개의 선택적 치환기를 나타내는데, 여기서 각 치환기는 같거나 다르며, 할로겐, 히드록시, 저급 알킬과 저급 알콕시의 군으로부터 독립적으로 선택되고;

R₅와 R₆은 같거나 다르며, 독립적으로 -R₈, -(CH₂) _a C(=O)R_9, -(CH₂) _a C(=O)OR₉, -(CH₂) _a C(=O)NR₉R₁₀, -(CH₂) _a C(=O)NR₉(CH₂) _b C(=O)R₁₀, -(CH₂) _a NR₉C(=O)R₁₀, (CH₂) _a NR₁₁C(=O)NR₉R₁₀, -(CH₂) _a NR₉R₁₀, -(CH₂) _a OR₉, -(CH₂) _a SO _c R₉또는 -(CH₂ ) _a SO₂NR₉R₁₀이거나; 혹은

R₅와 R₆이 모두 그들에 결합한 질소 원자와 더불어 헤테로고리 또는 치환 헤테로고리를 이루며;

R₇은 각 경우에 독립적으로 할로겐, 히드록시, 시아노, 니트로, 카르복시, 알킬, 알콕시, 할로알킬, 아실옥시, 티오알킬, 술핀일알킬, 술폰일알킬, 히드록시알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 치환 헤테로고리, 헤테로고리알킬, -C(=O)OR₈, -OC(=O)R₈, -C(=O)NR₈R₉, -C(=O)NR₈OR₉, -SO_cR₈, -SO_cNR₈R₉, -NR₈SO _c R₉, -NR₈R₉, -NR₈C(=O)R₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b OR₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b R₉, -O(CH₂) _b NR₈R₉, 또는 페닐기에 융합한 헤테로고리이고;

R₈, R₉, R₁₀과 R₁₁은 같거나 다르며, 각 경우에 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 헤테로고리알킬이거나; 혹은

R₈과 R₉는 그들에게 연결된 원자 또는 원자들과 함께 헤테로고리를 이루며;

a와 b는 서로 같거나 다를 수 있고 각 경우에 0, 1, 2, 3 또는 4 중에서 독립적으로 선택되며,

c는 각 경우에 0, 1 또는 2이다.
제60항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 아래 화학식 구조를 가지는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물과 이들 입체이성질체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 조성물.

단,여기서 R₀은 -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, NH 또는 -CH₂-이고;

상기 구조 (III)의 화합물은 (i) 무치환, (ii) 모노치환물이고 제1 치환기가 있거나, 또는 (iii) 이중치환물이고 제1과 제2 치환기가 있으며;

상기 제1 또는 제2 치환기는 존재할 경우 3, 4, 5, 7, 8, 9, 또는 10 위치에 있는데, 이때 제1과 제2 치환기는 존재할 경우 독립적으로 알킬, 히드록시, 할로겐, 니트로, 트리플루오로메틸, 술폰일, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬옥시, 사이클로알킬옥시, 알콕시알킬, 알콕시알콕시, 아미노알콕시, 모노-알킬아미노알콕시, 디-알킬아미노알콕시 또는 아래 구조 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)로 나타낸 작용기인데;

이때 R₃과 R₄는 함께 알킬리덴 또는 헤테로원자를 포함하는 고리형 알킬리덴을 이루고, 혹은 R₃과 R₄는 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 아릴옥시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 모노-알킬아미노알킬 또는 디-알킬아미노알킬이며;

R₅는 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 아미노, 모노-알킬아미노, 디-알킬아미노, 아릴아미노, 아릴알킬아미노, 사이클로알킬아미노, 사이클로알킬알킬아미노, 아미노알킬, 모노-알킬아미노알킬 또는 디-알킬아미노알킬이다.
제60항에 있어서, 면역 조절성 화합물을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제81항에 있어서,

상기 면역 조절성 화합물은 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온, 3-(4'-아미노이소인돌린-1'-온)-1-피페리딘-2,6-디온, 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌-1,3-디온 또는 α-(3-아미노프탈이미도)글루타르이미드인 것을 특징으로 하는 조성물.
제81항에 있어서, 상기 면역 조절성 화합물은 아래 화학식 구조를 가지는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물과 이들 입체이성질체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 조성물.

단, 여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고, 나머지는 C=O 또는 CH₂이며, R²는 수소 또는 저급 알킬이다.
제81항에 있어서, 상기 면역 조절성 화합물은 아래 화학식 구조를 가지는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물과 이들 입체이성질체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 조성물.

단, 여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고, 나머지는 C=O 또는 CH₂이며,

R¹은 H, (C₁-C₈)알킬, (C₃-C₇)사이클로알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로고리알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, C(O)R³, C(S)R³, C(O)OR⁴, (C₁-C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬-C(O)OR⁵, C(O)NHR³, C(S)NHR³, C(O)NR³R^3', C(S)NR³R^3' 또는 (C₁-C₈)알킬-O(CO)R⁵;

R²는 H, F, 벤질, (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, 또는 (C₂-C₈)알킨일;

R³과 R^3'은 독립적으로 (C₁-C₈)알킬, (C₃-C₇)사이클로알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로고리알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, (C₀-C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬-C(O)OR⁵, (C₁-C₈)알킬-O(CO)R⁵, 또는 C(O)OR⁵;

R⁴는 (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, (C₁-C₄)알킬-OR⁵, 벤질, 아 릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로고리알킬, 또는 (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴;

R⁵는 (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, 또는 (C₂-C₅)헤테로아릴이고;

각 경우에 R⁶은 독립적으로 H, (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₂-C₅)헤테로아릴, 또는 (C₀-C₈)알킬-C(O)OR⁵이거나, 상기 R⁶ 작용기들이 모여 헤테로고리알킬을 이룰 수 있으며;

n은 0 또는 1이고;

*은 키랄 탄소 중심을 나타낸다.
제81항에 있어서, 상기 면역 조절성 화합물은 아래 화학식 구조를 가지는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물과 이들 입체이성질체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 조성물.

단, 여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂또는 C=O;

R은 H 또는 CH₂OCOR'이고;

(i) R¹, R², R³ 또는 R⁴ 각각은 서로 무관하게 할로겐, 탄소 수 1~4의 알킬, 또는 탄소 수 1~4의 알콕시이거나 (ii) R¹, R², R³ 또는 R⁴중 하나는 니트로 혹은 -NHR⁵이고 R¹, R², R³ 또는 R⁴중 나머지는 수소이며;

R⁵는 수소 또는 탄소 수 1~8의 알킬;

R⁶은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 벤조, 염소 또는 플루오르;

R'는 R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹);

R⁷은 m-페닐렌 또는 p-페닐렌 또는 -(C_nH_2n)-이고 여기서 n은 그 값이 0~4이고;

R⁸과 R⁹는 각각 서로에 무관하게 수소이거나 탄소 수 1~8의 알킬이든가, R⁸과 R⁹가 함께 연결되어 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌 또는 -CH₂CH₂X₁CH₂CH₂-인데 여기서 X₁은 -O-, -S- 또는 -NH-이고;

R¹⁰은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 또는 페닐이며;

*은 키랄 탄소 중심을 나타낸다.
제60항에 있어서, 상기 조성물은 혈관 확장제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제86항에 있어서, 상기 혈관 확장제는 혈압 강하제인 것을 특징으로 하는 조성물.
제86항에 있어서, 상기 혈관 확장제는 구아닐릴 고리화 효소, ADP-리보오스 전달 효소 또는 사이클로옥시게나아제를 활성화하거나, 지질옥시게나아제(lipoxygenase)를 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제86항에 있어서, 상기 혈관 확장제는 심방 나트륨 이뇨펩티드(ANP), 아드레노코르티코트로핀, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 니트로프러시드나트륨, 히드랄라진(hydralazine), 아데노신 삼인산, 아데노신, 인도메타신 또는 황산마그네슘인 것을 특징으로 하는 조성물.
제89항에 있어서, 상기 히드랄라진은 대략 0.1 mM 내지 대략 10 mM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제89항에 있어서, 상기 아데노신은 대략 0.001 mM 내지 대략 10.0 mM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제89항에 있어서, 상기 아데노신 삼인산은 대략 0.1 mM 내지 대략 1000 mM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제89항에 있어서, 상기 인도메타신은 대략 1 mg/kg 내지 대략 20 mg/kg 농도로 존재하며, 이때 상기 kg은 태반의 무게를 나타내는 것을 특징으로 하는 조성물.
제89항에 있어서, 상기 황산마그네슘은 대략 0.1 mM 내지 대략 20 mM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
세포 자멸사 억제제와 산소 운반 퍼플루오로카본에 줄기세포군을 접촉시키는 단계를 포함하되.

상기 세포 자멸사 억제제는 접촉한 상기 줄기세포군의 세포 자멸사를 상기 조성물에 접촉하지 않은 다른 줄기세포군보다 줄이거나 방지하기에 충분한 양과 시간에 걸쳐 존재하는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제95항에 있어서, 상기 세포 자멸사 억제제는 카스파제 억제제인 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제95항에 있어서, 상기 세포 자멸사 억제제는 c-Jun N-말단 키나아제(JNK) 억제제인 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제97항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 상기 줄기세포의 분화와 증식을 조절하지 않는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제97항에 있어서, 상기 JNK 억제제와 상기 퍼풀루오로카본은 상기 접촉 전에 한 용기 속에 포함되는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제97항에 있어서, 상기 접촉 전에 상기 JNK 억제제는 제1 용액, 상기 퍼플루오로카본은 제2 용액 속에 각각 포함되는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제95항에 있어서, 상기 용액은 히드록시에틸녹말, 락토비온산 음이온 및 라피노스(raffinose)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제95항에 있어서, 상기 줄기세포군을 세포 괴사 억제제와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제102항에 있어서, 상기 세포 괴사 억제제는 2-(1H-인돌-3-일)-3-펜틸아미노말레이미드인 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제95항에 있어서, 상기 줄기세포군은 상기 보존 도중 저산소 조건하에 6 시간 미만으로 노출되며, 이때 저산소 조건은 정상적인 혈액 산소 농도보다 낮은 산소 농도인 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제95항에 있어서, 상기 줄기세포군은 상기 보존 도중 상기 저산소 조건하에 2시간 미만으로 노출되는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제95항에 있어서, 상기 줄기세포군은 상기 보존 도중 상기 저산소 조건하에 1시간 미만으로 노출되는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제95항에 있어서, 상기 줄기세포군은 상기 보존 도중 상기 저산소 조건하에 30분 미만으로 노출되는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제95항에 있어서, 상기 줄기세포군은 상기 분리 도중 저산소 조건하에 노출되지 않는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제95항에 있어서, 상기 줄기세포군은 상기 보존 도중 전단 응력을 받지 않는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제99항에 있어서, 상기 용액은 히드록시에틸녹말, 락토비온산 음이온 및 라피노스(raffinose)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제100항에 있어서, 상기 제1 용액은 히드록시에틸녹말, 락토비온산 음이온 및 라피노스(raffinose)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제99항에 있어서, 상기 용액은 UW 용액을 함유하는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제100항에 있어서, 상기 제1 용액은 UW 용액을 함유하는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제95항에 있어서, 상기 줄기세포군은 태반 속에 포함되거나, 태반으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제97항에 있어서, 상기 JNK 억제제와 상기 퍼플루오로카본은 상기 접촉시 약 0℃에서 약 25℃ 사이인 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제97항에 있어서, 상기 JNK 억제제와 상기 퍼플루오로카본은 상기 접촉시 약 2℃에서 약 10℃ 사이인 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제97항에 있어서, 상기 JNK 억제제와 상기 퍼플루오로카본은 상기 접촉시 약 2℃에서 약 5℃ 사이인 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제97항에 있어서, 상기 접촉은 상기 줄기세포군의 이동 도중에 이루어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제97항에 있어서, 상기 접촉은 상기 줄기세포군의 냉동과 해동 도중에 이루어지는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제97항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 아래 화학식 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.

단, 여기서 A는 직접 결합, -(CH₂) _a -, -(CH₂) _b CH=CH(CH₂) _c -, 또는 -(CH₂) _b C≡C(CH₂) _c -;

R₁은 아릴, 헤테로아릴 또는 페닐기에 융합한 헤테로고리로서, 각각 R₃에서 독립적으로 선택된 하나 내지 네 개의 치환기로 선택적으로 치환되며;

R₂는 -R₃, -R₄, -(CH₂) _b C(=O)R₅, -(CH₂) _b C(=O)OR₅, -(CH₂) _b C(=O)NR₅R₆, -(CH₂) _b C(=O)NR₅(CH₂) _c C(=O)R₆, -(CH₂) _b NR₅C(=O)R₆,-(CH₂) _b NR₅C(=O)NR₆R₇, -(CH₂) _b NR₅R₆, -(CH₂) _b OR₅, -(CH₂) _b SO _d R₅또는 -(CH₂) _b SO₂NR₅R₆이고;

a는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6;

b와 c는 0, 1, 2, 3 또는 4 중에서 독립적으로 선택되며, 각각의 경우 서로 같거나 다를 수 있고;

d는 각 경우에 0, 1 또는 2;

R₃은 각각의 경우 독립적으로 할로겐, 히드록시, 카르복시, 알킬, 알콕시, 할로알킬, 아실옥시, 티오알킬, 술핀일알킬, 술폰일알킬, 히드록시알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 헤테로고리알킬, -C(=O)OR₈, -OC(=O)R₈, -C(=O)NR₈R₉, -C(=O)NR₈OR₉, -SO₂NR₈R₉, -NR₈SO₂R₉, -CN, -NO₂, -NR₈R₉, -NR₈C(=O)R₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b OR₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b R₉, -O(CH₂) _b NR₈R₉, 또는 페닐기에 융합된 헤테로고리;

R₄는 각각 R₃에서 독립적으로 선택되는 치환기 하나 내지 네 개로 선택적으로 치환되는 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이거나, R₄는 할로겐 또는 히드록시이며;

R₅, R₆과 R₇은 같거나 다르며, 각각의 경우 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이고, 이때 R₅, R₆과 R₇각각은 선택적으로 R₃으로부터 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 치환되며,

R₈과 R₉는 같거나 다르며, 각각의 경우 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리 또는 헤테로고리알킬이거나, R₈과 R₉는 이들에게 연결된 원자 또는 원자들과 함께 헤테로고리를 이루며, 이때 R₈과 R₉가 각각인 경우, 또 R₈과 R₉가 함께 헤테로고리를 이룬 경우에 이들은 R₃에서 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 선택적으로 치환된다.
제97항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 아래 화학식 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.

단, 여기서 R₁은 R₇에서 독립적으로 선택되는 하나 내지 네 개의 치환기로 선택적으로 치환되는 아릴 또는 헤테로아릴;

R₂는 수소;

R₃은 수소 또는 저급 알킬;

R₄는 하나 내지 네 개의 선택적 치환기를 나타내는데, 여기서 각 치환기는 같거나 다르며, 할로겐, 히드록시, 저급 알킬과 저급 알콕시의 군으로부터 독립적으로 선택되고;

R₅와 R₆은 같거나 다르며, 독립적으로 -R₈, -(CH₂) _a C(=O)R_9, -(CH₂) _a C(=O)OR₉, -(CH₂) _a C(=O)NR₉R₁₀, -(CH₂) _a C(=O)NR₉(CH₂) _b C(=O)R₁₀, -(CH₂) _a NR₉C(=O)R₁₀, (CH₂) _a NR₁₁C(=O)NR₉R₁₀, -(CH₂) _a NR₉R₁₀, -(CH₂) _a OR₉, -(CH₂) _a SO _c R₉또는 -(CH₂ ) _a SO₂NR₉R₁₀이거나; 혹은

R₅와 R₆이 모두 그들에 결합한 질소 원자와 더불어 헤테로고리 또는 치환 헤테로고리를 이루며;

R₇은 각 경우에 독립적으로 할로겐, 히드록시, 시아노, 니트로, 카르복시, 알킬, 알콕시, 할로알킬, 아실옥시, 티오알킬, 술핀일알킬, 술폰일알킬, 히드록시알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 치환 헤테로고리, 헤테로고리알킬, -C(=O)OR₈, -OC(=O)R₈, -C(=O)NR₈R₉, -C(=O)NR₈OR₉, -SO_cR₈, -SO_cNR₈R₉, -NR₈SO _c R₉, -NR₈R₉, -NR₈C(=O)R₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b OR₉, -NR₈C(=O)(CH₂) _b R₉, -O(CH₂) _b NR₈R₉, 또는 페닐기에 융합한 헤테로고리이고;

R₈, R₉, R₁₀과 R₁₁은 같거나 다르며, 각 경우에 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로고리, 헤테로고리알킬이거나; 혹은

R₈과 R₉가 그들에게 연결된 원자 또는 원자들과 함께 헤테로고리를 이루며;

a와 b는 서로 같거나 다를 수 있고 각 경우에 0, 1, 2, 3 또는 4 중에서 독립적으로 선택되며,

c는 각 경우에 0, 1 또는 2이다.
제97항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 아래 화학식 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.

단,여기서 R₀은 -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, NH 또는 -CH₂-이고;

상기 구조 (III)의 화합물은 (i) 무치환, (ii) 모노치환물이고 제1 치환기가 있거나, 또는 (iii) 이중치환물이고 제1과 제2 치환기가 있으며;

상기 제1 또는 제2 치환기는 존재할 경우 3, 4, 5, 7, 8, 9, 또는 10 위치에 있는데, 이때 제1과 제2 치환기는 존재할 경우 독립적으로 알킬, 히드록시, 할로겐, 니트로, 트리플루오로메틸, 술폰일, 카르복실, 알콕시카르보닐, 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 아릴알킬옥시, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬옥시, 사이클로알킬옥시, 알 콕시알킬, 알콕시알콕시, 아미노알콕시, 모노-알킬아미노알콕시, 디-알킬아미노알콕시 또는 아래 구조 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f)로 나타낸 작용기인데;

이때 R₃과 R₄는 함께 연결되어 알킬리덴 또는 헤테로원자를 포함하는 고리형 알킬리덴을 이루고, 혹은 R₃과 R₄는 독립적으로 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 아릴옥시알킬, 알콕시알킬, 아미노알킬, 모노-알킬아미노알킬 또는 디-알킬아미노알킬이며;

R₅는 수소, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아릴알킬, 사이클로알킬알킬, 알콕시, 알콕시알킬, 알콕시카르보닐알킬, 아미노, 모노-알킬아미노, 디-알킬아미노, 아릴아미노, 아릴알킬아미노, 사이클로알킬아미노, 사이클로알킬알킬아미노, 아미노알킬, 모노-알킬아미노알킬 또는 디-알킬아미노알킬이다.
제97항에 있어서, 상기 줄기세포에 면역 조절성 화합물을 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제123항에 있어서, 상기 면역 조절성 화합물은 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디하이드로이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온, 3-(4'-아미노이소인돌린-1'-온)-1-피페리딘-2,6-디온, 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌-1,3-디온 또는 α-(3-아미노프탈이미도)글루타르이미드인 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.
제123항에 있어서, 상기 면역 조절성 화합물은 아래 화학식 구조를 가지는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물과 이들 입체이성질체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.

단, 여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고, 나머지는 C=O 또는 CH₂이며, R²는 수소 또는 저급 알킬이다.
제123항에 있어서, 상기 면역 조절성 화합물은 아래 화학식 구조를 가지는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물과 이들 입체이성질체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.

단, 여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고, 나머지는 C=O 또는 CH₂이며,

R¹은 H, (C₁-C₈)알킬, (C₃-C₇)사이클로알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로고리알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, C(O)R³, C(S)R³, C(O)OR⁴, (C₁-C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬-C(O)OR⁵, C(O)NHR³, C(S)NHR³, C(O)NR³R^3', C(S)NR³R^3' 또는 (C₁-C₈)알킬-O(CO)R⁵;

R²는 H, F, 벤질, (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, 또는 (C₂-C₈)알킨일;

R³과 R^3'은 독립적으로 (C₁-C₈)알킬, (C₃-C₇)사이클로알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로고리알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, (C₀-C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬-C(O)OR⁵, (C₁-C₈)알킬- O(CO)R⁵, 또는 C(O)OR⁵;

R⁴는 (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, (C₁-C₄)알킬-OR⁵, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로고리알킬, 또는 (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴;

R⁵는 (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, 또는 (C₂-C₅)헤테로아릴이고;

각 경우에 R⁶은 독립적으로 H, (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알켄일, (C₂-C₈)알킨일, 벤질, 아릴, (C₂-C₅)헤테로아릴, 또는 (C₀-C₈)알킬-C(O)OR⁵이거나, 상기 R⁶ 작용기들이 모여 헤테로고리알킬을 이룰 수 있으며;

n은 0 또는 1이고;

*은 키랄 탄소 중심을 나타낸다.
제123항에 있어서, 상기 면역 조절성 화합물은 아래 화학식 구조를 가지는 화합물 또는 그 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물, 클라트레이트, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 라세미 혼합물과 이들 입체이성질체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 줄기세포군의 보존 방법.

단, 여기서 X와 Y 중 하나는 C=O이고 나머지는 CH₂또는 C=O;

R은 H 또는 CH₂OCOR'이고;

(i) R¹, R², R³ 또는 R⁴ 각각은 서로 무관하게 할로겐, 탄소 수 1~4의 알킬, 또는 탄소 수 1~4의 알콕시이거나 (ii) R¹, R², R³ 또는 R⁴중 하나는 니트로 혹은 -NHR⁵이고 R¹, R², R³ 또는 R⁴중 나머지는 수소이며;

R⁵는 수소 또는 탄소 수 1~8의 알킬;

R⁶은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 벤조, 염소 또는 플루오르;

R'는 R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹);

R⁷은 m-페닐렌 또는 p-페닐렌 또는 -(C_nH_2n)-이고 여기서 n은 그 값이 0~4이고;

R⁸과 R⁹는 각각 서로에 무관하게 수소이거나 탄소 수 1~8의 알킬이든가, R⁸과 R⁹가 함께 연결되어 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌 또는 -CH₂CH₂X₁CH₂CH₂-인 데 여기서 X₁은 -O-, -S- 또는 -NH-이고;

R¹⁰은 수소, 탄소 수 1~8의 알킬, 또는 페닐이며;

*은 키랄 탄소 중심을 나타낸다.
제3항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 약 0.5 μM 내지 약 10 μM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제62항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 약 0.5 μM 내지 약 10 μM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제97항에 있어서, 상기 JNK 억제제는 약 0.5 μM 내지 약 10 μM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 보존 방법.
제8항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제60항에 있어서, 상기 단백질 분해 효소는 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제12항에 있어서, 상기 점액 분해 효소는 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제73항에 있어서, 상기 점액 분해 효소는 약 0.1 mg/mL 내지 약 10 mg/mL 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제40항에 있어서, 상기 면역 조절성 화합물은 약 0.5 μM 내지 약 10 μM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 분리 방법.
제81항에 있어서, 상기 면역 조절성 화합물은 약 0.5 μM 내지 약 10 μM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제123항에 있어서, 상기 면역 조절성 화합물은 약 0.5 μM 내지 약 10 μM 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 보존 방법.