CN112941009B - 一种ffpe样本预处理液及从ffpe样本中分离单细胞的方法 - Google Patents
一种ffpe样本预处理液及从ffpe样本中分离单细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112941009B CN112941009B CN202110197602.0A CN202110197602A CN112941009B CN 112941009 B CN112941009 B CN 112941009B CN 202110197602 A CN202110197602 A CN 202110197602A CN 112941009 B CN112941009 B CN 112941009B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- units
- ffpe
- ethanol
- pbs buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 18
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 15
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 13
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 13
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 13
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 12
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 claims description 11
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 claims description 11
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 claims description 11
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 10
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 8
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 claims description 7
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 claims description 7
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 7
- 108010007093 dispase Proteins 0.000 claims description 7
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 5
- 238000010008 shearing Methods 0.000 claims description 5
- YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N chembl176323 Chemical compound C1C[C@]2(C)[C@@]3(C)CC(N=C4C[C@]5(C)CCC6[C@]7(C)CC[C@@H]([C@]7(CC[C@]6(C)[C@@]5(C)CC4=N4)C)CCCCCCCC)=C4C[C@]3(C)CCC2[C@]2(C)CC[C@H](CCCCCCCC)[C@]21C YRQNKMKHABXEJZ-UVQQGXFZSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydrate Chemical compound O.CCO IDGUHHHQCWSQLU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 9
- 238000012174 single-cell RNA sequencing Methods 0.000 abstract description 8
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 abstract description 7
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 abstract description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 5
- 238000013427 histology analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 27
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 5
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 3
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 3
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 3
- 238000000370 laser capture micro-dissection Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 210000003040 circulating cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及单细胞组学分析领域，具体涉及一种FFPE样本预处理液及从FFPE样本中分离单细胞的方法。本发明所提供的FFPE样本预处理液均为常用分子细胞生物学试剂，RNA酶抑制剂的加入有效抑制样本中RNA的降解；提供的从福尔马林固定石蜡包埋样品中分离单个细胞的方法，工艺简单，耗时短，试剂耗材低廉；不需要使用流式细胞仪进行分选，对设备要求低，普通实验室即可高质量地实现对福尔马林固定石蜡包埋样品中单个细胞的分离，有效降低分离成本；分离全过程用时仅需3~5 h，具有很强的实用性，可以明显提高单细胞RNA测序的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及单细胞组学分析领域，具体涉及一种FFPE样本预处理液及从FFPE样本中分离单细胞的方法。
背景技术
单细胞RNA测序（scRNA-seq）可揭示每个细胞的独特性，从而在单细胞分子水平上研究生物学并解决以前无法回答的问题，例如揭示细胞异质性、细胞发育、细胞间不同基因表达模式等，目前已广泛应用在生物学、医药研发、临床医学等各个领域。scRNA-seq方法包括步骤有（1）单细胞或单核的分离和裂解、（2）反转录、（3）cDNA扩增和（4）测序文库的制备。目前，单细胞或单核的分离和裂解需要脱离细胞外基质和细胞-细胞粘附（循环细胞除外），通常可以通过酶处理或激光捕获显微切割（LCM）和膜片钳来实现。大多数细胞捕获技术需要从新鲜组织中分离出完整的单个细胞。但是在某些情况下活细胞的解离可能是有问题的。
福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织是临床上带有患者随访数据的大量资源。由于FFPE在样品在制备的过程中，会发生蛋白核酸交联，mRNA也会存在不同程度的降解、修饰过程，在FFPE样品脱腊、解交联过程中仍会造成mRNA的降解。因此，对FFPE样品的scRNA-seq极具挑战性。目前已有对于FFPE样品分离为单个细胞的方法，但均耗时较长，操作步骤较多，并且需要使用流式细胞仪进行分选，急需一种快速、简便的分离FFPE组织中单细胞用于单细胞RNA测序。
发明内容
有鉴于此，本发明针对现有技术中存在的不足，提供一种FFPE样本预处理液及从FFPE样本中分离单细胞的方法。所述FFPE样本预处理液可以有效抑制样本中RNA的降解并且促进单细胞的分离，所提供的从FFPE样本中分离单细胞的方法在较短时间内以相对较低成本获得FFPE样品的单细胞悬液。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案得以实现：
本发明的一个方面，是提供一种FFPE样本预处理液，所述的预处理液为含有35~50单位/mL胶原酶iv型（Collagenase Type 4）、60~80单位/mL胶原酶ii型（collagenase Type2）、0.4~0.6单位/mL分散酶 I（Dispase I）、70~100 单位/mL透明质酸酶（hyaluronidase）、0.1~0.2 单位/µL marine RNase抑制剂、0.3~0.5 mM氯化钙（CaCl2）和4~5 mM 二硫苏糖醇（DTT）的PBS缓冲液。
作为优选，在本发明的实施方式中，上述用于FFPE样本的预处理液为含有35单位/mL Collagenase Type 4、60单位/mL collagenase Type 2 、0.4单位/mL Dispase I、70单位/mL hyaluronidase、0.1单位/µL marine RNase inhibitor、 0.3mM CaCl2和 4mM 二硫苏糖醇（DTT）的PBS缓冲液。
本发明的另一个方面，是提供一种从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本中分离单细胞的方法，所述方法包含以下步骤：
（1）切片：去除FFPE组织两侧多余的石蜡后将FFPE组织切成薄片；
（2）脱蜡：将薄片用二甲苯浸泡洗涤多次去除残留的石蜡；
（3）再水化：将薄片依次浸入到浓度逐渐降低的乙醇水溶液中逐步洗涤得到样本组织；
（4）将样本组织用Tris-EDTA(1×TE，pH8.0) 清洗后放入Tris-EDTA溶液中水浴锅处理一段时间，迅速置于冰上冷却，用PBS缓冲液洗涤；
（5）加入FFPE样本预处理液，剪碎样本组织后放入恒温振荡金属浴中消化；
（6）消化后筛网过滤，PBS缓冲液冲洗滤网，离心5 min，弃上清，加入PBS缓冲液重悬沉淀，得到单细胞悬液。
步骤（1）中所述切片的厚度为40-60 µm的薄片。
步骤（2）中所述浸泡洗涤多次的第一次浸泡时的环境温度为50~60℃ ，浸泡时间为3 ~5min。
步骤（3）中所述乙醇水溶液的浓度依次为100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇和30%乙醇。
步骤（4）中所述水浴的温度为65~75℃，时间为20~30min。
步骤（4）中所述PBS缓冲液中含有终浓度为0.3~0.5 mM的CaCl2；其pH为7.4。
步骤（5）中所述消化的时间为15~60 min，所述恒温振荡金属浴的转速为1200rpm/min。
步骤（6）中所述筛网的孔径为30~50 µm，所述PBS缓冲液均需提前预冷，预冷温度为2~5℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明所提供的FFPE样本预处理液均为常用分子细胞生物学试剂，RNA酶抑制剂的加入有效抑制样本中RNA的降解；提供的从福尔马林固定石蜡包埋样品中分离单个细胞的方法，工艺简单，耗时短，试剂耗材低廉；不需要使用流式细胞仪进行分选，对设备要求低，普通实验室即可高质量地实现对福尔马林固定石蜡包埋样品中单个细胞的分离，有效降低分离成本；分离全过程用时仅需3~5 h，具有很强的实用性，可以明显提高单细胞RNA测序的准确性。
附图说明
图1是实施例3中所分离的单个细胞DAPI染色图。
具体实施方式
本发明公开了一种FFPE样本预处理液及从FFPE样本中分离单细胞的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。下例实施实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：预处理液的配置
FFPE样本预处理液的成分，具体应用时，可以采用如下实施例进行配比： FFPE样本预处理液为含有50单位/mL胶原酶iv型（Collagenase Type 4）、80单位/mL胶原酶ii型（collagenase Type 2）、0.6单位/mL分散酶 I（Dispase I）、100 单位/mL透明质酸酶（hyaluronidase）、0.2 单位/µL marine RNase抑制剂、 0.5 mM氯化钙（CaCl2）和 5 mM 二硫苏糖醇（DTT）的PBS缓冲液。
实施例2：预处理液的配置
FFPE样本预处理液的成分，具体应用时，可以采用如下实施例进行配比： FFPE样本预处理液中含有35单位/mL Collagenase Type 4、60单位/mL collagenase Type 2 、0.4单位/mL Dispase I、70 单位/mL hyaluronidase、0.1单位/µL marine RNaseinhibitor、 0.3mM CaCl2和 4mM 二硫苏糖醇（DTT）的PBS缓冲液。
实施例3
本实施例中以小鼠肝FFPE组织为测试样本，提供一种从福尔马林固定石蜡包埋组织中分离单细胞的方法，具体的步骤如下：
（1）切片：用解剖刀从小鼠肝FFPE组织的两侧去除多余的石蜡，将FFPE组织切成约40µm的薄片；
（2）脱蜡：将薄片收集到1.5 mL离心管中，用1 mL二甲苯浸泡洗涤3次（第一次需将薄片置于55℃ 环境中浸泡3 min以加速溶解石蜡，后两次常温浸泡5min）去除残留的石蜡；
（3）再水化：将薄片依次浸入无水乙醇×2、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇中，每次5min；
（4）放入1 mL Tris-EDTA(1×TE，pH8.0) 溶液中洗涤2次，在70℃水浴锅中处理20min以逆转蛋白核酸交联，迅速置于冰上冷却1 min防止高温造成mRNA进一步降解；
（5）加入1 mL含有终浓度为0.5 mM CaCl2的PBS缓冲液（pH7.4）洗涤3次去除EDTA；
（6）加入100 µL实施例1中配置的预处理液，用眼科剪剪碎样本组织至无明显颗粒，每个样本中加入1 mL新鲜制备的预处理液，置于恒温振荡金属浴中消化15~60 min，金属浴转速为1200 rpm/min，隔20 min 吸取10 µL组织样品，观察消化情况；
（7）消化后，用40 µm筛网过滤，5 mL 4℃预冷的PBS缓冲液冲洗滤网；
（8）4℃ 500 rcf离心5 min，弃上清，加入50 µL预冷的PBS缓冲液重悬沉淀，得到单细胞液。
将处理后的单细胞液进行DAPI染色观察细胞数量。加入200 µL的DAPI染色液，轻柔吸打混匀后避光静置2 min，加入2 mL 预冷的PBS缓冲液后混匀，500 rcf 离心5min，去除上清，加入500 µL预冷的PBS-RI（PBS-RI的组分为含有终浓度为5 mM DTT和0.2 U/µLmarine RNase inhibitor）重悬沉淀，吸取10 µL细胞悬液置于荧光显微镜下观察细胞数量。
图1是所分离的单个细胞的DAPI染色图；其中，左图为明场，右图为荧光场；如图1可见， DAPI染色率为78.6%，细胞浓度为1.1ⅹ106 cell/mL。
取200 µL细胞核用于RNA提取，提取过程按RNA提取试剂盒的说明书进行操作，完成后使用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测RNA质量，经测定DV200值为71.3%。
实施例4
本实施例中以乳腺癌FFPE组织为测试样本，提供一种从福尔马林固定石蜡包埋组织中分离单细胞的方法，具体的步骤如下：
（1）切片：用解剖刀从小鼠肝FFPE组织的两侧去除多余的石蜡，将FFPE组织切成约60 µm的薄片；
（2）脱蜡：将薄片收集到离心管中，用1 mL二甲苯浸泡洗涤3次（第一次需将薄片置于60℃ 环境中浸泡3 min以加速溶解石蜡，后两次常温浸泡3min）去除残留的石蜡；
（3）再水化：将薄片依次浸入无水乙醇×2次、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇中，每次5min；
（4）放入1 mL Tris-EDTA(1×TE，pH8.0) 溶液中洗涤2次，在75℃水浴锅中处理30min以逆转蛋白核酸交联，迅速置于冰上冷却1 min防止高温造成mRNA进一步降解；
（5）加入1 mL含有终浓度为0.3mM CaCl2的PBS缓冲液（pH7.4）洗涤3次去除EDTA；
（6）加入100 µL实施例2中配置的预处理液，用眼科剪剪碎样本组织至无明显颗粒，每个样本中加入1.5mL新鲜制备的预处理液，置于恒温振荡金属浴中消化15~60 min，金属浴转速为1200 rpm/min，隔20 min 吸取10 µL组织样品，观察消化情况；
（7）消化后，用50 µm筛网过滤，5 mL 2℃预冷的PBS缓冲液冲洗滤网；
（8）2℃ 500 rcf离心5 min，弃上清，加入50 µL预冷的PBS缓冲液重悬沉淀，得到单细胞液。
将处理后的单细胞液进行DAPI染色观察细胞数量。加入200 µL的DAPI染色液，轻柔吸打混匀后避光静置2 min，加入2 mL 预冷的PBS缓冲液后混匀，500 rcf 离心5min，去除上清，加入500 µL预冷的PBS-RI（PBS-RI的组分为含有终浓度为5 mM DTT和0.2 U/µLmarine RNase inhibitor）重悬沉淀，吸取10 µL细胞悬液置于荧光显微镜下观察细胞数量。观察发现DAPI染色率为72.3%，细胞浓度为0.92ⅹ106 cell/mL。取200 µL细胞核用于RNA提取，提取过程按RNA提取试剂盒的说明书进行操作，完成后使用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测RNA质量，经测定DV200值为70.1%。
实施例5
本实施例中以小鼠肝FFPE组织为测试样本，提供一种从福尔马林固定石蜡包埋组织中分离单细胞的方法，具体的步骤如下：
（1）切片：用解剖刀从小鼠肝FFPE组织的两侧去除多余的石蜡，将FFPE组织切成约40µm的薄片；
（2）脱蜡：将薄片收集到离心管中，用二甲苯浸泡洗涤3次（第一次需将薄片置于50℃ 环境中浸泡5 min以加速溶解石蜡，后两次常温浸泡5min）去除残留的石蜡；
（3）再水化：将薄片依次浸入无水乙醇×2、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇中，每次5min；
（4）放入1 mL Tris-EDTA(1×TE，pH8.0) 溶液中洗涤2次，在70℃水浴锅中处理20min以逆转蛋白核酸交联，迅速置于冰上冷却1 min防止高温造成mRNA进一步降解；
（5）加入1 mL含有终浓度为0.5 mM CaCl2的PBS缓冲液（pH7.4）洗涤3次去除EDTA；
（6）加入100 µL实施例1中配置的预处理液，用眼科剪剪碎样本组织至无明显颗粒，每个样本中加入1 mL实施例1中配置的预处理液，置于恒温振荡金属浴中消化20~60min，金属浴转速为1200 rpm/min，隔10 min 吸取10 µL组织样品，观察消化情况；
（7）消化后，用40 µm筛网过滤，5 mL5℃预冷的PBS缓冲液冲洗滤网；
（8）5℃ 500 rcf离心5 min，弃上清，加入50 µL预冷的PBS缓冲液重悬沉淀，得到单细胞液。
将处理后的单细胞液进行DAPI染色观察细胞数量。加入200 µL的DAPI染色液，轻柔吸打混匀后避光静置2 min，加入2 mL 预冷的PBS缓冲液后混匀，500 rcf 离心5min，去除上清，加入500 µL预冷的PBS-RI（PBS-RI的组分为含有终浓度为5 mM DTT和0.2 U/µLmarine RNase inhibitor）重悬沉淀，吸取10 µL细胞悬液置于荧光显微镜下观察细胞数量。DAPI染色率为76.7%，细胞浓度为1.2ⅹ106 cell/mL。取200 µL细胞核用于RNA提取，提取过程按RNA提取试剂盒的说明书进行操作，完成后使用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统检测RNA质量，经测定DV200值为70.5%。
本发明所提供的FFPE样本预处理液均为常规实验试剂，耗材低廉，RNA酶抑制剂的加入有效抑制样本中RNA的降解；所提供的从FFPE样本中分离单细胞的方法不需要流式细胞仪进行分选，对设备要求低，分离时间短，且分离后的单细胞浓度较高，可以明显提高单细胞RNA测序的准确性。
应当理解，上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种FFPE样本预处理液，其特征在于，所述的预处理液为35~50单位/mL胶原酶iv型、60~80单位/mL胶原酶ii型、0.4~0.6单位/mL分散酶 I、70~100 单位/mL透明质酸酶、0.1~0.2 单位/µL marine RNase抑制剂、0.3~0.5 mM氯化钙和4~5 mM 二硫苏糖醇的PBS缓冲液。
2.根据权利要求1所述的预处理液，其特征在于，所述预处理液为35单位/mL胶原酶iv型、60单位/mL胶原酶ii型、0.4单位/mL分散酶 I、70 单位/mL透明质酸酶、0.1单位/µLmarine RNase抑制剂、0.3mM氯化钙和4mM 二硫苏糖醇的PBS缓冲液。
3.一种从福尔马林固定石蜡包埋样本中分离单细胞的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：
（1）切片：去除FFPE组织两侧多余的石蜡后将FFPE组织切成薄片；
（2）脱蜡：将薄片用二甲苯浸泡洗涤多次去除残留的石蜡；
（3）再水化：将薄片依次浸入到浓度逐渐降低的乙醇水溶液中逐步洗涤得到样本组织；
（4）将样本组织用Tris-EDTA清洗后放入Tris-EDTA溶液中水浴锅处理一段时间，迅速置于冰上冷却，用PBS缓冲液洗涤；
（5）加入如权利要求1-2任一项所述的FFPE样本预处理液，剪碎样本组织后放入恒温振荡金属浴中消化；
（6）消化后筛网过滤，PBS缓冲液冲洗滤网，离心弃上清，加入PBS缓冲液重悬沉淀，得到单细胞液。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中所述切片的厚度为40-60 µm的薄片。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述浸泡洗涤多次的第一次浸泡时的环境温度为50~60℃ ，浸泡时间为3 ~5min。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述乙醇水溶液的浓度依次为100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇和30%乙醇。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述水浴的温度为65~75℃，时间为20~30min。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（4）中所述PBS缓冲液中含有终浓度为0.3~0.5 mM的CaCl2；其pH为7.4。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（5）中所述消化的时间为15~60 min，所述恒温振荡金属浴的转速为1200 rpm/min。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（6）中所述筛网的孔径为30~50 µm，所述PBS缓冲液均需提前预冷，预冷温度为2~5℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110197602.0A CN112941009B (zh) | 2021-02-22 | 2021-02-22 | 一种ffpe样本预处理液及从ffpe样本中分离单细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110197602.0A CN112941009B (zh) | 2021-02-22 | 2021-02-22 | 一种ffpe样本预处理液及从ffpe样本中分离单细胞的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112941009A CN112941009A (zh) | 2021-06-11 |
| CN112941009B true CN112941009B (zh) | 2024-03-01 |
Family
ID=76245193
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110197602.0A Active CN112941009B (zh) | 2021-02-22 | 2021-02-22 | 一种ffpe样本预处理液及从ffpe样本中分离单细胞的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112941009B (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2006332680A1 (en) * | 2005-12-29 | 2007-07-12 | Anthrogenesis Corporation | Improved composition for collecting and preserving placental stem cells and methods of using the composition |
| CN103725672A (zh) * | 2013-10-29 | 2014-04-16 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 一种从福尔马林固定石蜡包埋组织中共分离dna和rna的试剂盒及方法 |
| CN105018598A (zh) * | 2015-06-05 | 2015-11-04 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 一种ffpe样本的fish预处理方法以及预处理液 |
| CA3072463A1 (en) * | 2017-08-18 | 2019-02-21 | Fluidigm Corporation | Methods and kits for extracting nucleic acids from paraffin embedded samples |
| CN109554345A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-04-02 | 新格元(南京)生物科技有限公司 | 一种将人胰腺癌组织分散为单个活细胞的消化液及其方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6428785B1 (en) * | 1999-10-28 | 2002-08-06 | Immunolytics Inc. | Method and composition for treating prostate cancer |
| KR101940657B1 (ko) * | 2017-04-24 | 2019-01-21 | (주) 노보믹스 | 위암의 생물학적 특성에 기반한 군 구분 및 예후 예측 시스템 |
-
2021
- 2021-02-22 CN CN202110197602.0A patent/CN112941009B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2006332680A1 (en) * | 2005-12-29 | 2007-07-12 | Anthrogenesis Corporation | Improved composition for collecting and preserving placental stem cells and methods of using the composition |
| CN103725672A (zh) * | 2013-10-29 | 2014-04-16 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 一种从福尔马林固定石蜡包埋组织中共分离dna和rna的试剂盒及方法 |
| CN105018598A (zh) * | 2015-06-05 | 2015-11-04 | 厦门艾德生物医药科技有限公司 | 一种ffpe样本的fish预处理方法以及预处理液 |
| CA3072463A1 (en) * | 2017-08-18 | 2019-02-21 | Fluidigm Corporation | Methods and kits for extracting nucleic acids from paraffin embedded samples |
| CN109554345A (zh) * | 2018-11-21 | 2019-04-02 | 新格元(南京)生物科技有限公司 | 一种将人胰腺癌组织分散为单个活细胞的消化液及其方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Genome-wide Spatial Expression Profiling in FFPE Tissues;Villacampa et al.;bioRxiv;第1-38页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112941009A (zh) | 2021-06-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2022009735A (ja) | 固定生物学的試料から生体分子を抽出するためのターゲット細胞または組織を決定するための方法 | |
| JP6608280B2 (ja) | 生物学的試料の安定化 | |
| EP1330518B1 (en) | Method for collecting and using nuclear mrna | |
| US20060166258A1 (en) | Preservation of RNA in a biological sample | |
| CN108300688B (zh) | 原代肝细胞分离和培养方法 | |
| WO2005012879A2 (en) | Methods and compositions for preparing tissue samples for rna extraction | |
| CZ2013456A3 (cs) | Způsob separace sporadických buněk z tělních tekutin a zařízení pro provádění tohoto způsobu | |
| CN113293196A (zh) | 适用于冷冻组织的单细胞核提取方法 | |
| CN111808815A (zh) | 一种胃癌实体瘤原代细胞的培养方法 | |
| CN112280828A (zh) | 一种降低单细胞扩增偏倚性的离体组织细胞核分离方法 | |
| CN112941009B (zh) | 一种ffpe样本预处理液及从ffpe样本中分离单细胞的方法 | |
| Nijssen et al. | Axon-seq for in Depth Analysis of the RNA Content of Neuronal Processes | |
| CN111504742A (zh) | 一种基于激光显微切割技术的骨组织细胞收集方法 | |
| CN113322314B (zh) | 一种新型组织单细胞空间转录组技术 | |
| CN116287115A (zh) | 一种获得单细胞或单细胞核样本的方法、使用其获得的样本及应用 | |
| CN116496988A (zh) | 一种人肺腺鳞癌pd1抗体获得性耐药原代细胞株及其应用 | |
| CN105624304A (zh) | 一种牙鲆幼鱼性腺mRNA原位杂交的方法 | |
| CN113025688A (zh) | 一种基于定制的纳米孔直接RNA测序逆转录接头检测全长非poly(A)转录本的方法 | |
| Strable et al. | Detecting spaciotemporal transcript accumulation in maize by RNA in situ hybridization | |
| CN111349603A (zh) | 一种乳腺癌临床穿刺样本的解离方法 | |
| WO2015119107A1 (ja) | がん細胞の取得方法 | |
| CN118209351A (zh) | 一种用于荧光原位杂交的含红细胞的石蜡组织切片的处理方法及应用 | |
| CN115466714A (zh) | 一种适用于小鼠肝脏单细胞测序的低温解离方法 | |
| Rouco et al. | Temporal constraints on enhancer usage shape the regulation of limb gene transcription | |
| Yang et al. | Benchmark for establishment of organoids from gastrointestinal epithelium and cancer based on available consumables and reagents |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |