WO2015119107A1 - がん細胞の取得方法 - Google Patents

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WO2015119107A1
WO2015119107A1 PCT/JP2015/052973 JP2015052973W WO2015119107A1 WO 2015119107 A1 WO2015119107 A1 WO 2015119107A1 JP 2015052973 W JP2015052973 W JP 2015052973W WO 2015119107 A1 WO2015119107 A1 WO 2015119107A1
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WO
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cancer
cells
cancer cells
tissue
minutes
Prior art date
Application number
PCT/JP2015/052973
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English (en)
French (fr)
Inventor
宮川　功
聖子 河村
昶運 小林
Original Assignee
倉敷紡績株式会社
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity

Definitions

  • the present invention relates to a method for obtaining cancer cells. More specifically, this invention relates to the acquisition method of the cancer cell used for the method of evaluating the anticancer effect
  • anticancer drugs may act on normal cells and show strong side effects, the response rate of anticancer drugs is less than 50% except for some cases. It is known that it varies greatly from patient to patient. Therefore, it is required to avoid unnecessary administration of ineffective anticancer drugs, reduce the physical and economic burden on patients, and avoid loss of treatment opportunities. Therefore, the importance of anticancer drug susceptibility testing that evaluates whether anticancer drugs to be administered are effective for cancer patients before they are treated with anticancer drugs. Is expensive.
  • Anticancer drug susceptibility testing is typically performed after cancer tissues removed by surgery or the like are grown in vitro and then various anticancer drugs are applied to evaluate the survival of cancer cells. .
  • anticancer drug susceptibility tests include the SDI method, the HDRA method, the CD-DST method, and the ATP method.
  • the CD-DST method is described in Patent Documents 1 to 11 and the like, and its high technology is shown, but it is still an unstable technology for handling at a practical level.
  • In order to perform accurate evaluation in these anticancer drug sensitivity tests it is necessary to proliferate cancer cells in good condition.
  • the cancer tissue is generally composed of a substance composed of proliferating cancer cells and an interstitium composed of an extracellular matrix such as collagen fibers and fibroblasts that produce them, glycoproteins, mucopolysaccharides and the like. Composed.
  • the hardness of cancer tissue varies, and when it is rich in stroma such as collagen fibers, it becomes hard, and when it is rich in parenchymal cells, it becomes soft.
  • the tissue is minced to a paste with a razor or the like, and then treated with an enzyme to digest the extracellular matrix and perform tissue dispersion.
  • An object of this invention is to provide the method which can acquire the cancer cell used for an anticancer agent sensitivity test in a state with less damage than the conventional method irrespective of the kind of cancer.
  • the cancer tissue is physically minced into a paste with a razor or the like to cut the stroma and expose the cells. Increases the efficiency of digestion reaction.
  • tumor cells could not be cultured properly in the subsequent steps.
  • this mince treatment damages the cancer cells themselves, damages the cells due to the depletion of the medium, and damages. It was found that the leakage from the cells had an adverse effect on the subsequent culturing process, which was the reason why the culture could not be performed properly.
  • the present inventors conducted further diligent studies. Unlike the conventional method, the present inventors perform chemical crushing, then physically crush the tissue, and then perform chemical crushing again. Thus, it has been found that cells with little damage can be obtained regardless of the type of cancer. More specifically, in the method of the present invention, first, chemical treatment such as enzyme treatment is performed, the stroma is decomposed to some extent, and after the stroma is loosened, the tissue is again subjected to physical crushing treatment such as pipetting. Crushing, and crushing by a process including chemical treatment such as enzyme treatment again. In the method of the present invention, it is not necessary to perform the mince treatment, and it can be taken out while maintaining the cell clump. Further, all the processes after the shredding process can be performed in the medium, and damage due to the depletion of the medium can be prevented. Thereby, it is considered that cancer cells can be efficiently extracted while reducing damage.
  • chemical treatment such as enzyme treatment
  • the present invention is a method for obtaining cancer cells used in a method for evaluating an anticancer action of a drug against cancer cells, (A) a step of chemically crushing a sample derived from cancer tissue that has undergone shredding, (B) an acquisition method, comprising: a step of physically crushing a sample obtained in step (a); and a step of (c) chemically crushing the sample obtained in step (b). Is to provide.
  • this invention provides the method as described in a 1st aspect further including the process of crushing the sample obtained by the process (c) as a process (d) in a 2nd aspect further. Is.
  • the present invention provides the first aspect or the second aspect, wherein the sample derived from the cancer tissue that is chemically crushed in the step (a) is not subjected to the mince treatment. This method is provided.
  • the chemical disruption in the steps (a) and (c) is a treatment with a composition containing an enzyme.
  • the method described in 1. is provided.
  • the present invention provides the method according to any one of the first to fourth aspects, wherein in the fifth aspect, the chemical disruption in the step (a) is performed for 10 minutes to 60 minutes. To do.
  • the present invention provides the method according to any one of the first to fifth aspects, wherein the physical disruption in the step (b) is gently performed for 10 seconds to 3 minutes. Is to provide.
  • the present invention also provides the method according to any one of the first to sixth aspects, wherein in the seventh aspect, the chemical disruption in the step (c) is performed for 10 minutes to 60 minutes. To do.
  • the present invention further includes a step of culturing the sample obtained in step (c) or (d) on a support to obtain cells attached to the support.
  • the method according to any one of the first aspect to the seventh aspect is provided.
  • the present invention provides a method for evaluating the anticancer action of a drug against cancer cells, which is obtained by the method according to any one of the first to eighth aspects.
  • a method comprising the steps of culturing cancer cells and allowing a drug to act on the cultured cancer cells.
  • the present invention in the tenth aspect, is a method for evaluating an anticancer action of a drug against cancer cells, which is obtained by the method according to any one of the first aspect to the eighth aspect.
  • the method comprises the steps of embedding the cultured cancer cells in a droplet gel and culturing, and allowing a drug to act on the cultured cancer cells.
  • cells that can be appropriately cultured can be obtained from a sample derived from a cancer tissue regardless of the type of cancer in the cell culturing step used in the anticancer drug sensitivity test. .
  • cells that can be subjected to anticancer drug sensitivity tests with high probability.
  • the time required for the tissue dispersion processing can be shortened as compared with the prior art, an effect of shortening the time when a large amount of tests are performed can be expected.
  • the present invention provides a method for obtaining cancer cells.
  • Acquired cancer cells are used for a drug sensitivity test for cancer cells.
  • the kind of sensitivity test using the cells obtained through the present invention is not particularly limited, it is preferably a test in which three-dimensional culture is performed.
  • the test for performing three-dimensional culture includes, for example, evaluating the results of culturing cancer cells in a droplet gel in which cancer cells are embedded. More preferably, the sensitivity test is a CD-DST method.
  • the type of cancer tissue used in the method of the present invention is not particularly limited. Examples include solid cancers such as digestive organ cancer, head and neck cancer, breast cancer, lung cancer, cancerous chest / peritonitis, cervical cancer, endometrial cancer, ovarian cancer and the like.
  • the method of the present invention is particularly suitable for hard cancer.
  • Examples of the sample derived from cancer tissue include all or part of a surgical material, all or part of a biopsy sample, and the like.
  • the surgical material for example, a tissue removed at the time of surgical resection for the purpose of treatment can be used.
  • tissue collected by test excision and test puncture by a minimally invasive collection method.
  • tissues collected by the minimally invasive sampling method include various biopsy samples, thoracoscopic or laparoscopic materials, ascites, and samples obtained from pleural effusion.
  • the sample may be subjected to mechanical separation processing such as shredding processing using scissors, tweezers, a razor or the like after collection from a living body.
  • the sample may be washed using a washing solution containing a medium component or an antibiotic.
  • the method for obtaining cancer cells of the present invention includes a step of chemically crushing a sample derived from cancer tissue as step (a).
  • the sample to be chemically crushed in step (a) is preferably subjected to shredding treatment.
  • shredding treatment By using the sample that has been subjected to the shredding process in the step (a), the amount of collected cells to be collected can be improved.
  • the cell recovery rate tends to be remarkably improved.
  • a sample derived from a cancer tissue that has undergone shredding can be obtained using a cutting instrument such as scissors, tweezers, and razor after collection from a cancer patient.
  • a sample derived from a cancer tissue that has been subjected to shredding treatment is preferably a 1 mm to 10 mm square, more preferably a 2 mm to 8 mm square, and even more preferably a 3 mm to 5 mm square minced tissue.
  • it is 80% by weight or more, more preferably 90% by weight or more, and still more preferably 95% by weight or more in the cancer tissue-derived sample subjected to the cutting treatment.
  • the sample that is chemically crushed in the step (a) is preferably a sample that has not been subjected to mince treatment.
  • a sample that has not been subjected to the mince treatment cancer cells that are less damaged and that proliferate appropriately in the subsequent culture step can be obtained.
  • the stromal tissue of the cancer tissue is decomposed, the binding force of the whole tissue is relaxed, and the subsequent physical crushing can be performed with a small physical force. Even when a sample that has not been treated is used, a sufficient amount of cancer cells can be obtained regardless of the type of cancer tissue.
  • Step (a) may not be performed in the presence of a culture medium, or may be performed in the presence of a culture medium. It is preferable to perform the step (a) in the presence of a medium because it is possible to prevent damage to cancer cells due to the depletion of the medium.
  • the state and type of the medium are not particularly limited as long as it is used for culturing, proliferating, and storing cancer cells.
  • the medium is a liquid medium.
  • An example of a preferable medium is DF culture solution (DF: mixed culture solution of 1 volume of Dulbecco's Modified Eagle (DME) culture medium and 1 volume of Ham'sF12 culture medium).
  • the time of the step (a) is not particularly limited. It is possible to take a longer time than the conventional method, or to shorten it. Preferred examples of the time of step (a) include 10 minutes to 120 minutes, 10 minutes to 60 minutes, 10 minutes to 30 minutes, and the like. More preferably, the time of step (a) is 10 minutes to 60 minutes.
  • the chemical disruption in step (a) refers to a process of chemically decomposing cell stroma and exposing cancer cells.
  • the chemical disruption in step (a) is performed by treatment with a composition containing an enzyme.
  • the enzyme contained in the composition examples include proteases such as collagenase, dispase, elastase, thermolysin and trypsin, nucleolytic enzymes such as deoxyribonuclease, and hyaluronidase. These enzymes may be used alone or in combination.
  • the composition comprises collagenase.
  • collagenase any of those derived from Clostridium or actinomycetes may be used.
  • the collagenase may be purified at any degree, but preferably contains a crudely purified collagenase.
  • the enzyme activity can be appropriately adjusted by those skilled in the art in consideration of the type of cells, the time required for treatment, and the like.
  • the treatment time with the enzyme-containing composition is not particularly limited.
  • Examples of preferable treatment time include 10 minutes to 120 minutes, 10 minutes to 60 minutes, 10 minutes to 30 minutes, 15 minutes to 30 minutes, and the like.
  • the temperature of treatment with the composition containing the enzyme can be appropriately adjusted by those skilled in the art depending on the enzyme used. Examples of preferable treatment temperatures include 30 ° C. to 40 ° C. and 32 ° C. to 38 ° C.
  • the treatment with the composition containing the enzyme can loosen interstitial bonds, and can effectively expose cancer cells from a sample of cancer tissue without subsequent paste formation. Therefore, even if the target cancer is a hard cancer with a hard stromal tissue, there is no need for a powerful physical treatment to make a paste, Less cancer cells can be obtained.
  • the method of the present invention includes a step of physically crushing the sample obtained in step (a) as step (b).
  • physical crushing may use a blade such as a razor, it can be performed without using a blade such as a razor.
  • it can be performed by pipetting or mixing using an apparatus.
  • Physical crushing by pipetting can be performed by pipetting using a disposable pipette or the like. More specifically, physical crushing by pipetting can be performed by putting a sample in a container such as a centrifuge tube and pipetting a plurality of times, for example, 10 to 20 times.
  • physical crushing by mixing can be performed by performing mixing using an automatic disperser. More specifically, the physical crushing by mixing can be performed for 10 seconds to 3 minutes, preferably 30 seconds to 2 minutes, by changing the rhythm using a program of the apparatus.
  • the interstitial tissue of the sample is decomposed by the chemical disruption in step (a), and the binding force of the entire tissue is loosened. Therefore, the physical force used in step (b) is Can be relatively weak. By weakening the physical force, damage to the cancer cells can be reduced, and the acquisition efficiency of cancer cells that proliferate appropriately in the subsequent culture process can be increased.
  • it is not necessary to perform the mince process and the physical force may be weak, so that the tissue dispersion process of the sample can be completed in a short time. Furthermore, since the mince process is essential in the conventional process, it has to be performed manually and cannot be automated.
  • the step (b) of the present invention may be performed manually, but a desired result can be obtained even if it is not performed manually. Therefore, the process (b) of the present invention can be performed as an automatic process for a large amount of sample, and it can be expected to further shorten the processing time.
  • the physical disruption in the step (b) may be performed in the presence of a composition containing the enzyme used for the chemical disruption in the step (a), a medium, or the like.
  • the process of step (a) and the process of step (b) can be performed in the same reaction vessel, and the method of the present invention can be performed more simply and in a short time.
  • the method of the present invention includes a step of chemically crushing the sample obtained in step (b) as step (c).
  • the chemical crushing in step (c) is the same processing as the processing in step (a) described above. Specific conditions may be the same as or different from the above-described step (a).
  • the chemical crushing in the step (c) can decompose the stroma covering the cells, weaken the binding force between the tissues in the sample, and effectively expose the cancer cells.
  • the sample to be crushed in step (c) is moderately relaxed and the cancer cells are exposed by chemical crushing in step (a) and subsequent physical crushing in step (b). Since it becomes easy, the chemical crushing in the step (c) can be completed in a relatively short time.
  • the time of the step (c) is not particularly limited. Preferred examples of the time for step (c) include 10 minutes to 120 minutes, 10 minutes to 60 minutes, 10 minutes to 30 minutes, 15 minutes to 30 minutes, and the like. More preferably, the time of step (c) is 10 minutes to 60 minutes.
  • the process temperature can be suitably adjusted by those skilled in the art according to the enzyme to be used. Examples of preferable treatment temperatures include 30 ° C. to 40 ° C. and 32 ° C. to 38 ° C.
  • the method of the present invention preferably includes a step of physically crushing the sample obtained in step (c) as step (d).
  • the physical crushing in the step (d) is the same processing as the processing in the step (b) described above. Specific conditions may be the same as or different from the above-described step (b).
  • the stromal tissue whose binding force has been weakened by the chemical disruption in step (c) is cut, and cancer cells are exposed. Since cancer cells are exposed by physical disruption in step (d), a large number of cancer cells are sampled even when chemical disruption in step (c) is performed for a relatively short time. Can be obtained from.
  • the step (d) can also play a role of shortening the chemical disruption time of the step (c) and improving the acquisition efficiency of desired cells.
  • the physical disruption in the step (d) may be performed in the presence of a composition containing the enzyme used for the chemical disruption in the step (c), a culture medium, or the like.
  • the process of step (d) and the process of step (c) can be performed in the same reaction vessel, and the method of the present invention can be performed more simply and in a short time.
  • the above-mentioned steps (a) to (c) and, if necessary, (d) may be carried out continuously, or after a certain step is completed, after several minutes to several days, the next step May be performed.
  • the time taken for the dispersion treatment of cancer cells by the method of the present invention is not particularly limited.
  • the method of the present invention can shorten the time for dispersing the cancer cells as compared with the conventional method.
  • Examples of the dispersion treatment time according to the present invention include 20 minutes to 6 hours, 20 minutes to 3 hours, 20 minutes to 2 hours, 20 minutes to 1 hour 30 minutes, 20 minutes to 1 hour, and the like.
  • the method of the present invention makes it possible to shorten the time from when a cancer cell is put into a culture medium after being shredded, compared to the conventional method.
  • the time until the cancer cells are put into the culture medium after being shredded is not particularly limited, but for example, less than 6 hours, less than 3 hours, less than 1 hour, less than 30 minutes, less than 15 minutes, Less than 5 minutes, less than 5 minutes, less than 3 minutes, less than 1 minute, and the like.
  • cancer cells with reduced damage as compared with the conventional method can be obtained.
  • cancer cells used for the anticancer drug sensitivity test can be obtained.
  • the cells obtained by the method of the present invention are cultured on a support, and the cells attached to the support are obtained, thereby obtaining cells that proliferate appropriately in the subsequent culture step. be able to.
  • the cells attached to the support can be obtained to remove stromal cells, dead cells, cells that are damaged and have poor growth properties, etc.
  • the support for culturing cancer cells may be coated with a cell adhesion factor in layers.
  • cell adhesion factors include extracellular substrates such as various types of collagen, fibronectin, laminin, vitronectin, cadherin, gelatin, peptide and integrin. These may be used alone or in combination of two or more. However, it is more preferable to use various collagens in terms of further improving cell adhesion and cell extensibility, and it is particularly preferable to use type I collagen or type IV collagen among various collagens.
  • the cell adhesion factor applied to the surface of the support may be the same as the gelling agent in the droplet gel.
  • Acquisition of cells adhered to the support can be performed, for example, by removing a culture solution containing blood cells, unnecessary cell components, etc., and then adding a cell release agent to exfoliate the cells adhered to the support. it can.
  • the cell exfoliating agent include EDTA-trypsin.
  • the cell adhered to the support may be detached by adding a release agent for the applied product when the applied product is on the support.
  • the coating material of the support is collagen
  • the release agent for the coating material is, for example, collagenase.
  • the composition containing cancer cells obtained by obtaining the cells attached to the support, can be embedded in a drop-like gel and cultured without further separation or purification. Cancer sensitivity test can be performed.
  • action can be performed with few processes, and cancer can be obtained from the sample derived from cancer tissue. Since the time required to acquire cells and start culturing can be shortened, the damage received by the cells can be further reduced and the success rate of the anticancer susceptibility test can be improved. A large number of samples can be evaluated.
  • the present invention also provides a method for evaluating the anticancer effect of a drug on cancer cells using the obtained cancer cells.
  • the method includes culturing the obtained cancer cell, and further includes causing a target drug to act on the cultured cancer cell.
  • the method includes allowing a drug to act in vitro.
  • the method includes a step of culturing the obtained cells by embedding them in a droplet gel.
  • a method for evaluating the anticancer activity of a drug against cancer cells using the cancer cells obtained by the acquisition method of the present invention (A) a step of embedding the acquired cancer cells in a droplet gel; (B) A step of bringing the droplet gel obtained in step (A) into contact with a solution containing a drug, (C) It can be performed by a method including a step of culturing cancer cells in the droplet gel after step (B), and a step of (D) evaluating the culture result in step (C).
  • Examples of the droplet gel in the above step (A) include those having a convex surface on a flat substrate.
  • An example of the volume of the droplet gel is 3 to 300 ⁇ L, 3 to 150 ⁇ L, 5 to 100 ⁇ L, 15 to 50 ⁇ L, and the like.
  • the height of the droplet gel is, for example, 2 mm or less.
  • Examples of the droplet gel include those showing a transparency of 1 to 95% transmittance with respect to 400 nm light.
  • the viscosity of the droplet gel is, for example, 50 to 2000 centipoise or 100 to 1000 centipoise from the viewpoint of achieving both easy handling and maintaining the shape of the droplet gel.
  • the droplet gel may include a gelling agent.
  • the gelling agent examples include extracellular matrix such as type I collagen and matrigel, and soft agar.
  • the content of collagen in the droplet gel is, for example, 0.1 to 2.0% by weight from the viewpoint of maintaining the shape of the droplet gel.
  • the drip gel may contain polysaccharides and other polymer materials such as extracellular matrix, medium components such as serum medium, and the like.
  • the droplet gel may be set to pH 6.2 to 7.6 or pH 6.8 to 7.4, for example, with a buffer solution or the like.
  • the salt strength or ionic strength of the droplet gel is, for example, 100 to 180 mmol, 140 to 160 mmol, or the like.
  • the embedding of cancer cells in the above step (A) is performed by, for example, mixing a solution containing a gelling agent and components such as cancer cells, ice-cooling the obtained mixture, and using a pipette. It can be carried out by dropping it on a material and leaving it at 30 to 45 ° C. for 30 minutes to 2 hours.
  • a base material is provided with the surface which can fix a droplet-like gel. Examples of the substrate include culture dishes such as Petri dishes and multi-dish; flasks and other ordinary culture containers; culture plates such as cover slips or cell disks in the form of glass or plastic flakes, and the like.
  • the base material is preferably optically transparent in that it is easy to evaluate the results of culturing cancer cells.
  • the concentration of the cancer cell in the droplet gel embedding the cancer cell is, for example, 1 to 10 7 cells / mL, preferably 10 2 to 10 6 cells / mL.
  • the drug in the above step (B) is evaluated for anticancer activity against cancer cells.
  • anti-cancer drugs that act directly on cancer cells as cancer treatment, prevention, or improvement agents, they do not attack cancer cells directly, but they are immune cells and other substances in the body. Examples include drugs that exhibit functions of suppressing the growth of cancer cells, slowing down the activity of cancer cells, and killing cancer cells by cooperative action with other drugs.
  • anticancer agents include antimetabolites such as 5-FU; irinotecan anticancer agents such as SN-38; microtubule depolymerization inhibitors such as docetaxel; platinum preparations such as cisplatin and oxaliplatin; Is mentioned.
  • Other molecules that selectively modify growth factors involved in cell growth and their receptors, as well as molecules or enzymes involved in cell growth, cell cycle, apoptosis, and their signal transduction to obtain anticancer effects examples include targeted drugs. Examples include those that act on growth factor receptors such as trastuzumab, cetuximab, and gefitinib, those that act on signal transduction of fusion genes such as imatinib and crizotinib, and those that suppress angiogenesis in cancer tissues such as bevacizumab.
  • the other drug include a prodrug of an anticancer drug, a drug that regulates intracellular metabolic enzyme activity related to metabolism of the anticancer drug or the prodrug, an immunotherapy agent, and the like.
  • the contact with the solution containing the drug in the step (B) is, for example, a solution containing the drug with respect to the drip gel on the base material so that the drip gel does not dry and become a flat dry product. It is preferable to carry out so that the whole of the droplet gel is covered with a solution containing a drug.
  • the solution containing the drug to be contacted may contain a medium such as a serum medium in addition to the drug.
  • the concentration of the drug in the solution can be arbitrarily set according to the purpose, preferably based on the drug concentration in the vicinity of the cell when the drug is administered to the living body from which the cells are derived.
  • the culture of the cancer cells in the above step (C) is preferably performed by bringing a droplet gel embedding the cancer cells into contact with a liquid medium.
  • a serum-free medium is preferable from the viewpoint of suppressing the growth of mixed fibroblasts.
  • the contact with the liquid medium is preferably performed by covering the entire droplet gel with the liquid medium so that the droplet gel is not dried.
  • the culture period is, for example, 1 to 10 days, preferably 3 to 8 days.
  • the droplet gel brought into contact with the liquid medium may be one obtained by washing and removing the drug by washing after the contact with the solution containing the drug.
  • the evaluation of the culture result in the above step (D) is performed, for example, by comparing the number of viable cancer cells before and after the culture, or without adding the drug and the number of viable cells when cultured with the drug added. This is done by comparing the number of viable cells when cultured.
  • the number of viable cancer cells can be measured by visual observation with a microscope.
  • the number of viable cancer cells may be measured by performing a staining method that selectively stains living cells and measuring the color developed by staining.
  • Staining methods that selectively stain living cells include staining methods that use phagocytosis of cells such as neutral red staining method, latex particle staining method, and staining using intracellular enzyme activity such as fluorescein diacetate staining method.
  • the stained cancer cells may be fixed by formalin fixation or the like. Thereby, elution of a dyeing agent can be prevented temporarily and highly sensitive dyeing can be performed.
  • the droplet gel after dyeing may be dried. Thereby, alteration and deterioration can be prevented.
  • the drip gel can be dried by, for example, air drying or forced drying by heating at about 10 to 50 ° C.
  • the measurement of color development by staining may be performed by photographing the dyed droplet gel and digitizing and evaluating the photographed image. Evaluation after digitization may include numerical correction based on the shape of the stained cell image. Cancer cells form massive and dark images, and fibroblasts tend to form thin and thin images. Surviving cancer cells can be corrected by selecting the numerical values of the massive stained images. Can be measured more accurately and conveniently.
  • Collagenase activity measuring method The collagenase activity in this specification is measured by the following method for measuring FALGPA degradation activity.
  • Reagent B 50 mM Tricine, 10 mM CaCl 2 , 400 mM NaCl, pH 7.5 (25 ° C.)
  • Reagent D Distilled water (D) Reagent E Enzyme solution: Dissolve the enzyme in distilled water so that the concentration is 5 to 10 times that used.
  • Reagent composition and operation of reaction solution 2.9 mL of Reagent B is placed in a 1 cm optical path length cell and warmed to 25 ° C. When A345 nm stabilizes, add 0.1 mL of reagent C (blank test) or reagent D (main test), mix immediately, and record the decrease in A345 nm for 5 minutes at 25 ° C.
  • FALGPA unit is obtained by the following equation.
  • FALGPA units / mL ⁇ (E1-E2) ⁇ 3 / (F ⁇ 0.1) ⁇ / 0.53
  • Reference example 1 In the conventional method, specimen washing, tissue shredding, tissue mince treatment, tissue dispersion, recovery, pre-culture, and cell recovery are performed according to the procedures shown in 1 to 7 below.
  • Gastrointestinal cancer such as gastric cancer, colon cancer, pancreatic cancer, breast cancer, lung cancer, head and neck cancer, cancerous chest / peritonitis, cervical cancer, endometrial cancer or ovarian cancer in cancer patients
  • a medium solution to which an antibiotic is added is added. Rinse the specimen thoroughly in the specimen washing solution of the first dish. The specimen is transferred to the second and third dishes, and the cleaning operation is performed.
  • the specimen cleaning solution used was based on pentocilin (Toyama Chemical Co., Ltd., for injection of pentocillin) in DF culture solution (DF: mixed culture solution of 1 volume of Dulbecco's Modified Eagle (DME) culture medium and 1 volume of Ham'sF12 culture medium).
  • DF mixed culture solution of 1 volume of Dulbecco's Modified Eagle (DME) culture medium and 1 volume of Ham'sF12 culture medium.
  • DME Dulbecco's Modified Eagle
  • Tissue mince processing The minced specimen is minced on a dish using a razor blade sandwiched between needle holders until the minced tissue becomes a paste.
  • scissors, tweezers, and needle holders are washed with 70% ethanol, and are used repeatedly by burning with a burner.
  • 20 mL of DF culture solution is added to the minced cancer tissue, and the tissue is collected together with the DF culture solution in a 50 mL centrifuge tube. Further, 10 mL of DF culture solution is added to sufficiently collect the tissue attached to the culture dish. Centrifuge for 3 minutes at 400 ⁇ g in a tabletop centrifuge.
  • tissue dispersion enzyme composition adjusted to a concentration 10 times the prescription concentration is added to prepare a tissue dispersion solution of the prescription concentration.
  • 10% FBS FBS is fetal bovine serum
  • the composition of the tissue-dispersing enzyme to be added is adjusted so that the enzyme activity value after adjustment is collagenase activity 0.01 to 15 U / mL, preferably 0.03 to 10 U / mL.
  • Pre-culture The cells obtained by the collection process are collected by centrifugation, and the supernatant is removed by aspiration.
  • the cell sediment after centrifugation is suspended in 5 mL of the preculture medium (PCM-1) of the ply master kit (manufactured by Kurashiki Boseki Co., Ltd.).
  • the PCM-1 culture solution in which the cells are suspended is seeded into a collagen gel flask. Leave in a CO 2 incubator and culture overnight. After overnight culture, the culture medium containing blood cells and unnecessary cell components is removed by suction. Tumor cell engraftment on collagen gel flasks is observed.
  • Cell recovery The culture solution in the collagen gel flask is removed by suction, 5 mL of DF culture solution is added and washed, and then 2 mL of DF culture solution is added. Further, 0.2 mL of the tissue dispersing enzyme composition adjusted to 10 times the prescription concentration is added to adjust the prescription concentration enzyme solution. Shake at 37 ° C. for 15-30 minutes to dissolve the collagen gel in the flask. Cells detached from the collagen gel flask are collected into a 50 mL centrifuge tube. If cell adhesion to the flask is observed, add 3 mL of EDTA-trypsin and shake for 5 minutes.
  • Example 1 Tissue-dispersed specimen washing and shredding treatment by hand
  • the cancer tissues of non-small cell lung cancer, stomach cancer and colorectal cancer were excised as specimens, and specimens were washed according to Procedure 1 of Reference Example 1 above.
  • the washed specimen was chopped into 3 to 5 mm squares according to Procedure 2 in Reference Example 1 above.
  • reaction solution mixture of 4.5 mL of DF medium and 0.5 mL of enzyme solution
  • the enzyme solution was prepared to have a collagenase activity of 0.31 U / mL.
  • the contents were stirred by pipetting 10-20 times using a 5 mL disposable pipette. After stirring, enzyme digestion and stirring were repeated again at 37 ° C. for 30 minutes.
  • EDTA solution was added to stop the enzyme reaction. Thereafter, the cell mass was sedimented by centrifugation, and the enzyme solution was removed.
  • Example 2 Tissue-dispersed specimen washing and shredding using an apparatus
  • Non-small cell lung cancer, gastric cancer and colon cancer cancer tissues were respectively removed as specimens, and specimens were washed according to Procedure 1 of Reference Example 1 above.
  • the washed specimen was chopped into 3 to 5 mm squares according to Procedure 2 in Reference Example 1 above.
  • Tissue dispersion treatment Cells were collected in the same manner as in Example 1 except that tissue dispersion treatment was performed for each cancer tissue using a gentleMACS Dissociator (Miltenyi Biotech). Details of the organization distribution processing by “gentleMACS Dissociator” are as follows. Immediately after shredding, 5 mL of the same reaction solution as in Example 1 was added to 0.3 g of the tissue piece, recovered in C tube of the dedicated kit, and subjected to enzyme treatment at 37 ° C. for 30 minutes. After processing, C tube was set in the gentleMACS Dissociator and mixed for 30 seconds. This loosens the tissue that has been digested to some extent and exposes the undigested tissue. After mixing, enzyme treatment was further performed at 37 ° C. for 30 minutes. After the treatment, C tube was further set in the gentleMACS Dissociator and mixed for 30 seconds. EDTA solution was added to stop the enzyme reaction. Thereafter, the cell mass was sedimented by centrifugation, and the enzyme solution was removed.
  • Comparative Example 1 Using the cancer tissues of non-small cell lung cancer, stomach cancer and colon cancer as specimens, cells were collected according to the procedures 1 to 7 of Reference Example 1.
  • Comparison of required time Table 4 below shows the time required for cleaning the specimen, mincing the tissue, mincing the tissue, dispersing the tissue, and collecting in Comparative Example 1 and Examples 1 and 2.
  • Tissue pieces of 3 to 5 mm square that have been subjected to tissue shredding by the method described in Reference Example 1 and 2 are disassembled into two groups, and the tissue dispersion process described in Comparative Example 1 and Examples 1, 2 The tissue dispersion treatment described in 1. was performed. After the dispersion treatment, cancer cells were collected by the method described in Reference Example 1-5, pre-cultured overnight by the method described in Reference Example 1-6, and then subjected to the method described in Reference Example 1-7. The cells were collected and the number of viable cells was measured by trypan blue staining.
  • the tissue weight in the table indicates the weight per group of cancer tissues used to collect cells. Comparison of the number of recovered cells shows a value obtained by dividing the number of cells of Examples 1 and 2 of the same specimen by the number of cells of Comparative Example 1. Unlike the number of cells in the collected paste-like tissue piece, the number of cells that have not been damaged can be more accurately measured by measuring the number of cells immediately after the pre-culture. In addition, about the comparison, it compared by the data immediately after preliminary culture. The reason for not checking the collected cells is that it cannot be determined whether the collected cells are damaged.

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Abstract

　本発明は、がん細胞を用いる抗がん作用の評価方法における培養工程で適切に培養できる細胞を、がんの種類によらずに、短時間で十分に取得することを目的とする。本発明は、がん細胞に対する薬剤の抗がん作用を評価する方法に用いるがん細胞の取得方法であって、 （ａ）細切処理を受けたがん組織由来の試料を化学的に破砕する工程、 （ｂ）工程（ａ）により得られた試料を物理的に破砕する工程、および （ｃ）工程（ｂ）により得られた試料を化学的に破砕する工程 を含むことを特徴とする、取得方法を提供する。

Description

がん細胞の取得方法
　本発明は、がん細胞の取得方法に関する。より具体的には、本発明は、がん細胞に対する薬剤の抗がん作用を評価する方法に用いるがん細胞の取得方法に関する。
　抗がん剤は、正常細胞にも作用して強い副作用を示す場合があるものの、抗がん剤の奏効率は、一部を除いて５０％に満たず、抗がん剤の効き具合は、患者によって大きく異なることが知られている。したがって、効かない抗がん剤の不要投与を避け、患者の身体的、経済的負担を減らし、治療機会の逸失を避けることが求められる。このため、がん患者が抗がん剤の投与による治療を受ける前に、投与を予定する抗がん剤が、そのがん患者に効くかどうかを評価する抗がん剤感受性試験の重要性は高い。
　抗がん剤感受性試験は、典型的には、手術などで摘出したがん組織を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで増殖させた後、各種抗がん剤を作用させ、がん細胞の生死を評価して行う。
　抗がん剤感受性試験は、ＳＤＩ法、ＨＤＲＡ法、ＣＤ－ＤＳＴ法、ＡＴＰ法などが挙げられる。例えば、ＣＤ－ＤＳＴ法は、特許文献１～１１などに記載されており、その高い技術が示されているが、実用レベルで扱うにはまだ不安定な技術である。これらの抗がん剤感受性試験において正確な評価を行うためには、がん細胞を良好な状態で増殖させることが必要である。臨床検査として実用レベルで扱うには、確実に細胞培養を完遂させること、腫瘍量の少ない生検であっても抗がん剤感受性試験を行えるに必要な細胞量を確保できること、多検体を同時に評価できることが求められる。
特許２８７９９７８号公報 特開平３－２８５６９６号公報 特開平７－３１４７０号公報 特開平７－２４１１９０号公報 特開平１０－１１５６１２号公報 特開２００３－９８５３号公報 特開２００８－１１７９７号公報 特開２００５－９５０５８号公報 特開２０１０－２２７０８８号公報 特開２０１１－１１５１０６号公報 国際公開第２０１１／０９００６８号
　抗がん剤感受性試験の前工程として、がん組織からがん細胞を抽出する組織分散工程が必須である。ここで、がん組織は一般的に、増殖するがん細胞からなる実質と、コラーゲン線維などの細胞外基質やそれらを産生する線維芽細胞、糖タンパク、ムコ多糖類等からなる間質とで構成される。がん組織の硬さは様々であり、コラーゲン線維などの間質に富むと硬くなり、実質細胞に富むと柔らかくなる。
　従来の方法では、例えば剃刀等によって組織をペースト状になるまでミンスしてから、酵素処理をして細胞外基質を消化し、組織分散を実施している。しかし、このようなミンス処理は、間質の多少にかかわらず、細胞に直接的なダメージを与え、また培地の枯渇による乾燥などのダメージも与える。間質が多い試料の場合には、ペースト状にするまでに時間がかかることから、このダメージが深刻となる。いずれも次の培養工程で細胞を適切に培養できない場合がある。
　仮に細胞に与えるダメージを軽減するためにミンス処理を短時間で終わらせると、間質と細胞との分離が不十分であり、次の培養工程で細胞が適切に培養できない場合がある。
　本発明は、抗がん剤感受性試験に用いるがん細胞を、がんの種類によらずに、従来法よりもダメージの少ない状態で取得できる方法を提供することを目的とする。
　従来の方法では、がん組織を物理的に剃刀等でペースト状にミンスすることによって、間質を切断して細胞を露出させるのと同時に、組織片を小さくして、次の工程で行う酵素による消化反応の効率を上げている。しかしながら、その後の工程で腫瘍細胞を適切に培養できない場合があった。本発明者らは、鋭意検討したところ、従来の方法では、このミンス処理ががん細胞そのものにダメージを与えていたこと、培地の枯渇により細胞にダメージを与えていたこと、さらに、ダメージを受けた細胞からの漏出物が、その後の培養工程に対して悪影響を与えていたことが、適切に培養できない原因であることを見出した。
　また、間質が多い試料の場合、剃刀でがん組織をミンスする時間を通常よりも多く要し、そのため細胞に与えるダメージが大きいことを見出した。さらに、剃刀等でミンス処理を行っても組織の切断が足りず、培養に適した状態の細胞の取得量が低い場合があることを見出した。
　本発明者らは、これらの知見に基づき、さらに鋭意検討したところ、従来法とは異なり、化学的な破砕処理を行い、次いで物理的に組織の破砕を行い、再度化学的な破砕処理を行うことにより、がんの種類によらずに、ダメージの少ない細胞を取得することができることを見出した。より詳細には、本発明の方法は、まず酵素処理などの化学的な処理を行い、間質をある程度分解させ、間質が緩まった後に再度、ピペッティング等の物理的な破砕処理で組織を破砕し、再度酵素処理などの化学的な処理を行うことを含む工程によって破砕を行う。本発明の方法は、ミンス処理を行わなくてもよく、細胞集塊を維持したまま取り出すことができる。また、細切処理後の全ての処理を培地内で行うことが可能であり、培地の枯渇によるダメージを防ぐことが可能である。これにより、ダメージを軽減させながら効率よくがん細胞を抽出することができるものと考えられる。
　すなわち、本発明は、第１の態様において、がん細胞に対する薬剤の抗がん作用を評価する方法に用いるがん細胞の取得方法であって、
（ａ）細切処理を受けたがん組織由来の試料を化学的に破砕する工程、
（ｂ）工程（ａ）により得られた試料を物理的に破砕する工程、および
（ｃ）工程（ｂ）により得られた試料を化学的に破砕する工程
を含むことを特徴とする、取得方法を提供するものである。
　また、本発明は、第２の態様において、さらに、工程（ｄ）として、工程（ｃ）により得られた試料を物理的に破砕する工程を含む、第１の態様に記載の方法を提供するものである。
　また、本発明は、第３の態様において、工程（ａ）において化学的に破砕されるがん組織由来の試料が、ミンス処理を受けていないものである、第１の態様または第２の態様の方法を提供するものである。
　また、本発明は第４の態様において、工程（ａ）および工程（ｃ）の化学的な破砕が、酵素を含む組成物による処理である、第１の態様～第３の態様のいずれか１に記載の方法を提供するものである。
　また、本発明は、第５の態様において、工程（ａ）における化学的な破砕が、１０分～６０分間行われる、第１の態様～第４の態様のいずれか１に記載の方法を提供するものである。
　また、本発明は、第６の態様において、工程（ｂ）における物理的な破砕が、１０秒～３分間穏やかに行われる、第１の態様～第５の態様のいずれか１に記載の方法を提供するものである。
　また、本発明は、第７の態様において、工程（ｃ）における化学的な破砕が、１０分～６０分間行われる、第１の態様～第６の態様のいずれか１に記載の方法を提供するものである。
　また、本発明は、第８の態様において、さらに、工程（ｃ）または（ｄ）により得られた試料を、支持体上で培養し、支持体に付着した細胞を取得する工程を含む、第１の態様～第７の態様のいずれか１に記載の方法を提供するものである。
　また、本発明は、第９の態様において、がん細胞に対する薬剤の抗がん作用を評価する方法であって、第１の態様～第８の態様のいずれか１に記載の方法によって取得されたがん細胞を培養し、培養されたがん細胞に薬剤を作用させる工程を含む、方法を提供するものである。
　また、本発明は、第１０の態様において、がん細胞に対する薬剤の抗がん作用を評価する方法であって、第１の態様～第８の態様のいずれか１に記載の方法によって取得されたがん細胞を滴塊状ゲルに包埋して培養し、培養されたがん細胞に薬剤を作用させる工程を含む、方法を提供するものである。
　本発明の方法によれば、抗がん剤感受性試験に用いる細胞の培養工程において、適切に培養できる細胞を、がん組織由来の試料から、がんの種類によらずに取得することができる。加えて、がん患者から取得できるがん組織が少ない場合であっても、高い確率で抗がん剤感受性試験に供し得る細胞を提供できる。また、組織分散処理に要する時間を従来よりも短縮することも可能であるため、大量に試験を行う場合の時間短縮効果も期待できる。
比較例１、実施例１、２での、予備培養後の細胞を示す写真である。写真上部の試料番号は、表５に記載の試料番号に対応する。
　本発明は、がん細胞の取得方法を提供する。取得するがん細胞は、がん細胞に対する薬剤の感受性試験に用いるものである。本発明を経て得られた細胞を用いる感受性試験の種類は特に限定されないが、好ましくは３次元培養を行う試験である。３次元培養を行う試験は、例えばがん細胞を包埋する滴塊状ゲルにおけるがん細胞の培養結果を評価することを含む。より好ましくは、感受性試験はＣＤ－ＤＳＴ法である。
　本発明の方法に供されるがん組織の種類は特に限定されない。例として、消化器がん、頭頸部がん、乳がん、肺がん、がん性胸・腹膜炎、子宮頚がん、子宮体がん、卵巣がん等の固形癌が挙げられる。本発明の方法は、特に、硬がんに適している。がん組織由来の試料としては、例えば、手術材料の全部または一部、生検試料の全部または一部などが挙げられる。手術材料として、例えば、治療を目的とした外科切除術時に摘出される組織を用いることが出来る。また、病理診断や疾病の治療および経過予後の判定などを目的として、低侵襲的採取法によって試験切除的・試験穿刺的に採取される組織を用いることが出来る。低侵襲的採取法によって採取される組織としては、各種生検試料、胸腔鏡下あるいは腹腔鏡下材料、腹水、および、胸水などから得られる試料などが挙げられる。試料は、生体からの採取後、ハサミ、ピンセットおよび剃刀等を用いた細切処理などの機械的分離処理を受けたものであってもよい。また、試料は、培地成分や抗生剤を含む洗浄液を用いて洗浄されたものであってもよい。
　本発明のがん細胞の取得方法は、工程（ａ）として、がん組織由来の試料を化学的に破砕する工程を含む。
　工程（ａ）で化学的に破砕する試料は、細切処理を受けたものであることが好ましい。工程（ａ）において細切処理を受けた試料を用いることによって、取得する細胞の回収量を向上させることができる。特に、硬がんにおいては、細切処理を用いた試料の場合は細胞の回収率が顕著に向上する傾向がある。細切処理を受けたがん組織由来の試料は、がん患者からの採取後、ハサミ、ピンセットおよび剃刀等の切断器具を用いて、取得することができる。細切処理を受けたがん組織由来の試料は、好ましくは、１ｍｍ～１０ｍｍ角の、より好ましくは、２ｍｍ～８ｍｍ角の、さらに好ましくは、３ｍｍ～５ｍｍ角の細切された組織を、細切処理を受けたがん組織由来の試料中の好ましくは、８０重量％以上、より好ましくは、９０重量％以上、さらに好ましくは、９５重量％以上含む。
　工程（ａ）で化学的に破砕する試料は、好ましくは、ミンス処理を受けていない試料である。ミンス処理を受けていない試料を用いることによって、ダメージが少なく、その後の培養工程において適切に増殖するがん細胞を取得することができる。本発明の工程（ａ）によれば、がん組織の間質組織が分解され、組織全体の結合力が緩まり、その後の物理的な破砕を、少ない物理的力によって行うことができるため、ミンス処理を受けていない試料を用いる場合であっても、がん組織の種類によらずに、十分な量のがん細胞を取得することができる。
　工程（ａ）は、培地の存在下で行われなくてもよいし、培地の存在下で行われてもよい。工程（ａ）を、培地の存在下で行うことにより、培地の枯渇によるがん細胞へのダメージを防ぐことが可能であるため、好ましい。培地は、がん細胞の培養、増殖、保存に用いられるものであれば状態、種類は特に限定されない。好ましくは、培地は液体培地である。好ましい培地の例として、ＤＦ培養液（ＤＦ：ダルベッコ変法イーグル（ＤＭＥ）培養液１容とＨａｍ'ｓＦ１２培養液１容の混合培養液）などが挙げられる。
　がん細胞へのダメージを防ぐことが可能であることから、工程（ａ）の時間は特に限定されない。従来法よりも長い時間をかけることも可能であるし、短くすることも可能である。好ましい工程（ａ）の時間の例として、１０分～１２０分間、１０分～６０分間、１０分～３０分間などが挙げられる。より好ましくは、工程（ａ）の時間は１０分～６０分間である。
　工程（ａ）における化学的な破砕は、化学的に細胞間質を分解し、がん細胞を露出させる処理のことをいう。好ましくは、工程（ａ）における化学的な破砕は、酵素を含む組成物での処理によって行われる。
　組成物に含まれる酵素としては、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、エラスターゼ、サーモライシン、トリプシンなどのプロテアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼなどの核酸分解酵素、ヒアルロニダーゼが挙げられる。これらの酵素は単独でも組み合わせても良い。好ましくは、組成物はコラゲナーゼを含む。コラゲナーゼとしては、クロストリジウム由来、放線菌由来などいずれのものを用いても良い。また、コラゲナーゼの精製度はいずれのものを用いても良いが、望ましくは粗精製のコラゲナーゼを含むことが望ましい。酵素活性は、細胞の種類、処理に要する時間などを考慮して当業者が適宜調整できる。
　酵素を含む組成物による処理時間は特に限定されない。好ましい処理時間の例として、１０分～１２０分間、１０分～６０分間、１０分～３０分間、１５分～３０分間などが挙げられる。酵素を含む組成物による処理の温度は、用いる酵素に応じて当業者が適宜調整できる。好ましい処理温度の例として、３０℃～４０℃、３２℃～３８℃が挙げられる。酵素を含む組成物による処理によって、間質の結合を緩めることができ、その後にペースト状にしなくても、がん組織の試料からがん細胞を効果的に露出させることができる。そのため、対象とするがんが硬い間質組織を持つ硬がんである場合であっても、ペースト状態とするための強力な物理的な処理が必要なく、がん組織によらずに、ダメージの少ないがん細胞を取得することができる。
　本発明の方法は、工程（ｂ）として、工程（ａ）により得られた試料を物理的に破砕する工程を含む。物理的な破砕は、剃刀等の刃物を用いてもよいが、剃刀等の刃物を用いることなく行うことができる。例えば、ピペッティングや装置を用いたミキシング等で行うことができる。ピペッティングによる物理的な破砕は、ディスポピペット等を用いて、ピペッティングを行うことでできる。ピペッティングによる物理的な破砕は、より具体的には、試料を遠沈管等の容器に入れて、複数回、例えば１０～２０回ピペッティングを行うことでできる。また、ミキシングによる物理的な破砕は、自動分散装置を用いてミキシングを行うことでできる。ミキシングによる物理的な破砕は、より具体的には、装置のプログラムを用いてリズムを変えて、１０秒～３分間、好ましくは３０秒～２分間で行うことができる。
　本発明の方法においては、工程（ａ）の化学的な破砕によって、試料の間質組織が分解され、組織全体の結合力が緩まっているため、工程（ｂ）において用いる物理的な力は、相対的に弱くてよい。物理的な力を弱めることによって、がん細胞に対するダメージを軽減させ、その後の培養工程において適切に増殖するがん細胞の取得効率を高めることができる。また、本発明においては、ミンス処理を行う必要が無く、物理的な力が弱くてよいので、短時間で、試料の組織分散処理を終えることができる。さらに、従来の工程ではミンス処理が必須のため、人手によって行われなければならず、自動化することができなかった。本発明の工程（ｂ）は、人手によって行われてもよいが、人手によって行われなくとも、所望の結果を得ることができる。そのため、本発明の工程（ｂ）は、大量の試料を対象とする自動的な処理として行うことができ、処理時間を一層短縮することも期待できる。
　工程（ｂ）の物理的な破砕は、工程（ａ）の化学的な破砕に用いた酵素を含む組成物や、培地などの存在下で行ってもよい。この場合、工程（ａ）の処理と、工程（ｂ）の処理を、同一の反応容器において行うことができ、本発明の方法を、より簡便にかつ短時間に行うことができる。
　本発明の方法は、工程（ｃ）として、工程（ｂ）により得られた試料を化学的に破砕する工程を含む。工程（ｃ）の化学的な破砕は、上述した工程（ａ）の処理と同様の処理である。具体的な条件は上述した工程（ａ）と同じでもよいし、変えてもよい。
　工程（ｃ）の化学的な破砕によって、細胞を覆っていた間質を分解して、試料における組織間の結合力を弱め、がん細胞を効果的に露出させることができる。本発明では、工程（ａ）における化学的な破砕、およびこれに続く工程（ｂ）における物理的な破砕によって、工程（ｃ）において破砕する試料は、適度に弛緩し、がん細胞を露出しやすいものとなっているため、工程（ｃ）における化学的な破砕は、比較的短時間で終わらせることも可能である。工程（ｃ）の時間は、とくに限定されない。好ましい工程（ｃ）の時間の例として、１０分～１２０分間、１０分～６０分間、１０分～３０分間、１５分～３０分間などが挙げられる。より好ましくは、工程（ｃ）の時間は１０分～６０分間である。酵素を含む組成物による処理を行う場合、処理温度は用いる酵素に応じて当業者が適宜調整できる。好ましい処理温度の例として、３０℃～４０℃、３２℃～３８℃が挙げられる。
　工程（ｃ）の化学的な破砕を、工程（ａ）の化学的な破砕に用いた酵素を含む組成物や、培地などの存在下で、工程（ｂ）の物理な破砕に用いた反応容器中でそのまま行ってもよい。この場合、酵素を含む組成物や培地を新たに追加する時間や、反応容器を変更する時間を削減することができ、より簡便に本発明の方法を実施することができる。また、本発明の方法の全体の工程に要する時間を短縮でき、試料から得るがん細胞の受けるダメージの総量を減らすことができ、その後の培養工程において適切に増殖する細胞の取得効率を高めることができる。
　本発明の方法は、好ましくは、工程（ｄ）として、工程（ｃ）により得られた試料を物理的に破砕する工程を含む。工程（ｄ）の物理的な破砕は、上述した工程（ｂ）の処理と同様の処理である。具体的な条件は上述した工程（ｂ）と同じでもよいし、変えてもよい。本発明の方法においては、工程（ｄ）における物理的な破砕によって、工程（ｃ）の化学的な破砕によって結合力が弱まった間質組織が切断され、がん細胞が露出する。工程（ｄ）における物理的な破砕によってがん細胞の露出を行うため、工程（ｃ）における化学的な破砕が比較的短い時間しか行われない場合であっても、多数のがん細胞を試料から取得することができる。工程（ｃ）における化学的な破砕を比較的短時間で終えることにより、がん細胞に対するダメージを低減させることができ、その後の培養工程において適切に増殖する細胞の取得効率を高めることができる。このように、工程（ｄ）は、工程（ｃ）の化学的な破砕の時間を短縮し、所望の細胞の取得効率を向上させる役割をも果たし得る。
　工程（ｄ）の物理的な破砕は、工程（ｃ）の化学的な破砕に用いた酵素を含む組成物や、培地などの存在下で行ってもよい。この場合、工程（ｄ）の処理と、工程（ｃ）の処理を、同一の反応容器において行うことができ、本発明の方法を、より簡便にかつ短時間に行うことができる。
　上述の工程（ａ）～（ｃ）、および必要に応じて（ｄ）は、連続して行われてもよいし、ある工程が終了した後に、数分間～数日間おいてから、次の工程が行われてもよい。このため、本発明の方法によるがん細胞の分散処理にかかる時間は特に限定されない。ある態様において、本発明の方法により、がん細胞の分散処理の時間を従来法よりも短縮することも可能である。本発明による分散処理の時間の例として、２０分間から６時間、２０分間から３時間、２０分間から２時間、２０分間から１時間３０分間、２０分間から１時間などが挙げられる。
　本発明において、がん細胞を、細切処理後から培地に投入するまでの時間は特に限定されない。ある態様において、本発明の方法により、がん細胞を、細切処理後から培地に投入するまでの時間を従来法よりも短縮することも可能である。本発明において、がん細胞を、細切処理後から培地に投入するまでの時間は特に限定されないが、例えば、６時間未満、３時間未満、１時間未満、３０分間未満、１５分間未満、１０分間未満、５分間未満、３分間未満、１分間未満などが挙げられる。
　以上の工程（ａ）～（ｃ）、必要に応じてさらに工程（ｄ）を行う本発明の方法によって従来法よりもダメージが低減されているがん細胞を得ることができる。このがん細胞を培養して、抗がん剤感受性試験に用いるがん細胞を得ることができる。
　具体的な実施形態において、本発明の方法によって得られた細胞を、支持体上で培養し、支持体に付着した細胞を取得することによって、その後の培養工程において適切に増殖する細胞を取得することができる。支持体上で培養した際に、支持体に付着した細胞を取得することによって、試料に含まれる間質細胞や、死亡細胞や、ダメージを受けて増殖性の優れない細胞などを除去することができ、その後の培養において、薬剤感受性試験に適した状態で増殖し、高確率で抗がん作用の評価を成功し得るがん細胞を含む組成物を取得することができる。がん細胞を培養する支持体は、細胞接着因子が層状に塗布されていてもよい。細胞接着因子としては、各種タイプのコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、カドヘリン、ゼラチン、ペプチドおよびインテグリン等の細胞外基質を好ましく挙げることができ、これらは１種のみを用いても、２種以上併用してもよいが、細胞接着性や細胞伸展性がより向上するという点で、各種コラーゲンを用いることがより好ましく、各種コラーゲンの中でも、タイプＩコラーゲンやタイプＩＶコラーゲンを用いることが特に好ましい。支持体の表面に塗布する細胞接着因子は、滴塊状ゲルにおけるゲル化剤と同一でもよい。
　支持体に接着した細胞の取得は、例えば、血球、不要細胞成分などを含む培養液を除去した後、細胞の剥離剤を添加して、支持体に接着した細胞を剥離することによって行うことができる。細胞の剥離剤としては、例えば、ＥＤＴＡ－トリプシンなどが挙げられる。支持体に接着した細胞の剥離は、支持体に塗布物がある場合には、塗布物の剥離剤を添加することによって行ってもよい。支持体の塗布物がコラーゲンである場合、塗布物の剥離剤は、例えば、コラゲナーゼである。コラゲナーゼの添加によって細胞の剥離を行う場合、生細胞への作用よりも先に、生細胞が接着したコラーゲン・ゲル層自体を酵素分解することになり、生細胞への損傷が少ない。
　支持体に付着した細胞を取得することによって得られた、がん細胞を含む組成物は、その後のさらなる分離や精製を経なくても、そのまま滴塊状のゲルに包埋させて培養し、抗がん作用の感受性試験を行うことができる。このように、支持体に付着した細胞を取得することによって得られた組成物を用いれば、少ない工程によって、抗がん作用の感受性試験を行うことができ、がん組織由来の試料からがん細胞を取得し、培養を開始するまでの時間を短縮することができるため、細胞の受けるダメージを、より軽減することができ、抗がん作用の感受性試験の成功確率を向上させることができるだけでなく、大量の試料を評価することができる。
　本発明は、別の態様において、得られたがん細胞を用いて、がん細胞に対する薬剤の抗がん作用を評価する方法も提供する。当該方法は、得られたがん細胞を培養することを含み、さらに、培養されたがん細胞に対象となる薬剤を作用させることを含む。好ましくは、薬剤をｉｎ　ｖｉｔｒｏで作用させることを含む。好ましい態様において、当該方法は、得られた細胞を、滴塊状ゲルに包埋して培養する工程を含む。
　具体的な実施形態において、本発明の取得方法によって得られたがん細胞を用いるがん細胞に対する薬剤の抗がん作用を評価する方法は、
（Ａ）取得したがん細胞を、滴塊状ゲルに包埋する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）によって得られた滴塊状ゲルと薬剤を含む溶液とを接触させる工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）を経た滴塊状ゲルにおいて、がん細胞を培養する工程、および
（Ｄ）工程（Ｃ）における培養の結果を評価する工程
を含む方法によって行うことができる。
　上記の工程（Ａ）の滴塊状ゲルとしては、例えば、平面の基材上で凸表面を示す形状のものが挙げられる。滴塊状ゲルの容積の一例は、３～３００μＬ、３～１５０μＬ、５～１００μＬ、１５～５０μＬなどである。滴塊状ゲルの高さは、例えば、２ｍｍ以下である。滴塊状ゲルとしては、例えば、４００ｎｍの光に対して透過率１～９５％の透明度を示すものが挙げられる。滴塊状ゲルの粘度は、取り扱いの容易さと、滴塊状ゲルとしての形状の維持を両立させる観点から、例えば、５０～２０００センチポイズや、１００～１０００センチポイズなどである。滴塊状ゲルは、ゲル化剤を含んでよい。ゲル化剤としては、Ｉ型コラーゲン、マトリゲルなどの細胞外基質、軟寒天などが挙げられる。滴塊状ゲルにおけるコラーゲンの含有量は、滴塊状ゲルとしての形状の維持を両立させる観点から、例えば、０．１～２．０重量％である。さらに、滴塊状ゲルは、多糖類その他の細胞外基質などの高分子材料、血清培地などの培地成分などを含んでもよい。滴塊状ゲルは、例えば、緩衝液などによって、例えば、ｐＨ６．２～７．６や、ｐＨ６．８～７．４などに設定してもよい。滴塊状ゲルの塩強度またはイオン強度は、例えば、１００～１８０ｍｍｏｌや、１４０～１６０ｍｍｏｌなどである。
　上記の工程（Ａ）におけるがん細胞の包埋は、例えば、ゲル化剤を含む溶液とがん細胞などの成分を混合し、得られた混合液を氷冷し、ピペットを用いて、基材上に滴下し、３０～４５℃において３０分～２時間静置することによって行うことができる。基材は、滴塊状ゲルを固定できる表面を備えるものである。基材としては、例えば、ペトリ皿、マルチディッシュなどの培養皿；フラスコその他の通常の培養容器；ガラスやプラスチックの薄片状をなすカバースリップまたはセルディスクなどの培養プレート；などが挙げられる。基材は、がん細胞の培養結果の評価が容易である点で、好ましくは、光学的に透明である。がん細胞を包埋する滴塊状ゲルにおけるがん細胞の濃度は、例えば、１～１０７細胞／ｍＬ、好ましくは、１０２～１０６細胞／ｍＬである。
　上記の工程（Ｂ）における薬剤は、がん細胞に対する抗がん作用が評価されるものである。がんに対する治療、予防、または改善剤としては、がん細胞に直接的に作用する抗がん剤のほか、がん細胞を直接的に攻撃するのではないが、生体内の免疫細胞やその他の薬剤との協働的な作用によって、がん細胞の増殖を抑制したり、がん細胞の活動を鈍らせたり、がん細胞を死滅させたりする機能を発揮する薬剤が挙げられる。抗がん剤としては、例えば、５－ＦＵなどの代謝拮抗剤；ＳＮ－３８などのイリノテカン系抗がん剤；ドセタキセルなどの微小管脱重合阻害薬；シスプラチン、オキサリプラチンなどの白金製剤；などが挙げられる。他には、細胞増殖に関わる増殖因子およびその受容体、ならびに細胞増殖、細胞周期、アポトーシスおよびそのシグナル伝達に関わる分子または酵素などを選択的に修飾し、抗がん効果を得ようとする分子標的薬が挙げられる。例えば、トラスツズマブやセツキシマブ、ゲフィチニブなどの増殖因子受容体に作用するもの、イマチニブやクリゾチニブなどの融合遺伝子のシグナル伝達に作用するもの、ベバシズマブなどのがん組織の血管新生を抑制するものなどがある。他の薬剤としては、抗がん剤のプロドラッグ、抗がん剤もしくはそのプロドラッグの代謝に関連する細胞内代謝酵素活性を調整する薬剤、免疫療法剤などが挙げられる。
　上記の工程（Ｂ）における薬剤を含む溶液との接触は、例えば、滴塊状ゲルが乾燥して平坦な乾燥物にならないように、基材上にある滴塊状ゲルに対して、薬剤を含む溶液を重層し、薬剤を含む溶液によって滴塊状ゲルの全体を覆うようにして行うことが好ましい。接触させる薬剤を含む溶液は、薬剤の他、血清培地などの培地を含んでよい。溶液における薬剤の濃度は、好ましくは、細胞の由来する生体に対して薬剤を投与した際の当該細胞近辺における薬剤濃度を基本に目的に応じて任意に設定できる。
　上記の工程（Ｃ）におけるがん細胞の培養は、好ましくは、がん細胞を包埋する滴塊状ゲルと液体培地とを接触させて行う。接触させる液体培地としては、混入する線維芽細胞の増殖を抑制する点で、無血清培地が好ましい。液体培地との接触は、滴塊状ゲルが乾燥しないように、液体培地によって滴塊状ゲルの全体を覆うことによって行うことが好ましい。培養を行う期間は、例えば、１～１０日間、好ましくは、３～８日間である。液体培地に接触させる滴塊状ゲルは、薬剤を含む溶液との接触の後、洗浄によって、薬剤を洗浄除去したものであってもよい。
　上記の工程（Ｄ）における培養の結果の評価は、例えば、培養前後における生存がん細胞の数を比較することや、薬剤を添加して培養したときの生存細胞の数と薬剤を添加しないで培養したときの生存細胞の数を比較することによって行われる。生存がん細胞の数の計測は、顕微鏡による目視観察によって行うことができる。また、生存がん細胞の数の計測は、生細胞を選択的に染色する染色法を行い、染色による発色を測定することによって行ってもよい。生細胞を選択的に染色する染色法としては、ニュートラルレッド染色法などの細胞の食作用を利用した染色法、ラテックス粒子染色法、フルオレセインジアセテート染色法などの細胞内の酵素活性を利用した染色法、その他の蛍光試薬を用いた染色法などが挙げられる。染色後のがん細胞は、ホルマリン固定などによって固定してもよい。これにより、染色剤の溶出を一時的に防止して、感度の高い染色を行うことができる。染色後の滴塊状ゲルは、乾燥させてもよい。これにより、変質や劣化を防ぐことができる。滴塊状ゲルの乾燥は、例えば、風乾や、１０～５０℃程度の加熱による強制乾燥などによって行うことができる。染色による発色の測定は、染色後の滴塊状ゲルを、撮影し、撮影した画像を数値化して評価することによって行ってもよい。数値化後の評価は、染色された細胞の画像の形状に基づく数値の補正を含んでもよい。がん細胞は、塊状でしかも濃い画像をなし、線維芽細胞は、細い線維状で淡い画像をなす傾向があり、塊状の染色像の数値を選択する補正を行うことによって、生存するがん細胞を、より正確にかつ簡便に測定することができる。
　以下、実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例の範囲に限定されるものではない。
コラゲナーゼ活性測定方法
　本明細書におけるコラゲナーゼ活性は、以下のＦＡＬＧＰＡ分解活性測定の方法によって測定したものである。
ＦＡＬＧＰＡ分解活性測定の方法：
　以下の方法は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社のウェブサイトに掲載されている（http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/enzymatic-assay-of-collagenase-using-n-3-2furylacryloyl-leu-gly-pro-ala.html）。
（１）略語：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 （２）原理：
　コラゲナーゼの作用によりＦＡＬＧＰＡがＦＡＬとＧｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｌａに分解されるときのＦＡＬＧＰＡ由来の３４５ｎｍ吸光度（Ａ３４５ｎｍ）の減少変量を測定して活性を算出する。
（３）方法：
ａ．試薬：
（ａ）　試薬Ｂ　５０ｍＭトリシン、１０ｍＭＣａＣｌ２、４００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５（２５℃）緩衝液：
　トリシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ０３７７）０．８９６ｇ、ＮａＣｌ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ９８８８）２．３４ｇ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃ３８８１）０．１４７ｇを蒸留水８０ｍＬに溶解し、１Ｍ　ＮａＯＨ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ２５６７）、または１Ｍ　ＨＣｌ溶液（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ３１６２）にてｐＨ７．５（２５℃）に調整後、蒸留水で１００ｍＬにする。
（ｂ）　試薬Ｃ　１．０ｍＭ　Ｎ－（３－［２フリル］アクリロイル）－Ｌｅｕ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ａｌａ（ＦＡＬＧＰＡ）：
　ＦＡＬＧＰＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆ５１３５）９．６ｍｇをＡの溶液２０ｍＬに添加し、３０分以上撹拌して完全に溶解する。
（ｃ）　試薬Ｄ　蒸留水：
（ｄ）　試薬Ｅ　酵素溶液：
　使用時の５～１０倍濃度になるように、酵素を蒸留水に溶解する。
ｂ．条件：
　反応液ｐＨ＝７．５、反応温度＝２５℃、吸光度＝Ａ３４５ｎｍ、光路長＝１ｃｍ
ｃ．反応液の試薬組成および操作：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　試薬Ｂ　２．９ｍＬを１ｃｍ光路長のセルに入れ、２５℃に加温する。Ａ３４５ｎｍが安定したら試薬Ｃ（空試験）もしくは試薬Ｄ（本試験）を０．１ｍＬ添加、直ちに混合し２５℃でＡ３４５ｎｍの低下を５分間記録する。
（４）活性単位の定義と算出方法
　前記の条件下、ｐＨ７．５、２５°Ｃ、カルシウムイオンの存在下で１分間に１．０μｍｏｌｅのＦＡＬＧＰＡを加水分解する酵素量を１ＦＡＬＧＰＡ　ｕｎｉｔとする。ＦＡＬＧＰＡ　ｕｎｉｔは、以下の式によって求められる。
ＦＡＬＧＰＡ　ｕｎｉｔｓ／ｍＬ　＝　｛（Ｅ１－Ｅ２）×３／（Ｆ×０．１）｝／０．５３
上記の式中の記号または数値は、以下を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
参考例１：
　従来の方法では、以下の１～７に示す手順で、検体の洗浄、組織の細切、組織のミンス処理、組織分散、回収、予備培養、および細胞回収が行われる。
１．検体洗浄：
　がん患者における胃がん、大腸がん、膵臓がんなどの消化器がん、乳がん、肺がん、頭頸部がん、がん性胸・腹膜炎、子宮頚がん、子宮体がん又は卵巣がんなどの固形がん組織から検体を摘出する。以下のようにして、検体表面に付着する雑菌を取り除く。まず、１０ｃｍディッシュを３枚用意し、それぞれ抗生剤を加えた培地溶液（検体洗浄液）を２０ｍＬずつ入れる。検体を１枚目のディッシュの検体洗浄液中にて、検体表面を十分に濯ぎ洗いする。検体を２枚目、および３枚目のディッシュを移行させて、洗浄作業を行う。用いた検体洗浄液は、ＤＦ培養液（ＤＦ：ダルベッコ変法イーグル（ＤＭＥ）培養液１容とＨａｍ’ｓＦ１２培養液１容の混合培養液）にペントシリン（富山化学社製、ペントシリン注射用）をベースメディウムに対して終濃度１ｍｇ／ｍＬ、カナマイシン（ナカライテスク社製、硫酸カナマイシン試薬）をベースメディウムに対して濃度０．５ｍｇ／ｍＬ、アンポテリシンＢ（和光純薬社製）を、終濃度２．５μｇ／ｍＬとなるように添加したものである。
２．組織の細切処理：
　洗浄を行った検体を新しいディッシュに移し、ディッシュ上で、ハサミおよびピンセットを用いて、がん組織を３～５ｍｍ角程度となるよう手早く細切を行う。
３．組織のミンス処理：
　細切処理を行った検体を、ディッシュ上で、持針器に挟んだ剃刀刃を用いて、細切した組織をペースト状となるまでミンスを行う。なお、複数の検体を処理する場合、ハサミ・ピンセット・持針器を７０％エタノールで洗浄しバーナーで炙って繰り返し使用する。ミンスしたがん組織にＤＦ培養液を２０ｍＬ加え、ＤＦ培養液とともに組織を５０ｍＬ遠心管へ回収する。さらにＤＦ培養液を１０ｍＬ加えて、培養皿に付着した組織を十分に回収する。卓上型遠心機にて４００×ｇにて３分間の遠心を行う。
４．組織分散：
　遠心後、アスピレーションにより上清を除去する。遠心後の沈渣へＤＦ培養液を９ｍＬ添加し、遠沈管を振り混ぜて組織片をよくほぐす。処方濃度の１０倍濃度に調整した組織分散酵素組成物を１ｍＬ添加し、処方濃度の組織分散溶液を調整する。酵素組成物に応じて１０％ＦＢＳ（ＦＢＳは牛胎児血清）を添加してもよい。卓上型振とう機を使用し、３７℃恒温器内で２時間程度攪拌振盪を行う。典型的には、添加する組織分散酵素の組成は、調整後の酵素活性値が、コラゲナーゼ活性０．０１～１５Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．０３～１０Ｕ／ｍＬとなるよう調整する。
５．回収：
　ＤＦ培養液を１０ｍＬ加えて全量を２０ｍＬとし、４００×ｇにて３分間の遠心を行い、上清を除去する。上清を除去後、遠心管を軽く振り細胞をほぐし、培地を１０ｍＬ添加した後、強くピペッティングを行ない、細胞集塊を物理的にほぐす。ポアサイズ３００μｍのナイロンメッシュを用いて、細胞を含む懸濁液をろ過する。ＤＦ培養液を１０ｍＬ加え、遠心管とナイロンメッシュを十分に共洗いする。
６．予備培養：
　回収処理で得た細胞を遠心回収し、上清を吸引除去する。プライマスターキット（倉敷紡績株式会社製）の予備培養培地（ＰＣＭ－１）５ｍＬで遠心後の細胞沈渣を懸濁させる。細胞を懸濁したＰＣＭ－１培養液を、コラーゲン・ゲル・フラスコ内へ播種する。ＣＯ２インキュベーター内に静置し、一晩培養を行う。一晩培養後、血球や不要細胞成分などを含む培養液を吸引除去する。コラーゲン・ゲル・フラスコへの腫瘍細胞の生着が観察される。
７．細胞回収：
　コラーゲン・ゲル・フラスコ内の培養液を吸引除去し、ＤＦ培養液を５ｍＬ加えて洗浄後、ＤＦ培養液２ｍＬ加える。さらに、処方濃度の１０倍濃度に調整した組織分散用酵素組成物を０．２ｍＬ添加して、処方濃度の酵素溶液を調整する。３７℃で１５～３０分間振盪を行い、フラスコ内のコラーゲン・ゲルを溶解させる。コラーゲン・ゲル・フラスコから剥離した細胞を５０ｍＬ遠心管へ回収する。なお、フラスコへの細胞接着を認める場合、ＥＤＴＡ－トリプシン３ｍＬを加えて５分間振盪する。細胞の剥離を確認した後、１０％血清培地５ｍＬを加えてフラスコ内をよく共洗し、５０ｍＬ遠心管へ回収する。ＤＦ培養液を１０ｍＬ加えてメスアップ後、細胞を遠心回収する。
実施例１：手作業による組織分散
検体洗浄・細切処理
　非小細胞肺がん、胃がんおよび大腸がんのがん組織をそれぞれ検体として摘出し、上記参考例１の手順１に従い、検体洗浄した。洗浄を行った検体を、上記参考例１の手順２に従い、３～５ｍｍ角に細切した。
組織分散処理
　細切後すぐに、組織片０．３ｇに反応溶液５ｍＬ（ＤＦ培地４．５ｍＬおよび酵素液０．５ｍＬを混合したもの）を加え、１５ｍＬ容遠沈管に入れ、３７℃３０分間酵素消化した。酵素液は、コラゲナーゼ活性０．３１Ｕ／ｍＬとなるよう調製したものである。
　酵素消化後、内容物を５ｍＬのディスポピペットを用いて１０～２０回ピペッティングを行うことにより攪拌した。攪拌後、再度３７℃３０分間酵素消化、攪拌を繰り返した。
　ＥＤＴＡ溶液を添加し、酵素反応を停止した。その後、遠心分離により細胞塊を沈降させ、酵素液を除去した。
回収・予備培養・細胞回収
　上記参考例１の手順５～７に従い、細胞を回収した。
実施例２：装置を用いた組織分散
検体洗浄・細切処理
　非小細胞肺がん、胃がんおよび大腸がんのがん組織をそれぞれ検体として摘出し、上記参考例１の手順１に従い、検体洗浄した。洗浄を行った検体を、上記参考例１の手順２に従い、３～５ｍｍ角に細切した。
組織分散処理
　各がん組織につき、組織分散処理をｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（ミルテニーバイオテク社製）を用いて行う以外は、実施例１と同様にして、細胞を回収した。「ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ」による組織分散処理の詳細は以下のとおりである。
　細切後すぐに、組織片０．３ｇに実施例１と同様の反応溶液を５ｍＬ加え、専用キットのＣ　ｔｕｂｅに回収し、３７℃で３０分間酵素処理した。処理した後、Ｃ　ｔｕｂｅをｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒにセットし、３０秒間ミキシングした。このことにより、ある程度消化された組織がほぐれ、未消化の組織が露出する。ミキシング後、さらに３７℃で３０分間酵素処理した。処理した後、さらにＣ　ｔｕｂｅをｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒにセットし、３０秒間ミキシングした。ＥＤＴＡ溶液を添加し、酵素反応を停止した。その後、遠心分離により細胞塊を沈降させ、酵素液を除去した。
回収・予備培養・細胞回収
　上記参考例１の手順５～７に従い、細胞を回収した。
比較例１： 
　非小細胞肺がん、胃がんおよび大腸がんのがん組織をそれぞれ検体として用いて、参考例１の手順１～７の方法に従い細胞を回収した。
所要時間の比較
　比較例１および実施例１、２における、検体の洗浄、組織の細切、組織のミンス処理、組織分散、回収までの所要時間を以下の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　表４のＡに示すように、実施例では、培地に入れるまでノータイムであるため、細胞へのダメージが減少する。また、表４のＢに示すように、実施例では、繰り返し効率的な分散処理により酵素処理時間が短縮され、酵素による細胞へのダメージが減少する。
　このように、本発明の方法によれば、ダメージの少ない細胞を、所望により短時間で取得することができる。
細胞回収量の比較
　非小細胞肺がん、胃がんおよび大腸がんのがん組織を用いて、比較例１と実施例１、２での細胞回収量を以下の表５に示す。参考例１の１～２に記載方法で組織の細切処理を行った３～５ｍｍ角の組織片を２群に分解して、比較例１に記載の組織分散処理、および実施例１、２に記載の組織分散処理を行った。分散処理の後、参考例１の５に記載の方法によってがん細胞を回収し、参考例１の６に記載の方法にて一晩予備培養した後、参考例１の７に記載の方法にて細胞を回収し、生細胞数をトリパンブルー染色法にて測定した。
　表中の組織の重量は、細胞を回収するために用いたがん組織の１群あたりの重量を示す。回収細胞数比較は同一検体の実施例１および２の細胞数を比較例１の細胞数で除した値を示す。回収したペースト状の組織片中の細胞数と異なり、予備培養直後の細胞数を測定することにより、損傷を受けていない細胞の数を、より正確に測定することができる。
　なお、比較については、予備培養直後のデータで比較を行った。回収後の細胞で確認しない理由は、回収した細胞がダメージを受けているかが判断できないためである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　回収細胞数の相対的差異が２５%未満を同程度、２５%以上を一方が他方に対して多いとすると、表５に示すように、実施例の方法を用いた場合においては、比較例の方法を用いる場合よりも同程度もしくはそれ以上の細胞をがん組織から回収することができた。本発明の方法によって、ダメージの少ない細胞を取得することができることを示す。
予備培養後の細胞の観察
　非小細胞肺がん、胃がんおよび大腸がんのがん組織を用いて、比較例および実施例１、２で得られた予備培養後のコラーゲン・ゲル・フラスコ内に生着した細胞を光学顕微鏡を用いて観察した。結果を図１に示す。図１に示すように、実施例で得られた細胞は比較例よりも顕著な増殖が認められた。本発明の方法によって、ダメージの少ない細胞を取得することができることを示す。

Claims (10)

  1. 　がん細胞に対する薬剤の抗がん作用を評価する方法に用いるがん細胞の取得方法であって、
    （ａ）細切処理を受けたがん組織由来の試料を化学的に破砕する工程、
    （ｂ）工程（ａ）により得られた試料を物理的に破砕する工程、および
    （ｃ）工程（ｂ）により得られた試料を化学的に破砕する工程
    を含むことを特徴とする、方法。
  2. 　さらに、工程（ｄ）として、工程（ｃ）により得られた試料を物理的に破砕する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　工程（ａ）において化学的に破砕されるがん組織由来の試料が、ミンス処理を受けていないものである、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　工程（ａ）および（ｃ）の化学的な破砕が、酵素を含む組成物による処理である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　工程（ａ）における化学的な破砕が、１０分～６０分間行われる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　工程（ｂ）における物理的な破砕が、１０秒～３分間行われる、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　工程（ｃ）における化学的な破砕が、１０分～６０分間行われる、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　さらに、工程（ｃ）または（ｄ）により得られた試料を、支持体上で培養し、支持体に付着した細胞を取得する工程を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　がん細胞に対する薬剤の抗がん作用を評価する方法であって、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法によって取得されたがん細胞を培養し、培養されたがん細胞に薬剤を作用させる工程を含む、方法。
  10. 　がん細胞に対する薬剤の抗がん作用を評価する方法であって、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法によって取得されたがん細胞を滴塊状ゲルに包埋して培養し、培養されたがん細胞に薬剤を作用させる工程を含む、方法。
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