CN105400879B - lncRNAs筛选方法、ADSCs、软骨细胞诱导分化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种ADSCs成软骨分化过程中存在差异表达的lncRNAs的筛选方法、高软骨分化能力ADSCs、软骨细胞的诱导分化方法。lncRNAs筛选方法包括梯度诱导分化ADSCs成软骨细胞、对ADSCs进行lncRNAs测序、对lncRNAs测序结果进行分析等步骤。所述ADSCs所含的lncRNAs为H19、Scube3、NONRATG00281中的至少一种。所述高软骨分化能力的ADSCs被存在差异表达的lncRNAs修饰。

Description

lncRNAs筛选方法、ADSCs、软骨细胞诱导分化方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的涉及一种lncRNAs筛选方法、存在差异表达的ADSCs所含的lncRNAs、高软骨分化能力的ADSCs、软骨细胞的诱导分化方法。
背景技术
关节软骨的损伤和病变是临床常见疾病，可以发生于任何年龄和性别。由于关节软骨组织缺少血管系统，淋巴系统和神经支配，本身不含祖细胞，软骨细胞又被包围在致密细胞基质中，组织损伤后自行修复能力很差，一旦发生损伤，会导致关节肿胀和疼痛，加速骨关节炎的进展。
目前，临床上的关节软骨损伤的修复方法主要有软骨清理成形术、软骨下钻空术等关节表面重建方法，以及骨膜移植等生物治疗方法。它们对延缓关节退化和修复关节一定功能具有重要作用，但修复后的软骨组织无论在生物学还是在生物力学上均与原来的软骨有所不同，并易发生软化退变，导致疗效下降。近年来随着细胞培养技术、移植技术及生物材料科学的发展，组织工程学得到了迅速发展，为修复关节软骨缺损提供了一个新的治疗途径。软骨组织工程技术是在体外培养、扩增软骨种子细胞，并且以较高浓度将其种植于具有良好的生物相容性和降解性的支架材料上构建组织工程软骨，然后植入到组织缺损部位，完成组织的修复和重建。
种子细胞是软骨组织工程学中的基本要素之一也是首要环节，选择理想的种子细胞是组织工程学中的关键。理想的种子细胞需具备以下条件：①来源广泛、取材方便、对机体损伤少。②在体外培养中具有较强的增殖传代能力、保持良好的生物学活性和表型表达稳定。③植入体内能耐受机体免疫、高质量地修复关节软骨缺损并能保持良好的远期疗效。目前用于软骨组织工程的种子细胞主要有软骨细胞、胚胎干细胞以及间充质干细胞等。
软骨细胞由于增殖能力较低，体外培养扩增困难且极易发生去分化现象，限制了其在临床上的应用。
胚胎干细胞虽然具有高度的分化潜能，体外能诱导分化成软骨细胞，但是将胚胎干细胞应用于软骨组织工程需要解决如下问题：①保证足够细胞数目和细胞活性的同时防止其致瘤性。②影响胚胎干细胞分化的条件，提高定向分化效率以及分化可控性。③胚胎干细胞衍生物移植导致的免疫排斥。④胚胎干细胞的临床应用所面临的伦理学问题。
间充质干细胞是具有向多种细胞系分化潜能的间充质前体细胞，与其它来源间充质干细胞相比，脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)具有以下优点：①不涉及伦理问题；②取材方便，来源充足，通过抽脂术即可大量获取，对供区影响小，并发症少；③分离培养简单，容易获得，可在体外大量快速增殖；④在一系列诱导因子作用下可定向分化为软骨细胞；⑤免疫原性低，组织相容性好，能适应体内环境，ADSCs生成的软骨可以避免免疫排斥反应。
ADSCs在体外需要经过诱导才能分化为软骨细胞。这种诱导包括添加许多不同的生长因子、分化因子、激素和细胞因子。主要的有转化生长因子(TGF-β1，TGF-β3)，胰岛素样生长因子(IGF-1)，地塞米松，骨形态发生蛋白家族(BMPs)等。ADSCs向软骨细胞分化过程中的细胞内的作用机制目前还不是很清楚。目前ADSCs体外成软骨诱导分化方法还有许多需要完善的地方，主要缺点有：体外诱导分化时间长；诱导分化获得的软骨细胞成熟度不高。因此，本领域迫切需要开发出快速、高效地诱导脂肪干细胞成软骨分化的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种lncRNAs筛选方法、存在差异表达的ADSCs所含的lncRNAs和高软骨分化能力的ADSCs。以克服现有体外定向诱导分化成软骨细胞方法存在诱导分化时间长，获得的软骨细胞成熟度不高的缺陷。
本发明另一目的在于提供一种软骨细胞的诱导分化方法，以克服现有体外定向诱导分化成软骨细胞方法存在诱导分化时间长，获得的软骨细胞成熟度不高的缺陷。
为了实现上述发明目的，作为本发明的一个方面，提供了一种lncRNAs筛选方法，包括如下步骤：
将ADSCs进行定向诱导分化成软骨细胞处理，并分别取样所述定向诱导分化第X天、Y天、Z天的细胞；其中，X＜Y＜Z，且X≥0；
利用转录组学RNA-seq深度测序技术分别对所述定向诱导分化第X天、Y天、Z天的所述细胞和成熟软骨细胞进行lncRNAs测序；
利用生物信息学分析方法对所述lncRNAs测序的结果进行分析，筛选出ADSCs与成熟软骨细胞存在差异表达的lncRNAs。
作为本发明的另一方面，提供了一种ADSCs所含的lncRNAs，所述lncRNAs为H19、Scube3、NONRATG00281中的至少一种。
作为本发明的再一方面，提供了一种高软骨分化能力的ADSCs。所述ADSCs含有lncRNAs，且所述lncRNAs是由本发明lncRNAs筛选方法筛选出存在差异表达的lncRNAs或为本发明所述的ADSCs所含的lncRNAs；
其中，所述存在差异表达的lncRNAs为H19、Scube3、NONRATG00281中的至少一种。
作为本发明的又一方面，提供了一种软骨细胞的诱导分化方法，包括对本发明高软骨分化能力的ADSCs进行成软骨分化的步骤。
与现有技术相比，本发明lncRNAs筛选方法采用RNA高通量测序和生物信息学方法能有效筛选出ADSCs与成熟软骨细胞存在差异表达的特定lncRNAs，以便被作为基因修饰的研究目标，为获得具有高软骨分化能力的ADSCs提供了基础。
本发明ADSCs所含的lncRNAs为H19、Scube3、NONRATG00281中的至少一种，优选为H19。因此，采用其修饰其他该ADSCs，能获得具有高软骨分化能力的ADSCs，使得被修饰后的ADSCs具有快速高效的分化成软骨细胞，使得诱导分化获得的软骨细胞成熟度高。
本发明高软骨分化能力的ADSCs由于被本发明lncRNAs筛选方法筛选出的存在差异表达的lncRNAs或者直接采用本发明ADSCs所含的lncRNAs修饰，因此，其能在体外快速、高效地分化成软骨细胞，使得诱导分化获得的软骨细胞成熟度高。
本发明软骨细胞的诱导分化方法是以上述本发明高软骨分化能力的ADSCs为基础进行诱导分化，从而有效提高了其诱导分化成软骨细胞的速率，并提高了分化获得的软骨细胞成熟度高。
附图说明
图1为发明实施例将ADSCs成软骨诱导第0、3、7天的样本层次聚类分析及热图绘制；
图2为发明实施例筛选出的3个lncRNA在诱导第0天、3天、7天的差异表达；
图3为本发明实施例将筛选出的含lncRNA-H19的ADSCs在功能缺失性研究中成软骨诱导分化第7天的阿尔辛蓝染色结果；其中，图a.对照ADSCs；图b.RNAiH19-ADSCs；
图4为本发明实施例将筛选出的含lncRNA-H19的ADSCs在功能缺失性研究中成软骨诱导分化第7天细胞表面II型胶原表达百分比；
图5为本发明实施例将筛选出的含lncRNA-H19的ADSCs在功能获得性研究中成软骨诱导分化第7天的阿尔辛蓝染色结果；其中，图a.对照ADSCs；图b.H19-ADSCs；
图6为本发明实施例将筛选出的含lncRNA-H19的ADSCs在功能缺失性研究中成软骨诱导分化第7天细胞表面II型胶原表达百分比。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一方面，本发明实施例提供了一种lncRNAs筛选方法，包括如下步骤：
步骤S01：将ADSCs进行定向诱导分化成软骨细胞处理，并分别取样所述定向诱导分化第X天、Y天、Z天的细胞；其中，X＜Y＜Z，且X≥0；
步骤S02：利用转录组学RNA-seq深度测序技术分别对所述定向诱导分化第X天、Y天、Z天的所述细胞和成熟软骨细胞进行lncRNAs测序；
步骤S03：利用生物信息学分析方法对所述lncRNAs测序的结果进行分析，筛选出ADSCs与成熟软骨细胞存在差异表达的lncRNAs。
具体地，上述步骤S01中，将ADSCs进行定向诱导分化第X天、Y天、Z天的细胞是为了获得不同分化程度的ADSCs，这样，在该不同分化程度的ADSCs所含的lncRNAs会存在差异表达，以便便于后续步骤S02中的测序和对测序获得的数据进行生物信息分析，以便找出表达具有显著差异的lncRNAs。
在一实施例中，定向诱导分化第X天、Y天、Z天中的X为0天，Y可以为3天，Z可以为7天。当然还可以是其他梯度时间，只要是能使得导分化第X天、Y天、Z天的细胞中的lncRNAs具有显著差异即可。
另外，该步骤S01中的定向诱导分化是本领域现有常规的定向诱导分化方法。
上述步骤S02中，转录组学RNA-seq深度测序技术能有效对经定向诱导分化的细胞的RNA进行治疗检测，如有效得出各RNA样品A260/A280比值、A260/A230比值等数据。
上述步骤S03中，可以将步骤S02中的定向诱导分化第X天、Y天、Z天的所述细胞设置“诱导Y天vs X天”，“诱导Z天vs X天”，“诱导Zd vs.Y天”这3组差异表达数据模型，并对各组差异表达数据模型进行统计分析，筛选出具有统计学显著差异表达的lncRNAs。
通过分析，挑选出随着诱导天数增加表达上调的lncRNAs，因为该差异表达倍数较高lncRNAs经过后续验证是与成软骨相关的基因。
在一实施例中，挑选出随着诱导天数增加表达上调的lncRNAs为H19、Scube3、NONRATG00281中的至少一种，其中，优选为H19，因为通过筛选，H19是随着诱导天数增加表达上调的lncRNAs，也即是其随着诱导天数增加，其lncRNAs表达差异最显著，具体如下文中所述。
在进一步实施例中，为了确保筛选出的lncRNAs具体的如H19、Scube3、NONRATG00281确实是与成软骨相关的基因。在一实施例中，在上述步骤S03之后，还包括利用qRT-PCR技术对筛选出的所述lncRNAs进行验证的步骤，以验证所述lncRNAs表达差异。通过对上述步骤S03中筛选的lncRNA进行qRT-PCR验证，验证了上述步骤S03中筛选的lncRNA如H19、Scube3、NONRATG00281在ADSCs成软骨分化诱导分化过程中随着天数的增加均呈现上调表达的趋势。由此证明了上述步骤S03中筛选的lncRNA如H19、Scube3、NONRATG00281的差异表达显著。
为了进一步验证筛选出的lncRNAs具体的如H19、Scube3、NONRATG00281确实是与成软骨相关的基因，在一实施例中，在利用qRT-PCR技术对筛选出的所述lncRNAs进行验证的步骤之后，还包括对筛选出的所述lncRNAs如H19、Scube3、NONRATG00281进行成软骨分化的功能性验证的步骤。
在具体实施例中，所述功能性验证包括功能缺失性验证和功能获得性验证。
其中，一实施例中，所述功能缺失性验证方法如下：
采用RNA干扰技术沉默筛选出的所述lncRNAs对ADSCs进行修饰，获得RNAi-ADSCs，以正常ADSCs作为对照，分别将所述RNAi-ADSCs和所述正常ADSCs在体外诱导成软骨分化n1天后观察两组细胞形态和免疫组化法检测细胞表面II型胶原的表达；其中，所述0＜n1。
该功能缺失性验证方法中的RNA干扰技术可以是采用定制的RiboTM lncRNASmart Silencer特异性抑制核内。筛选出的所述lncRNAs可以是如上文所述H19、Scube3、NONRATG00281。n1可以是3、7等天数等。
另一实施例中，所述功能获得性验证方法如下：
采用慢病毒感染技术过表达所述lncRNAs对ADSCs进行修饰，获得LV-ADSCs，以正常ADSCs作为对照，分别在体外诱导成软骨分化n2天后观察两组细胞形态和免疫组化法检测细胞表面II型胶原的表达；其中，所述0＜n2，在具体实施例中，n2可以是3、7等天数。
该慢病毒可以选用本领域常用的慢病毒。慢病毒感染技术过表达所述lncRNAs对ADSCs进行修饰是指采用定制的慢病毒载体过表达含有筛选出的ADSCs细胞中的lncRNA，获得lncRNA-ADSCs，其中，lncRNA-ADSCs中的lncRNAs可以是如上文所述H19、Scube3、NONRATG00281。
通过上述功能性验证包括功能缺失性验证和功能获得性验证，进一步验证了筛选出的lncRNAs具体的如H19、Scube3、NONRATG00281确实是与成软骨相关的基因。
下面通过具体实施例对上述本发明实施例lncRNAs筛选方法进一步说明。
1.ADSCs的分离、培养、鉴定
1.1应用膨胀试剂抽脂术，在手术室无菌条件下，取腹部手术患者的腹部皮下脂肪混合液50ml，置于无菌的225ml离心管中，将离心管置于冰盒中，快速运送至GMP实验室进行实验；
1.2取225ml离心管上层的脂肪组织，转移至无菌平皿中，用眼科镊剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，眼科剪或手术刀将脂肪组织剪碎成1mm3大小组织块，用含有0.5％庆大霉素的pH值为7.2-7.4的D-Hanks缓冲液多次冲洗脂肪组织至洗出液清亮，去除残留的血液；
1.3洗涤后脂肪组织按10ml每管转移至50ml离心管，每管加入0.1％的I型胶原酶20ml，置于37℃恒温水浴振荡摇床中，150rpm振荡30min，期间振荡混匀一次，振荡结束后取出静置片刻，液面分三层，上层为油脂层，中间为未消化脂肪组织层，下层为多细胞的混合悬液层；
1.4加入20ml脂肪干细胞完全培养基终止消化，充分混匀，1500rpm离心15min，弃上层溶液，加入20ml DPBS重悬细胞洗涤一次，1000rpm离心5min；
1.5弃上清，用ADSCs完全培养基将细胞密度调整为1×105/ml，混合均匀，取5ml细胞悬液接种于包被的T25细胞培养瓶，使接种密度为2×104/cm2，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
1.6培养24h后，将培养瓶中的培养液吸出，用D-PBS缓冲液轻微冲洗细胞培养瓶，弃去未贴壁的细胞，往培养瓶中加入5ml新鲜的ADSCs完全培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
1.7细胞生长过程中，每两天更换一次新鲜的ADSCs完全培养基，细胞生长融合至80％时，胰蛋白酶消化传代。
2.RNA提取及lncRNAs测序
收集上述1中腹部脂肪标本获得ADSCs，分别传至第3代后用成软骨诱导分化培养基诱导分化，取诱导分化第0天、3天、7天的细胞(分别编号A1、A2、A3)，利用RNA提取试剂盒(Aurum Total RNA Mini Kit，BioRad，Cat.No.732-6820)分别提取3个细胞样本的总RNA并进行质量检测，结果如表1所述，该结果显示各RNA样品A260/A280比值均位于2.0左右，A260/A230>2.0，质量符合RNA-seq深度测序技术的质量要求。
表1 ADSCs成软骨诱导第0、3、7天总RNA检测结果
样品编号 A260/280比值 A260/230比值 浓度(ng/μl) 体积(μL) 质量(ng)
A1 1.97 2.18 612.88 40.00 24512.20
A2 1.92 2.21 363.76 40.00 14550.4
A3 1.94 2.08 467.99 40.00 18719.6
3.lncRNA测序数据生物信息学分析
对来自3个细胞样本lncRNA测序数据进行生物信息学分析。按照差异倍数大于2倍，P<0.01的原则挑选“诱导3天vs.0天”，“诱导7天vs.0天”，“诱导7d vs.3天”这3组差异表达数据用于后续分析。
3.1差异表达的lncRNAs分析
ADSCs诱导0、3、7天细胞内上调或下调的的lncRNAs数量见表2，差异表达阈值定义为上调和下调Fold Change≥1.5，P<0.05为差异有显著性意义。为了确定这些差异表达的lncRNAs是否在ADSCs成软骨诱导分化中起作用，还需要对数据进行进一步的处理分析。
表2 ADSCs成软骨诱导第0、3、7天呈现上调或下调的lncRNAs数量
样本 lncRNAs上调数 lncRNAs下调数
A2vs A1 562 449
A3vs A1 736 895
A3vs A2 269 654
3.2样本层次聚类分析及热图绘制
热图中每一列代表一个lncRNA，每一行代表样品，通过层次聚类，能很形象地观察出哪些基因在不同样品中表达发生变化。图1从上到下分别是ADSCs成软骨诱导第0、3、7天的lncRNAs表达热图。从图1中可以看出人ADSCs成软骨诱导分化的0、3、7天存在差异表达。
根据诱导0、3、7天差异表达倍数较高者可能是与成软骨相关的基因，挑选出差异表达倍数较高的3个随着诱导天数增加表达上调的lncRNAs进行进一步的验证，其在0、3、7天的表达值、差异表达倍数、变化趋势如表3所示。
表3筛选出的lncRNAs在不同样本中的表达情况
LncRNA名称 A1 A2 A3 差异表达倍数 变化趋势
H19 64.3598456 128.365214 260.598621 1.99-4.05 上调
Scube3 138.265492 259.325489 380.259854 1.88-2.75 上调
NONRATG00281 256.254896 325.245698 459.346952 1.27-1.79 上调
表3中的数据显示，挑选出的三种lncRNA的表达量均随着诱导天数增加而上调，诱导第7天的表达量分别是诱导第0天的4.05、2.75和1.79倍，其中H19的差异表达倍数最高(4.05)。
4.对目的lncRNAs进行qRT-PCR验证
对上述3中挑选出的3个lncRNA进行qRT-PCR验证分析，结果发现，3个样本中这3个目的lncRNA在ADSCs成软骨分化诱导0、3、7天均呈现上调表达的趋势。3个lncRNAs在各样本中的相对含量及差异表达倍数如表4、图2所示。
表4筛选出的lncRNAs在不同样本中的相对表达含量和差异表达倍数
由表4中的数据显示，挑选出的三种lncRNA在不同样本中的相对表达量均随着诱导天数增加而上调，诱导第7天的相对表达量分别是诱导第0天的3.57、2.53、2.90倍，其中H19的差异表达倍数最高(3.57)，进一步验证了表3中的实验数据，因此将H19选作本专利的目的lncRNA进行下一步的功能性验证。
5.功能性验证分析
选取差异表达倍数最高的lncRNA-H19进行成软骨分化的功能性研究，从以下两方面进行验证。
5.1功能缺失性研究
采用定制的RiboTM lncRNA Smart Silencer特异性抑制核内和胞质中的lncRNA-H19对ADSCs进行修饰，获得RNAiH19-ADSCs，以正常ADSCs细胞作为对照，分别在体外诱导成软骨分化7天后观察两组细胞形态，免疫组化法检测细胞表面II型胶原的表达。具体步骤如下：
1)接种5×105个ADSCs细胞至含有适量完全培养基的24孔板培养孔中；
2)稀释RiboTM lncRNA Smart Silencer：用30μl 1X riboFECTTMCP Buffer稀释2.5μl 20μM RiboTM lncRNA Smart Silencer储存液，轻轻混匀；
3)混合液制备：加入3μl riboFECTTMCP Reagent，轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min；
4)将riboFECTTMCP混合液加入到464.50μl细胞培养基中，轻轻混匀；
5)将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养24～96h；
6)转染完成后，以正常ADSCs细胞作为对照，分别在体外诱导成软骨分化7天后对两组细胞进行软骨特性检测。阿尔辛蓝(AB-PSA)染色结果见图3，细胞表面II型胶原表达的流式检测结果见图4。实验结果表明：lncRNA-H19沉默表达后的RNAiH19-ADSCs与对照组ADSCs相比，在诱导分化第七天，分化成熟的软骨细胞变少，且表达II型胶原的阳性细胞所占比例下降；
5.2功能获得性研究
采用定制的慢病毒载体分别过表达ADSCs细胞中的lncRNA-H19，获得H19-ADSCs，以正常ADSCs细胞作为对照，分别在体外诱导成软骨分化7天后观察两组细胞形态，免疫组化法检测细胞表面II型胶原的表达。具体步骤如下：
1)接种5×105个ADSCs细胞至含有适量完全培养基的24孔板培养孔中。
2)解冻一支慢病毒溶液，用干细胞培养基将其进行稀释以得到最佳MOI(30)；弃去24孔板中的培养液，将上述稀释后的慢病毒溶液轻轻吹打混匀后，加至24孔板中，每孔中另外加入终浓度为10μg/ml的Polybrene，来回晃动24孔板轻轻混合均匀后，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜；
3)24h后，弃去六孔板中含病毒溶液，加入0.5ml干细胞培养，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中继续培养96h，获得lncRNA-H19过表达的ADSCs(H19-ADSCs)；
4)转染完成后，以正常ADSCs细胞作为对照，分别在体外诱导成软骨分化7天后对两组细胞进行软骨特性检测。阿尔辛蓝(AB-PSA)染色结果见图5，细胞表面II型胶原表达的流式检测结果见图6。实验结果表明：lncRNA-H19过表达后的H19-ADSCs与对照组ADSCs相比，在诱导分化第七天，分化成熟的软骨细胞更多，且表达II型胶原的阳性细胞所占比例大大提高。
因此，本发明l实施例ncRNAs筛选方法采用RNA高通量测序和生物信息学方法能有效筛选出ADSCs与成熟软骨细胞存在差异表达的lncRNAs，以便被作为基因修饰的研究目标。进一步地，本发明实施例lncRNAs筛选方法筛选和锁定的lncRNAs为H19、Scube3、NONRATG00281中的至少一种，优选为H19。该筛选出的H19、Scube3、NONRATG00281特别是H19被作为基因修饰的研究目标，能获得具有高软骨分化能力的ADSCs。
另一方面，基于上文所述的本发明实施例lncRNAs筛选方法，本发明实施例还提供了一种ADSCs所含的lncRNAs，其特征在于：所述lncRNAs为H19、Scube3、NONRATG00281中的至少一种。这样将本发明ADSCs所含的lncRNAs修饰其他该ADSCs，能获得具有高软骨分化能力的ADSCs，使得被修饰后的ADSCs具有快速高效的分化成软骨细胞，使得诱导分化获得的软骨细胞成熟度高。
再一方面，基于上文所述的本发明实施例lncRNAs筛选方法和ADSCs所含的lncRNAs，本发明实施例还提供了一种具有高软骨分化能力的ADSCs。在一实施例中，所述ADSCs含有lncRNAs，且所述lncRNAs是由权利要求1-7任一所述的lncRNAs筛选方法筛选出存在差异表达的lncRNAs。
在优选实施例中，所述具有高软骨分化能力的ADSCs ADSCs是上文所述的本发明实施例lncRNAs筛选方法筛选出ADSCs与成熟软骨细胞存在差异表达的lncRNAs为靶点，也即是采用上文所述的本发明实施例lncRNAs筛选方法筛选出的lncRNAs在具体实施例中是H19、Scube3、NONRATG00281中的至少一种，尤其是H19为靶点，采用慢病毒感染技术对ADSCs进行修饰后获得的LV-ADSCs。
在具体实施例中，以上文筛选出的lncRNAs-H19为例，本发明实施例具有高软骨分化能力的含有lncRNAs-H19的ADSCs可以按照如下方法获得：
1.用膨胀试剂抽脂术，在手术室无菌条件下，取腹部手术患者的腹部皮下脂肪混合液50ml，置于无菌的225ml离心管中，将离心管置于冰盒中，快速运送至GMP实验室进行实验；
2.取225ml离心管上层的脂肪组织，转移至无菌平皿中，用眼科镊剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，眼科剪或手术刀将脂肪组织剪碎成1mm3大小组织块，用含有0.5％庆大霉素的pH值为7.2-7.4的D-Hanks缓冲液多次冲洗脂肪组织至洗出液清亮，去除残留的血液；
3.洗涤后脂肪组织按10ml每管转移至50ml离心管，每管加入0.1％的I型胶原酶20ml，置于37℃恒温水浴振荡摇床中，150rpm振荡30min，期间振荡混匀一次，振荡结束后取出静置片刻，液面分三层，上层为油脂层，中间为未消化脂肪组织层，下层为多细胞的混合悬液层；
4.加入20ml脂肪干细胞完全培养基终止消化，充分混匀，1500rpm离心15min，弃上层溶液，加入20ml DPBS重悬细胞洗涤一次，1000rpm离心5min。
5.弃上清，用ADSCs完全培养基将细胞密度调整为1×105/ml，混合均匀，取5ml细胞悬液接种于包被的T25细胞培养瓶，使接种密度为2×104/cm2，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
6.培养24h后，将培养瓶中的培养液吸出，用D-PBS缓冲液轻微冲洗细胞培养瓶，弃去未贴壁的细胞，往培养瓶中加入5ml新鲜的ADSCs完全培养基，置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
7.细胞生长过程中，每两天更换一次新鲜的ADSCs完全培养基，细胞生长融合至80％时，胰蛋白酶消化传代。
8.取培养至第五代的ADSCs细胞5×105个接种至含有适量完全培养基的24孔板培养孔中。
9.解冻一支定制的含有lncRNA-H19的过表达慢病毒溶液，用干细胞培养基将其进行稀释以得到最佳MOI(30)。弃去24孔板中的培养液，将上述稀释后的慢病毒溶液轻轻吹打混匀后，加至24孔板中，每孔中另外加入终浓度为10μg/ml的Polybrene，来回晃动24孔板轻轻混合均匀后，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育过夜。
10.24h后，弃去六孔板中含病毒溶液，加入0.5ml干细胞培养，置于饱和湿度、37℃、5.0％CO2培养箱中继续培养96h，获得lncRNA-H19过表达的ADSCs(H19-ADSCs)。
由于本发明实施例ADSCs由于是以上述本发明实施例lncRNAs筛选方法筛选存在差异表达的lncRNAs为靶点，当采用含有lncRNA-H19过表达慢病毒对ADSCs进行修饰后获得，使得被修饰后的ADSCs含有存在差异表达lncRNA，在具体实施例中如含有lncRNA-H19、lncRNA-Scube3、lncRNA-NONRATG00281也即是的LV-ADSCs。因此，被修饰后的ADSCs能在体外快速、高效地分化成软骨细胞，使得诱导分化获得的软骨细胞成熟度高。
又一方面，本发明实施例在上述本发明实施例具有高软骨分化能力的ADSCs的基础上，还提供了一种软骨细胞的诱导分化方法。在一实施例中，本发明实施例软骨细胞的诱导分化方法包括对上述本发明实施例具有高软骨分化能力的ADSCs进行成软骨分化的步骤。
经对具有高软骨分化能力的ADSCs进行诱导分化处理，可在7天内就能快速、高效地诱导分化被修饰后的所述ADSCs为成熟度较高的软骨细胞。
另外，上文各实施例中涉及到的试剂及溶液如下：
(1)试剂
①细胞培养所需试剂：无血清干细胞培养基(Lonza)、血清替代物Ultroser G(PALL)、DPBS、胰蛋白酶(Gibco公司)、I型胶原酶、D-Hanks缓冲液、庆大霉素；
②溶液
I型胶原酶，溶于D-Hanks缓冲液，现配现用；
③流式检测抗体：II型胶原抗体；
(2)培养基
ADSCs完全培养基：无血清干细胞培养基+2％Ultroser G+0.1％庆大霉素；
成软骨诱导分化培养基：无血清干细胞培养基+2％Ultroser G+0.1％庆大霉素+10ng/ml TGF-β1+50nmol/L维生素C+6.25ug/ml胰岛素。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种lncRNAs的应用，其特征在于：其用于修饰ADSCs，所述lncRNAs为H19、Scube3中的至少一种；所述修饰是指使ADSCs过表达所述lncRNAs。
2.一种高软骨分化能力的ADSCs，其特征在于：所述ADSCs由权利要求1所述的lncRNAs的应用方法修饰获得。
3.一种软骨细胞的诱导分化方法，包括对权利要求2所述的高软骨分化能力的ADSCs进行成软骨分化的步骤。
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