CN113215083B - 一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系，所述方法包括获取大菱鲆的肝组织，将肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完全培养基终止消化，得到处理后的组织块；将处理后的组织块均匀的贴到培养瓶中，将贴好的培养瓶置于23摄氏度的培养箱中6h，再将培养瓶倒置6h，正置后加入4ml原代完全培养基中进行原代培养再进行传代培养。通过本发明建立的大菱鲆肝实质细胞系能够实现连续传代，从而提供大量的大菱鲆肝细胞；建立稳定可持续的大菱鲆肝细胞系能够将其应用于大菱鲆营养代谢的分子细胞生物学研究中，从而在细胞水平上弥补现有技术的不足。

Description

一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系。
背景技术
肝脏是生物体内最重要的器官之一，具有营养代谢和免疫调节等多种重要功能。在肝脏中，肝实质细胞是肝脏中最主要的细胞类型，有着贮存糖原、蛋白代谢、脂肪代谢等重要的作用。在水产动物的研究中，鱼类的肝脏被用于生长、免疫、毒性等实验的研究。但由于水产动物个体差异性大，科学研究所得的数据往往组内差异大，实验结果与真实情况存在差异。因此，肝细胞培养在水产研究中的应用越来越普遍。鱼类的细胞系已经在鱼类营养学、毒理学、免疫学、内分泌学等研究领域做出了重要的贡献。然而，目前水产动物细胞的培养多集中于原代培养，而细胞的原代培养与实验所用水产动物的来源有着密切的关系。实验重复性与水产动物的来源密不可分。因此，建立一种稳定且可持续使用的肝细胞系对研究水产动物营养代谢、免疫调节与疾病防御有重要的意义。
大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)是一种具有高经济价值，肉质鲜美，生长迅速的食肉鱼类，大菱鲆在欧洲和亚洲都有大规模的养殖。相关技术中，目前在大菱鲆中已建立肌肉细胞系、鳍细胞系和肾细胞系等。大菱鲆肝细胞的培养在之前的研究中虽然有一定的进展，但大菱鲆肝细胞系还没有被建立，无法获取可以连续传代，且维持良好生长状态的大菱鲆肝细胞。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系，以解决现有技术中无法获取可以连续传代，且维持良好生长状态的大菱鲆肝细胞的问题。
为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法，包括：
获取大菱鲆的肝组织，将所述肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完全培养基终止消化，得到处理后的组织块；将处理后的组织块均匀的贴到培养瓶中，将贴好的培养瓶置于23摄氏度的培养箱中6h，再将所述培养瓶倒置6h，正置后加入4ml原代完全培养基中进行原代培养；
在原代培养过程中，每三天更换一次原代完全培养基，当迁出的细胞融合并长成细胞单层时进行传代培养；
在传代培养过程中，去除原代完全培养基后，加入含1ml EDTA的胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰蛋白酶铺满培养瓶底，之后将胰蛋白酶吸出，再加入1ml胰蛋白酶，放入培养箱静置3min，在显微镜下观察细胞收缩的情况，当细胞变圆且未悬浮之前，将胰蛋白酶吸出，拍打瓶底使细胞脱落，后加入8ml原代完全培养基混匀，分别吸入4ml到新的培养瓶中，在培养瓶上标记好传代的时间和传代的代数。当传代超过15代之后，将原代完全培养基换成传代完全培养基。
进一步的，还包括：
对培养的肝细胞进行PAS染色鉴定是否是肝实质细胞。
进一步的，所述对培养的肝细胞进行PAS染色鉴定是否是肝实质细胞，包括：
如果肝细胞胞质被染成紫红色，则证明肝细胞为肝实质细胞；
如果肝细胞胞质未被染成紫红色，则证明肝细胞为肝纤维细胞。
进一步的，还包括：
对传代培养超过30代的肝细胞进行染色体核型分析，以检测大菱鲆肝细胞传代的过程中是否出现变异。
进一步的，还包括：
对传代培养超过25代的肝细胞进行细胞活性检测。
进一步的，还包括：
将肝细胞接入六孔板中，采用pcDNA3.1-egfp转染肝细胞，在六孔板的每个孔中加入5μg质粒，24h后，在荧光显微镜下观察转染效果。
进一步的，基础培养基包括：每100ml DMEM/F12培养基中，加入1ml青霉素链霉素混合液100×；
原代完全培养基包括：每100ml DMEM/F12培养基中，20％的胎牛血清，10μg/LEGF，10μg/L FGF，10μg/L HGF，配制好的的培养基用0.22μm滤膜过滤除菌；
传代完全培养基包括：每100ml DMEM/F12培养基中，10％的胎牛血清，配制好的的培养基用0.22μm滤膜过滤除菌。
进一步的，所述获取大菱鲆的肝组织，将所述肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，包括：
将肝组织剪成1mm3的组织块，用含有双抗的D-PBS冲洗两遍；室温下，在15ml离心管中用0.1％的四型胶原酶消化30min，消化的同时用旋转振荡器进行旋转震荡，使肝组织充分接触胶原酶；用含有双抗的D-PBS冲洗一遍。
进一步的，所述采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完全培养基终止消化，得到处理后的组织块，包括：
室温下，在15ml离心管中用0.25％含EDTA的胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块消化5min，加入原代完全培养基终止消化。
本申请实施例提供一种细胞系，包括：采用上述任一实施例提供的大菱鲆肝实质细胞系的建立方法建立。
本发明采用以上技术方案，能够达到的有益效果包括：
本发明提供一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系，通过对大菱鲆的选取，获取大菱鲆的肝组织，进行消化处理后进行原代培养，再进行传代培养，从而获取稳定可持续使用的大菱鲆肝细胞系。通过本发明建立的大菱鲆肝实质细胞系能够实现在室温下连续传代，且不会出现变异，还可以在对每一代的肝细胞进行低温保存，从而提供大量的大菱鲆肝细胞；而建立稳定可持续使用的大菱鲆肝细胞系，能够将其应用于大菱鲆营养代谢的分子细胞生物学研究中，从而在细胞水平上弥补现有技术的不足。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明启动培养第5天肝细胞迁出图；
图2为本发明启动培养第15天肝细胞迁出图；
图3为本发明传代第20代大菱鲆肝细胞示意图；
图4为本发明肝细胞PAS染色图；
图5为ALB与CK18蛋白表达图；
图6a为100个肝细胞进行染色体计数示意图；
图6b为一个细胞的染色体镜下示意图；
图6c为染色体配对图；
图7为大菱鲆肝细胞活性图；
图8为大菱鲆肝细胞转染荧光图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下面结合附图介绍本申请实施例中提供的一个具体的大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系。
本申请实施例中提供的大菱鲆肝实质细胞系的建立方法，包括：
S101，获取大菱鲆的肝组织，将所述肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完全培养基终止消化，得到处理后的组织块；将处理后的组织块均匀的贴到培养瓶中，将贴好的培养瓶置于23摄氏度的培养箱中6h，再将所述培养瓶倒置6h，正置后加入4ml原代完全培养基中进行原代培养；
S102，在原代培养过程中，每三天更换一次原代完全培养基，当迁出的细胞融合并长成细胞单层时进行传代培养；
S103，在传代培养过程中，去除原代完全培养基后，加入含1ml EDTA的胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰蛋白酶铺满培养瓶底，之后将胰蛋白酶吸出，再加入1ml胰蛋白酶，放入培养箱静置3min，在显微镜下观察细胞收缩的情况，当细胞变圆且未悬浮之前，将胰蛋白酶吸出，拍打瓶底使细胞脱落，后加入8ml原代完全培养基混匀，分别吸入4ml到新的培养瓶中，在培养瓶上标记好传代的时间和传代的代数。当传代超过15代之后，将原代完全培养基换成传代完全培养基。
优选的，所述获取大菱鲆的肝组织，将所述肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，包括：
将肝组织剪成1mm3的组织块，用含有双抗的D-PBS冲洗两遍；室温下，在15ml离心管中用0.1％的四型胶原酶消化30min，消化的同时用旋转振荡器进行旋转震荡，使肝组织充分接触胶原酶；用含有双抗的D-PBS冲洗一遍。
优选的，所述采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完全培养基终止消化，得到处理后的组织块，包括：
室温下，在15ml离心管中用0.25％含EDTA的胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块消化5min，加入原代完全培养基终止消化。
大菱鲆肝实质细胞系的建立方法的工作原理为：本申请中首先进行实验的准备工作，确定试剂，其中，
主要试剂：EMEM/F12培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、CCK试剂盒、75％酒精、0.25％胰酶、四型胶原酶、胰岛素、表皮样生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)等。
实验材料：T25培养瓶、6孔细胞培养板、弯头镊子、手术剪、解剖刀、巴氏吸管。
制备培养基，具体如下：
本申请中的DMEM/F12培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自BiologicalIndustries公司，青霉素链霉素混合液100×购自Hyclone公司，EGF和FGF购自Gibco公司，HGF购自ProSpec公司，胰岛素100×购自Gibco公司，0.25％胰酶购自Gibco公司，四型胶原酶购自Sigma公司，多聚赖氨酸溶液购自生工公司。
实验材料的灭菌：将解剖所用的镊子、接种针、剪刀、解剖刀等实验耗材在高压灭菌锅中121℃，30min灭菌；
基础培养基的制备：每100ml DMEM/F12培养基中，加入1ml青霉素链霉素混合液100×。
原代完全培养基的制备：每100ml DMEM/F12培养基中，20％的胎牛血清，10μg/LEGF，10μg/L FGF，10μg/L HGF，1ml胰岛素100×，配制好的的培养基用0.22μm滤膜过滤除菌，制成大菱鲆肝细胞原代完全培养基。
传代完全培养基的制备：每100ml DMEM/F12培养基中，10％的胎牛血清，配制好的的培养基用0.22μm滤膜过滤除菌，制成大菱鲆肝细胞传代完全培养基。
T25培养瓶包被：吸取1ml 0.01％多聚赖氨酸滴入T25培养瓶中，用细胞刮均匀浸润板底，1h后将残余的多聚赖氨酸吸出，PBS冲洗3次后，晾干，盖紧备用(长期4℃保存；短期超净台内保存)。
然后进行大菱鲆原代肝细胞启动培养的具体步骤，具体如下：
1、实验大菱鲆的选取：选取体重约为10g左右的健康大菱鲆。
2、实验大菱鲆的暂养：大菱鲆体表擦拭干净，采用带有紫外杀菌灯的循环水系统暂养大菱鲆24h，海水中加入双抗(1000IU/ml青霉素、1000IU/ml链霉素)。
3、肝组织的分离：
将实验大菱鲆捞出，用75％酒精擦洗体表三次。擦洗完毕的大菱鲆移入超净台，将分离得到的肝脏组织放入含有双抗的D-PBS中，用解剖工具将肝脏表面的血渍清洗干净，将结缔组织用解剖工具尽可能分离。
然后进行肝组织的消化与接种，具体如下：
将肝组织剪成1mm3的组织块，用含有双抗的D-PBS冲洗两遍。室温下，在15ml离心管中用0.1％四型胶原酶消化30min，消化的同时用旋转振荡器进行旋转震荡，使肝组织充分接触胶原酶；用含有双抗的D-PBS冲洗一遍后，室温下，在15ml离心管中用0.25％含EDTA的胰酶消化5min，后加入原代完全培养基终止消化。用含有双抗的D-PBS冲洗一遍，沉淀后，弃去D-PBS。用接种环，将组织块均匀的贴到T25培养瓶中，每块组织块的距离不超过5mm，将干贴好的T25培养瓶在23℃培养箱里静置6h，之后将培养瓶倒置6h，正置之后缓缓加入4ml原代完全培养基，置于23℃开始原代启动培养。
启动原代培养，具体如下：
每三天更换一次原代完全培养基，并在倒置显微镜中观察组织块边缘和细胞迁出的情况，操作过程中尽量轻柔，以防组织块掉落。定期拍照，记录。当迁出的细胞融合并长成细胞单层，利用胰酶消化法进行传代培养。
启动传代培养，具体如下：
胰酶消化的具体方法如下：用巴氏吸管吸尽培养瓶里的培养基，加入1ml 0.25％含EDTA的胰酶，轻轻摇晃使胰酶铺满培养瓶底，之后把胰酶吸出，再加入1ml胰酶，放入培养箱静置3min，在显微镜下观察细胞收缩的情况，当细胞变圆但还没有悬浮之前，立刻把胰酶吸出，轻轻拍打瓶底使细胞脱落。后加入8ml原代完全培养基，轻轻混匀，分别吸入4ml到新的培养瓶中，在培养瓶上标记好传代的时间和传代的代数。当传代超过15代之后，培养基换成传代完全培养基。
如图1所示，当组织块贴壁到第5天时，组织块开始有少量细胞迁出。细胞迁出图片如图1所示。当组织块开始原代培养15天时，邻近的组织块迁出的细胞开始融合，细胞开始长成细胞单层，如图2所示。随着传代次数的增加，肝细胞增殖速度增加。图3为细胞传代传到20代的图片。根据实验观察，现细胞传代已超过50代，每一代的肝细胞均已冻存在液氮中。
一些实施例中，还包括：
对培养的肝细胞进行PAS染色鉴定是否是肝实质细胞。
优选的，所述对培养的肝细胞进行PAS染色鉴定是否是肝实质细胞，包括：
如果肝细胞胞质被染成紫红色，则证明肝细胞为肝实质细胞；
如果肝细胞胞质未被染成紫红色，则证明肝细胞为肝纤维细胞。
具体的，如图4所示，PAS(Periodic acid-schiff)糖原染色：对培养的肝细胞进行PAS染色鉴定是否是肝实质细胞，PAS试剂盒(G1360)购自中国索莱宝公司。染色完成之后，在光学显微镜下进行拍照。PAS反应显示糖原，在显微镜中观察肝细胞胞质被染成紫红色，证明传代出的肝细胞是肝实质细胞而不是肝纤维细胞。
特异性蛋白表达：将肝细胞用PBS轻轻冲洗两次，每孔加入200μl含蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche，瑞士)的RIPA裂解液(solarbio，中国)，在4℃裂解30min后于4℃，12000g离心10min，使用BCA蛋白测定试剂盒测定上清液的蛋白浓度。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sDS-PAGE)分离等量的蛋白质，根据分子量切胶，并将其转移到0.45μm PVDF膜(Millipore，美国)。在室温下用含5％脱脂牛奶的TBST缓冲液(Sangon Biotech)将膜封闭1h，并在4℃下与一抗孵育过夜。使用的抗体包括：ALB抗体(1∶500，WanleiBio，WL04835)和CK18抗体(1∶500，WanleiBio，WL0060)。之后，与二抗(HRP标记的山羊抗兔IgG)以1∶5000的稀释度在室温下孵育1h，将膜用超敏ECL化学发光试剂盒显影。
ALB和CK18为肝细胞特异性蛋白，可以表达肝细胞以确定肝细胞，并随着浓度的升高而升高，结果如图5所示。
一些实施例中，对传代培养超过30代的肝细胞进行染色体核型分析，以检测大菱鲆肝细胞传代的过程中是否出现变异。
具体的，对肝细胞(30代)进行染色体核型分析，检测大菱鲆肝细胞下传代的过程中是否出现变异。染色体核型分析使用染色体核型分析试剂盒，实验结束后，在光学显微镜下拍照记录。对传代30代的肝细胞进行染色体核型分析，对100个肝细胞进行分析，结果显示，77个肝细胞的染色体数量为44，结果如图6a所示。图6b所示为单个细胞下染色体图片；图6c所示为44条染色体的核型配对图。实验结果显示，此细胞系在建系的过程中，细胞未发生变异，细胞系成功被建立。
一些实施例中，对传代培养超过25代的肝细胞进行细胞活性检测。
具体的，对肝细胞进(25代)行细胞活性实验，细胞活性实验使用CCK-8试剂盒；对传代25代的肝细胞进行细胞活力分析，结果显示，前五天，随着培养时间的增加，肝细胞的细胞活力逐渐增加，之后肝细胞活力呈下降趋势，在第五天时，细胞活力最好，结果如图7所示。
一些实施例中，还包括：
将肝细胞接入六孔板中，采用pcDNA3.1-egfp转染肝细胞，在六孔板的每个孔中加入5μg质粒，24h后，在荧光显微镜下观察转染效果。
本申请中用pcDNA3.1-egfp进行肝细胞转染，转染24h，pcDNA转染效率高达90％以上，转染的图片如图8所示。可以观察到绝大部分细胞染色，证明细胞活力较好。
本发明的有益效果包括：
本发明基于大量细胞系建立条件，如细胞的筛选、血清培养、培养基筛选以及试剂的调配等，最终选择了上述简单有效的大菱鲆肝实质细胞系的建立方法；
通过上述实验结果证明本申请提供大菱鲆肝实质细胞系的建立方法确实有效，且培养方式简单；
除此之外，本发明应用于大菱鲆营养代谢的分子细胞生物学研究中，从而在细胞水平上弥补现有技术的不足。
综上所述，本发明提供一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法及细胞系，包括获取大菱鲆的肝组织，将所述肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完全培养基终止消化，得到处理后的组织块；将处理后的组织块均匀的贴到培养瓶中，将贴好的培养瓶置于23摄氏度的培养箱中6h，再将所述培养瓶倒置6h，正置后加入4ml原代完全培养基中进行原代培养；在原代培养过程中，每三天更换一次原代完全培养基，当迁出的细胞融合并长成细胞单层时进行传代培养；在传代培养过程中，去除原代完全培养基后，加入含1ml EDTA的胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰蛋白酶铺满培养瓶底，之后将胰蛋白酶吸出，再加入1ml胰蛋白酶，放入培养箱静置3min，在显微镜下观察细胞收缩的情况，当细胞变圆且未悬浮之前，将胰蛋白酶吸出，拍打瓶底使细胞脱落，后加入8ml原代完全培养基混匀，分别吸入4ml到新的培养瓶中，在培养瓶上标记好传代的时间和传代的代数。当传代超过15代之后，将原代完全培养基换成传代完全培养基。本申请构建一种稳定可持续使用的大菱鲆肝细胞系，并将其应用于大菱鲆营养代谢的分子细胞生物学研究中，从而在细胞水平上弥补现有技术的不足。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (7)

1.一种大菱鲆肝实质细胞系的建立方法，其特征在于，包括：
获取大菱鲆的肝组织，将所述肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完全培养基终止消化，得到处理后的组织块；将处理后的组织块均匀的贴到培养瓶中，将贴好的培养瓶置于23摄氏度的培养箱中6h，再将所述培养瓶倒置6h，正置后加入4ml原代完全培养基中进行原代培养；
在原代培养过程中，每三天更换一次原代完全培养基，当迁出的细胞融合并长成细胞单层时进行传代培养；
在传代培养过程中，去除原代完全培养基后，加入含1ml EDTA的胰蛋白酶，轻轻摇晃使胰蛋白酶铺满培养瓶底，之后将胰蛋白酶吸出，再加入1ml胰蛋白酶，放入培养箱静置3min，在显微镜下观察细胞收缩的情况，当细胞变圆且未悬浮之前，将胰蛋白酶吸出，拍打瓶底使细胞脱落，后加入8ml原代完全培养基混匀，分别吸入4ml到新的培养瓶中，在培养瓶上标记好传代的时间和传代的代数，当传代超过15代之后，将原代完全培养基换成传代完全培养基；
基础培养基包括：每100ml DMEM/F12培养基中，加入1ml青霉素链霉素混合液100×；
原代完全培养基包括：每100ml DMEM/F12培养基中，20％的胎牛血清，10μg/L EGF，10μg/L FGF，10μg/L HGF，配制好的的培养基用0.22μm滤膜过滤除菌；
传代完全培养基包括：每100ml DMEM/F12培养基中，10％的胎牛血清，配制好的的培养基用0.22μm滤膜过滤除菌；
所述获取大菱鲆的肝组织，将所述肝组织剪成组织块并冲洗，采用四型胶原酶消化处理并再次冲洗，包括：
将肝组织剪成1mm3的组织块，用含有双抗的D-PBS冲洗两遍；室温下，在15ml离心管中用0.1％的四型胶原酶消化30min，消化的同时用旋转振荡器进行旋转震荡，使肝组织充分接触胶原酶；用含有双抗的D-PBS冲洗一遍；
所述采用胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块再次消化处理，加入原代完全培养基终止消化，得到处理后的组织块，包括：
室温下，在15ml离心管中用0.25％含EDTA的胰蛋白酶对消化处理后得到的组织块消化5min，加入原代完全培养基终止消化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
对培养的肝细胞进行PAS染色鉴定是否是肝实质细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述对培养的肝细胞进行PAS染色鉴定是否是肝实质细胞，包括：
如果肝细胞胞质被染成紫红色，则证明肝细胞为肝实质细胞；
如果肝细胞胞质未被染成紫红色，则证明肝细胞为肝纤维细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
对传代培养超过30代的肝细胞进行染色体核型分析，以检测大菱鲆肝细胞传代的过程中是否出现变异。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
对传代培养超过25代的肝细胞进行细胞活性检测。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：
将肝细胞接入六孔板中，采用pcDNA3.1-egfp转染肝细胞，在六孔板的每个孔中加入5μg质粒，24h后，在荧光显微镜下观察转染效果。
7.一种细胞系，其特征在于，采用如权利要求1至6任一项所述的大菱鲆肝实质细胞系的建立方法建立。
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