CN115161285B

CN115161285B - 一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN115161285B
Application number: CN202210225348.5A
Authority: CN
Inventors: 张才; 何雷; 孟素丹; 王海蓉; 邵琦; 豆梦莹
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Filing date: 2022-03-09
Publication date: 2024-06-04
Anticipated expiration: 2042-03-09

Abstract

本发明属于引入外来遗传物质对细胞的修饰领域，具体涉及一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法和应用。本发明的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，其保藏号为CGMCC No.45029，于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系具有以下特点：其一是筛选获得的细胞活力强，传代80代后仍能保持高的细胞活性及生物学特性，其二是由于采用非病毒转染思路，对细胞的影响较病毒转染更小，应用范围大，结果的评价性更加准确。

Description

一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于引入外来遗传物质对细胞的修饰领域，具体涉及一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法和应用。

背景技术

肠上皮细胞是研究上皮细胞生长和分化的重要模型。细胞体外模型可用于评估药物的通过或毒性、肠道致病菌菌株与肠上皮的相互作用，以及涉及消化道的其他生理或病理现象。体外肠屏障的毒理学研究主要基于原代或传代细胞、永生化肠上皮细胞、非肠源细胞系和共培养物的细胞培养。肠上皮细胞是排列在肠腔内的单层细胞，主要功能包括作为阻止外来有害物质如抗原、微生物及其毒素通过肠腔内的屏障；利用跨上皮细胞转运途径和细胞旁路转运途径，选择性通过来自食物中的营养素、电解质和水等物质穿过肠腔进入循环系统。

因牛、羊等大动物在体内研究中耗时费力等缺点，其肠上皮细胞的建立一直是研究的热点，国内外学者通过不同方法建立了稳定的牛、羊肠上皮细胞模型。但目前技术存在两个问题，首先，目前可以通过胶原酶消化法能够获得一定纯度的奶牛小肠上皮细胞，然而，这些细胞并没有被永生化，体外培养发现这些原代小肠上皮细胞只能仅仅传3-5代并伴随着大量的细胞衰老和凋亡，根本无法满足试验的需求。其次传代培养的肠上皮细胞纯度不够，在大多数物种情况下，从组织块中分离出小肠上皮细胞常常会有成纤维细胞的污染，这两种细胞夹杂生长。由于成纤维细胞增殖速度远远大于上皮细胞，当成纤维细胞增殖到一定程度会包围着小肠上皮细胞生长，最终抑制小肠上皮细胞的生长。

公告号为CN104928250B的中国发明专利公开了一种永生化奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法和应用，其微生物保藏编号为CGMCC NO.8707，其是以中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞作为宿主细胞，用携带有SV-40-大T抗原的逆转录病毒载体感染宿主细胞，最终筛选获得稳定传代的永生化奶牛乳腺上皮细胞系。

肠上皮细胞在涉及消化道的生理或病理研究中具有重要作用。但肠上皮细胞的分离、纯化、培养非常耗时(可达一月至数月之久)，并且不容易分离获得活力很好的细胞，同时分离得到的肠上皮细胞在传至十几代之后即开始衰老并死亡，不能实现永生化。永生化的肠上皮细胞则可大大提高相关应用和研究的进度。通常情况下可使用活病毒载体或质粒转染诱导细胞永生化。使用SV-40-大T抗原的逆转录病毒载体转染，虽然转染效率高，但由于是使用的活病毒，所以在未来的应用上受到限制。而采用质粒转染时，具有较好的应用前景，但较病毒转染获得永生化细胞的难度更大。

发明内容

本发明的目的是提供一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，传代近80代后仍能保持高的细胞活性及生物学特性，可大幅节省体外细胞模型的构建时间，并提高研究成果的准确性。

本发明的第二个目的是提供上述永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系的构建方法。

本发明的第三个目的是提供上述永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系的应用。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，其保藏号为CGMCC No.45029。

本发明的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系具有以下特点：其一是筛选获得的细胞活力强，传代80代后仍能保持高的细胞活性及生物学特性，其二是由于采用非病毒转染思路，对细胞的影响较病毒转染更小，应用范围大，结果的评价性更加准确。

上述永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系的构建方法，包括以下步骤：利用胶原酶消化分离小肠上皮细胞，然后利用差速消化法纯化小肠上皮细胞，最后将外源性hTERT基因导入原代荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞，筛选，建立具有正常小肠上皮细胞生物学特性的永生化细胞。

现有采用慢病毒转染构建细胞系的方法，虽然转染效率高，容易获得具有一定永生特性的细胞株，但由于使用的是活病毒，在未来的应用上受到限制。如采用慢病毒转染构建细胞系的方法往往会出现细胞形态改变、细胞核型发生变化、具有致癌性等问题。若用致瘤性细胞系生产疫苗，疫苗癌基因会随活苗接种而整合入体内，人类若接种有癌基因的疫苗或长期食用整合有癌基因的肉类，有可能出现新一代癌症，酿成新的公共卫生问题。该方法采用非慢病毒转染思路，对细胞的影响小，更适应作为体外细胞模型使用。

上述永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系在构建细胞体外模型方面的应用。

采用本发明的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，可避免肠上皮细胞繁琐、漫长的分离培养过程，大幅缩减研究时间；细胞系的同质性优异，可减少批次之间细胞活性差异，有助于获得更为准确的实验结果。

优选地，所述应用为体外肠屏障的毒理学研究。

优选地，所述应用为评估药物对肠上皮细胞的通过性或毒性。

优选地，所述应用为评估肠道致病菌菌株与肠上皮细胞的相互作用。

优选地，所述应用为评估肠道致病病毒病毒株与肠上皮细胞的相互作用。

附图说明

图1为本发明中牛小肠上皮细胞的原代培养图；

图2为本发明中牛小肠上皮细胞的纯化培养图；

图3为本发明中牛小肠上皮细胞的传代培养图；

图4为本发明中牛原代小肠上皮细胞生长曲线；

图5为本发明中聚合酶链式反应(PCR)扩增特异目的基因；

图6为本发明中纯化细胞CK18的表达情况；

图7为本发明中hTERT转染牛原代肠上皮细胞系不同代数细胞形态；、

图8为本发明中第36代永生化牛小肠上皮细胞系的生长曲线；

图9为本发明中牛原代肠上皮细胞和牛hTERT转染的P36代肠上皮细胞的聚合酶链式反应(PCR)扩增特异目的基因图；

图10为本发明中传至第36代的hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞系CK18的表达情况；

图11为本发明中传至第36代的hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞的染色体核型分析；

图12为本发明中传至第36代的hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞的G-带分析结果；

图13为本发明中第76代永生化牛小肠上皮细胞系的生长曲线；

图14为本发明中牛原代肠上皮细胞和牛hTERT转染的P76代肠上皮细胞的聚合酶链式反应(PCR)扩增特异目的基因图；

图15为本发明中传至第76代的hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞系CK18的表达情况；

图16为本发明中传至第76代的hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞的染色体核型分析；

图17为本发明中传至第36代的hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞的G-带分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的实施过程进行详细说明。

实施例1永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法

本实施例的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，是利用胶原酶消化分离小肠上皮细胞，然后利用差速消化法纯化小肠上皮细胞，最后将外源性hTERT基因导入原代荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞，经筛选、克隆获得。其保藏号为CGMCC No.45029，于2021年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所。

构建方法具体说明如下：

1、原代牛小肠上皮细胞的分离培养

剪取刚刚屠宰公犊牛的十二指肠15cm左右，用含双抗PBS冲洗表面和肠腔，待流下液体清亮时，将肠腔中灌注双抗PBS，结扎小肠两端，置于预冷无菌PBS中，30min之内迅速带回实验室。在缓冲间内将小肠段用含双抗的PBS清洗几遍后，将带线的两端剪去，用PBS 液冲洗小肠内部，清洗干净后，将小肠段两端修剪平整。将小肠组织移至无菌超净工作台，铺展于盛有无菌PBS的培养皿中，用无菌的剪刀将小肠段纵向剪开(测量此时小肠腔面积30cm²)，用PBS液冲洗几遍后，用无菌的镊子和剪刀配合剪下上皮部分，再用双抗PBS反复吹打，洗涤至上清清亮。更换新的无菌剪刀再次将组织块剪碎，转移组织块至0.2％Ⅰ型胶原酶溶液中，置于37℃条件下振荡孵育消化1h，每隔5min摇动一次，直到组织块变得疏松，消化液变得浑浊，按1:1的比例加入预冷10％的胎牛血清培养基终止消化。依次经100目、 180目筛网，收集滤液。1000r/min离心5min，弃上清，重新加入新鲜10％的胎牛血清10mL，吹打混匀，重复两次后重悬，用血球计数板计进行细胞计数，然后将细胞密度调整为1×10⁶个/mL。将稀释好的细胞悬液接种于T25细胞培养瓶中，做好标记，放入37℃、5％CO₂饱和湿度的细胞培养箱中培养。(图1)

图1中，经Ⅰ型胶原酶消化过筛后得单细胞有成团现象，接种48h之后，在倒置显微镜下观察，细胞多以细胞团的形式开始贴壁，细胞团周围不断有细胞迁出，大量单细胞未贴壁 (图1a)；72h后可见细胞团周围迁出细胞增多，向四周蔓延生长，呈克隆样生长，折光率高(图1b)；96h后，细胞进一步向外辐射生长，形成小的细胞簇(图1c)；5～7d细胞融合成岛屿状，细胞为扁平多角形，成纤维样细胞与上皮样细胞夹杂生长。(图1d～1f)。

2、原代牛小肠上皮细胞的纯化

采用差速贴壁法纯化奶牛小肠上皮细胞。待培养瓶中的细胞密度达80％，弃去培养基，向培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶和EDTA混合溶液2mL，放入37℃、5％CO₂饱和湿度的细胞培养箱中消化1～2min，在显微镜下观察到细胞出现皱缩变圆后立即加与消化液等体积的10％FBS培养基，混合均匀以终止消化并收集细胞。将收集的细胞用5mL的10％胎牛血清培养基重悬，接种于新的T25培养瓶中培养90min，取出上清再接种，原培养瓶中加入新鲜培养基继续培养。(图2)

图2中，图a、c物镜5×；图b物镜20×。经差速贴壁90min的细胞，观察可见小的上皮样细胞簇，细胞紧密排列生长，几乎观察不到成纤维样细胞，但是肠上皮细胞数量少，增殖缓慢(图2a-2b)。培养至5d，细胞迅速增殖，细胞呈上皮细胞典型的“铺石路状”在培养瓶底部均匀铺展，几乎铺满瓶底(图2c)。

3、原代牛小肠上皮细胞的传代培养

待纯化后90min差速贴壁的细胞生长至80％融合，轻轻晃动细胞培养瓶，弃去原培养基，用无菌PBS清洗一遍，再加入1mL提前预热的0.25％胰蛋白酶-0.05％EDTA消化液，转动培养瓶使胰蛋白酶消化液铺满培养瓶底。置于CO₂培养箱中孵育2～4min，取出并拍打培养瓶侧壁，看到瓶底细胞逐渐大片脱落时，加入等体积预冷的含10％胎牛血清的培养基终止消化。用5mL的移液器反复地轻柔吹打底壁，将其分散为单细胞，转移细胞悬液至15mL离心管中，1000r/min，离心5min。弃上清，重悬细胞，对细胞悬液进行计数，调整接种密度为 2×10⁵cells/孔(6孔板)。间隔4h观察细胞贴壁情况。之后每天观察细胞增殖情况，每隔2天换一次培养液。(图3)

图3中，图a物镜5×；图b物镜20×。待纯化细胞(差速90min贴壁)生长至70％～80％融合时传代。传代后12h内贴壁，但大多未伸展形态。培养5～7d后，未伸展细胞脱落死亡，贴壁细胞体积变大开始衰老(图3)。

4、原代牛小肠上皮细胞生长曲线的测定

将纯化好的细胞的密度调整为1×10⁵个/mL，按200uL/孔接种到96孔板中，每组6个重复，培养1、2、3、4、5、6、7d时，每孔加10uLCCK-8溶液，37℃孵育2h，在450nm波长下，用酶标仪测定吸光度值，以时间为横坐标、吸光度值为纵坐标绘制细胞生长曲线。(图 4)

图4中，培养1d，BIECs并没有出现增长；培养至2～5d BIECs增殖能力较强，细胞增殖达到顶峰；培养至6～7d，细胞增殖能力下降(如图4)。

5、原代牛小肠上皮细胞的鉴定

5.1、RT-PCR检测原代牛小肠上皮细胞中特异目的基因

(1)待纯化后的肠上皮细胞与10min贴壁的成纤维细胞长至80％融合，弃去原培养基，用无菌PBS溶液清洗一遍，加入1mL Trizol裂解液吹打，直至细胞全部从皿底部脱落。吹打混匀后静置15min，使细胞充分裂解，吸入1.5mL无RNA酶离心管后-80℃保存。

(2)取出样品，放入超净工作台，融化后冰上操作，加入200μl预冷氯仿，盖紧离心管，用手剧烈震荡15s，反复混匀，待充分乳化后，室温静置15min后，4℃条件下12000r/min，离心15min。

(3)从离心机中小心取出离心管，将上层清液转入新的无RNA酶离心管中，向上清中加入等体积的异丙醇，盖紧离心管，上下颠倒离心管使充分混匀后，室温下下静置10min后， 4℃条件下12000r/min，离心10min，离心后试管底部出现沉淀。

(4)小心弃去上清，缓慢沿离心管壁加入75％乙醇1mL(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒离心管，洗涤管壁。之后4℃条件下12000r/min，离心15min，离心后小心弃去乙醇(尽量除尽)。此步骤重复两次。

(5)室温干燥2～5min，加入适量无RNA酶水溶解。

(6)取1μl经核酸浓度测定仪检测所提取RNA浓度。

(7)取上述所提取的RNA，进行反转录为cDNA储存；反转录－聚合酶链式反应(RT－PCR)扩增：以cDNA为模板进行普通PCR，将扩增产物经2％的琼脂糖电泳检测。用以扩增目的基因的引物序列见表1，PCR反应程序：PCR反应程序：95℃预变性30s；然后 95℃变性10s，54℃复性30s，72℃延伸30s，共34个循环；最后72℃总延伸5min，4℃保存。(图5)

表1 PCR引物序列及参数

图5为聚合酶链式反应(PCR)扩增特异目的基因，其中，1、3、5为成纤维细胞中表达CK18、E-钙黏素、肠肽酶；2、4、6为牛小肠上皮细胞中表达CK18、E-钙黏素、肠肽酶。分别提取牛的小肠上皮样细胞和成纤维细胞总RNA，PCR扩增后经2％凝胶电泳结果显示E －钙黏素、肠肽酶和CK18在所分离的牛小肠上皮细胞中阳性表达，而在成纤维细胞中为阴性表达(图5)，因此，本试验分离培养的细胞是牛小肠上皮细胞。

5.2、牛原代肠上皮细胞CK18免疫荧光鉴定

将纯化好的细胞的密度调整为1×10⁴个/mL，接种于6孔板中的细胞爬片上，待细胞融合至80％时，用PBS溶液清洗细胞2遍。然后6孔板每孔里面加1mL4％多聚甲醛溶液固定细胞15min，用PBS溶液清洗3次。用10％驴血清封闭室温封闭30min，弃血清。加鼠抗牛细胞角蛋白18一抗，置于4℃冰箱孵育过夜。用PBS溶液清洗3次，加鼠抗红色荧光二抗，避光室温孵育50min。用PBS溶液清洗3次，加DAPI染液，避光室温孵育10min。用PBS溶液清洗3次，流水冲洗10min，用抗荧光猝灭封片剂封片，置于荧光显微镜下观察并采集图像。(图6)

由图6可知，过荧光显微镜拍照视野下的所有细胞都发出红色荧光，细胞CK18蛋白表达为阳性，其中蓝色为DAPI染色的细胞核，证明纯化的细胞为牛小肠上皮细胞。

6、转hTERT基因牛小肠上皮细胞永生化细胞系的建立

6.1、Pci-neo-hTERT质粒转染原代牛小肠上皮细胞

按Invitrogen公司的Lipofectamine 2000Regent转染说明书操作如下：

(1)转染前24h，将纯化后的牛肠上皮细胞按1×10⁵个/mL接种至12孔板中，使细胞在次日可达到80％～90％的融合度。

(2)转染前4h，用无血清、无双抗的培养液洗涤细胞两次，然后每孔加800μL新鲜培养液。

(3)将1μg质粒稀释到100μL无血清的Opti-MEM中，添加2μLtubofect转染试剂并立即混匀，室温静置、避光孵育20min。

(4)将混合液滴加至培养板中，放置37℃、5％CO₂培养箱中孵育12h，弃去培养液，加入新鲜培养液。

(5)24h后，观察细胞状态，更换新鲜培养液。

6.2、G418筛选及阳性细胞的获得

(1)转染后待细胞达到80％融合时，吸取培养液，加入含500μg/mL G418的培养液培养，连续培养两周，前6天每隔3天换一次培养液，之后根据细胞死亡情况更换培养液，每天观察细胞生长及死亡情况。

(2)待对照组细胞全部死亡后，将G418的浓度减半。

(3)继续培养细胞，每隔2天换一次培养液，直至阳性克隆可见。

(4)待阳性细胞克隆扩增后，将阳性细胞克隆消化传代至12孔板中，进行扩大培养。(图7)

图7为hTERT转染牛原代肠上皮细胞系不同代数细胞形态，图a-f分别为第5代、第9代、第14代、第21代、第28代、第36代转染后牛肠上皮细胞；物镜5×。由图7可知，hTERT 转染牛肠上皮细胞后，传至第36代细胞形态未见明显变化。

6.3、hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞生长曲线的测定

将第36代牛肠上皮细胞的密度调整为1×10⁵个/mL接种于96孔板中，实验步骤同4。(图 8)

图8中，培养1～4d，BIECs增殖能力较强，细胞增殖达到顶峰；培养至4～6d，细胞增殖能力下降。

6.4、hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞系的鉴定

6.4.1、RT-PCR检测永生化牛小肠上皮细胞系细胞中特异目的基因

实验步骤同5.1。(图9)

图9为聚合酶链式反应(PCR)扩增特异目的基因，其中，1、3、5为牛原代肠上皮中表达CK18、E-钙黏素、肠肽酶；2、4、6为牛hTERT转染的P36代肠上皮中表达CK18、E- 钙黏素、肠肽酶。

提取牛hTERT转染的P36代小肠上皮细胞总RNA，PCR扩增后经2％凝胶电泳结果显示 E－钙黏素、肠肽酶和CK18在所培养的牛小肠上皮细胞中阳性表达，与原代小肠上皮细胞中的表达结果一致(图9)，因此，本试验转染后扩大培养的细胞是牛小肠上皮细胞。

6.4.2、永生化牛小肠上皮细胞系CK18免疫荧光鉴定

实验步骤同5.2。(图10)

图10中，由图10可知，通过荧光显微镜拍照视野下的所有细胞都发出红色荧光，细胞 CK18蛋白表达为阳性，其中蓝色为DAPI染色的细胞核，证明转染后的细胞为牛小肠上皮细胞。

6.4.3、hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞系的核型分析

取第36代牛小肠上皮细胞，加秋水仙素到培养液中至终浓度为0.05μg/mL，在37℃培养箱中继续培养3～4h，大部分处于细胞分裂中期。胰蛋白酶消化分离细胞后转入15mL离心管， 4℃下1000r/min离心3min收集细胞。弃去上清液加入预热至37℃的0.075mol/L氯化钾溶液 7mL，吹打混匀，置于37℃培养箱中孵育17min。悬液中加入新鲜固定液1mL，吹打混匀。将悬液以1400r/min离心10min，去上清。加入新鲜固定液7mL，吹打混匀，室温静置30min， 1400r/min离心10min，去上清，重复上个步骤1次。视细胞量加入固定液0.5mL，吹打混匀。取出预冷的载玻片，将载玻片倾斜45°，在载玻片上方迅速滴上2～3滴细胞悬液，轻轻吹散细胞，使其分散均匀，室温干燥。吉姆萨(Giemsa)工作液染色15min，冲洗，空气干燥。先用低倍镜寻找良好的分裂相，再使用高倍镜观察。(图11)同法制备一些空白片子(不染色)以备做G-带分析使用。

图11中，对传至第36代的hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞进行染色体核型分析，由图11可知，第36代的犊牛小肠上皮细胞染色体数为60条，其核型与哺乳动物细胞染色体图谱一致，进一步表明传至第36代的犊牛小肠上皮细胞具有稳定的生物学功能。

6.4.4、hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞系的G-带分析

将常规方法制得的片子(未染色)老化3～7d，置于70℃烤箱中处理2h后，断电自然冷却备用。取25g/L的胰蛋白酶原液2.5mL加8.5g/L生理盐水至50mL，配成1.25g/L的胰蛋白酶溶液，并用50g/L的NaHCO₃溶液调pH至7.0左右。胰蛋白酶溶液在37℃水浴箱中预热后将玻片标本浸入其中，处理1～2min，取出用8.5g/L的生理盐水漂洗2次，Giemsa染液(V(Giemsa原液)：V(pH6.8的磷酸缓冲液)＝1:9)染色15～20min。自来水冲洗，自然晾干，镜检。(图12)

图12中，X、Y性染色体及常染色体的G-带带纹位置、数目没有明显差异，表明传至第 36代的犊牛小肠上皮细胞具有稳定的生物学功能。

6.5、第76代hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞生长曲线的测定

将第76代牛肠上皮细胞的密度调整为1×10⁵个/mL接种于96孔板中，实验步骤同4。(图 13)

图13中，培养1～4d，BIECs增殖能力较强，细胞增殖达到顶峰；培养至4～6d，细胞增殖能力下降。

6.6、第76代hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞的鉴定

6.6.1、RT-PCR检测第76代永生化牛小肠上皮细胞中特异目的基因

实验步骤同5.1。(图14)

图14为聚合酶链式反应(PCR)扩增特异目的基因，其中，1、3、5为牛原代肠上皮中表达CK18、E-钙黏素、肠肽酶；2、4、6为牛hTERT转染的P76代肠上皮中表达CK18、E- 钙黏素、肠肽酶。

提取牛hTERT转染的P76代小肠上皮细胞总RNA，PCR扩增后经2％凝胶电泳结果显示 E－钙黏素、肠肽酶和CK18在所培养的牛小肠上皮细胞中阳性表达，与原代小肠上皮细胞中的表达结果一致(图14)，因此，本试验转染后扩大培养的细胞仍是牛小肠上皮细胞。

6.6.2、第76代永生化牛小肠上皮细胞CK18免疫荧光鉴定

实验步骤同5.2。(图15)

图15中，由图15可知，通过荧光显微镜拍照视野下的所有细胞都发出红色荧光，细胞 CK18蛋白表达为阳性，其中蓝色为DAPI染色的细胞核，证明转染后传代至第76代的细胞仍为牛小肠上皮细胞。

6.6.3、第76代hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞的核型分析

实验步骤同6.4.3。(图16)

图16中，对传至第76代的hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞进行染色体核型分析，由图16可知，第76代的犊牛小肠上皮细胞染色体数为60条，其核型与哺乳动物细胞染色体图谱一致，进一步表明传至第76代的犊牛小肠上皮细胞具有稳定的生物学功能。

6.4.4、第76代hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞的G-带分析

实验步骤同6.4.4。(图17)

图17中，X、Y性染色体及常染色体的G-带带纹位置、数目没有明显差异，表明传至第 76代的犊牛小肠上皮细胞具有稳定的生物学功能。

以上是以传至第36代和第76代的hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞为例，其鉴定结果和生物学功能验证证明本发明得到的荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，显示出极高的活性，并保持牛小肠上皮细胞的生物学特性稳定。

目前该永生化牛小肠上皮细胞系已传至80代，以上特点得到维持和延续，以其构建的体外细胞模型的实验结果与原代细胞模型无显著差异，证明本发明的hTERT转染的永生化牛小肠上皮细胞系非常适于构建体外细胞模型，从而急剧缩短模型构建时间，并利用其同质性的特点，使相关研究成果更加客观及符合实际。

在本发明的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系的基础上，可参考本领域的公知技术构建细胞体外模型，从而进行体外肠屏障的毒理学、评估药物对肠上皮细胞的通过性或毒性、评估肠道致病菌菌株与肠上皮细胞的相互作用、评估肠道致病病毒病毒株与肠上皮细胞的相互作用等研究，既能大幅节省体外细胞模型的构建时间，并能提高研究成果的准确性。

<110> 河南科技大学

<120> 一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系及其构建方法和应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> E-钙黏素扩增引物F

<400> 1

caacaaggaa acaggcgtca 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> E-钙黏素扩增引物R

<400> 2

tgggttgaat ctgggagcat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 肠肽酶扩增引物F

<400> 3

gcgattatgc ccctttcatt 20

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 肠肽酶扩增引物R

<400> 4

cagcctgcag gaagct 16

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> CK18扩增引物F

<400> 5

gattgccaac tctgggctga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> CK18扩增引物R

<400> 6

tggtgctctc ctcaatctgc 20

Claims

1.一种永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系，其特征在于，其保藏号为CGMCCNo.45029；所述永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系来源于十二指肠。

2.一种如权利要求1的永生化荷斯坦公犊牛小肠上皮细胞系在构建细胞体外模型方面的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为体外肠屏障的毒理学研究。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为评估药物对肠上皮细胞的通过性或毒性。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为评估肠道致病菌菌株与肠上皮细胞的相互作用。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用为评估肠道致病病毒病毒株与肠上皮细胞的相互作用。