CN104928250A - 永生化奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了永生化奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法和应用。本发明以中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞作为宿主细胞，用携带有SV-40-大T抗原的逆转录病毒载体感染宿主细胞，最终筛选获得一株稳定传代的永生化奶牛乳腺上皮细胞系，其微生物保藏编号是CGMCC NO.8707。本发明所构建的永生化奶牛乳腺上皮细胞系性能稳定，传代40代以后的细胞形态仍与原代细胞相似，比原代细胞生长迅速，特征性的表达乳腺上皮细胞特异性蛋白，并保持乳蛋白和乳脂肪合成的功能，在作为细胞模型研究乳成分合成及乳汁分泌机制、研究泌乳细胞凋亡及乳腺退化机制以及作为乳腺生物反应器生产生物活性蛋白等方面有广泛的用途。

Description

永生化奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一株永生化细胞系，尤其涉及一株永生化奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法和应用，属于永生化奶牛乳腺上皮细胞系的构建及应用领域。

背景技术

奶牛乳腺上皮细胞具有合成和分泌乳汁的特殊功能，在体外培养条件下仍可保持其特性。关于奶牛乳腺上皮细胞的研究已有半个多世纪。奶牛乳腺上皮细胞可以用来研究乳蛋白和乳脂肪基因表达及乳汁分泌机制，可以作为研究干乳期细胞凋亡及乳腺退化的宝贵材料，又可以作为乳腺特异性表达载体的检测系统，还可作为乳腺生物反应器的细胞模型生产有价值的生物活性蛋白，是极具应用价值的研究工具。然而，奶牛乳腺上皮细胞的体外培养存在很大的困难，传代次数极为有限，极大的限制了其研究和应用。因此将奶牛乳腺上皮细胞永生化具有非常重要的意义。

细胞永生化是指细胞获得持续生长增殖能力的特性。目前所建立的永生化细胞系多是将外源性病毒、原癌基因和抑癌基因突变体、外源性人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因等导入目的细胞而获得的。SV40是上世纪60年代发现的一种猴肾细胞病毒，SV40大T抗原是SV40早期编码区编码的一种具有多种功能的磷酸蛋白，在SV40转化细胞的过程中起着不可缺少的作用，也是实现细胞永生化最常用的目的基因。

1983年，Schmid等首先克隆建立了牛的乳腺上皮细胞系，命名为BMGE+HM，BMGE+H和EMGE-H。BMGH+HM没有典型上皮细胞的多角形形态特点，而具有较长突起的瘦长形，但能够合成细胞角蛋白及桥粒蛋白；BMGE+H具有典型的上皮细胞形态特点，并能合成细胞角蛋白，但不能形成圆顶或泡状结构，不能合成波形蛋白。

尽管目前国内外有不少关于有效建立细胞系的方法的报道，但乳腺上皮细胞系的数量和种类还远远不够，而且很多乳腺上皮细胞系普遍存在着在使用过程中不稳定，出现了形态分化或经过多次传代以后发生衰老、失去了腺上皮细胞的典型特点等问题，有待改进。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株性能稳定的永生化奶牛乳腺上皮细胞系；

本发明的目的之二是提供一种构建所述永生化奶牛乳腺上皮细胞系的方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明以中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞作为宿主细胞，将携带SV40-大T抗原的逆转录病毒转染宿主细胞，通过筛选、鉴定，获得4株永生化的奶牛乳腺上皮细胞系，分别命名为CMEC-1、CMEC-2、CMEC-3和CMEC-4。将这四株细胞系进行持续传代，在倒置显微镜下观察传代的永生化的奶牛乳腺上皮细胞和未转染的原代乳腺上皮细胞的形态。观察结果发现，CMEC-1、CMEC-2和CMEC-3这三株细胞系在传代过程中表现不稳定，仅有CMEC-4在传代过程中表现稳定，传到40代以后仍然表现很稳定，没有出现形态分化或出现衰老问题；因此，本发明将性能非常稳定的奶牛乳腺上皮永生化细胞系CMEC-4提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC NO.8707；分类命名为：中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞永生系。保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2013年12月31日：保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明还提供了一种构建永生化奶牛乳腺上皮细胞系的方法，包括以下步骤：以中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞作为宿主细胞，用含有SV40-大T抗原的逆转录病毒载体感染宿主细胞，传代、筛选、鉴定，即得。

优选的，采用组织块接种法培养和纯化得到奶牛乳腺上皮细胞。

优选的，所述的含有SV40-大T抗原的逆转录病毒载体是pBABE-SV40-large T antigene逆转录病毒载体；进一步优选的，当奶牛乳腺上皮细胞融合达到60-70%，用含pBABE-SV40-large T antigene逆转录病毒感染奶牛乳腺上皮细胞；感染4d后，使用含抗生素培养基持续培养14d，期间进行换液和传代直至细胞形态完全均一，传代至40代，得到性能稳定的永生化的奶牛乳腺上皮细胞系。

端粒酶活性检测结果表明，传代培养第20代的永生化奶牛乳腺上皮细胞CMEC-4的端粒酶活性仍远高于初代，而原代细胞基本上检测不到端粒酶活性，证明了本发明的永生化奶牛乳腺上皮细胞系CMEC-4的永生化特征。

通过绘制细胞生长曲线显示，本发明所构建的永生化奶牛乳腺上皮细胞系CMEC-4明显比原代细胞生长迅速，以5×10⁴个细胞的密度接种于12孔板，细胞倍增时间大约在36h，接种后5d即进入生长平台期。

上皮细胞特征性蛋白表达检测结果表明，本发明构建的永生化奶牛乳腺上皮细胞系CMEC-4传代至30代以后仍能特征性的表达乳腺上皮细胞特异性蛋白，说明永生化以后的乳腺上皮细胞CMEC-4仍然保持了乳腺上皮细胞的特性。

乳蛋白合成基因及乳蛋白表达检测结果表明，原代乳腺上皮细胞和永生化第30代乳腺上皮细胞CMEC-4中乳蛋白合成相关的嗜乳脂蛋白基因（BTN1A1）和β-酪蛋白基因（CAN2），乳脂肪合成相关的乙酰辅酶A羧化酶α基因（ACACA）脂肪酸合成基因（FASN）和过氧化物酶体增殖激活因子的γ-受体基因（PPARG）的表达没有显著差异。说明本发明构建的永生化奶牛乳腺上皮细胞系CMEC-4仍保持了乳蛋白和乳脂肪合成的功能。

染色体核型分析结果表明，本发明构建的永生化乳腺上皮细胞CMEC-4的染色体接近100条，形成多倍体，而原代乳腺上皮细胞有染色体30对60条。永生化后细胞染色体数目明显增多，接近100条，这与以往报道的SV40-大T转染或感染永生化细胞的实验结果一致，属于正常现象。

裸鼠致瘤实验结果表明，本发明构建的永生化奶牛乳腺上皮细胞CMEC-4不能致裸鼠成瘤，说明本发明构建的永生化乳腺上皮细胞CMEC-4未癌变。

乳蛋白合成的机理研究需要稳定的泌乳型细胞作为细胞模型工具，本发明构建的永生化奶牛乳腺上皮细胞系保持乳蛋白合成特性，其对作为蛋白质合成底物和拥有信号传导功能的氨基酸具有浓度依赖性的响应，即在氨基酸存在的条件下，永生系细胞的乳蛋白合成基因和蛋白表达发生变化，调控乳蛋白合成的信号通路被激活。因此，本发明构建的永生化奶牛乳腺上皮细胞系能够满足乳蛋白合成的机理的细胞模型的要求，应用于氨基酸调控乳蛋白合成的机制研究。

本发明所构建的永生化奶牛乳腺上皮细胞系在研究乳蛋白基因表达及乳汁分泌机制，作为乳腺生物反应器的细胞模型生产有价值的生物活性蛋白以及研究泌乳细胞凋亡及乳腺退化等方面有广泛的用途。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明的永生化奶牛乳腺上皮细胞系，其细胞形态与原代细胞较为相似，呈鹅卵石形，细胞边界线明显，细胞形态更为均一，培养至40代仍然保持较为稳定的状态，解决了奶牛乳腺上皮细胞体外培养困难的问题。

2、本发明的永生化奶牛乳腺上皮细胞系，明显比原代细胞生长迅速，细胞倍增时间大约在36h，接种后5d即进入生长平台期。

3、本发明的永生化奶牛乳腺上皮细胞系仍然保持了乳腺上皮细胞的特性，能特征性的表达乳腺上皮细胞特异性蛋白，保持了乳蛋白和乳脂肪合成的功能，能够用于乳腺泌乳功能等方面的研究。

附图说明

图1为pBABE-Hygro逆转录病毒载体图。

图2为4株永生化奶牛乳腺上皮细胞的细胞形态学特征显微显示图（×100）。A：原代奶牛乳腺上皮细胞；B：最初获得永生化的奶牛乳腺上皮细胞CMEC-4（第1代）；C:永生化奶牛乳腺上皮细胞CMEC-1；D:永生化奶牛乳腺上皮细胞CMEC-2；E:永生化奶牛乳腺上皮细胞CMEC-3；F:永生化奶牛乳腺上皮细胞CMEC-4（第10代）；G:CMEC-3生长到第10代停止增殖；H：CMEC-4培养至30代时的细胞形态学特征。

图3为永生化奶牛乳腺上皮细胞CMEC-4的端粒酶活性检测图。

图4为永生化奶牛乳腺上皮细胞CMEC-4的细胞生长曲线图，其中横坐标为时间（天数），纵坐标为细胞数（10⁴）。

图5为永生化奶牛乳腺上皮细胞CMEC-4特征性表达蛋白的细胞免疫荧光照片（×200）。

图6为永生化奶牛乳腺上皮细胞CMEC-4乳蛋白合成基因及乳蛋白表达检测图；M：marker；A：原代乳腺上皮细胞；B：永生化第3代乳腺上皮细胞；C：永生化第10代乳腺上皮细胞；D：永生化第30代乳腺上皮细胞。

图7为永生化奶牛乳腺上皮细胞CMEC-4染色体核型分析图。

本发明涉及到术语的定义

术语“细胞永生化”：指体外培养的细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离，从而具有无限增殖能力的过程。

术语“宿主细胞”：指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“转染”：指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。

术语“感染”：指病毒等微生物在宿主细胞内进行增殖或复制。

术语“逆转录病毒载体”：保留病毒颗粒的包装信号，而缺失病毒颗粒包装蛋白基因；它可以克隆并表达外源基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。

术语“表达”：内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。

术语“传代”：当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液的过程，否则将影响细胞的继续生存。

术语“传代数”：增殖物已被传代培养的次数。

术语“贴壁”：当细胞悬液被接种到培养器皿后，首先要发生粘附，结合到生长基质表面，形成贴壁。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内

实施例1永生化奶牛乳腺上皮细胞系的构建及鉴定

1.永生化奶牛乳腺上皮细胞系的构建

1.1pBABE-Puro逆转录病毒载体

逆转录病毒质粒及pBABE-SV40-largeT antigene质粒均由中国科学院动物研究所老师馈赠，图1为使用到的pBABE-Puro Retroviral Vector逆转录病毒载体图谱。

pBABE-puro-SV-40-large-T质粒

取出冻存的DH5α感受态细胞（每支100μL）冰上融化，加入0.5μL质粒，混匀之后冰上放置30min，42℃孵育60-90s，再置于冰上放置2min；加入37℃温热的SOC培养基900μL，37℃220rpm摇菌1h；取200μL菌液涂在含卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃培养过夜；从LB琼脂平板上挑取10个克隆，加入含卡那霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定；转化E.Coli，扩增细菌后提取质粒，-20℃保存。

1.2腺病毒病毒包装

第1天：传HEK-293T细胞于10cm的培养皿上，以便次日达到70-80%融合；

第2天：用1.5ml的优化MEM培养基稀释7.5μg的pBABE-SV40-largeTantigene质粒，5μg的pUMVC质粒(Addgene)和5μg的pCMV-VSV-G（Addgene）；在离心管中，用1.5mL的MEM培养基和稀释30μL的Lipofectamine，然后室温孵育5min，再将稀释的质粒与稀释后的Lipofectamine混合，室温孵育20min；最后将上述混合物逐滴加入到HEK-293T细胞上，培养6-8h后换完全生长培养基；

第4天：富集转染48h后的病毒上清液，低速离心取出细胞碎片，然后用0.45μm的滤膜过滤，收集病毒液，加入Polybrane终浓度为10μg/mL以促进病毒的感染效率。

1.3奶牛乳腺上皮细胞的培养和纯化

用于构建永生化细胞系的奶牛乳腺上皮细胞来自一头健康的3岁中国荷斯坦奶牛。采用组织块接种法培养和纯化得到健康的奶牛乳腺上皮细胞，具体步骤如下：

1）从牛场将乳腺组织块带回实验室，在细胞间超净工作台进行试验；

2）用加双抗的D-Hanks溶液清洗组织块，并用灭菌的工具将组织块尽可能地剪碎，再用D-Hanks液清洗乳汁至溶液澄清；

3）把组织块剪成1mm³左右，均匀地放置在培养皿中，间距约1cm，每一组织块上滴加一滴基础培养基，放置在38℃，5%CO²培养箱里培养；

4）贴壁2h，取出后加入适量的基础培养基，继续培养；注意观察组织块的干燥程度适当加入基础培养基，每次加入的量只需浸润组织块，而不能使组织块因液体过多而漂浮起来；到12h后，加入1mL基础培养基培养。

5）每1～2d换一次培养基，显微镜观察，直至细胞长满培养皿；

6）细胞长满培养皿后，弃去培养液，用D-hanks溶液清洗2次，加入400μL0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA溶液进行消化，一般消化时间在8～15min，用基础培养基终止消化反应。

7）用移液器反复吹打后，收集细胞悬液于15mL离心管，1000×g室温离心5min。弃上清液，加入新鲜基础培养基，悬浮细胞。

8）将获得的细胞在细胞计数板上计数后，调整细胞的密度，按10⁴～10⁵个/mL接种到35mm的培养皿中，加入适当基础培养基，置于38℃，5%CO₂培养箱中培养。

重复以上操作，可达到对上皮细胞的纯化和富集。一般经过3次消化处理即可获得纯的乳腺上皮细胞。

1.4腺病毒感染奶牛乳腺上皮细胞建立永生化细胞系

1）将奶牛乳腺上皮细胞以2×10⁴接种到六孔板中，培养2d后细胞融合达到60-70%；

2）感染前用D-Hanks溶液清洗细胞2次；

3）收集病毒液以1:1或2:1的比例用培养基（DMEM/F12+10%FBS）进行稀释后，添加到目的细胞中，每孔细胞添加1mL含病毒培养基，polybrene的工作浓度为10μg/mL；

4）感染12-24h后，观察细胞状态，更换新鲜培养基继续培养；

5）感染4d后，添加含promycine（工作浓度为1000μg/mL）的培养基持续培养，隔天换液一次；

6）使用含抗生素培养基持续培养14d，90%细胞死亡，剩余10%产生抗生素抗性的细胞单一分布，期间细胞停止生长或生长缓慢。14d后换正常培养基，换液和传代直至细胞形态完全均一，最终获得4株永生化的奶牛乳腺上皮细胞系，分别命名为CMEC-1、CMEC-2、CMEC-3和CMEC-4。将这四株细胞系进行持续传代，在倒置显微镜下观察传代的永生化的奶牛乳腺上皮细胞和未转染的原代乳腺上皮细胞的形态，观察结果如图2所示。经过一段时间的培养，只有CMEC-4表现出最为稳定的状态，传代已超过40代，还能继续传代培养。CMEC-1生长速度较慢，生长到第5代就不再生长(图2C)。CMEC-2表现出纤维细胞的形态和特征，只培养到第7代(图2D)。CMEC-3生长到第10以后，生长速度变慢，细胞大量的死亡（图2G）。CMEC-4培养至30代仍然保持较为稳定的状态（图2H），其细胞形态与原代细胞（图2A）较为相似，呈鹅卵石形，细胞边界线明显。但细胞形态更为均一，同样面积内细胞数量多于原代细胞（图2B）。

2永生化奶牛乳腺上皮细胞系的鉴定

2.1、实验方法

2.1.1永生化细胞的端粒酶活性检测

样品制备

1）每个反应取2×10⁵奶牛乳腺上皮细胞（CMEC-4）移入一个试管，2-8℃下以3000g离心10分钟形成细胞团，小心移去上清液，将细胞在PBS中重悬并重复离心步骤；小心移去上清液，细胞小团可放在-80℃下储存；

2）将细胞小团在200μl裂解试剂中重悬，冰上预冷并提吸至少3次，冰中孵育30分钟（如果将冷冻细胞团用于提取，加入裂解液前在冰上融化细胞团）。

3）2-8℃，16000g离心裂解物20分钟；小心将上清液移入新的离心管中，保证没有细胞残渣的带入，推荐仅抽吸175μl细胞提取物；

继续进行TRAP反应（如不立即进行TRAP反应，将小份细胞抽提物在液氮中休克性冷冻，将提取物储存在-80℃）；

TRAP反应

1）对于所有的对照和样品反应，每个PCR反应需要加25μL Reactionmixture（Solution2）和5μL的Internal Standard（IS，Solution3），或者反应预混合液；

2）样品和阴性对照：每个反应加入1-3μL细胞提取物（0.5-10μg总蛋白，或相等量的1×10³-3×10³个细胞）；

3）对照样品：加入1μL的对照模板（使用低Solution4或者高含量Solution5模板）到PCR管中，加入1μL裂解液（Solution1）到另一个PCR管中，这个PCR管视为对照模板的空白；

加入无核酸酶的水至总体积到50μL，进行以下PCR操作。PCR反应程序为：25℃10-30min；94℃5min；94℃30s、50℃30s、72℃90s，30cycles；72℃10min。

杂交和ELISA

1）对于每个样品，取10μL变性试剂（Solution7）到2个不同反应管中；每个管中加入2.5μL的扩增产物，15-25℃孵育10min；

2）每个样品管加入100μL杂交缓冲液T（Solution8），另一个管加入100μL杂交缓冲液IS（Solution9），涡旋混合（阴性对照只使用杂交缓冲液T）；

3）转移100μL反应混合液到试剂盒提供的MP板中，使用膜盖好；放入混匀器中300rpm，37℃孵育2h；

4）将杂交液完全从MP板中移出，使用250μL的Washing buffer清洗3次，1×（Solution10），每次至少30s，每次清洗完都完全移除清洗液；

5）每孔加入100μL Anti-DIG-HRP工作液（Solution11），用膜将板封好，放入混匀器中300rpm，15-25℃孵育30min；

6）完全移去溶液，使用250μL的Washing buffer清洗5次，1×（Solution10），每次至少30s，每次清洗完都完全移除清洗液；

7）将TMB底物试剂（Solution13）15-25℃提前温热，每孔加入100μL的TMP底物液，封号MP板，避光，300rpm，15-25℃孵育10-20min；

8）不移去反应底物，直接每孔加入100μL终止液（Solution14）终止显色反应，使HRP底物改变颜色，从蓝色变为黄色；

9）加入底物30min内使用酶标仪450nm进行检测，使用690nm为参考波长。

结束反应后，以450nm检测吸光值，使用690nm为参考波长，两组吸光值的差值带入公式计算样品的RTA并做图。

根据公式计算RTA：

其中：

TS8：TS8，对照模板，端粒酶特殊杂交缓冲液；

TS8,0：裂解液，端粒酶特殊杂交缓冲液；

TS8,IS：TS8，对照模板，IS-特殊杂交缓冲液。

样品：

S1：样品，端粒酶特殊杂交缓冲液；

S1,0：热处理样品，端粒酶特殊杂交缓冲液；

S1,IS：样品，IS-端粒酶特殊杂交缓冲液。

2.1.2细胞生长曲线绘制

将奶牛乳腺上皮细胞（CMEC-4）以约5×10⁴个/孔的浓度接种于12孔板（Corning）中，分别置于38℃，5%CO₂的培养箱中进行培养，采用台盼蓝染色法每1d进行一次细胞计数,每天设3个独立重复,连续9d。未计数组每2d换液一次,以时间（天数）为横坐标，细胞数（10⁴）为纵坐标，绘制生长曲线。

2.1.3上皮细胞特征性蛋白表达检测

将纯化好的奶牛乳腺上皮细胞（CMEC-4）以1×10⁶个的数量接种到35mm培养皿中，培养3～5d后，进行如下操作：

1）待细胞长成半汇合单层，用预冷的D-Hank’s液洗涤细胞3次；

2）用冰浴的丙酮:甲醇(1:1)(-20℃)固定5min；

3）用D-Hank’s液冲洗细胞3次，每次5min，然后擦干边缘水分；

4）滴加1mL1%Triton100的D-Hank’s液破膜20min；

5）用D-Hank’s液冲洗细胞3次，每次5min，然后擦干边缘水分；

6）滴加封闭液（碧云天），室温放置1h；

7）用D-Hank’s液冲洗细胞3次，每次5min，然后擦干边缘水分；

8）滴加一抗1mL（1:500稀释），4℃过夜；

9）D-Hank’s液冲洗3次，每次5min，然后擦干边缘水分；

10）滴加羊抗鼠IgG-FITC二抗1mL（1:200），放于湿盒内室温下孵育30～40min，注意避光；

11）D-Hank’s液冲洗3次，每次5min，然后擦干边缘水分；

12）使用浓度为5μg/mL DAPI的D-Hank’s液室温孵育10min；

13）D-Hank’s液冲洗3次，每次5min，然后擦干边缘水分；荧光显微镜下观察，照相。

2.1.4乳蛋白合成基因及乳蛋白表达检测

实验中PCR使用的引物序列见表1，引物由上海生工合成。

表1引物序列

2.1.4.1RNA提取

细胞RNA的提取完全参照QIAGEN试剂盒说明书；采用NanoDrop1000测定提取RNA浓度及OD_260/280，样品浓度均保持在150～200ng/μL的范围，OD_260/280测定值在1.8～2.0之间。

1）用D-Hank’s溶液清洗细胞；

2）在12孔板中每三个孔加入约350μL Buffer RLT吹吸均匀，转移至1.5mL离心管后静置；

3）加入等体积的70%乙醇吹吸均匀（不可离心）；

4）将700μL样品转移至核试剂柱中（放于2mL收集管中）于>10000r/min离心15s，丢弃流通物；

5）往柱上加700μL Buffer RW1，同样的速度离心15s，丢弃流通物；

6）往柱上加500μL Buffer RPE(事先用4倍体积乙醇稀释)，以同样速度离心15s，丢弃流通物；

7）往柱上加500μL Buffer RPE，以同样速度离心2min；

8）换新2mL收集管，全速离心1min；

9）换新的1.5mL收集管，往柱上加20μL无Rnase水，以>10000r/min离心1min来洗脱RNA；

10）往柱上加20μL无Rnase水，以>10000r/min离心1min来再次洗脱RNA。

2.1.4.2反转录

采用800ng RNA/20μL体系，参照反转录试剂盒（TIANGEN）进行mRNA反转录。取2μL10×RT mix、2μL dNTP混合液（2.5×10^-3each）、2μL Oligo-dT15或Random(10μM)、1μL Quant Reverse Transcriptase配制成混合液并混匀后置于冰上，加入50ng～2μg模板RNA，再加RNase-free水至20μL，最后将反应体系于37℃孵育60min。反转录结束后NanoDrop1000测定cDNA浓度和OD_260/280。

2.1.4.3PCR反应及电泳

采用20μL的反应体系：上、下游引物（10mmol/L）各2μL，Taq酶Mix混合液10μL，模板cDNA2μL，最后用水补足为20μL。

反应程序：95℃4min；95℃30s,60℃30s,72℃1min，40cycles;72℃7min。

取2g琼脂糖，加入100mL电泳缓冲液，制成2%的凝胶。在电泳槽中加入1×电泳缓冲液。取5～8μL PCR扩增产物点样，120V恒压，电泳20～30min。将胶块放入0.5μg/mL溴化乙锭溶液中染色20min，在凝胶成像仪或紫外投射仪上成像。

2.1.5染色体核型分析

1）在奶牛乳腺上皮细胞（CMEC-4）中加秋水仙碱溶液，使终浓度为0.2μg/mL（在10mL10%血清培养基中加2μL浓度0.1mg/mL的秋水仙素），于37℃培养箱中温育5-6h左右；

2）观察细胞状态，使得处于中期（贴壁且为圆形）的较多。倒掉细胞瓶中的培养基，加入4mL0.25%胰酶，显微镜观察中期细胞脱壁后，加8mL终止液终止消化；

3）收集细胞于15mL离心管中，1200r/min离心10min；

4）加预热的KCl低渗液（37℃）6mL（第一毫升逐滴加入，而后可稍快）；

5）37℃水浴中低渗32min，低渗结束时，加约1mL固定液，立即混匀进行预固定，然后离心（1200r/min，10min）；

6）弃上清后，用6mL固定液重悬，于室温下固定30min，1200r/min离心10min，弃上清；

7）用约6mL固定液第二次固定，室温下15min左右，1200r/min离心10min，弃上清；

8）用约6mL固定液第三次固定，室温下15min左右，1200r/min离心10min，弃上清后用适量（约0.5mL）固定液重悬细胞；

9）滴1～2滴细胞悬液于湿冷的载玻片上，用酒精灯火焰固定；

10）室温下放置，空气干燥后，-20℃保存备用。

11）取适量Giemsa，用PBS稀释10倍，混匀，1000r/min离心1min，去除颗粒（giemsa用量：1mL/张片子）；

12）染色：拿一张大的玻璃板，用废片子垫在下面，晾干的片子扣在上面空出砖石笔划过的区域，正面朝下，用1mL枪从片子下将Giemsa注入，不要有气泡。染色10min，拿洗瓶用去离子水冲去Giemsa，室温空气干燥；

13）在片子分裂相区域滴PBS后，在显微镜下镜检，观察，并在CCD及软件Video TesT Karyo3.1的配合下拍照，编辑，进行核型分析。

2.1.6裸鼠致瘤实验

动物实验中使用A549细胞作为实验阳性对照，原代乳腺上皮细胞作为阴性对照，30代永生化乳腺上皮细胞（CMEC-4）为实验组，进行裸鼠致瘤实验。具体操作步骤如下：

1）将处于对数生长期的各实验组成瘤细胞胰酶消化后，用血球计数板对细胞进行计数，并最终用一定体积的PBS重悬，使细胞悬液的浓度为1～2×10⁷个细胞/mL；

2）用一次性注射器将一定量的细胞悬液注射到裸鼠右侧腋窝，注射的细胞量一般为2×10⁶个细胞；

3）注射后饲养裸鼠至肉眼可见瘤体；

4）继续饲养1～2周后，实验结束，收集数据。

2.2实验结果

2.2.1永生化细胞的端粒酶活性检测结果

检测了原代乳腺上皮细胞、永生化第1代和第30代细胞CMEC-4的端粒酶活性，结果显示第30代永生化奶牛乳腺上皮细胞的端粒酶活性远高于初代，而原代细胞基本上检测不到端粒酶活性（图3）。由此，证明了细胞的永生化特征。

2.2.2细胞生长曲线绘制结果

实验结果显示，永生化的奶牛乳腺上皮细胞(CMEC-4)明显比原代细胞生长迅速，细胞倍增时间大约在36h，接种后5d即进入生长平台期（图4）。

2.2.3上皮细胞特征性蛋白表达检测结果

细胞角蛋白（cytokeratin，CK）CK8和CK18是乳腺上皮细胞的特异性表达蛋白。上皮细胞特征性蛋白表达检测结果显示原代乳腺上皮细胞、永生化3代乳腺上皮细胞和永生化20代乳腺上皮细胞均为CK8和CK18阳性表达（图5），说明永生化以后的乳腺上皮细胞仍然保持了上皮细胞的特性。

2.2.4乳蛋白合成基因及乳蛋白表达检测结果

检测结果显示，原代乳腺上皮细胞，永生化第3代乳腺上皮细胞，永生化第10代乳腺上皮细胞，永生化第20代乳腺上皮细胞(CMEC-4)之间乳蛋白合成相关的嗜乳脂蛋白基因（BTN1A1）和β-酪蛋白基因（CAN2），乳脂肪合成相关的乙酰辅酶A羧化酶α基因（ACACA）脂肪酸合成基因（FASN）和过氧化物酶体增殖激活因子的γ-受体基因（PPARG）这5个基因的表达没有显著差异（图6），ACTB和R9两个基因为对照。

2.2.5染色体核型分析结果

染色体核型分析显示，原代乳腺上皮细胞染色体30对60条，永生化后细胞染色体数目明显增多，接近100条（图7），这与以往报道的SV40-大T转染或感染永生化细胞的实验结果一致，属于正常现象。

2.2.6裸鼠致瘤实验结果

动物实验中以A549细胞为阳性对照，原代乳腺上皮细胞为阴性对照，第30代永生化乳腺上皮细胞(CMEC-4)为实验组注射到裸鼠右侧腋窝，饲养裸鼠至肉眼可见瘤体。结果显示，阳性实验组裸鼠成瘤，阴性实验组裸鼠没有成瘤，实验组裸鼠未成瘤。此结果说明，本发明所构建的永生化乳腺上皮细胞(CMEC-4)未癌变。

Claims (10)

1.一株永生化奶牛乳腺上皮细胞系，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC NO.8707。

2.一种构建权利要求1所述永生化奶牛乳腺上皮细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：以中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞作为宿主细胞，用含有SV-40-大T抗原的逆转录病毒载体感染宿主细胞，经过传代、筛选、鉴定，即得。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：采用组织块接种法培养和纯化得到奶牛乳腺上皮细胞。

4.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述含有SV-40-大T抗原的逆转录病毒载体是pBABE-SV40-large T antigene逆转录病毒载体。

5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：感染4d后，添加含抗生素promycine培养基持续培养。

6.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：使用含抗生素培养基持续培养14d，期间进行换液和传代直至细胞形态完全均一，持续传代，筛选到性能稳定的永生化奶牛乳腺上皮细胞系。

7.权利要求1所述的永生化奶牛乳腺上皮细胞系在作为永生化奶牛乳腺上皮细胞模型研究乳成分合成或乳汁分泌机制中的用途。

8.权利要求1所述的永生化奶牛乳腺上皮细胞系作为乳腺生物反应器生产生物活性蛋白的用途。

9.权利要求1所述的永生化奶牛乳腺上皮细胞系在作为细胞模型研究奶牛乳腺上皮细胞的细胞生物学机制中的用途。

10.按照权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的细胞生物学机制包括在应激条件下泌乳细胞凋亡或自嗜机制。