CN106939300A

CN106939300A - 树鼩肝细胞永生化细胞系及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN106939300A
Application number: CN201710280569.1A
Authority: CN
Inventors: 马娜; 董少忠; 寸韡
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2017-04-26
Filing date: 2017-04-26
Publication date: 2017-07-11

Abstract

本发明涉及一种树鼩肝细胞永生化细胞系及其构建方法与应用，属于生物医学技术领域。该细胞系命名为ITH6.1，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏号为CCTCC NO:C201740，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。本发明的ITH6.1永生化树鼩肝细胞系可连续传代100次后，仍然保持二倍体核型，具备极强的增殖能力，真正实现了永生化。该细胞有着较强的增殖能力，进一步对ITH6.1进行蛋白表达、生化指标等特性分析，结果显示了ITH6.1具有典型的树鼩肝细胞特性。同时致瘤性实验等安全性检测也提示了该细胞系具有较好的生物安全性。

Description

树鼩肝细胞永生化细胞系及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种树鼩肝细胞永生化细胞系及其构建方法与应用。

背景技术

树鼩(tree shrew，Tupaia belangeri)是一种生活在热带和亚热带地区的哺乳纲攀鼩类的小型动物，形态酷似松鼠，是灵长类动物的近亲。由于树鼩具有体型小，经济易得，易驯养，繁殖能力强，饲养管理成本低、对人类病毒易感等优点，常常用于替代或减少一些非人灵长类动物的使用，所以很早就被用作灵长类目(包括人类)的疾病动物模型。近年来研究发现，在丙型肝炎、乙型肝炎、手足口疾病、肝癌、糖尿病、肿瘤等疾病的研究中得到广泛的应用。

肝脏疾病是一种严重危害人类健康的疾病，合适的动物模型仍然为许多药物筛选和疫苗开发所急需。相对于小鼠、大鼠等啮齿类动物，树鼩是一种与灵长类亲缘关系更为接近的小型动物，因此具有其独特的应用价值，树鼩肝细胞具备了与人肝细胞很多相似的特点。然而，肝脏是一种处于分化末端的器官，即使经过较为费时费力的操作获得原代肝细胞，细胞在体外培养数天后就会死亡，很难进行耗时较长的基因导入或基因编辑等实验研究。若可以将树鼩肝细胞永生化，使其具有了无限增殖潜能，不仅能为细胞生物学的研究提供性状稳定、源源不断的树鼩肝细胞模型，在嗜肝病毒的研究、肝细胞移植、基因治疗、生物人工肝以及药理、毒理学等研究方面也具有潜在的应用价值。

由于目前还没有建立树鼩永生化肝细胞系的先例，因此本研究以建立永生化树鼩肝细胞系为目的，通过向体外树鼩原代肝细胞导入外源性基因，成功建立了树鼩肝细胞永生化的方法。

树鼩永生化细胞系的建立不仅为树鼩动物肝病模型的优化提供了一种更为稳定的体外预实验分析系统，减少了实验动物的使用量，有利于树鼩动物模型的推广。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供了一株永生化树鼩肝细胞系ITH6.1及其构建方法，用本方法可稳定获得永生化的树鼩肝细胞系。本发明的ITH6.1永生化树鼩肝细胞系可连续传代100次后，仍然保持二倍体核型，具备极强的增殖能力，真正实现了永生化。该细胞有着较强的增殖能力，进一步对ITH6.1进行蛋白表达、生化指标等特性分析，结果显示了ITH6.1具有典型的树鼩肝细胞特性。同时致瘤性实验等安全性检测也提示了该细胞系具有较好的生物安全性。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

树鼩肝细胞永生化细胞系，该细胞系命名为ITH6.1，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏号为CCTCC NO:C201740，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

上述树鼩肝细胞永生化细胞系的构建方法，包括以下步骤：

步骤(1)，含SV40TAg基因的重组慢病毒的获得：将表达SV40TAg蛋白的慢病毒表达质粒和包装质粒共转染293T细胞，包装出含SV40TAg基因的重组慢病毒；

步骤(2)，慢病毒感染：在PTH贴壁培养基中将树鼩原代肝细胞培养至其贴壁后，更换为PTH维持培养基，以树鼩原代肝细胞开始培养时计，24h后按照MOI＝2的比例接种步骤(1)得到的含SV40TAg基因的重组慢病毒，24小时后更换为完全培养液继续培养，得到ITH6细胞；

步骤(3)，传代：当步骤(2)培养得到的ITH6细胞接近汇片时进行传代，将ITH6单细胞悬液计数后按5×10⁴个细胞/cm²的接种密度接种至包被了鼠尾胶原的培养皿中，用完全培养基于37℃、5％CO₂孵箱中静置培养3-5天，经有限稀释法挑选单克隆细胞株后，得到树鼩肝细胞永生化细胞系ITH6.1；

其中所述的PTH贴壁培养基包含如下组分：以1号灌流液为溶剂，II型胶原酶50mg/L、IV胶原酶50mg/L、质量浓度为17％氯化钙水溶液1ml/L；所述的1号灌流液包含如下组分：氯化钠160.8mmol/L、氯化钾3.15mmol/L、磷酸氢二钠0.7mmol/L、HEPES 33mmol/L。

进一步，优选的是，所述的PTH维持培养基包含如下组分：Williams E培养基95％(v/v)，Insulin-Transferrin-Selenium Supplement(100×)1％(v/v)，GlutaMAXTM-I(100×)1％(v/v)，human EGF 10ng/ml(m/v)，human HGF 10ng/ml(m/v)，地塞米松40ng/ml(m/v)，氢化可的松20ug/ml(m/v)，DMSO 0.2％(v/v)，胰岛素30ug/ml，青霉素/链霉素双抗溶液1％(v/v)。

进一步，优选的是，所述的完全培养液包含如下组分：胎牛血清10％(v/v)，青霉素/链霉素双抗溶液1％(v/v)，DMEM培养基89％(v/v)。

进一步，优选的是，

包被了鼠尾胶原的培养皿的制备方法是将浓度为50ug/ml大鼠鼠尾I型胶原包被液加入细胞培养皿中，使得加入包被液的量刚好覆盖细胞培养皿的底部，之后在细胞超净台内放置1小时后，吸走包被液，晾干，再用PBS洗细胞培养皿两遍后，将细胞培养皿再次晾干；最后用封口膜将细胞培养皿再封好，放入4℃冰箱保存备用；

其中，所述的浓度为50ug/ml大鼠鼠尾I型胶原包被液包含如下组分：乙酸0.02mol/L、大鼠鼠尾I型胶原50ug/ml，溶剂为0.22um过滤器过滤除菌的离子水。

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

1.建立了一种高效建立树鼩永生化肝细胞的方法，通过携SV40TAg基因(GI:443428122)的重组慢病毒感染树鼩原代肝细胞后，成功建立了永生化树鼩肝细胞系ITH6。用有限稀释法，成功挑选到ITH6的一株亚克隆细胞ITH6.1，具有良好的增殖能力，迄今已在体外成功传代超过100次，依然保留着良好的增殖特性和细胞状态。应用本发明方法所建立的永生化树鼩肝细胞系可以方便，快速的获得大量具有二倍体核型的树鼩肝细胞。

2.染色体分析结果显示其染色体数目为62条与中缅树鼩相符，证实了ITH6.1是树鼩来源的细胞系。通过RT-PCR检测到了CK18、Alb等一系列标志性肝细胞功能基因在ITH6.1中的表达，证实了ITH6.1的肝细胞属性。

3.在此之前，由于没有永生化的树鼩细胞系，很多细胞水平的实验都不方便开展，只能直接开展动物实验，这对树鼩动物资源是种很大的浪费，ITH6.1树鼩肝细胞系的成功建立，为树鼩动物实验开展之前，提供了开展细胞水平实验的条件，根据得出的有效的数据后再开展动物实验，有利于树鼩动物福利的实现。此外，ITH6.1树鼩肝细胞系的成功建立，提供了方便的基因获取方式，不需要再处死树鼩，使得实验室对一些树鼩基因的获得比以往方便很多，有利于树鼩资源的推广，对树鼩试剂的研究，各种树鼩实验资料的完善起到推动作用。

4.ITH6.1的建立成功，也为其他树鼩细胞系的建立，提供了很好的借鉴，有利于改善目前树鼩细胞系匮乏的研究现状，有利于树鼩资源的推广使用。并且，随着对ITH6.1的深入研究，它更多的潜在利用价值也将日益被挖掘。由于树鼩和灵长类动物具有更近的亲缘关系，树鼩肝细胞具备了与人肝细胞很多相似的特点，树鼩永生化细胞系的建立不但减少了实验动物的使用量，提供了一种更为稳定的实验研究对象，同时也将为树鼩动物肝病模型的优化提供更为方便快捷的体外预分析系统。

附图说明

图1是ITH6细胞在显微镜下的形态观察结果。IA(Bar＝100um)中显示的是树鼩原代肝细胞刚接种入细胞培养皿，细胞呈圆形，透亮，可见大核，状态良好；IB(Bar＝100um)为接种后4h，细胞已基本贴壁，开始在培养皿上生长。IIA(Bar＝100um)和IIB(Bar＝200um)显示的是树鼩原代肝细胞接种后24h的细胞生长情况，细胞呈上皮细胞样生长，扁平的细胞呈多角形，胞质近中央处有圆形或椭圆形的细胞核，细胞之间紧密连接，细胞膜及核膜分布基本清晰；IIC(Bar＝100um)和IID(Bar＝200um)显示的是树鼩原代肝细胞接种后48h的细胞生长情况，细胞开始汇合，细胞间可见明亮的界限(胆小管)，属于肝细胞之间特征性结构。

图2是ITH6.1细胞的生长曲线图。

图3是应用RT-PCR检测ITH6.1细胞(P50)肝细胞功能相关基因CK18、Alb表达情况的琼脂糖凝胶电泳图。以树鼩原代肝细胞(PTH)为阳性对照。

图4是ITH6.1细胞染色体分析图。

本发明树鼩肝细胞永生化细胞系，该细胞系命名为ITH6.1，已于2017年3月16日保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏号为CCTCC NO:C201740，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。主要试剂:

1)牛血清白蛋白(BSA)，美国Sigma公司；

2)Williams E培养基，Life Technology公司；

3)DMEM高糖培养基，Hyclone公司；

4)二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)，Sigma公司；

5)胎牛血清(fetal bovine serum)，BI公司；

6)4-经乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，美国Hyclone公司；

8)胶原酶II型(collagenase II)，Invitrogen公司；

9)胶原酶IV型(collagenase IV)，美国Sigma公司；

10)肝细胞生长因子(HGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、胰岛素、地塞米松，Sigma公司；

11)聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，Invitrogen公司；

12)胰岛素转铁蛋白-硒添加剂ITS(Insulin-Transferrin-SeleniumSupplement)(100x)，Life Technology公司；

13)鼠尾胶原RAT TAIL，COLLAGEN I；

14)杂交瘤无血清培养基(SFM培养基) Gibico；

15)DMEM培养基 Gibico；

16)青霉素/链霉素双抗溶液(100×) Gibco；

17)胰蛋白酶 Sigma；

18)磷酸盐缓冲液PBS Hyclone；

19)GeneGreen核酸染料天根生物；

20)琼脂糖 BIOWEST；

21)opti-MEM Gibco；

22)LIPOfectmin2000 Invitrogen公司；

23)TRNzol-A+总RNA提取试剂天根生物

主要溶液：

1)1号灌流液：氯化钠160.8mmol/L、氯化钾3.15mmol/L、磷酸氢二钠0.7mmol/L、HEPES33mmol/L。

2)2号灌注液：以1号灌流液为溶剂，II型胶原酶(invitrogen)50mg/L、IV胶原酶(Sigma)50mg/L、质量浓度为17％氯化钙水溶液1ml/L。

3)PTH贴壁培养基：以1号灌流液为溶剂，II型胶原酶(invitrogen)50mg/L、IV胶原酶(Sigma)50mg/L、质量浓度为17％氯化钙水溶液1ml/L。

4)PTH维持培养基：Williams E培养基95％(v/v)，Insulin-Transferrin-Selenium Supplement(100×)1％(v/v)，GlutaMAXTM-I(100×)1％(v/v)，human EGF10ng/ml(m/v)，human HGF 10ng/ml(m/v)，地塞米松(Dexamethasone)40ng/ml(m/v)，氢化可的松(Hydrocordisone)20ug/ml(m/v)，DMSO 0.2％(v/v)，胰岛素30ug/ml，青霉素/链霉素双抗溶液1％(v/v)。，DMEM培养基89％(v/v)。(青霉素/链霉素双抗溶液为商品化液体产品，按照1％体积比使用即可，已在主要试剂中列出厂家。)

5)完全培养液：胎牛血清10％(v/v)，青霉素/链霉素双抗溶液1％(v/v)，DMEM89％(v/v)

6)0.25％胰蛋白酶：0.25g的胰蛋白酶溶于100ml的PBS。

7)大鼠鼠尾I型胶原包被液：乙酸0.02mol/L、大鼠鼠尾I型胶原50ug/ml、溶剂采用0.22um过滤器过滤除菌的离子水，4℃保存。

8)40ug/ml秋水仙溶液：秋水仙素0.004g的秋水仙素溶于100ml去离子水。

9)固定液：甲醇75％(v/v)，冰醋酸25％(v/v)。

10)Giemsa染液：称Giemsa粉末0.5克，加几滴甘油研磨，再加入甘油(使加入的甘油总量为33ml)。56℃中保温90-120分钟。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。使用时用PBS 10倍稀释后使用。

11)50×TAE溶液：Tris-base 2mol/L，Na₂EDTA·2H₂O 0.1mol/L，冰乙酸5.71％(v/v)。

质粒与载体:

表达SV40TAg蛋白的慢病毒表达质粒由Addgene公司购买，包装质粒Lenti-XPackaging Single Shots购买自宝生物。

细胞株：

293T细胞为表达SV40T抗原的人肾上皮细胞，KMB17细胞为人胚肺二倍体细胞，Hela细胞为人宫颈癌细胞，以上细胞均由中国医学科学院医学生物学研究所保存和提供。

1.树鼩原代肝细胞的分离

1.1固定树鼩并进行深度麻醉后，从股静脉处注射肝素，进行抗凝处理，切开腹腔，剥离门静脉和下腔静脉，穿刺门静脉，用150-200ml 1号灌流液在20分钟以内灌流至肝脏血色褪去，肝脏颜色呈现赭黄色。继续进行2号灌注液灌注，当用止血钳轻压后出现一个需2-3秒才能恢复的小窝时，即可停止灌注，一般采用2号灌注液灌注时间需维持在15min到20min。将肝脏取下，撕破肝包膜，梳刮肝组织，抖落肝细胞至灌流液中，大量细胞随着肝组织被撕开口释放出来。

1.2将以上组织液通过细胞筛网过滤，室温下静置20min使活细胞沉降，弃上清液后重悬，以1200转/钟(RPM)离心3分钟，重复两次，用PTH贴壁培养基重悬细胞，以5×10⁵个/ml细胞密度接种细胞培养皿，4小时以后，换液为PTH维持培养基。显微镜下树鼩原代肝细胞(Primary tupaia hepatacyte，PTH)形态进行观察并记录，观察图像见图1。

1.3倒置显微镜观察新鲜分离后的树鼩原代肝细胞，细胞透亮，且细胞呈圆形或类圆形，边界清晰，多呈单个散在均匀的分布；一般接种2h后细胞就开始贴壁，部分细胞伸出突起，4h左右，细胞基本完成贴壁，此时，通过换液去除贴壁不牢、贴壁细胞以及崩解的细胞碎片；24h大部分肝细胞已完全贴壁，细胞完全伸展，形态逐渐不规则，呈铺路石样，光镜下可见肝细胞呈六边形、三角形或不规则型，排列整齐，细胞界限清晰，胞浆丰富透亮。细胞核有单核、双核，呈圆形或椭圆形，48h后贴壁肝细胞已完全铺张开来，呈现出“铺路石样”形态特征，细胞开始汇合相互融合形成岛屿状结构，细胞之间紧密连接，细胞膜及核膜分布清晰可见。显微镜下观察图像见图1。

2.含SV40TAg基因重组慢病毒的获得：

2.1表达SV40TAg蛋白的慢病毒表达质粒pBABE-puro SV40LT与慢病毒包装质粒Lenti-X Packaging Single Shots共转染293T细胞：293T细胞于转染前更换为杂交瘤无血清培养基(SFM)培养基，表达质粒pBABE-puro SV40LT与慢病毒包装质粒Lenti-XPackaging Single Shots各1ug和200ul的opti-MEM与含20ul LIPOfectmin2000的200ul的opti-MEM混匀后静置20分钟，加入长成单层的293T细胞(购买自ATCC)，于37℃、5％CO₂条件下静置培养。

2.2慢病毒的收集：分别于转染后24h和48h收集步骤2.1的细胞培养上清，72000g、120分钟超速离心收集病毒，并重悬于杂交瘤无血清培养基，-80℃贮存备用。

3.含SV40TAg基因重组慢病毒感染树鼩原代肝细胞——ITH6细胞的获得

在培养皿中以5×10⁴个细胞/cm²的接种密度接种树鼩原代肝细胞，加入PTH贴壁培养基，待细胞贴壁后，更换为PTH维持培养基，在细胞接种的24h后，将步骤2中获得的慢病毒按照MOI＝2(Multiplicity of infection，MOI，感染复数)的比例接种树鼩原代肝细胞，24小时后更换为完全培养液，此细胞标记为ITH6细胞。

4.鼠尾胶原包被液包被细胞培养皿步骤

浓度为50ug/ml大鼠鼠尾I型胶原包被液加入细胞培养皿或细胞培养板中，使得加入包被液的量刚好覆盖细胞培养皿(板)的底部。将加入了包被液的细胞培养皿(板)在细胞超净台内放置1小时后，吸走包被液，并晾干细胞培养皿(板)，再用PBS洗细胞培养皿(板)两遍后，将细胞培养皿(板)再次晾干。最后用封口膜将其封好，放入4℃冰箱保存备用。

5.ITH6细胞的传代、冻存和复苏

1)细胞传代：

当步骤3中得到的细胞接近汇片时进行传代，传代时，取含有ITH6细胞的培养皿(直径＝100mm，细胞密度没有要求)，弃去旧培养基，PBS清洗一次，加入1-2ml的0.25％(m/v)胰蛋白酶消化液，消化贴壁细胞1-2分钟，弃除胰酶消化液，加入完全培养液，用吸管轻轻吹打瓶壁使细胞分散成为单细胞悬液，按照5×10⁴个细胞/cm²的接种密度接种至包被了鼠尾胶原的培养皿中，置于37℃，5％CO₂孵箱，静置培养。

2)细胞的冻存：

取步骤3获得的处于对数期生长旺盛的含有ITH6细胞的培养皿(直径＝100mm，细胞密度没有要求)，弃培养基，PBS洗两遍，加入1-2ml的0.25％(m/v)胰蛋白酶消化液至细胞面成空洞状，用DMEM培养基重悬吹打分散细胞，300g离心3分钟后去掉上清，用冻存液(DMSO:PTH维持培养基:胎牛血清比例为1：2：7)(v:v:v)以2×10⁶个/ml的密度重新悬浮细胞并分装到冻存管中，放入程序冻存盒-80℃过夜后转移到液氮中保存。

3)细胞复苏：

取出保存在液氮中的ITH6细胞，迅速放入37-42℃水浴中快速融化，然后以300g离心 3分钟去上清，再加入PTH贴壁培养基使细胞充分悬浮后转移到提前包被了鼠尾胶原的培养皿中，放37℃、5％CO₂孵箱中培养。

6.有限稀释法挑选单克隆细胞株

选取步骤5中1)步骤静置培养3-5天且生长状态良好的细胞，进行细胞计数后分别以1×10⁵个细胞/皿、1×10⁴个细胞/皿、1×10³个细胞/皿的细胞接种量接种于三个直径为10cm细胞培养皿，待观察到细胞贴壁后(大约接种后4小时)，将PTH贴壁培养基换为PTH维持培养基，之后每天镜下观察细胞生长情况，每隔3天换一次PTH维持培养基。

当出现克隆增生的细胞团时，挑选成簇增生单细胞团，吸取培养皿内旧培养基，将克隆环放到相应的细胞克隆团的位置，向环内加入1-2ml的0.25％的胰蛋白酶消化，以正好盖住细胞为宜，在倒置显微镜下观察，待细胞间隙增大后，立即加入新的完全培养液，用枪头吸吹环内的细胞，使细胞脱离培养皿形成悬液并将悬液接种到96孔细胞培养板的一个孔内，然后用完全培养液逐渐扩大培养，以获得单克隆细胞株，并按照步骤5中的方法冻存。得到ITH6.1细胞系。

7.ITH6.1的生长曲线的绘制(计数法)

取生长状态良好的ITH6.1细胞，制成1×10⁴个/ml的细胞悬液，接种于12孔培养板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养，24小时后开始计数，以后每隔24小时计数一次，每次取3孔细胞分别进行计数，连续计数6天。根据细胞计数结果，以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴，绘制细胞生长曲线。按Patter-son公式：TD＝logtN×tlolgo2gNo(t：培养时间；N0：接种后起始细胞数；Nt：培养t小时后的细胞数)

通过计数法得到每天ITH6.1的细胞数后，绘制ITH6.1的细胞生长曲线，如图1所示，从可知，ITH6.1于培养第3天开始进入快速增长期，于5天达到峰值并开始进入增殖抑制期。绘制的生长曲线见图2。

8.ITH6.1种属来源鉴定实验

应用RT-PCR检测到了ITH6.1(P50)在mRNA水平表达的肝细胞功能相关基因CK18(GI:34036)、Alb(GI:947208389)，CK18基因编码的细胞角蛋白CK18和Alb编码的白蛋白均是肝实质细胞特异性标志物。

8.1)引物序列如下：

表1

8.2)RNA抽提

取ITH6.1细胞，弃培养液后加入TRNzol-A+总RNA提取试剂严格按照说明书操作提取ITH6.1细胞总RNA；

8.3)逆转录反应获取cDNA

1)严格按照PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(购买自宝生物)说明书进行实验操作。按下表2配置反应液。

表2

试剂	使用量
		Random 6mers(50uM)	1ul
dNTP Mixture(10mM each)	1ul
		Template RNA	8ul

2)65℃保温5分钟后，冰上急速冷却，得到变性后的反应液。

3)按照下表配置20ul反应液

表3

4)按照下列条件进行逆转录反应：30℃，10分钟42℃，60分钟。

5)95℃放置5分钟使酶失活，冰上放置。

8.4)PCR反应体系:

1)在PCR反应管中加入反应体系:

cDNA 2ul

l0xPCR缓冲液2.5ul

dNTP(2.5mmol/L)4ul

上游引物(l0lummol/L)lul

下游引物(l0umol/L)lul

TaqDNA聚合酶(5u/ml)0.2ul

无核酸酶水14.3ul

总体积25ul

2)扩增条件及反应参数：

a.预变性94℃5min；

b.变性94℃30sec；

c.复性55℃或58℃30sec；

d.延伸72℃90sec；

e.延伸72℃5min；

其中b-d步骤循环35次。

8.5)PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳:

1)于三角烧瓶中，称取1g琼脂糖，加入100ml TAE溶液，配成1％的琼脂糖胶溶液，置于微波炉中，中火加热3min至琼脂糖融化，冷却至60℃时，加入5ul GeneGreen核酸染料混匀。

2)将洗净的电泳版和梳子擦干，将电泳板放入制胶槽中，插入梳子，倒入胶溶液，使胶的厚度达到0.5cm，室温下放置至少40min以上。

3)胶凝好后，缓慢地拔出梳子，将电泳板连同胶一起取出制胶槽，放入电泳槽，倒入1×TAE，使液面高出胶平面1mm。

4)取PCR产物5ul与1μl的6×loading buffer(购买自宝生物)混匀，后缓慢地加入电泳孔中。

5)电泳仪电压设置为100v，恒压电泳，20min左右观察结果。

6)将电泳后的胶从胶板上取下，置于紫外透射反射仪上进行观察。结果可见肝细胞功能标志性的基因CK18、Alb有明显的特异性条带，结果见图3。

9.ITH6.1染色体核型分析

1)秋水仙素处理

取生长于直径＝100mm的细胞培养皿且状态良好的ITH6.1细胞(细胞的密度没有要求)，在培养皿的完全培养液中加入秋水仙素溶液(40ug/ml，购买自sigma)，使其终浓度为40ng/ml，在37℃、5％CO₂的细胞培养箱中静置2小时。

2)低渗处理

秋水仙素处理好的ITH6.1细胞，弃培养基用PBS洗两次后，加入0.5ml 0.25％胰蛋白酶消化，加入1ml完全培养液悬起，用吸管转移到15ml离心管，1200rpm离心5分钟，收集细胞。然后加入7ml的0.075mol/L的KCl水溶液，用吸管吹打成细胞悬液，置于37℃水浴放置20分钟。

3)固定

滴加1ml的固定液进行固定3分钟。

4)滴片

固定后，1200rpm/min离心5分钟，弃上清，加入0.5ml固定液重悬细胞，距离载玻片30cm滴加于玻璃载玻片上。

5)把载玻片移入烘箱75℃烤3小时，即得到ITH6.1细胞的涂片。

6)染色和观察。将烤好的ITH6.1细胞涂片放入Giemsa染液进行染色，保证染液充分覆盖细胞面，5分钟后，用水冲洗片子，加上盖玻片后显微镜下观察。先用低倍镜寻找良好的分裂相，然后，在油镜下观察拍照。

7)观察结果：选取第50代ITH6.1进行核型分析，计数了20个细胞分裂相，结果显示ITH6.1的染色体数为62条，与树鼩Chinese tree shrew(Tupaia belangeri chinensis)的染色体条数相同。染色体形态较好，能见到树鼩特征性的8号端着丝粒长染色体(如图4中箭头所示)，这一点也再次验证了ITH6.1细胞是树鼩细胞。结果见图4。

10.永生化树鼩肝细胞系ITH6.1的安全性研究--裸鼠致瘤实验

1)实验分组和裸鼠接种：

20只雌性BALB/c-nu裸鼠(南方医科大学实验动物中心提供)依次编号1-20，实验分为ITH6.1P50组(接种第50代ITH6.1细胞)、ITH6.1P80组(接种第80代ITH6.1细胞)、Hela细胞组(阳性对照组)、KMB17组(阴性对照组)共4组，按随机数目表法完全随机分配，每组裸鼠4只(n＝5)。收集第50代和第80代永生化人树鼩细胞ITH6.1，加DMEM调至细胞密度为5xl0⁸个/mL，每只裸鼠注射0.2ml，即注射数量为1.0X10⁷个，注射部位为右腋皮下；阳性对照组Hela细胞组，阴性对照组KMB17组细胞的处理方式、裸鼠的注射方式和注射细胞数量同上。

2)实验动物日常观察

每3天称量裸鼠体重、观察瘤体形成情况(形成时间、大小)、测量一次瘤体大小，待瘤体直径接近1cm时即处死该只裸鼠切取肿瘤组织以中性福尔马林液固定。

3)实验结果

永生化树鼩肝细胞ITH6.1接种裸鼠后，同阴性对照组KMB17组裸鼠一样，动物生长情况良好，细胞接种部位右腋下直至实验终点(接种后三个月)均无肿物形成，三组动物一直生长状态良好。Hela组接种细胞1周后在每只裸鼠的注射部位就都能观察到肿瘤形成，致瘤率为100％；肿瘤生长迅速，一月以内，5只裸鼠的肿瘤直径均超过1cm。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 树鼩肝细胞永生化细胞系及其构建方法与应用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

actgctgtgc gaagcaagaa cc 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

attcaagcag gtcaccgtgg ca 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcatccagaa cgagaaggag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cactgtggtg ctctcctcaa 20

Claims

1.树鼩肝细胞永生化细胞系，其特征在于，该细胞系命名为ITH6.1，保藏于中国典型培养物保藏中心建株，保藏号为CCTCC NO:C201740，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

2.权利要求1所述的树鼩肝细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1），含SV40TAg基因的重组慢病毒的获得：将表达SV40TAg蛋白的慢病毒表达质粒和包装质粒共转染293T细胞，包装出含SV40TAg基因的重组慢病毒；

步骤（2），慢病毒感染：在PTH贴壁培养基中将树鼩原代肝细胞培养至其贴壁后，更换为PTH维持培养基，以树鼩原代肝细胞开始培养时计，24h后按照MOI=2的比例接种步骤（1）得到的含SV40TAg基因的重组慢病毒，24小时后更换为完全培养液继续培养，得到ITH6细胞；

步骤（3），传代：当步骤（2）培养得到的ITH6细胞接近汇片时进行传代，将ITH6单细胞悬液计数后按5×10⁴个细胞/cm²的接种密度接种至包被了鼠尾胶原的培养皿中，用完全培养基于37℃、5%CO₂孵箱中静置培养3-5天，经有限稀释法挑选单克隆细胞株后，得到树鼩肝细胞永生化细胞系ITH6.1；

其中所述的PTH贴壁培养基包含如下组分：以1号灌流液为溶剂，II型胶原酶50mg/L、IV胶原酶50mg/L、质量浓度为17%氯化钙水溶液1ml/L；所述的1号灌流液包含如下组分：氯化钠 160.8 mmol/L、氯化钾 3.15 mmol/L、磷酸氢二钠0.7 mmol/L、HEPES 33 mmol/L。

3.根据权利要求2所述的树鼩肝细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，所述的PTH维持培养基包含如下组分：Williams E 培养基95%（v/v），Insulin-Transferrin-Selenium Supplement（100×）1%（v/v），GlutaMAX ™ -I (100×）1%（v/v），human EGF10ng/ml（m/v），human HGF 10ng/ml（m/v），地塞米松40ng/ml（m/v），氢化可的松20ug/ml（m/v），DMSO 0.2%（v/v），胰岛素 30ug/ml，青霉素/链霉素双抗溶液1%（v/v）。

4.根据权利要求2所述的树鼩肝细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，所述的完全培养液包含如下组分：胎牛血清10%（v/v），青霉素/链霉素双抗溶液1%（v/v），DMEM培养基89%（v/v）。

5.根据权利要求2所述的树鼩肝细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于，包被了鼠尾胶原的培养皿的制备方法是将浓度为50ug/ml大鼠鼠尾I型胶原包被液加入细胞培养皿中，使得加入包被液的量刚好覆盖细胞培养皿的底部，之后在细胞超净台内放置1小时后，吸走包被液，晾干，再用PBS洗细胞培养皿两遍后，将细胞培养皿再次晾干；最后用封口膜将细胞培养皿再封好，放入4℃冰箱保存备用；