CN102696535A - 树鼩非酒精单纯性脂肪肝动物模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

树鼩非酒精单纯性脂肪肝动物模型的构建方法。本发明以树鼩为模型动物，用每公斤普通饲料加20g胆固醇和200g猪油为高脂饲料，供树鼩自由采食，提供纯净水自由饮用。7周后，60%的树鼩呈明显脂肪肝症状，14周后，80%的树鼩呈明显的脂肪肝症状，其中20%的树鼩呈重症脂肪肝症状，部分树鼩有约95%的肝细胞脂肪化。分析结果证明，本发明造模时间短，成功率高，安全可靠，可用于非酒精性脂肪肝，尤其是单纯性脂肪肝的药物研究与功效评价。

Description

树鼩非酒精单纯性脂肪肝动物模型的构建方法

 

技术领域

本发明属于动物模型的建立方法，具体涉及利用动物构建非酒精性脂肪肝动物模型的方法。

背景技术

脂肪肝的发病率近几年在欧美和中国迅速上升，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病。在白领人士、政府官员、高级知识分子等职业人群中脂肪肝的平均发病率约为25%；在肥胖人群与Ⅱ型糖尿病患者中脂肪肝的发病率约为50%；在嗜酒和酗酒者脂肪肝的发病率约为58%；在经常失眠、疲劳、不思茶饭、胃肠功能失调的亚健康人群中脂肪肝的发病率约为60%。

非酒精性脂肪肝病是指除酒精外和其他明确的肝脏损伤因素所致的以弥漫性肝细胞大泡性脂肪变为主要特征的临床病理综合症。依据病变肝组织是否伴有炎症反应和纤维化，非酒精性脂肪肝病可分为：单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎和肝硬化。

理想的非酒精性脂肪肝动物模型应该具有：（1）模拟人类非酒精性脂肪肝的演变过程，具有人类脂肪肝病变特征。（2）形成率高，可控性强，重复性好，死亡率低。（3）方法简便易行，价格低廉。在诱导不同类型的非酒精性脂肪肝动物模型的建立中，肝炎和肝硬化两种动物模型较为常见，而单纯性脂肪肝还少见报道。另一方面，由于人体肝脏功能的复杂性与实验动物种族差异性、动物年龄的选择、饲料的控制、造模时间以及模型判定指标尚缺乏统一标准等因素的影响，使任何一种实验动物模型都不能全面、准确地反映人类脂肪肝的本质，尤其是单纯性脂肪肝的本质。因此，利用与人类遗传关系更接近的实验动物建立单纯性脂肪肝模型就显得尤为重要，更能反映和研究人类单纯性脂肪肝本质。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用亲缘关系更接近于人类的动物——树鼩，建立造模时间短、造模成功率及造模效率高的非酒精单纯性脂肪肝动物模型的方法。

本发明通过以下方式实现其目的： 

随机选取成年雄性和雌性树鼩作为模型动物，雄性成年体重120～140克，雌性成年体重110～130克，用高脂饲料供树鼩自由采食，高脂饲料成分为：每公斤普通饲料加20g胆固醇和200g猪油，并提供纯净水自由饮用，持续饲养14周，该期间为造模期。

所述方法是在造模期内树鼩普通饲料的营养成分为：19%<粗蛋白质<21%、4%<粗脂肪<5%。

所述方法进一步是随机选取成年雄性和雌性树鼩各10只作为模型动物的对照动物，雄性体重120～140克，雌性体重110～130克，自由采食普通饲料。

本发明具有以下优点和积极效果：

1、提供了一种利用亲缘关系较接近于人类的树鼩，建立非酒精单纯性脂肪肝动物模型的方法。相对于大、小鼠，兔子等啮齿类动物而言，树鼩的亲缘关系更接近于人类。因此，本发明用树鼩诱导的脂肪肝动物模型更能反映人类脂肪肝的本质。

2、本发明单纯性脂肪肝动物模型的建立方法安全可靠，所需的造模时间短，造模成功率和造模效率高，具有良好的应用前景。

3、通过建立单纯性脂肪肝动物模型，可以用来研究脂肪肝的发生机制，筛选保肝药物，探索保肝作用原理，甚至评价相关药物对该种疾病的药效评估，具有十分重要的意义。

附图说明

图1和图2是DIASUS超声仪10-22 MHz凸阵探头扫描正常树鼩肝组织超声图，肝组织回声均匀，肝脏内管道结构分布清晰。

图3为中度脂肪肝超声图，回声不均匀。

图4和图5为重度脂肪肝超声图，回声不均匀，肝脏内管道结构分布不清晰，肝脏肿大，肝前缘变钝。

图6和图7分别为HE染色正常肝切片（200×）、（100×）图。

图8为HE染色轻度脂肪样（200×）病变图。

图9为HE染色中度脂肪样（200×）病变图。

图10为HE染色重度脂肪样（200×）病变图，肝细胞约有75%脂肪变。

图11（100×）、图12（200×）和图13（400×）为HE染色重度脂肪样病变图，肝细胞约有95%脂肪变。

以下结合附图对本发明做进一步说明，本发明包括但不限于实施例列举的内容，如简单地扩大建立的动物数量也应当视为本发明的保护范围。

具体实施方式

（一）本发明模型的建立

实施例1：

随机选取成年雄性和雌性树鼩各20只作为模型动物，雄性成年体重120～140克，雌性成年体重110～130克，用高脂饲料由树鼩自由采食，高脂饲料的成分为：每公斤普通饲料加20g胆固醇和200g猪油。在造模期内，所有动物皆自由饮水。

造模期共为14周。7周后，60%的树鼩呈明显单纯性脂肪肝症状，14周后，80%的树鼩呈明显的单纯性脂肪肝症状，其中20%的树鼩呈重症单纯性脂肪肝症状，部分树鼩约有95%的肝细胞脂肪化。

在整个实验过程中，无动物死亡。

实施例2：

随机选取成年雄性和雌性树鼩各30只作为实验动物，雄性成年体重120～140克，雌性成年体重110～130克，其中，用成年雄性和雌性树鼩各10只作为对照动物，自由采食普通饲料，普通饲料营养成分为：19%<粗蛋白质<21%、4%<粗脂肪<5%。其余20只雄性和20只雌性动物作为模型动物，用高脂饲料由树鼩自由采食，其成分为：每公斤普通饲料加20g胆固醇和200g猪油。在造模期内，所有动物皆自由饮水。

在整个实验过程中，无动物死亡。

（二）树鼩脂肪肝诊断模式评价方法及结果

该方法包括血清生化标志物、影像学、病理组织学诊断。

1、血清生化标志物主要包括血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、血清总蛋白（TP）、葡萄糖（GLU）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IDBIL）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）和白球比（A/G）。

造模过程中，每周采血一次，实验树鼩禁食10小时，然后在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉条件下，尾静脉采血0.8毫升，3000rpm离心10分钟，分离血清，测试血清ALT、TP、GLU、TBIL、DBIL、IDBIL、ALB、GLO浓度和A/G值，分析结果显示：

ALT和TBIL指标在脂肪肝病变模型树鼩与正常对照组树鼩差异极显著（P<0.01）；DBIL和IDBIL指标在脂肪肝病变模型树鼩与正常对照组树鼩差异显著（P<0.05）；而TP、GLU、ALB、GLO与A/G指标在模型组与对照组之间差异均不显著（P>0.05）。

2、B超检查。

在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉条件下，采用DIASUS超声仪10-22 MHz凸阵探头对肝脏部位扫描，保存图片进行分析。结果显示：

正常肝组织超声图（见图1和图2）。肝实质光点微细、分布均匀；肝内管道系统走行正常，纹理清楚，透声良好。

中度脂肪肝超声图（见图3）。回声不均匀，肝脏内管道结构不清晰。

重度脂肪肝超声图（见图4和图5）。回声不均匀，肝脏内管道结构分布不清晰，肝脏肿大，肝前缘变钝。

3、病理组织学分析。

在氯胺酮10mg/kg肌肉麻醉条件下，活检肝组织，10%中性福尔马林固定，石蜡包埋、4um切片，制备肝脏组织学切片，用于HE染色，采用Leica显微镜观察肝细胞脂肪变性情况。病理切片分析结果：

正常肝切片，肝细胞正常，明显可见细胞核、胞质和膜【见图6（200×）和图7（100×），HE染色】。

轻度脂肪样病变图，明显可见脂肪细胞，同时可见大量正常肝细胞【见图8（200×），HE染色】。

中度脂肪样病变图，明显可见脂肪细胞，同时可见大量正常肝细胞。但脂肪细胞与正常肝细胞数量的比例明显增加【见图9（200×），HE染色】。

重度脂肪样病变图，可见大范围的脂肪细胞，正常肝细胞比例明显减少，肝细胞约有75%脂肪变【见图10（200×），HE染色】。

同样，重度脂肪样病变图，肝细胞约有95%脂肪病变【见图11（100×）、图12（200×）和图13（400×），HE染色】。

Claims (3)

1.树鼩非酒精单纯性脂肪肝动物模型的构建方法，其特征是随机选取成年雄性和雌性树鼩作为模型动物，雄性成年体重120～140克，雌性成年体重110～130克，用高脂饲料供树鼩自由采食，高脂饲料成分为：每公斤普通饲料加20g胆固醇和200g猪油，并提供纯净水自由饮用，持续饲养14周，该期间为造模期。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是在造模期内树鼩普通饲料的营养成分为：19%<粗蛋白质<21%、4%<粗脂肪<5%。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是随机选取成年雄性和雌性树鼩各10只作为模型动物的对照动物，雄性体重120～140克，雌性体重110～130克，自由采食普通饲料。

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