CN104509705B - 一种复合高脂饲料在构建非酒精性脂肪肝大鼠模型中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物实验模型领域，公开了一种复合高脂饲料及其在构建非酒精性脂肪肝大鼠模型中的应用。所述的高脂饲料由如下原料组成：按质量百分比计，77.5％大鼠基础饲料，10％鸡蛋，10％椰子油，2％胆固醇，0.5％胆盐；按大鼠体重计，丙戊酸钠500mg/kg/d。8周后，大鼠均出现典型的非酒精性脂肪肝症状：肝脏大量脂肪蓄积伴炎症细胞浸润。该发明造模时间短、成功率高，适用于有肝毒性副作用的药物合并高脂饮食所诱发的非酒精性脂肪肝的发病机制研究、相关防治措施的筛选及治疗药物的功效评价。

Description

一种复合高脂饲料在构建非酒精性脂肪肝大鼠模型中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种复合高脂饲料，及其在构建非酒精性脂肪肝动物模型中的应用，该动物模型可用于饮食复合药物所诱导的非酒精性脂肪肝的发病机制的研究及防治措施的评价。

背景技术

随着人们生活水平提高，生活习惯、饮食结构的改变，及超声等影像技术的广泛应用，非酒精性脂肪肝的发病率逐年上升，且呈低龄化趋势，已成为危害人类健康的三大肝病之一。非酒精性脂肪肝的成因复杂，高糖高脂饮食诱导的高脂血症、肥胖、糖尿病等认为是非酒精性脂肪肝的主要的高危因素。

大量新药的问世，药物性肝病的发病率相应增加，如扑热息痛、四氯化碳、丙戊酸、四环素等可引起广泛的肝细胞内脂肪沉积并伴随炎症等症状，与脂肪肝类似。慢性疾病需要长期甚至终身用药，伴随着高糖高脂等不良饮食习惯，食物与药物的相互作用对肝脏所带来的问题日益突显出来。阐明非酒精性脂肪肝的发病机制、制定有效的防治措施是医学界亟需攻克的难题。

鉴于医学伦理、研究技术的限制，非酒精性脂肪肝研究进展缓慢。临床前的动物模型是研究非酒精性脂肪肝发病机制、筛选有效的防治措施的重要手段。采用高脂饲料构建非酒精性脂肪肝动物模型是当前最常用的方法，具有操作简便、重复性好的优点；但也存在造模时间长，实验成本较高等缺陷。采用高浓度脂肪乳灌胃或药物如四氯化碳腹腔注射导致肝脏急性病变从而诱导非酒精性脂肪肝虽然造模时间短，但造模成功率低，动物死亡率高，发病机制、病变过程及组织学形态改变均与人类脂肪肝有较大差异。采用fa/fa大鼠，ob/ob小鼠及BHE大鼠等具有一定遗传特性的种系均可形成糖、脂肪代谢相关性的脂肪肝，但这些动物需要后天培养，价格极其昂贵，实用性有限。

当前常见的脂肪肝模型基本是单一地针对饮食或药物或酒精所诱导的肝损伤。然而，在非酒精性脂肪肝的形成过程中，肝脏往往会受到饮食、药物、环境化学物质等作用。显然，采用常规模型进行研究的时候，往往不能真实地反映疾病的发病机制和客观地评价防治措施。

发明内容

本发明的目的：提供一种复合高脂饲料，基于该饮食配方构建的非酒精性脂肪肝动物模型能模拟高脂饮食与长期药物所诱导的肝脏脂肪病变，模型建立简单、耗时短。

上述目的是由以下技术方案实现的：

一种复合高脂饲料，由如下配方构成：按质量百分比计，77.5％大鼠基础饲料，10％鸡蛋，10％椰子油，2％胆固醇，0.5％胆盐；按大鼠体重计，丙戊酸钠500mg/kg/d。

所述的高脂饲料原料及丙戊酸钠均为市售产品。

所述的复合高脂饲料用于构建非酒精性脂肪肝动物模型。

所述的大鼠优选健康雄性SD大鼠为模型动物，6-8周龄，体重180-220克。

所述SD大鼠自由采食高脂饲料，其中丙戊酸钠用生理盐水溶解，每天经灌胃给予500mg/kg/d，每天给予一次。

SD大鼠经复合高脂饲料饲养8周，得到非酒精性脂肪肝动物模型。

所述方法进一步是随机选取同批次SD大鼠作为对照动物，自由采食基础饲料，每天灌胃给予等量生理盐水。

本发明具有以下优点和积极效果：

1.本发明所述的复合高脂饲料配方简单，易于控制，构建的动物模型成功率高，造模时间短，有良好的应用前景。

2.本发明所构建的动物模型可用于研究药物与饮食在非酒精性脂肪肝的发病机制中的相互作用；筛选防治措施，评价饮食对药物的药理毒理的影响，都具有重要意义。

附图说明：

附图1为正常对照组大鼠肝脏表观图；

附图2为模型组大鼠肝脏表观图；

附图3为正常对照组大鼠肝脏切片HE染色观察结果(×200)；

附图4为模型组大鼠肝脏切片HE染色观察结果(×200)；

具体实施方式

(一)本发明模型的建立

实施例1选取健康雄性SD大鼠随机分成模型组和空白对照组。模型组大鼠经适应性饲养1周后，自由采食高脂饲料，同时每天灌胃给予剂量为500mg/kg/d的丙戊酸钠生理盐水溶液，每天给药1次，连续饲养8周。空白对照组大鼠则供给基础饲料，每天灌胃等量空白生理盐水，每天给药1次，连续饲养8周。

实施例2选取健康雄性SD大鼠(6-8周龄，体重180-220克)随机分成模型组和空白对照组。模型组大鼠经适应性饲养1周后，自由采食高脂饲料，同时每天灌胃给予剂量为500mg/kg/d的丙戊酸钠生理盐水溶液，每天给药1次，连续饲养8周。空白对照组大鼠则供给基础饲料，每天灌胃等量空白生理盐水，每天给药1次，连续饲养8周。造模期间，模型组大鼠喂饲的复合高脂饲料由如下配方构成：按质量百分比计，77.5％大鼠基础饲料，10％鸡蛋，10％椰子油，2％胆固醇，0.5％胆盐；按大鼠体重计，丙戊酸钠500mg/kg/d。造模4周后，大鼠出现脂肪肝症状，持续加重至8周时，大鼠表现为明显的脂肪肝症状。

(二)大鼠肝损伤评价方法及结果

评价方法包括肝脏体重比、血清生化标志物、肝脏脂质水平、解剖学、病理组织学诊断

1.肝脏体重比造模8周后，大鼠禁食12小时自由饮水，解剖大鼠，分别称量体重、肝重，比较两组大鼠的差异。结果见下表：

与空白组相比，模型组大鼠的体重虽未见显著变化，但反应肝脂变的肝重、肝脏体重比这两个指标值却显著升高(P＜0.05)。

2.血清生化标志物主要包括血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)。造模8周后，大鼠眼眶静脉采血，3000rpm离心15分钟，取血清测试血清AST、ALT、MDA浓度，检测结果见下表：

模型组大鼠的血清生化标志物水平与正常对照组差异显著(P＜0.05)，表明模型组大鼠的肝脏出现明显炎性病变。

3.肝脏脂质指标主要包括游离脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)。造模8周后，大鼠脱颈椎处死，迅速取出全肝，剪取同一部位肝脏组织，用磷酸盐缓冲液(PBS)将肝脏表面血污冲洗干净，加入四倍组织重量的PBS制成匀浆，3000rpm离心15分钟，取上清待用。用游离脂肪酸试剂盒、甘油三酯试剂盒、胆固醇试剂盒分别检测两组大鼠肝匀浆，检测结果见下表：

模型组大鼠的肝脏脂质水平(FFA、TG、TC)与显著高于正常对照组(P＜0.05)，表明模型组大鼠肝脏内大量的脂质沉积。

4.解剖学造模8周后，大鼠脱颈椎处死，沿胸骨正中线剖开腹部，充分暴露肝脏、腹网膜、肠道组织，拍照，解剖学结果见附图1和2。与空白组相比，模型组大鼠皮毛光泽暗淡略呈蜡样；肝脏体积显著增大，包膜紧张，边缘圆钝，呈奶黄色，油腻感厚重；而空白组大鼠肝脏则为正常解剖形态和色泽。

5.病理组织学诊断造模8周后，大鼠脱颈椎处死，剪取同一部位肝脏组织，10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片后常规脱蜡、脱水，HE染色，显微镜下行组织病理形态学检查。肝细胞脂肪变性计分按照《非酒精性脂肪肝诊断标准》，评价标准如下：

肝细胞变性：

“-”表示无明显病变

“+”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞数约占25％

“++”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞数约占50％

“+++”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞数约＞75％肝细胞细胞坏死：

“+”表示点状坏死

“++”表示碎片状坏死

“+++”表示桥接状坏死或大片坏死

炎细胞浸润：

“+”表示肝小叶内或汇管区少量的炎细胞浸润

“++”表示肝小叶内或汇管区中等量的炎细胞浸润

“+++”表示肝小叶内或汇管区大量的炎细胞浸润

病理切片分析结果：对照组大鼠正常肝切片，肝脏结构和肝细胞形态基本无异常情况[见图3]。模型组大鼠可见大范围的脂肪细胞(胞质内充满大量脂肪空泡)，肝汇管区有炎细胞浸润，肝细胞可见点状坏死，肝脏脂肪性病变比例＞75％[见图4]。

大鼠肝脏脂肪变性和炎症评分结果见下表：

评分结果表明，模型组大鼠肝细胞的炎症反应明显。

按本发明提供的方法，对大鼠进行造模，无一例动物死亡，成功率为100％。可见，本发明动物模型的建立方法安全可靠，成功率高，填补了长期饮食复合药物诱导非洒精性脂肪肝模型的空白，具有良好的应用前景，对研究非酒精性脂肪肝复杂的危险因素，筛选有效的防治措施都有着重要意义。

Claims (2)

1.一种复合高脂饲料在大鼠非酒精性脂肪肝实验模型的构建中的应用，其特征在于，所述模型建立包括以下步骤：

1)SD大鼠自由进食高脂饲料，

2)每日灌胃给予丙戊酸钠生理盐水溶液1次，所述丙戊酸钠的浓度为500mg/kg/d，

3)经上述复合高脂饲料喂养8周得到非酒精性脂肪肝大鼠模型；

其中，所述复合高脂饲料配方由以下原料构成：按质量百分比计，77.5％大鼠基础饲料，10％鸡蛋，10％椰子油，2％胆固醇，0.5％胆盐。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的大鼠为180～200g，6～8周龄的SD大鼠。