CN112088837A - 一种非酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法,该方法采用高脂高糖饮食与昼夜节律紊乱协作诱导小鼠非酒精性脂肪肝模型建立。本发明的方法耗时短、造模成功率高、成本低且无因使用化学试剂而导致的毒副作用,称为绿色动物模型。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域,涉及一种非酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法,具体涉及一种由高脂高糖饮食及节律紊乱诱导小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立方法。
背景技术
非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指无酒精摄入病史,而以脂肪组织在肝脏内聚集(≥5%)为主要特征的病理表现。在一般人群中,目前非酒精性脂肪肝患病率为10%以上,而在发达国家,则超过30%,在肥胖人群中,非酒精性脂肪肝患病率高达75%。近十年,随着人们生活条件的好转和生活方式的改变,其患病率还在不断上升。据研究报道,非酒精性脂肪肝的发病原因除了与肥胖、2型糖尿病、代谢综合征、以及药物所致的肝损伤等有关以外,也与高糖高脂饮食和作息紊乱等因素密切相关。由于非酒精性脂肪肝病情复杂,目前尚无好的治疗方法,各医疗研究机构都在研发针对非酒精性脂肪肝的特效药,因而,无论是新药的安全性评估还是疗效分析,都需要既经济又可靠的动物模型。
目前,市场上尚无具有遗传稳定性的非酒精性脂肪肝小鼠模型,一般的此类模型,都是后天诱导所得。不同的造模方法所需时间不同,通常的造模方法是用化学试剂配合高脂饮食,化学试剂造成肝脏损伤,随后受损的肝脏细胞吸收高脂饲料中的脂肪滴。此类方法耗时长,且化学试剂造成的肝损伤容易导致小鼠猝死,不但使得造模成功率降低、造模成本提高,而且也不符合人体非酒精性脂肪肝的生理病理特征。
CN111084784A公开了一种非酒精性脂肪肝小鼠模型的建立方法,通过HFD(高脂)饲料诱导建立非酒精性脂肪肝(NAFLD)小鼠模型,20周建成。
CN105850867A一种伴有肥胖、血脂异常和胰岛素抵抗等特征的由高脂诱导的非酒精性脂肪肝病动物模型的建立方法。该发方法选用C57BL/6小鼠,随机分模型组和对照组,适应性喂养后,模型组给予高脂饲料,对照组给予对照饲料,期间每周测量体重一次,10周后取血处死,检测常规血脂及肝功能;取鲜活肝测定组织内胆固醇与甘油三酯含量;另取肝组织做进行H.E.和油红O染色,判定NAFLD模型效果与质量。其中,模型组与对照组均采取正态分布分组方法,即以小鼠体重为依据,将小鼠划分为高、中、低三个体重区间,将每个区间随机分配到模型组和对照组中,模型组和对照组,每组8只,模型组喂食高脂饲料,对照组喂食对照饲料,在饲养方法上采取单只单笼饲养措施,饲料定量定投,早晚各一次,维持20g/笼,保证较小的组内差异,2-3天换垫料,给笼具消毒,垫料为刨花木屑,里面含有小木块,要求高压灭菌,造模10周,期间自由引水,水源为SPF级的灭菌水,每周称量体重一次。各组取肝脏同一部位,分两份,一份进行石蜡切片,并对其进行H.E.染色,另一份进行冰冻切片,并对其进行油红O染色;进行分析,确定利用C57BL/6小鼠经高脂诱导成功建立了伴有肥胖、血脂异常、胰岛素抵抗特征的非酒精性脂肪肝病动物模型。
CN103462948B一种新型非酒精性脂肪肝病模型制备方法,包括以下步骤:a.将饲养小鼠随机分两组,第一组:模型小组:第二组:对照小鼠;每天记录状态并取尿液、肝组织及血液作脂质分析;b.处理实验对象;c.建立模型;d.肝组织与血液采集;e.将鼠肝组织标本进行常规冰冻切片,取材、普通胶水包冰冻切片、染色后封片;f.对模型小鼠常规进行病理检查;g.对对照小鼠常规进行病理检查;将f)和g)步骤中得出的动态分析肝组织脂肪进行对比,所述肉毒碱拮抗物,即THP;每天按照小鼠的实际体重,按重量为0.05%计算THP用量,以0.85%NaCl溶解,经腹腔注射一次/天,注射2~4周;小鼠暂养条件:所述两组野生型小鼠均置于湿度55%,温度为22±2℃,12小时昼/夜交替的恒温环境饲养;所述对照小鼠以等量0.85%NaCl溶液,经腹腔注射。
以上构建的非酒精性脂肪肝病模型要么采用化学药损伤肝的方法造模,要么选取周期非常长,成本高,不绿色,与正常的非酒精性脂肪肝形成病理区别较大,作为药物试验的模型有失科学性和真实性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法,该方法采用高脂高糖饮食与节律紊乱协作诱导小鼠非酒精性脂肪肝模型建立。本发明的方法耗时短、造模成功率高、成本低且无因使用化学试剂而导致的毒副作用,称为绿色动物模型。
本发明的一种非酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法,包括以下步骤:
(1)将SPF级C57BL/6雄性小鼠32只,适应性饲养一周,每天更换垫料,在此期间喂基础饲料和饮用纯净水;
(2)将上步饲养一周的小鼠随机分为造模组和对照组,每组16只,其中,造模组用高脂高糖饲料喂养并使节律紊乱,对照组用普通饲料喂养并正常作息时间;
(3)每周一次定时监测空腹小鼠体重;
(4)分别于饲养第8和12周,隔夜禁食后称重,随后麻醉并处死小鼠,分离取出肝脏,称量,立即制作冰冻切片并行油红O染色,判断造模是否成功。
上述本发明的构建方法,步骤2)所述的高脂高糖饲料包含26.2%蛋白质、34.9%脂肪、26.3%碳水化合物和12.6%微量元素,所述的普通饲料包含:19.2%蛋白质、4.3%脂肪、67.3%碳水化合物和9.2%微量元素。
优选的,上述本发明的非酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法,造模组的饮用水为糖水,所述糖水为每kg水含有800-850g糖,优选含有830g糖,其中,所述糖由重量百分比的55%葡萄糖和45%果糖组成。对照组的饮用水为Millipore纯水系统所制。
上述本发明的构建方法,步骤1)中所述的饮用水为Millipore纯水系统所制纯净水。步骤2)中所述的节律紊乱是指小鼠昼夜颠倒作息。
上述本发明的构建方法,所述小鼠给食时间为:
造模组小鼠:给食时间:8:00-20:00,在此期间自由摄食饮水;
断食时间:20:00-次日8:00,在此期间禁食禁水
对照组小鼠:任何时间均可自由摄食饮水。
所述小鼠在清洁级动物饲养房内饲养,室内温度保持在18-23℃,相对湿度保持在50%-55%,保证室内空气流通。
在一具体实施方案中,本发明的非酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法,包括以下步骤:
(1)购买SPF级C57BL/6雄性小鼠32只,体重为16±2g(购自中国农业科学院兰州兽医研究所),小鼠4只/笼饲养,适应性饲养一周,每天更换垫料,在此期间给予基础饲料;
(2)将小鼠随机分为造模组和对照组,每组16只,分别为高脂高糖饮食并节律紊乱组(造模组)和普通饲养并作息正常组(对照组);
(3)配制高脂高糖饲料和普通饲料,造模组小鼠被给予高脂高糖饲料及昼夜颠倒作息(小鼠为夜行动物),对照组小鼠被给予普通饲养并作息正常;
(4)分别在饲养第8和12周,每组随机抽取8只小鼠,空腹称重后处死,取新鲜肝脏组织做冰冻切片,随后油红O染色,剩余的肝脏组织用4%的多聚甲醛固定,随后以石蜡包埋,连续切片并HE染色,最后在显微镜下观察油红O和HE染色切片,判断肝脏组织的病理变化。
本发明的构建方法在饲养第8周即可成功获得非酒精性脂肪肝小鼠模型,第12周非酒精性脂肪肝症状已非常典型。
本发明的构建方法所述的高脂饲料由26.2%蛋白质、34.9%脂肪、26.3%碳水化合物和12.6%微量元素组成;造模组的饮用水为糖水,即将糖溶于Millipore纯水系统所制纯净水中得到,即830g糖/kg水,其中,所述糖由55%葡萄糖和45%果糖组成。
本发明的构建方法,造模组小鼠的给食时间为8:00-20:00,在此期间自由摄食饮水,断食时间为20:00-次日8:00,在此期间禁食禁水;
本发明的构建方法,动物饲养条件为:清洁级动物房,室内温度保持在18-23℃,相对湿度保持在50%-55%,保证室内空气流通。
本发明的非酒精性脂肪肝模型实质上是一种由高脂高糖饮食及节律紊乱诱导小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立。以模拟人群高脂高糖等不良饮食习惯及昼夜颠倒的生活方式、诱导小鼠非酒精性脂肪肝模型的建立,全程无化学试剂参与,故而与人类非酒精性脂肪肝发生发展的病理机制较为接近。实验动物非酒精性脂肪肝相关症状和机体内环境改变也与人类相似,此种动物模型耗时短、成本低、成功率高、无因使用化学试剂而产生的毒副作用,且稳定性较好,更适合用于非酒精性脂肪肝的机制及药物治疗研究。
附图说明
图1为本发明采用高脂高糖饮食与节律紊乱构建的非酒精性脂肪肝小鼠体重变化趋势图;
图2为本发明采用高脂高糖饮食与节律紊乱构建的小鼠非酒精性脂肪肝视觉检查照片;
图3为本发明采用高脂高糖饮食与节律紊乱构建的非酒精性脂肪肝小鼠肝脏油红O染色镜下检测结果;
图4为本发明采用高脂高糖饮食与节律紊乱构建的非酒精性脂肪肝小鼠肝脏HE染色镜下病理学检测结果。
具体实施方式
以下实施例仅是代表性的,用于进一步阐明和理解本发明的精神实质,但不以此限制本发明的范围,任何在本发明的精神实质下进行简单的修饰或变通都属于本发明的范围。
实施例1非酒精性脂肪肝小鼠模型的构建
本发明的非酒精性脂肪肝小鼠模型的构建主要采用高脂高糖饮食及昼夜节律紊乱诱导非酒精性脂肪肝产生,从而建立非酒精性脂肪肝小鼠模型。
其构建方法,包括以下步骤:
步骤1:SPF级C57BL/6J雄性小鼠32只,体重为16±2g,购自中国农业科学院兰州兽医研究所。适应性饲养一周后随机分为两组,分别为高脂高糖饲料及节律紊乱的造模组,普通饲料及正常作息的对照组。
步骤2:按照配方进行制备高脂高糖饲料和普通饲料。对造模组给予高脂高糖饲料饲养,对照组给予普通饲料饲养。每日按8g/100g干饲料投放饲料,自由摄食饮水。普通组饲料的组成:19.2%蛋白质+4.3%脂肪+67.3%碳水化合物+9.2%微量元素,饮水为Millipore纯水系统所制纯净水;任何时间均可自由摄食饮水。高脂高糖组饲料组成:26.2%蛋白质+34.9%脂肪+26.3%碳水化合物+12.6%微量元素,饮水为糖水,由55%葡萄糖+45%果糖配比的糖溶于Millipore纯水系统所制纯净水制得,其中水与糖的重量比为100:83;给食时间为8:00-20:00,在此期间自由摄食饮水,断食时间为20:00-次日8:00,在此期间禁食禁水。
步骤3:分别于饲养第8和12周每组随机抽取8只小鼠处死后分离肝脏,部分新鲜肝脏组织制备冰冻切片,油红O染色;剩余肝脏组织用4%多聚甲醛固定,以石蜡包埋,连续切片,HE染色,最后在显微镜下观察油红O切片及HE切片中肝脏组织的病理变化。
实施例2检查和判断非酒精性脂肪肝小鼠模型是否建立成功
检查方法如下:
肝脏大体标本检查:
处死小鼠后,开腹行肉眼观察肝脏大体形态、大小及颜色,用指腹触摸感受肝脏质地,分离肝脏后触摸肝脏切面。可见对照组小鼠肝脏呈红褐色,质地柔软,肝韧带附近无明显脂肪组织,模型组(造模组)小鼠肝脏部分区域呈淡黄色,肝脏略有增大,肝包膜轻度紧张,切面轻微油腻感。
肝指数:
分别于喂养的第8和12周,每组随机选取小鼠,空腹称重,随后处死小鼠,取完整肝脏于磷酸盐缓冲液中洗净,滤纸吸干水分称重并计算肝指数。肝指数=肝湿重/末次体重×100%。
肝功能变化,取小鼠全血4℃静止过夜,随后离心取血清用全自动生化分析仪做肝功能检测。
肝脏组织病理学变化:取新鲜肝组织做冰冻切片,油红O染色;其余部分肝组织用4%多聚甲醛固定、石蜡包埋、连续石蜡切片,HE染色,随后在光学显微镜下观察肝脏组织病理学改变。
非酒精性脂肪肝模型建造成功的标准:
实验性啮齿类大、小鼠非酒精性脂肪肝模型建立成功的金标准为肝脏细胞内有大量脂肪泡沉积。
统计学方法数据录入GraphPad Prism7.0软件进行统计分析,结果描述以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,有差异再进行两两比较,检验水准α=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义。
结果分析:
(1)体重:在第1-6周两组小鼠体重均无统计学差异,但随着时间变化造模组体重均大于对照组的趋势,即高脂高糖饲料组的小鼠体重与普通饲料组的小鼠体重差值增大。如图1所示。图1中,LFD为低脂饮食组小鼠,HFD为高脂饮食组小鼠。
(2)肝脏视觉检查:处死小鼠后,分离肝脏并观察其大体形态、大小、颜色、用食指指腹触摸感受肝脏质地。相比于对照组,造模组小鼠肝脏包膜紧张,略有增大,部分区域呈淡黄色,肝韧带附近可见脂肪组织,切面轻微油腻,如图2所示。图2中,LFD为低脂饮食组小鼠,HFD为高脂饮食组小鼠。
(3)肝脏指数:造模组肝体脂数大于对照组,且具有统计学意义。
(4)肝功能变化:取小鼠全血4℃静置过夜后离心分离血清,全自动生化分析仪做肝功能检测。见表1所示。
表1
上表1是本发明高脂高糖饮食及节律紊乱诱导所得非酒精性脂肪肝小鼠模型的肝功能生化检测结果,其中,LFD为低脂饮食组小鼠,HFD为高脂饮食组小鼠。
(5)油红O染色:肝脏组织冰冻切片并行油红染色,显微镜下观察发现造模组小鼠肝脏细胞内聚集了大量的脂肪滴,而对照组小鼠肝脏细胞内的脂肪滴较少,如图3所示。图3中,LFD为低脂饮食组小鼠,HFD为高脂饮食组小鼠。
(6)肝脏组织病理学改变:肝脏组织HE染色镜下观察组织病理学改变时发现,对照组小鼠肝脏汇管区无明显炎细胞浸润,细胞间极少充血,未发现明显的脂肪病变,而造模组小鼠肝脏组织内可见明显大泡性脂肪变干细胞,如图4所示。图4中,LFD为低脂饮食组小鼠,HFD为高脂饮食组小鼠。
通过以上检查、观察和生化指标数据检测结果,实施例1的方法成功构建成非酒精性脂肪肝小鼠模型。
应当指出,综上所述实施例仅是本发明的优选实验方法,对于技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本实验原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰品,这些改进和润饰也应该视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种非酒精性脂肪肝小鼠模型的构建方法,包括以下步骤:
(1)将SPF级C57BL/6雄性小鼠适应性饲养一周,每天更换垫料,在此期间喂基础饲料和饮用纯净水;
(2)将饲养一周的小鼠随机分为造模组和对照组,其中,造模组用高脂高糖饲料喂养并使其生活节律紊乱,对照组用普通饲料喂养并正常作息时间;
(3)每周一次定时监测空腹小鼠体重;
(4)分别于饲养第8和12周,隔夜禁食后称重,随后麻醉并处死小鼠,分离取出肝脏,称量,立即制作冰冻切片并行油红染色,判断造模是否成功。
2.根据权利要求1所述的构建方法,步骤2)所述的高脂高糖饲料包含26.2%蛋白质、34.9%脂肪、26.3%碳水化合物和12.6%微量元素。
3.根据权利要求1所述的构建方法,步骤2)所述的普通饲料包含:19.2%蛋白质、4.3%脂肪、67.3%碳水化合物和9.2%微量元素。
4.根据权利要求1所述的构建方法,造模组的饮用水为糖水,对照组的饮用水为Millipore纯水系统所制纯净水。
5.根据权利要求4所述的构建方法,所述糖水为每kg水含有800-850g糖,优选含有830g糖,所述糖由重量百分比的55%葡萄糖和45%果糖组成。
6.根据权利要求1所述的构建方法,步骤1)中所述的饮用纯净水为Millipore纯水系统所制。
7.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于所述小鼠给食时间为:
造模组小鼠:给食时间:8:00-20:00,在此期间自由摄食饮水,
断食时间:20:00-次日8:00,在此期间禁食禁水;
对照组小鼠:任何时间均可自由摄食饮水。
8.根据权利要求1所述的构建方法,步骤2)中所述的节律紊乱是指小鼠昼夜颠倒作息。
9.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于:所述小鼠在清洁级动物饲养房内饲养,室内温度保持在18-23℃,相对湿度保持在50%-55%,保证室内空气流通。
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