CN105596684A - 一种知母提取物和百合知母提取物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种知母提取物,该知母提取物对STZ+高脂诱导的2型糖尿病模型、灌胃AlCl3诱导的痴呆模型以及STZ+高脂+AlCl3诱导的复合模型大鼠的糖脂代谢有明显的调节作用,对3种模型引起的认知障碍有明显的改善作用;本发明提供了一种百合知母提取物,该百合知母提取物能显著改善抑郁症伴IBS模型大鼠的症状。
Description
技术领域
本发明涉及一种提取物,具体涉及一种知母提取物和百合知母提取物
背景技术
糖尿病(Diabetesmellitus)是一种常见的疾病,是严重影响人类健康的一类代谢性疾病。目前已有大量研究证明糖尿病起着加速大脑衰老的作用。糖尿病最大危害在于动脉硬化及微血管病变基础上产生多种慢性并发症,可遍及全身,如糖尿病心脏病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病周围神经病变等。过去糖尿病引起脑损害的相关研究主要集中在糖尿病脑血管病变,近来糖尿病和认知功能障碍的相关性研究越来越受到重视。随着人口老龄化进程的加快,2型糖尿病(T2DM)和老年痴呆均已成为全球面临的严重社会问题。研究表明糖尿病患者中有60%-70%存在轻度认知功能障碍、痴呆,T2DM成为认知功能减退的一个危险因素。近几年,科学界提出了一个新术语-糖尿病相关认知能力下降(Diabetes-associatedcognitivedecline,DACD),指轻至中度的认知功能障碍状态,特别指精神运动性迟缓和思维灵活性下降。而轻度认知障碍(mildcognitiveimpairment,MCI)是正常衰老到阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)的过渡阶段,也是痴呆的高危人群,其发展为痴呆的风险是非痴呆者的10倍。
抑郁症(Majordepression)是临床常见的精神疾患之一,其较高的发病率、复发率、致残率及致死率(自杀),严重危害个人、家庭、社会;全球范围内呈现出的终生患病率高达20%,世界卫生组织预测,到2020年将上升到世界第二大疾病。抑郁症的核心症状包括情绪低落和快感缺乏,食欲和体重改变,精神低落,烦躁不安,睡眠障碍等;亦有腹痛、腹胀、排便习惯改变和大便性状异常、粘液便等肠道异常表现。肠易激综合征(irritablebowelsyndrome,IBS)是一种较常见的慢性肠功能紊乱综合征,无器质性或异常的生化指标,其病因和发病机制尚未完全明确,其治疗也限于对症。此病约占消化道疾病专科门诊患者的一半左右,临床特点为持续或间歇发作的腹胀、腹痛、排便习惯异常(便秘、腹泻和便秘与腹泻交替)和粪便性状改变。胃肠动力紊乱和内脏高敏感是其病理基础,一般认为与精神心理应激、脑-肠互动功能紊乱、胃肠道动力障碍、感染、肠道菌群失调、饮食不洁、遗传、免疫和神经内分泌紊乱等因素有关。这些因素均可单独或联合发挥作用引起或加重IBS的症状。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种知母提取物和百合知母提取物。
为实现上述目的,所采取的技术方案:一种知母提取物,所述知母提取物是由以下方法制备而成的:
(1a)将知母用70%乙醇水溶液提取,得到提取液;
(2a)用大孔树脂柱对步骤(1a)中得到的提取液进行吸附处理,先用蒸馏水和20%乙醇水溶液洗脱除去杂质,然后用70%乙醇水溶液洗脱,收集所述70%乙醇水溶液洗脱出来的洗脱液,浓缩至干,得到所述知母提取物。
优选地,所述步骤(1a)中知母与70%乙醇水溶液的重量比为1:11。
优选地,所述步骤(2a)中蒸馏水的用量为20倍柱体积,所述20%乙醇水溶液的用量为3倍柱体积,所述70%乙醇水溶液的用量为3倍柱体积。
本发明提供了一种百合知母提取物,所述百合知母提取物是由以下方法制备而成的:
(1b)将百合和知母混合后用70%乙醇水溶液提取,得到提取液;
(2b)用大孔树脂柱对步骤(1b)中得到的提取液进行吸附处理,先用蒸馏水和20%乙醇水溶液洗脱除去杂质,然后用70%乙醇水溶液洗脱,收集所述70%乙醇水溶液洗脱出来的洗脱液,浓缩至干,得到所述百合知母提取物。
优选地,所述百合和知母的重量比为1:1~3。
优选地,所述百合和知母的重量比为1:1。
优选地,所述百合和知母的总重量与所述70%乙醇水溶液的重量之比为1:11。
优选地,所述步骤(2b)中蒸馏水的用量为20倍柱体积,所述20%乙醇水溶液的用量为3倍柱体积,所述70%乙醇水溶液的用量为3倍柱体积。
本发明还提供了上述所述的知母提取物在制备改善认知障碍的药物中的用途。
本发明还提供了上述所述的知母提取物在制备降低血糖的药物中的用途。
本发明还提供了上述所述的百合知母提取物在制备治疗抑郁症伴肠易激综合征的药物中的用途。
本发明的有益效果在于:本发明提供了一种知母提取物,该知母提取物对STZ+高脂诱导的2型糖尿病模型、灌胃AlCl3诱导的痴呆模型以及STZ+高脂+AlCl3诱导的复合模型大鼠的糖脂代谢有明显的调节作用,对3种模型引起的认知障碍有明显的改善作用;本发明提供了一种百合知母提取物,该百合知母提取物能显著改善抑郁症伴IBS模型大鼠的症状。
附图说明
图1为本发明实施例1中注射STZ前后大鼠血糖变化柱状图;
图2为本发明实施例1中给药20周NC组、DM组和ZDM组大鼠平均体重变化趋势图;
图3为本发明实施例1中给药20周NC组、AD组、ZAD和NK组大鼠平均体重变化趋势图;
图4为本发明实施例1中给药20周NC组、AM组和ZAM组大鼠平均体重变化趋势图;
图5为本发明实施例1中给药20周各组大鼠平均体重变化趋势图;
图6为本发明实施例1中A-正常组和B-DM模型组的形态图;
图7为本发明实施例1中给药8周Barnes迷宫实验短期记忆实验结果,图7A:探究任意洞潜伏期,图7B:到达目标洞潜伏期,图7C:错误次数,与正常组相比,*p<0.05,**p<0.01;与模型组相比,Δp<0.05,ΔΔp<0.01;
图8为本发明实施例1中给药8周Barnes迷宫实验长期记忆实验结果,图8A:探究任意洞潜伏期,图8B:到达目标洞潜伏期,图8C:错误次数,与正常组相比,*p<0.05,**p<0.01;与模型组相比,Δp<0.05,ΔΔp<0.01;
图9为本发明实施例1中给药16周Barnes迷宫实验短期记忆实验结果,图9A:探究任意洞潜伏期;图9B:到达目标洞潜伏期;图9C:错误次数,与正常组相比,*p<0.05,**p<0.01;与模型组相比,Δp<0.05,ΔΔp<0.01;
图10为本发明实施例1中给药16周Barnes迷宫实验短期记忆实验结果,图10A:探究任意洞潜伏期;图10B:到达目标洞潜伏期;图10C:错误次数,与正常组相比,*p<0.05,**p<0.01;与模型组相比,Δp<0.05,ΔΔp<0.01;
图11为本发明实施例1中大鼠探究两个相同物体时间柱状图,A1和A2是两个相同的物体;
图12为本发明实施例1中大鼠探究两个不同物体时间,A1和B是两个不同的物体,*p<0.05,**p<0.01;
图13为本发明实施例1中连续4天定位航行实验结果(分别为图13A、13B、13C、13D),与正常组相比,*p<0.05,**p<0.01;与模型组相比,Δp<0.05,ΔΔp<0.01;
图14为本发明实施例1中连续4天定位航行实验结果;
图15为本发明实施例1中空间探索实验结果(第一象限百分比);
图16为本发明实施例1中给药8、16周各组大鼠FPG柱形图,与正常组相比,*p<0.05,**p<0.01;与模型组相比,Δp<0.05,ΔΔp<0.01;
图17为本发明实施例1中给药8、16周各组大鼠TC柱形图,与正常组相比,*p<0.05,**p<0.01;与模型组相比,Δp<0.05,ΔΔp<0.01;
图18为本发明实施例1中给药8、16周各组大鼠TG柱形图,与正常组相比,*p<0.05,**p<0.01;与模型组相比,Δp<0.05,ΔΔp<0.01;
图19为本发明实施例1中血糖水平与取血时间,与正常组比较,**P<0.01,*P<0.05;与模型组比较,△△P<0.01,△P<0.05;
图20为本发明实施例1中给药10周糖耐量实验血糖变化柱状图;
图21为本发明实施例1中血糖曲线下面积AUC图,与正常组比较,**P<0.01,*P<0.05;与模型组比较,△△P<0.01,△P<0.05;
图22为本发明实施例2中各皂苷对抑郁症伴IBS大鼠体质量的影响趋势图(n=8);
图23为本发明实施例2中各提取物对抑郁症伴IBS大鼠水平穿越格子数评分结果柱状图;
图24为本发明实施例2中各提取物对抑郁症伴IBS大鼠垂直站立次数评分结果柱状图;
图25为本发明实施例2中各提取物对抑郁症伴IBS大鼠理毛次数评分结果柱状图;
图26为本发明实施例2中各提取物对抑郁症伴IBS大鼠糖水消耗量的结果柱状图;
图27为本发明实施例2中各提取物对抑郁症伴IBS大鼠强迫游泳不动时间的影响柱状图;
图28为本发明实施例2中各提取物对抑郁症伴IBS大鼠球囊结直肠扩张(1.5mL)下AWR评分的影响柱状图;
图29为本发明实施例2中各提取物对抑郁症伴IBS大鼠球囊结直肠扩张(2.0mL)下AWR评分的影响柱状图;
图30为本发明实施例2中各提取物对抑郁症伴IBS大鼠排便粒数的影响柱状图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1:知母提取物对糖尿病性认知障碍模型大鼠的影响
本实施例采用腹腔注射链脲佐菌素(STZ)联合喂食高脂饲料诱导SD大鼠糖尿病模型、AlCl3灌胃引起的痴呆模型以及STZ联合高脂+AlCl3灌胃引起的复合模型,探讨知母有效部位提取物对糖尿病模型、痴呆模型以及复合模型大鼠认知障碍的药效。
1、材料和方法
1.1实验动物:SD大鼠,雄性,SPF级,180-220g,合格证号:SCXR(粤)2013-0085,购于南方医科大学实验动物中心。饲养于广州中医药大学实验动物中心SPF级动物房,饲养条件为恒温23±2℃,相对湿度50~60%,采用12h∶12h昼夜间断照明;自由进食饮水。每个鼠笼饲养4只,用苦味酸标记。
1.2试药:知母提取物(实验室自制):
(1)将知母药材粉末用10倍重量的70%乙醇水溶液渗漉提取,渗漉速度不超过0.15BV/h,得到提取液;
(2)用改良的pipo-1型大孔树脂加压吸附步骤(1a)中得到的提取液中的提取物,生药与湿树脂质量比为1000:70,先用20BV蒸馏水和3BV20%乙醇水溶液洗脱除去杂质,然后用3BV70%乙醇水溶液洗脱,收集所述70%乙醇水溶液洗脱出来的洗脱液,减压浓缩至干,得到所述知母提取物。
双蒸水(学校自制),乙醚,75%乙醇,生理盐水。肝素钠(江苏万邦生化医药股份有限公司,批号:1301107);链脲佐菌素(STZ,美国sigma公司,批号:040M1357);柠檬酸、柠檬酸钠均为分析纯(天津市大茂化学仪器厂,批号:20101201-2),脑复康片(广东华南药业,批号:140203)。
试剂盒:葡萄糖(Glu)试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司);甘油三酯(TG)试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司);总胆固醇(TC)试剂盒(上海荣盛生物药业有限公司)。
1.3饲料配比:高脂饲料配方组成:基础饲料52.2%,蔗糖20%,酪蛋白10%,磷酸氢钙0.6%,石粉0.4%,添加剂0.4%,猪油15%,胆固醇1.2%,胆盐0.2%。由广东省医学实验动物中心加工,饲料合格证号:SCXK(粤)2013-0002。基础饲料,SPF级,由广东省医学实验动物中心提供。
1.4糖尿病模型诱导方法:雄性SD大鼠64只,在饲养观察室里适应性饲养1周后,禁食16h,取血,测定空腹血糖(fastingplasmaglucose,FPG)、总胆固醇(Totalcholesterol,TC)、总甘油三酯(Totaltriglyceride,TG),作为基础糖脂水平。随机取32只作为正常对照组(NC)、痴呆模型组(AM组),痴呆模型给药组(ZAM组)、脑复康组(NK组),每组8只,一直到实验结束均喂食基础饲料,其余大鼠在取血后适应4天,禁食14h后,腹腔注射STZ35mg/kg(正常组注射缓冲盐溶液)造高血糖模型,在30min内注射完毕。3周后,禁食16h,测定血糖、TC、TG,根据血糖、TC、TG及体重,随机均匀分组,其中糖尿病模型组(DM组)8只,DM给药组(ZDM组)8只,复合模型组(AM组)8只,AM给药组(ZAM组)8只,并开始喂饲高脂饲料,开始给药,每天上午灌胃,连续给药4(16周)个月。其中AD组、ZAD组、AM组、ZAM组每天灌胃AlCl3水溶液,500mg/kg/d连续8周,第9周开始自由饮用1.6g/LAlCl3直至实验结束。
1.5给药剂量方法:根据2010版药典,按临床生药量计,以人体重(60kg)折算大鼠的临床等效剂量。药典知母常用剂量6-12g,本实验用12g计算,知母总皂苷提取率7%,大鼠系数为7,所以大鼠一般给药剂量为12000mg×7%/60kg*7=98mg/kg。高剂量为98mg/kg×2=196mg/kg。脑复康片按说明书人体给药剂量换算。
1.6样本采集及指标测定
1.6.1一般指标观察:给药期间,每周称大鼠体重2次,每周记录连续3天的摄食量。
1.6.2行为学指标测定:分别采用Barnes迷宫实验、新颖物体识别实验和Morris水迷宫实验进行行为学指标测定。
1.6.3血液生化指标观察
1.6.3.1大鼠禁食16h血样采集:在大鼠给药8周禁食16h,乙醚麻醉,眼眶静脉丛取血,血样4℃低温离心取血浆,分别测定FPG、TC、TG。
于给药10周后,每组随机选择6只进行口服糖耐量实验(oralglucosetolerancetest,OGTT)。
在大鼠给药16周禁食16h,乙醚麻醉,眼眶静脉丛取血,血样4℃低温离心取血浆,分别测定FPG、TC、TG。
1.7统计方法
所有数据用均数标准差()表示,采用SPSS13.0统计软件对数据进行统计分析,组件比较用单因素方差分析(one-wayANOVA),以P<0.05为差异有显著性。
2、结果
2.12型糖尿病大鼠模型建立
2.1.1注射STZ前后大鼠体重变化
表1注射STZ前后大鼠体重变化(n=6,)
注:与正常组相比,*P<0.05,**P<0.01。
结果显示:在注射STZ前,正常组与模型组之间大鼠体重差异均无显著性(p>0.05)。但在注射STZ后,与正常组相比,模型组大鼠体重显著降低(p<0.01),说明链脲佐菌素(STZ)对大鼠胰岛β细胞有一定的破坏能力(见表1)。
2.1.2注射STZ前后大鼠血糖变化:如图1所示:适应性饲养一周后,正常组与模型组大鼠基础血糖水平无差异。注射STZ3周之后,大鼠禁食16小时,眼眶取血测定Glu值,发现模型组与正常组比较差异显著(P<0.01)。提示,糖尿病大鼠模型建模成功。
2.2一般指标观察结果
2.2.1大鼠体重变化:分别统计正常组与3个模型组和相应知母提取物给药组体重变化以及增长趋势。结果分析如下(注:第2周注射STZ,第5周分组并开始给药,其中DM组、ZDM组、AM、ZAM组开始饲喂高脂饲料,第6周开始算给药1周)。
2.2.2大鼠形态变化:从大鼠形态可以看出,正常组大鼠体形均匀,毛色顺滑,大鼠活泼好动,精神状态好;而模型组大鼠体态明显肥胖,毛色失去光泽,显得杂乱,大鼠精神状态不佳。解剖发现,模型组大鼠体内脂肪明显要多于正常组大鼠,呈现脂肪堆积,尤其是肠系膜周围脂肪和附睾脂肪,如图6。
从体重变化趋势图可以看出,在开始饲喂高脂饲料之后,DM组和ZDM组体重相对正常组上升明显,并逐渐呈现出显著差异;而从给药第3周开始,给药组能明显降低糖尿病大鼠体重的作用,说明知母提取物具有一定的降脂作用,如图2。铝是慢性蓄积性神经毒物,与痴呆的发病率、死亡率密切相关关,铝选择性地蓄积在大脑受累及的神经元,铝在体内的大量累积会导致大脑损害,体重减轻等。如图3所示,随着AD组、ZAD组以及NK组灌胃AlCl3时间的延长,其体重会明显减轻,而通过给药之后,能抑制体重减轻,使其基本维持正常水平。而复合模型组一方面由于饲喂的高脂饲料,其体重会明显上升,但随着AlCl3在体内的积聚,又会导致体重下降,所以整体来看,AM模型组体重上升没有DM组明显,如图5,但相对正常组,其体重仍然明显升高,而通过给药之后基本能维持在正常水平范围,如图4。综上可以看出,知母提取物能有效控制高脂导致的体重增加,同时能够调节铝蓄积导致的体重减轻,说明知母提取物能综合调节各模型组体重的作用。
2.3大鼠行为学试验结果
2.3.1Barnes迷宫实验
2.3.1.1给药8周Barnes迷宫实验结果
探究任意洞的潜伏期是大鼠对新环境探究的一种表现,痴呆大鼠其探究能力会比正常组差一些。从图7A可以看出,糖尿病模型组和复合模型组的探究时间与正常组比,无显著差异,而痴呆模型组与正常组相比差异显著(p<0.05)。通过给药之后,知母提取物给药组和阳性药组均能够显著减少其探究时间。从统计结果可以看出,长期记忆测定中,大鼠探究任意洞的潜伏期无统计学意义,但从图8A可看出,AD组与其他组相比是偏高的。
大鼠到达目标洞的潜伏期是考察大鼠空间记忆能力以及探究能力的重要指标,由图7B和图8B可以看出,3个模型组与正常组比均有显著差异,而通过给药之后,各给药组动物到达目标洞的时间明显缩短,其中痴呆模型和复合模型给药组与对应模型组相比,显著缩短了寻找时间(p<0.01);从图7B可以看出,糖尿病模型组给药后,寻找时间也缩短,但是没有统计意义。Barnes迷宫实验最重要的统计指标是大鼠到达目标洞的时间,这是本实验大鼠记忆力最直观的指标,从图7B和图8B可以看出,DM模型组、AD模型组和AM模型组寻找目标洞的时间明显增多,与正常组相比有显著差异(p<0.01),而知母提取物给药组和脑复康均具有很好的提高大鼠记忆力的能力,与模型组相比均有显著差异。
错误次数是用来考察大鼠空间记忆能力,错误次数越少,表明其记忆能力越强。从图7C和图8C可以看出,痴呆模型和复合模型大鼠错误次数显著增多,而通过知母提取物和阳性药脑复康给药后均接近正常水平。结合这三组结果可以看出,知母提取物能明显增强大鼠短期空间记忆能力。
2.3.1.2给药16周Barnes迷宫实验结果
从图9A可以看出,与给药两个月相比,模型组探究任意洞潜伏期时间明显增长,可见随着时间延长,痴呆症状会逐渐加剧,而通过给药之后,基本维持正常水平,
到达目标洞潜伏期是本实验考察的最重要的指标,从图9B和10B可以看出3个模型组到达目标洞时间均明显升高,特别是符合模型,而3个给药组到达目标洞时间均减少,说明知母提取物能够改善大鼠空间记忆以及探索能力。
错误次数跟大鼠到达目标洞的时间一般成正比,从图9C和10C可以看出,3个模型组次数均明显高于正常组,而知母提取物和阳性药均能减少错误次数,说明知母提取物能明显提高大鼠学习记忆能力。长期记忆测试结果和短期结果相一致,均是模型组学习记忆能力明显下降,而给药组能明显提高大鼠空间探索以及记忆能力。
2.3.2给药8周新颖物体识别实验结果
表2各组动物对新物体分辨指数(n=6,)
注.与正常组比:*p<0.05,**p<0.01与模型组比:△p<0.05,△△p<0.01
给药8周,新颖物体识别实验结果表明,正常组分辨指数比各模型组均高,并且均有统计学意义,其中糖尿病模型组与正常组相比(p<0.05),通过知母提取物给药后,分辨指数有一定的提升,但是与模型相比无显著差异。而痴呆模型组和复合模型组与正常组相比,认知能力明显下降(p<0.01),通过知母提取物给药后,分辨指数均明显提高(p<0.05)(见表2)。
以图11和12可以看出,各组动物对于两个相同物体的探究时间相近,各组均无统计意义。而对两个不同物体的探究时间均表现出不同程度的差异,正常大鼠会对新鲜食物花更多的时间去探究,从图12可以看出,本实验中正常组差异最明显(p<0.01),而三个模型组对两个物体的探究时间无统计意义;通过知母提取物给药后能不同程度的提高各模型组的辨识能力,其中痴呆模型组给药后,与模型组相比,差异非常显著(p<0.01);
综合本实验和Barnes,可以看出,实验造的3个模型均已经出现不同程度的认知障碍,而通过知母提取物给药后能明显提高大鼠的学习记忆以及认知能力。
2.3.3给药16周Morris水迷宫实验结果
2.3.3.1定位航行实验结果如图13和14。
2.3.3.2空间探索实验结果
表3Morris水迷宫实验结果(n=6,)
注·与正常组相比,*p<0.05,**p<0.01;与模型组相比,Δp<0.05,ΔΔp<0.01
在最初的训练中,大鼠主要以边缘式和随机式寻找平台,随着训练增加,除模型组动物仍有大部分保持此搜索策略外,其余组均主要为直线式和趋向式;由图13、图14可以看出,定位航行实验中3个模型组的平均潜伏期显著长于正常组(P<0.05或P<0.01),即模型组大鼠与正常组大鼠相比需要更长的时间来找到平台;而3个知母提取物给药组可显著缩短模型大鼠到达平台潜伏期(P<0.05或P<0.01),且3个给药组之间没有显著差异。空间探索实验表明,与正常组相比,3个模型组在平台所在象限(第一象限)的搜索时间百分比明显降低,说明模型大鼠的空间记忆能力明显下降,而通过知母提取物给药之后,能显著提高模型大鼠空间记忆能力(见图15和表3)。
2.4知母提取物对各模型大鼠糖脂代谢的影响
2.4.1各组大鼠禁食16小时空腹血糖水平
表4给药8、16周各组大鼠FPG结果(n=6,)
如表4,图16所示,给药8周和16周空腹血糖结果显示,糖尿病模型和复合模型大鼠血糖显著升高(p<0.01),而通过给药之后,血糖明显降低;与模型组相比均有统计意义(p<0.05,p<0.01)。而单独痴呆模型组和给药组血糖与正常组比没统计意义,说明单独痴呆模型对血糖影响不大。随着造模及给药时间延长,到给药16周,知母提取物给药组降糖效果相对给药8周效果更好。
2.4.2各组大鼠禁食16h条件下血浆总胆固醇水平
表5给药8、16周各组大鼠TC结果(n=6,)
如表5,图17所示,给药8周和16周总胆固醇结果显示,与NC组相比DM模型和AM模型大鼠总胆固醇水平显著升高(p<0.01),与模型组相比,通过知母提取物给药后胆固醇水平均明显下降(p<0.01)。而AD组及给药组大鼠在给药8周时,血脂均偏高,与正常组差异显著,说明虽然痴呆对血糖影响不大,但是对血脂的影响还是很明显的(p<0.01),而随着造模时间延长,血脂呈现下降的趋势,可能是铝在体内积累导致体重减轻,血脂降低,而知母提取物给药组在给药16个月后,能平衡铝导致的血脂异常降低,使其保持在正常范围之内。
2.4.3各组大鼠禁食16h条件下血浆总甘油三酯水平
表6给药8、16周各组大鼠TG结果(n=6,)
如表6,图18所示,给药8周和16周总甘油三酯结果显示,与NC组相比,DM和AM模型大鼠TG水平显著升高(p<0.05,p<0.01),通过知母提取物给药后能明显降低模型大鼠TG水平,且呈现时间依赖关系。而AD组TG结果与TC结果趋势相同,随着造模时间延长,TG呈现先上升后下降的趋势,可能是铝在体内积累导致体重减轻,血脂降低,同样导致TG水平降低;说明AlCl3导致的痴呆模型会导致大鼠体内血脂代谢紊乱。而知母提取物给药组能改善血脂代谢异常。
2.4.4大鼠禁食16h条件下口服糖耐量实验结果
给药10周对各组大鼠进行OGTT实验,实验大鼠禁食16h。方法:分别在0min、30min、60min、120min,尾尖监测血糖,用血糖仪测定各时间点的血糖值,计算血糖曲线下面积Φ(AUC),计算方法:Φ=(A+B)×0.25+(B+C)×0.25+(C+D)×0.5(单位:mmol.h/L;A、B、C、D分别为0、30、60、120min血糖值)。
表7各组大鼠口服耐糖量(OGTT)结果(n=6,)
从图19和表7可以看出,DM组从0min到120min血糖始终最高,与正常组相比有统计意义(p<0.01),图20、21可以看出,30min各组血糖上升,其中DM组上升最明显,且随着时间的推移,下降速度也比正常组缓慢,到120min后比正常组高;AM模型组由于饮用AlCl3溶液有加速衰老的作用,所以AM组没有DM组血糖升高的明显,但是整体上,其血糖还是比正常组要高,且降低不到正常水平;通过知母提取物给药之后,DM模型和AM模型大鼠血糖基本降到正常水平。而AD模型组及给药组大鼠禁食后血糖普遍偏低,和正常组比差异明显,与AlCl3溶液加速衰老有关,可能糖耐量实验不适合单独痴呆模型糖脂代谢异常的指标判定。
实施例2:百合知母提取物对抑郁症伴IBS模型大鼠的影响
1、材料与方法
1.1实验动物与分组
1.1.1实验动物
成年SD大鼠,雄性,SPF级,体质量180~220g,购自广东省医学实验动物中心,动物合格证号:SCXK(粤)2008-0002。饲养于广州中医药大学实验动物中心,温度20~25℃,相对湿度40%~60%,光照周期12h:12h昼夜间断照明,常规饲料喂养。大鼠适应环境3天后实验正式开始。
1.1.2分组
大鼠适应环境后采用体重及open-field行为学评分进行分组,选择体重及评分相近的56只大鼠分为正常对照组(Normal)、抑郁症伴IBS模型组(Model)、百合提取物组(LS)、知母提取物组(TI)、百合知母提取物组(LT)、氟西汀组(FluoxetineHydrochlorideFLU)、得舒特组(PinaveriumBromideDicetelPBD),每组8只,每组大鼠1只/笼饲养。
1.2实验药品、试剂与主要仪器
1.2.1实验药品
知母提取物:同实施例1
百合提取物:其制备方法除了原料不同,这里采用的是百合,其他同实施例1。
百合知母提取物:
(1)将百合和知母药材粉末按重量比为百合:知母=1:1混合后用10倍重量的70%乙醇水溶液渗漉提取,渗漉速度不超过0.15BV/h,得到提取液;
(2)用改良的pipo-1型大孔树脂加压吸附步骤(1)中得到的提取液中的提取物,生药与湿树脂质量比为1000:70,先用20BV蒸馏水和3BV20%乙醇水溶液洗脱除去杂质,然后用3BV70%乙醇水溶液洗脱,收集所述70%乙醇水溶液洗脱出来的洗脱液,减压浓缩至干,得到所述知母提取物。
制得的知母提取物、百合提取物和百合知母提取物纯度达50%以上。百合皂苷与知母皂苷的提取率分别为0.6%和7%;盐酸氟西汀分散片,美国礼来公司,批号:2014A规格:20mg/粒;得舒特,法国雅培制药公司,批号:627413,规格:50mg/片。
1.2.2实验试剂
蔗糖(普宁市绿活食品有限公司,20120827);医用胶布;乙醚(广州化学试剂厂,120918);石蜡油(泰兴科学仪器经营部20060603-2);促肾上腺皮质激素(ACTH)试剂盒、多巴胺(DA)试剂盒、降钙素基因相关肽(CGRP)试剂盒、血管活性肠肽(VIP)试剂盒、促肾上腺皮质激素释放激素(CRF)试剂盒、P物质(SP)试剂盒、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)试剂盒,均购于上海源叶生物科技有限公司;五羟色胺(5-HT)试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司;10%甲醛生理盐水溶液;苏木精染液;伊红染液;醛品红染液;橙黄G液。
1.2.3主要仪器
敞箱实验(open-fieldtest)装置自制;束缚筒自制(根据大鼠的体型用矿泉水瓶特制的束缚筒,可通过调节两个塑料筒结合来控制大鼠活动空间);8Fr乳胶双腔导尿管(浙江康康医疗器械有限公司);高速震荡仪;BS124S型电子天平(德国Sartorius公司);MultiskanGO1510-01208全波长酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司);1-15K型冷冻离心机(美国sigma公司);石腊包埋机(德国LEICA公司);石腊切片机(德国LEICA公司);摊片机(德国比ICA公司);尼康ECLIPSETE2000-S倒置显微镜(日本Nikon公司)。
1.3造模方法与给药
1.3.1造模方法
正常对照组不做任何处理。抑郁症伴IBS模型组和其余五组:实验参照大鼠每天接受夹尾应激刺激、束缚应激刺激,用裹有海绵的夹子夹大鼠尾巴近端1/3处,注意不损伤皮肤,使其激怒,刺激时间持续30min。夹尾刺激结束后,让大鼠休息5min后宽医用纱布束缚大鼠肩部、前上肢及胸部,限制其前肢搔抓头面部,但不控制其他活动,束缚2h后释放大鼠归笼,自由进食水。夹尾、束缚刺激每天1次,持续6周。实验参照现有方法进行改进,大鼠每天加以慢性不可预见性应激刺激,包括:禁水(24h)、禁食(24h)、热水游泳刺激(45℃,5min)、冰水游泳刺激(4℃,5min)、高速振荡(10min)、潮湿垫料(24h)、笼内异物(24h)、45度倾斜饲养笼。7种刺激因子在大鼠适应3d后开始造模,持续6周。每日随机安排1种,每种刺激不能连续出现,使动物不能预料刺激的发生,具体实验日程见表8。
表8实验日程安排
1.3.2给药
实验大鼠按照体质量10mL·kg-1于造模同时灌胃给药,百合提取物组100mg·kg-1,知母提取物组220mg·kg-1,百合知母提取物组240mg·kg-1(百合提取物、知母提取物及百合知母提取物所用剂量是参照前期基础实验的有效剂量),氟西汀组给予10mg·kg-1,得舒特组给予15mg·kg-1,药物用0.5%阿拉伯树胶配成相应的混悬液,正常对照组和抑郁症伴IBS模型组给予等量0.5%阿拉伯树胶溶液。每天根据大鼠体质量调整给药体积,每天1次,连续6周。
1.4模型外在指标评估
1.4.1大鼠体质量
实验开始前,称量大鼠原始体质量;之后每个星期称量大鼠体质量,以观察各组实验大鼠体重的变化。
1.4.2open-field实验
Open-field实验装置由不透明材料制成,底面为75cm×75cm的正方形并被等分为25个等边方格,周围有高40cm的墙壁。实验在安静的房间内进行观察。将大鼠置于中心方格内,观察大鼠在3分钟内的水平穿越格子数的评分:主要反映实验动物对新空间的兴奋性及探索性、垂直站立次数(两前爪腾空或攀附墙壁次数)评分:主要反映实验动物对新空间的观察了解及适应程度、理毛次数(两前爪梳理毛发的次数)评分:主要反映实验动物对自身感受的关注度及其对周围环境的熟悉情况;彻底清洁装置后再进行另一只大鼠的观察,于应激刺激0周、4周、6周进行旷场试验。
1.4.3糖水消耗量
实验前24h大鼠适应含糖饮水,每笼同时放置2瓶装有1%蔗糖水的饮水瓶。随后的24h禁食,每笼给予事先称量好的一瓶1%蔗糖水,一瓶蒸馏水。24h后,取两个瓶子定量,计算动物禁食的蔗糖水消耗量。糖水消耗量实验在第2周、4周、6周进行检测。
1.4.4强迫游泳实验
将大鼠放入游泳缸(长55cm、宽40cm、高40cm)中,水深25cm、常温水,游泳实验时每次1只,每只大鼠游泳5min,记录大鼠不动的秒数,每组强迫游泳后更换一次水,判定不动的标准:大鼠在水中停止挣扎或呈漂浮状态,仅有轻微的肢体运动使头部浮在水面;在实验的4周末和6周末进行强迫游泳实验。
1.4.5腹部回撤反射(AWR)评分实验
将大鼠逐只置于盛有乙醚的透明容器内,容器加盖,使大鼠进入麻醉状态,取出麻醉的大鼠,导尿管经石蜡油润滑后插入大鼠肛门,导尿管球囊插入的深度距离肛门5~6cm,医用胶布把大鼠尾巴根部和肛门外导尿管粘在一起,较好的固定导尿管球囊的深度。大鼠苏醒后,放入特制的透明塑料桶笼(18cm×5cm×7cm)中,只能前后运动,不能转身。5min适应期后用球囊进行结直肠扩张,每只大鼠给予结直肠内球囊扩张2次;用注射器往结直肠内球囊注射水的容量分别为1.5mL和2.0mL,每一阀值都重复进行2次,每次持续5min,每次间隔为30s。由另一独立的观察者进行AWR值评估,数据取平均值,作为肠道敏感性评估。实验的2、4、6周进行球囊结直肠扩张(colorectaldistention,CRD)刺激评价腹部撤回反射(AWR)评分。AWR实验评分标准参照文献:0分:在给予CRD刺激时大鼠情绪基本稳定;1分:在给予CRD刺激时,变得不稳定,偶尔扭动头部;2分:腹背部肌肉轻微收缩但腹部未抬离地面;3分:腹背部肌肉较强收缩并把腹部抬离地面;4分:腹部肌肉强烈收缩,背部呈弓形并把腹部、会阴部抬离地面。
1.4.6排便量统计
实验大鼠用束缚筒束缚2h,观察束缚2h内排便的粪点数,正常组同期观察,实验均在白天进行。实验的第2,4,6周观察大鼠排便的情况。
1.5统计学处理
采用STATVIEW统计软件进行统计分析,实验资料结果用表示。组间比较方差齐用One-wayANOVA法,两两比较方差齐用LSD法,方差不齐时,采用Dunnett’sT3检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2、研究结果
2.1大鼠体质量结果
实验前各组大鼠体重无明显差异,一周后,正常对照组(Normal)体重较其他组明显增加,抑郁症伴IBS模型组(Model)体重增加缓慢,与Normal比较,抑郁症伴IBS模型组大鼠出现精神萎靡、行为迟缓、活动能力下降、目光呆滞,进食量减少、毛色晦暗、体重量下降,差异有统计、意义(P<0.01),说明应激激素可致大鼠精神异常、饮食减少,体重下降。与Model比较,百合提取物组(LS)、知母提取物组(TI)、百合知母提取物组(LT)、氟西汀组(FLU)和得舒特组(PBD),用药4周后大鼠一般状态明显改善,毛色逐渐恢复原有光泽,体重明显增加,均具有对抗抑郁刺激,改善大鼠饮食情况,见表9,图22。
表9各皂苷对抑郁症伴IBS大鼠体质量的影响(n=8)
注:与Normal比较*P<0.05,**P<0.01,与Model比较#P<0.05,##P<0.01
2.2open-field实验评分结果
大鼠旷场实验的水平穿越格数、竖立次数、理毛次数评分在实验前无明显差异,经过4周的应激刺激后抑郁症伴IBS模型组大鼠各项评分,与正常对照组比较有显著性差异(P<0.01或P<0.05),说明动物表现出抑郁状态、活动能力下降、兴趣丧失。与抑郁症伴IBS模型组相比,各提取物组均能明显提高大鼠的活动能力。其中,百合知母提取物用药6周后能显著改善大鼠各项评分(P<0.01),优于单味提取物的疗效。阳性药氟西汀也能明显改善大鼠的活动能力。结果见表10~12、图23~25。
表10各提取物对抑郁症伴IBS大鼠水平穿越格子数评分结果(n=8)
注:与Normal比较*P<0.05,**P<0.01,与Model比较#P<0.05,##P<0.01。
表11各提取物对抑郁症伴IBS大鼠垂直站立次数评分结果(n=8)
注:与Normal比较*P<0.05,**P<0.01,与Model比较#P<0.05,##P<0.01。
表12各提取物对抑郁症伴IBS大鼠理毛次数评分结果(n=8)
注:与Normal比较*P<0.05,**P<0.01,与Model比较#P<0.05,##P<0.01。
2.3糖水消耗量结果
应激刺激第2周进行检测大鼠糖水消耗量,显示各组大鼠糖水消耗量并无显著性差异。第4、6周检测的结果见表13、图26;实验结果表明,与正常对照组比较,抑郁症伴IBS模型组大鼠糖水消耗量显著降低(P<0.01),提示大鼠对幸福事件感知能力下降,说明动物表现出抑郁状态、兴趣丧失。与抑郁症伴IBS模型组相比,各提取物组均能明显提高抑郁症伴IBS模型大鼠低下的糖水消耗量(P<0.05orP<0.01)。
表13各提取物对抑郁症伴IBS大鼠糖水消耗量的结果(n=8)
注:与Normal比较*P<0.05,**P<0.01,与Model比较#P<0.05,##P<0.01
2.4强迫游泳实验结果
应激刺激4周后和6周后观察大鼠强迫游泳的不动时间,显示各提取物均具有缩短大鼠游泳不动时间的趋势,其中,与抑郁症伴IBS模型组大鼠相比,百合知母提取物可显著缩短游泳不动时间,具有统计学差异(P<0.01)疗效优于单味提取物,结果见表14、图27
表14各提取物对抑郁症伴IBS大鼠强迫游泳不动时间的影响(n=8)
注:与Normal比较*P<0.05,**P<0.01,与Model比较#P<0.05,##P<0.01
2.5腹部回撤反射(AWR)评分结果
大鼠在球囊结直肠扩张下,AWR评分反映抑郁症伴IBS模型大鼠内脏的敏感性,与正常对照组相比,接受应激刺激,4周后IBS模型组大鼠在不同扩张容量(1.5mL、2.0mL)下的AWR评分呈显著性增加(P<0.01),说明其内脏敏感性增加,即所谓痛觉过敏,符合IBS临床特点,与人类IBS慢性内脏感觉过敏相似;各提取物组AWR评分明显降低,提示药物治疗有效,且与阳性药得舒特组的AWR评分无统计学差异,结果见表15~16、图28~29。
表15各提取物对抑郁症伴IBS大鼠球囊结直肠扩张下AWR评分的影响(n=8)
注:与Normal比较*P<0.05,**P<0.01,与Model比较#P<0.05,##P<0.01
表16各提取物对抑郁症伴IBS大鼠球囊结直肠扩张下AWR评分的影响(n=8)
注:与Normal比较*P<0.05,**P<0.01,与Model比较#P<0.05,##P<0.01
2.6排便量统计结果
应激刺激4周后与正常对照组比较,抑郁症伴IBS模型组大鼠,排便粒数明显增加,具有显著性差异(P<0.01),且大便不成形呈松散样或稀糊样;6周后,大便呈稀糊状且表面附着黏液增多,排便次数逐渐增多,反映了大鼠对抵抗外界应激刺激与恐惧的能力减弱。表明采用夹尾刺激配合束缚刺激可以较好的模拟IBS患者相关的外在症状。经药物治疗后大鼠大便性状、排便次数逐渐恢复正常。各组大鼠2、4、6周排便粒数统计结果见表17、图30。
表17各提取物对抑郁症伴IBS大鼠排便粒数的影响(n=8)
注:与Normal比较*P<0.05,**P<0.01,与Model比较#P<0.05,##P<0.01
目前抑郁症和IBS动物模型的刺激方式主要包括躯体应激刺激、心理应激刺激和综合应激刺激等三种类型,本研究采用孤养+夹尾刺激+束缚刺激+慢性不可预见性温和刺激法诱导建立抑郁症伴IBS大鼠模型,通过躯体应激和心理应激相结合的方法制备动物模型。通过6周的刺激模型组大鼠在旷场试验中的自发活动显著减低、放入敞箱装置后探究活动明显减少;糖水消耗量明显减少,表明大鼠欣快感缺失,处于一种精神萎靡的抑郁状态;强迫游泳实验数据显示大鼠的绝望时间明显增加;大鼠结肠组织的HE染色结果可以表明,本模型未造成大鼠结肠组织病理性改变,同时模型组SD大鼠的AWR评分明显升高,表明抑郁症伴IBS大鼠的内脏敏感性增加,腹痛和腹部不适等症状明显,以上实验结果说明本模型能够较好的模拟抑郁症伴IBS的核心症状。
本实验研究表明,百合提取物、知母提取物、百合知母提取物均能在一定程度上改善束抑郁症伴IBS模型大鼠的症状且百合知母提取物的疗效最为显著。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种知母提取物,其特征在于,所述知母提取物是由以下方法制备而成的:
(1a)将知母用70%乙醇水溶液提取,得到提取液;
(2a)用大孔树脂柱对步骤(1a)中得到的提取液进行吸附处理,先用蒸馏水和20%乙醇水溶液洗脱除去杂质,然后用70%乙醇水溶液洗脱,收集所述70%乙醇水溶液洗脱出来的洗脱液,浓缩至干,得到所述知母提取物。
2.根据权利要求1所述的知母提取物,其特征在于,所述步骤(2a)中蒸馏水的用量为20倍柱体积,所述20%乙醇水溶液的用量为3倍柱体积,所述70%乙醇水溶液的用量为3倍柱体积。
3.一种百合知母提取物,其特征在于,所述百合知母提取物是由以下方法制备而成的:
(1b)将百合和知母混合后用70%乙醇水溶液提取,得到提取液;
(2b)用大孔树脂柱对步骤(1b)中得到的提取液进行吸附处理,先用蒸馏水和20%乙醇水溶液洗脱除去杂质,然后用70%乙醇水溶液洗脱,收集所述70%乙醇水溶液洗脱出来的洗脱液,浓缩至干,得到所述百合知母提取物。
4.根据权利要求3所述的百合知母提取物,其特征在于,所述百合和知母的重量比为1:1~3。
5.根据权利要求4所述的百合知母提取物,其特征在于,所述百合和知母的重量比为1:1。
6.根据权利要求3所述的百合知母提取物,其特征在于,所述百合和知母的总重量与所述70%乙醇水溶液的重量之比为1:11。
7.根据权利要求3所述的百合知母提取物,其特征在于,所述步骤(2b)中蒸馏水的用量为20倍柱体积,所述20%乙醇水溶液的用量为3倍柱体积,所述70%乙醇水溶液的用量为3倍柱体积。
8.如权利要求1-2任一所述的知母提取物在制备改善认知障碍的药物中的用途。
9.如权利要求1-2任一所述的知母提取物在制备降低血糖的药物中的用途。
10.如权利要求3-7任一所述的百合知母提取物在制备治疗抑郁症伴肠易激综合征的药物中的用途。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160525 |