CN114159447A - 18β-甘草次酸在制备治疗抑郁相关神经元保护药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请属于生物医药技术领域，具体涉及18β‑甘草次酸在制备治疗抑郁相关神经元保护药物中的应用。具体包括18β‑甘草次酸可通过抑制抑郁症相关小胶质细胞活化介导的神经元凋亡，发挥神经元保护作用；同时，18β‑甘草次酸可以激活抑郁症相关的核转录因子Nrf‑2启动脑源性神经生长因子转录翻译而发挥神经元细胞保护作用，且18β‑甘草次酸药效作用明显，无明显副作用。

Description

18β-甘草次酸在制备治疗抑郁相关神经元保护药物中的应用

技术领域

本申请属于生物医药技术领域，尤其涉及一种18β-甘草次酸在制备治疗抑郁相关神经元保护药物中的应用。

背景技术

抑郁症是以持续的情绪低落、兴趣减退、意志下降为核心症状的慢性综合性疾病，属于常见的精神类疾病，具有高复发率、高致残率及高自杀率的特点。据2017年世界卫生组织报告称，全球抑郁症患者已达3.22亿人，发病率约为4.4％，并且存在抑郁症反复发作而慢性化的问题；抑郁症也是致残的最大诱因(全球因抑郁症而致残的人数超过5000万)，是导致自杀的最主要因素。在我国，抑郁症患者已经超过5400万，而终身患病率更是高达6.8％。随着社会竞争的不断加剧，生活节奏日趋紧张，预计到2030年，抑郁症将会成为世界第一大负担疾病。以5-羟色胺再摄取抑制剂为代表的药物，如氟西汀、帕罗西汀、舍曲林等，是临床使用最广泛的抗抑郁制剂。这些药物虽能快速缓解抑郁症状，但同时也伴有一定的不良反应，如过度镇静、轻度躁动到躁狂性精神病、激动性抑郁、性功能障碍等，且抗抑郁药物需要长期服用，上述反应中的每一种都会使个人的心理状况恶化，并可能导致自杀、暴力和其他形式的极端异常行为。因此，随着抑郁症发病数逐年攀升，寻找安全有效的治疗药物显得尤为紧迫。

抑郁症发病机制复杂，神经元和神经可塑性损伤假说是其病理机制之一。长期抑郁可导致神经元死亡，使患者生活及生存能力明显下降，因此寻找新的药物保护神经元的死亡是提高抑郁症患者生活质量的关键。

发明内容

本申请的目的在于提供一种18β-甘草次酸在制备治疗抑郁相关神经元保护药物中的应用，旨在解决现有技术中缺乏抑郁相关神经元保护药物的相应药物开发的问题。

为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本申请提供18β-甘草次酸在制备治疗抑郁相关神经元保护药物中的应用；18β-甘草次酸的结构式如下：

第二方面，本申请提供一种用于治疗抑郁相关神经元保护药物的药物组合物，药物组合包括18β-甘草次酸和药学上可接受的辅助剂。

本申请第一方面提供的18β-甘草次酸在制备治疗抑郁相关神经元保护药物中的应用，基于对抑郁相关小胶质细胞和/或促炎因子、抗炎因子表达的调节，显著减少神经元细胞凋亡，提高对神经元细胞的保护；通过激活抑郁症相关的核转录因子Nrf-2启动脑源性神经生长因子转录的调节剂而发挥神经元细胞保护作用。18β-甘草次酸能够针对性地对抑郁引起的神经元细胞损伤具有较好的作用，为天然组分，效果好，无明显副作用，适于广泛应用。

本申请第二方面提供的一种用于治疗抑郁相关神经元保护的药物组合物，由于药物组合包括18β-甘草次酸和药学上可接受的辅助剂；提供的药物组合物以18β-甘草次酸为活性成分，18β-甘草次酸能够保护抑郁引起的神经元细胞损伤，作为药物组合物的主要活性成分，在使用过程中具有优异的抗抑郁神经元细胞损伤作用，能够广泛应用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请实施例提供的甘草酸灌胃给药大鼠后，血浆及脑组织中相关外源性成分的分布特征。

图2是本申请实施例提供的甘草次酸灌胃给药大鼠后，其在血浆和脑组织中的分布。

图3是本申请实施例提供的18β-GA具有显著的体内抗炎活性。(A)基于LPS显微注射诱导的炎症斑马鱼评价18β-GA的抗炎活性代表性图片；(B)基于CuSO₄浸泡诱导的炎症斑马鱼评价18β-GA的抗炎活性代表性图片；(C)基于LPS显微注射诱导的炎症斑马鱼评价18β-GA的抗炎活性量化数据；其中，***p<0.001vs PBS组；^#p<0.05，^###p<0.05vs LPS组；(D)基于CuSO₄浸泡诱导的炎症斑马鱼评价18β-GA的抗炎活性量化数据，其中，***p<0.001vs CuSO4组；^#p<0.05，^###p<0.05vs CuSO₄组。

图4是本申请实施例提供的18β-GA显著增强神经细胞生存活力分析图。(A)CCK8检测BV2细胞生存活力。(B)HT22细胞生存活力；其中，***p<0.001vs CTL组；^###p<0.001vs LPS组。(C)PC12细胞生存活力；其中，***p<0.001vs CTL组；^###p<0.001vs LPS组。

图5是本申请实施例提供的18β-GA具有显著的体外抗炎活性分析图。(A)不同浓度LPS作用BV2细胞的NO释放量，其中，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001vs CTL组。(B)18β-GA显著抑制LPS刺激的BV2细胞NO释放，其中，**p<0.01vs CTL组；^##p<0.01vs LPS组。

图6是本申请实施例提供的18β-GA具有显著的抗神经元凋亡活性分析图。(A)基于流式细胞凋亡检测评价18β-GA的抗神经元凋亡的代表性图片。(B)18β-GA显著减少BV2小胶质细胞激活介导的神经元凋亡；其中，***p<0.001vs CTL组；^#p<0.05，^###p<0.05vs LPS组。

图7是本申请实施例提供的18β-GA调节BV2细胞炎症因子表达。(A)不同浓度18β-GA干预BV2细胞的IL-6表达量变化；其中，***p<0.001vs CTL组；^##p<0.01vs LPS组。(B)不同浓度18β-GA干预BV2细胞的IL-1β表达量变化，其中，***p<0.001vs CTL组；^#p<0.05vs LPS组。(C)不同浓度18β-GA干预BV2细胞的IL-10表达量变化，其中，***p<0.001vs CTL组；^#p<0.05vs LPS组。(D)不同浓度18β-GA干预BV2细胞的IL-4表达量变化其中，*p<0.05vs LPS组。

图8是本申请实施例提供的18β-GA抗抑郁样作用。(A)实验流程图。(B)18β-GA逆转慢性压力引起的社会交互时间减少。(C)18β-GA对小鼠运动能力的影响作用。(D)18β-GA逆转慢性压力引起的强迫游泳不动时间延长。(E)18β-GA逆转慢性压力引起的糖水偏爱摄取率减少。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001vs Vehicle+Stress组。

图9是本申请实施例提供的18β-GA促进Nrf2与BDNF外显子I启动序列结合启动BDNF转录的作用图。(A)荧光素酶检测原代神经细胞给与不同浓度18β-GA可激活BDNF外显子I启动序列荧光素酶活性；其中，***p<0.001vs空白对照组。(B)荧光素酶检测18β-GA(10μM)可激活BDNF外显子I启动序列荧光素酶活性并且可以被siRNA-Nrf2特异性阻断；其中，***p<0.001vs空白对照组。(C)染色质免疫沉淀技术检测18β-GA可促进Nrf2与BDNF外显子I启动序列结合定性图。(D)染色质免疫沉淀技术检测18β-GA可促进Nrf2与BDNF外显子I启动序列结合；其中，*p<0.05vs空白对照组。

图10是本申请实施例提供的18β-GA促进Nrf2与BDNF mRNA和蛋白表达的qPCR和Western-blot分析图。(A)qPCR实验发现18β-GA可以促进Nrf2mRNA表达；其中，***p<0.001vs空白对照组。(B)qPCR实验发现18β-GA可以促进BDNF mRNA表达；其中，*p<0.05vs空白对照组。(C)qPCR实验发现18β-GA可以降低MeCP2 mRNA表达；其中，***p<0.001vs空白对照组。(D)Western-blot实验定性图。(E)Western-blot实验发现18β-GA也可以促进Nrf2蛋白表达升高；其中，*p<0.05vs空白对照组。(F)Western-blot实验发现18β-GA也可以促进BDNF蛋白表达升高；其中，***p<0.001vs空白对照组。(F)Western-blot实验发现18β-GA也可以降低MeCP2蛋白表达；其中，*p<0.05；空白对照组。

图11是本申请实施例提供的18β-GA可促进Nrf2与BDNF启动子I结合的ChiP-PCR实验结构图。(A)慢性压力可引起Nrf2与BDNF外显子I启动序列结合减弱，18β-GA可逆转Nrf2与BDNF启动子结合的减弱；其中，**p<0.01；***p<0.001vs正常对照组。

图12是本申请实施例提供的18β-GA可逆转慢性压力刺激引起的Nrf2蛋白和MeCP2蛋白表达改变的Western-blot分析图。(A)Western-blot实验定性图。(B)慢性压力可引起Nrf2蛋白表达下降，18β-GA可逆转慢性压力引起的Nrf2蛋白表达下降；其中，*p<0.05；**p<0.01vs正常对照组。(C)慢性压力可引起BDNF蛋白表达下降，18β-GA可逆转慢性压力引起的BDNF蛋白表达下降；其中，**p<0.01vs正常对照组。(D)慢性压力可引起MeCP2蛋白表达升高，18β-GA可逆转慢性压力引起的MeCP2蛋白表达升高；其中，**p<0.01vs正常对照组。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“其”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

本申请实施例第一方面提供18β-甘草次酸在制备治疗抑郁相关神经元保护药物中的应用；18β-甘草次酸的结构式如下：

本申请第一方面提供的18β-甘草次酸在制备治疗抑郁相关神经元保护药物中的应用，基于对抑郁相关小胶质细胞和/或促炎因子、抗炎因子表达的调节，显著减少神经元细胞凋亡，提高对神经元细胞的保护，通过激活抑郁症中的核转录因子Nrf-2启动脑源性神经生长因子转录的调节剂而发挥神经元细胞保护作用。18β-甘草次酸能够针对性地对抑郁引起的神经元细胞损伤具有较好的作用，为天然组分，效果好，无明显副作用，适于广泛应用。

在一些实施例中，18β-甘草次酸的获取由常规的提取方法从甘草原材料中进行提取获得。

在一些实施例中，所述18β-甘草次酸通过抑制抑郁症相关小胶质细胞活化介导的神经元凋亡，发挥神经元保护作用。

在一些实施例中，所述18β-甘草次酸通过激活抑郁症中的核转录因子Nrf-2启动脑源性神经生长因子转录的调节剂而发挥神经元细胞保护作用。

在一些实施例中，18β-甘草次酸的有效浓度为5.0-50mg/kg，控制18β-甘草次酸的有效浓度为5.0-50mg/kg，可保证提供的该浓度的18β-甘草次酸能够较好激活激活核转录因子Nrf-2启动脑源性神经生长因子转录，进而发挥对神经元细胞保护作用。在一些具体的药物组合物的应用中，18β-甘草次酸的有效浓度为5.0-50mg/kg。

在一些实施例中，18β-甘草次酸应用于抑郁相关斑马鱼、细胞、动物模型，通过上述模型，可以确定，18β-甘草次酸可用于治疗或/和预防所述抑郁症相关的生理指标、分子机制、行为学变化。

本申请实施例第二方面提供了一种用于治疗抑郁相关神经元保护药物的药物组合物，药物组合包括18β-甘草次酸和药学上可接受的辅助剂。

本申请第二方面提供的一种用于治疗抑郁相关神经元保护的药物组合物，由于药物组合包括18β-甘草次酸和药学上可接受的辅助剂；提供的药物组合物以18β-甘草次酸为活性成分，18β-甘草次酸能够保护抑郁引起的神经元细胞损伤，作为药物组合物的主要活性成分，在使用过程中具有优异的抗抑郁神经元细胞损伤作用，能够广泛应用。

在一些实施例中，药物组合物还包括药学上可接受的辅助剂，以方便其制备成满足各种给药途径的剂型。

在一些实施例中，药物的剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、液剂、乳剂、悬浮剂、软膏剂、注射剂、皮肤贴剂中的一种。

在一些实施例中，辅助剂包括填充剂、崩解剂、粘合剂、乳化剂、润滑剂、助流剂、着色剂中的一种或几种，但不限于此。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

一种用于治疗抑郁相关神经元保护的药物组合物

药物组合物包括18β-甘草次酸和药学上可接受的辅助剂，其中，18β-甘草次酸的有效浓度为10.0mg/kg。

且，药物组合物的剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、液剂、乳剂、悬浮剂、软膏剂、注射剂、皮肤贴剂中的一种，辅助剂包括填充剂、崩解剂、粘合剂、乳化剂、润滑剂、助流剂、着色剂中的一种或几种。

实施例2

一种用于治疗抑郁相关神经元保护的药物组合物

药物组合物包括18β-甘草次酸和药学上可接受的辅助剂，其中，18β-甘草次酸的有效浓度为20mg/kg。

且，药物组合物的剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、液剂、乳剂、悬浮剂、软膏剂、注射剂、皮肤贴剂中的一种，辅助剂包括填充剂、崩解剂、粘合剂、乳化剂、润滑剂、助流剂、着色剂中的一种或几种。

对比例1

一种用于治疗抑郁相关神经元保护的药物组合物

药物组合物包括18β-甘草次酸和药学上可接受的辅助剂，其中，18β-甘草次酸的有效浓度为0.5mg/kg。

且，药物组合物的剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、液剂、乳剂、悬浮剂、软膏剂、注射剂、皮肤贴剂中的一种，辅助剂包括填充剂、崩解剂、粘合剂、乳化剂、润滑剂、助流剂、着色剂中的一种或几种。

对比例2

一种用于治疗抑郁相关神经元保护的药物组合物

药物组合物包括18β-甘草次酸和药学上可接受的辅助剂，其中，18β-甘草次酸的有效浓度为70mg/kg。

且，药物组合物的剂型为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、液剂、乳剂、悬浮剂、软膏剂、注射剂、皮肤贴剂中的一种，辅助剂包括填充剂、崩解剂、粘合剂、乳化剂、润滑剂、助流剂、着色剂中的一种或几种。

性质测定及结果分析

性质测定(一)

分析甘草酸及甘草次酸的体内代谢产物18β-GA的途径

以实施例2得到的产品进行甘草次酸(18β-GA)组的试验。

试验方法：

①实验动物及给药方案

SPF级雄性SD大鼠(220±20)g，由广东省医学实验动物中心提供。实验前大鼠适应性饲养7天后，随机分成2组：甘草酸组(n＝4)，甘草次酸(18β-GA)组(n＝4)和空白组(n＝4)。将上述大鼠置于代谢笼中，实验前禁食12小时，期间自由饮水。甘草酸和甘草次酸单体化合物分别用玉米油溶解后，以40mg/kg剂量分别灌胃给药。每组灌胃液体积保持一致，连续给药3天。

②生物样本的收集及前处理方法

血浆样本的收集及前处理：末次灌胃给药后，采集各组中大鼠0.5、1、2、4h肝门静脉血。置于用肝素钠润洗的EP管中，以15521g离心10min制备血浆样本，合并各组各时间点血浆。前处理时，3倍量的乙腈沉淀蛋白，以15521g离心10min，上清液在氮气下吹干。残渣用200μL甲醇复溶，超高速离心后，4μL上清液进UPLC-Q/TOF-MS分析。

脑组织样本的收集及前处理：末次灌胃给药后，采集各组中大鼠0.5、1、2、4h的脑组织样本。称量后，加2倍体积生理盐水匀浆，取各时间点约1mL匀浆液混合，加入6倍量甲醇-乙腈(1:1,v/v)，涡旋2min，14000g离心10min，上清液室温下氮气吹干，加一定量甲醇复溶，14000g离心10min，取上清液4μL进样UPLC-Q/TOF-MS分析。

③UPLC-Q/TOF-MS分析

UPLC分析在配备有二元溶剂系统，自动进样器的Acquity UPLC 1-Class系统上进行(Waters Corporation)。采用BEH RP C18柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，在40℃柱温条件下实现色谱分离。流动相由水(A)和乙腈(B)组成，二者均包含0.1％甲酸(v/v)。以0.4mL/min的流速进行梯度洗脱，洗脱程序如下：5％B,0-0.5min；5-80％B,0.5-10min；80-100％B,10-12min；100％B,12-13min；100％-5％B,13-14min；5％B,14-15min。进样体积设为2μL，检测波长为280nm。UPLC系统与四极杆飞行时间质谱仪串联(SYNAPT^TMG2HDMS,Waters,Manchester,U.K.)。质谱采用电喷雾离子源(ESI)，毛细管电压3kV(ESI+)或-2.5kV(ESI-)，锥孔电压30V(ESI+)或40V(ESI-)，二级锥孔电压4V，源温100℃，脱溶剂气温度300℃，反吹气流速50L/h，脱溶剂气流速800L/h，氩气为碰撞气，在MSE模式中，氩被用作CID的碰撞气体。质谱扫描范围为50-1200Da，以甲酸钠溶液校正质量轴，以亮氨酸脑啡肽为内标校正质量精度(正离子模式m/z 556.2771)。数据采集为centroid模式。

结果分析：

甘草酸灌胃给药大鼠后，在血液中检识得到三个外源性成分。分别为甘草酸原型成分(t_R＝6.00min，m/z 823.4116)，单葡萄糖醛酸甘草次酸(tR＝7.20min，m/z 647.3795)以及18β-GA(tR＝9.00min，m/z 471.3474)。表明甘草酸经过肠吸收及肝代谢后，主要发生去葡萄糖醛酸化反应，形成相应的代谢产物。进一步，对脑组织分析发现，如图1所示，结果表明甘草酸在体内主要发生去葡萄糖醛酸化代谢，生成单葡萄糖醛酸甘草次酸和甘草次酸，其中只有甘草次酸可以穿透血脑屏障吸收进入脑组织，因此，上述三个化合物只有18β-GA可以穿透血脑屏障吸收进入脑组织。此外，18β-GA单体灌胃给药后，其在血液和脑组织中也都有分布，如图2所示，研究结果佐证了18β-GA具备穿透血脑屏障吸收进入脑组织的能力。上述结果明确了18β-GA是甘草酸代谢后吸收入脑的主要成分，明确了18β-GA具备治疗神经系统相关疾病的潜力。

性质测定(二)

分析18β-GA的体内抗炎活性

以实施例1、实施例2、对比例2得到的产品进行甘草次酸组的试验。

试验方法

基于转基因斑马鱼炎症模型体内评价18β-GA抗炎活性

Tg(mpo:GFP)转基因系为中性粒细胞标志转基因鱼；Tg(coro1α:GFP；Lyz:DsRed)转基因系为巨噬细胞(GFP标记，绿光)与中性粒细胞(DsRed标记，红光)双标志转基因鱼。在体视荧光显微镜下能直接观察到中性粒细胞和巨噬细胞在斑马鱼体内的分布、迁移和聚集。通过对免疫细胞行为的直接观察，可直观了解到药物的抗炎效果。我们采用Tg(coro1α:GFP；Lyz:DsRed)转基因系斑马鱼构建LPS显微注射到幼鱼卵黄位诱导构建内毒素炎症模型，采用Tg(mpo:GFP)转基因系斑马鱼与CuSO₄预孵育2小时构建化学损伤炎症模型。基于上述两种模型，对入脑成分18β-GA在无毒剂量下进行抗炎活性评价。

结果分析

在明确18β-GA具备吸收入脑的前提下，基于2种转基因炎症斑马鱼模型进行抗炎活性评价。首先，在3天龄的幼鱼中确定18β-GA的非毒剂量。然后，采用Tg(mepgl:DsRed)转基因系斑马鱼显微注射LPS到幼鱼的卵黄囊，构建炎症模型。基于该模型，通过浸泡方式给药，进行活性评价。实验结果发现，如图3A和图3C所示，图3A为基于LPS显微注射诱导的炎症斑马鱼评价18β-GA的抗炎活性的代表性图片，图3C为基于LPS显微注射诱导的炎症斑马鱼评价18β-GA的抗炎活性的量化数据分析，可以看出18β-GA在0.25μM时具有显著抗炎活性。此外，采用Tg(mpo:GFP)转基因系斑马鱼预先与CuSO4作用，构建炎症模型。基于该模型进行活性评价，如图3B和图3D所示，图3B为基于CuSO4浸泡诱导的炎症斑马鱼评价18β-GA的抗炎活性的代表性图片，图3D为基于CuSO4浸泡诱导的炎症斑马鱼评价18β-GA的抗炎活性的量化数据，实验结果表明18β-GA表现出良好的抗炎活性，进一步表明18β-GA具有显著的抗炎活性。

性质测定(三)

分析18β-GA具有抑制抑郁症相关小胶质细胞活化介导的神经元凋亡，发挥神经元保护作用。

以实施例1、实施例2、对比例1、对比例2得到的产品进行甘草次酸(18β-GA)组的试验。

试验方法(1)分析18β-GA显著增强神经细胞生存活力

①细胞培养及处理

小鼠小胶质细胞系BV2，小鼠海马神经元细胞系HT22，大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12，由中国科学院细胞库提供。BV2和HT22细胞培养于包含10％标准胎牛血清和100IU/mL青霉素和10μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)完全培养基中，每2～3天传代一次。PC12使用包含5％热灭活胎牛血清、10％马血清和100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RIPM 1640培养，第3代起更换含50ng/mL NGF、5％热灭活胎牛血清、10％马血清和100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RIPM 1640分化培养基诱导分化7天。所有细胞培养于37℃，5％CO₂培养箱中。

①CCK8细胞活力检测

将8×10³个细胞接种于96孔板(100uL/孔)，并放入二氧化碳培养箱预培养(37℃，5％CO₂)。BV2、HT22、PC12达到80％融合时加入0.5μmol/L 18β-GA培养箱孵育6h，随后BV2加入1μg/mL LPS作用24h，HT22、PC12加入LPS刺激BV2细胞24h后收集的培养液上清作用24h。药物作用后每孔加入10μL CCK8试剂，将培养板在培养箱内孵育3小时，酶标仪于450nm波长处测定其吸光度OD值。

细胞存活率(％)＝[(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)]×100％

结果分析(1)

小胶质细胞作为中枢神经系统中的先天性免疫细胞，是导致神经退行性疾病中神经元功能障碍或死亡的关键介体。小胶质细胞在受到外界炎性刺激时会从分枝型的静息态转变为变形虫表型的活化态，从而促进炎性反应。CCK8检测发现1μg/mL LPS处理的BV2细胞培养液上清(BV2细胞的生存活力如图4A所示)与HT22和PC12共培养后，HT22和PC12细胞生存率均显著降低，LPS处理的BV2细胞培养液促进神经元细胞死亡，细胞生存率分别为62.76±8.61％(如图4B所示)和78.05±7.70％(如图4C所示)。表明LPS可能诱导BV2小胶质细胞活化，产生促炎因子刺激神经元细胞，从而抑制神经元存活。而18β-GA处理的HT22和PC12细胞生存活力增强，细胞数目较LPS上清液处理组增加(图4B、图4C)，证明18β-GA抑制了LPS诱导的BV2活化产生的物质对神经元细胞的损害，明确了18β-GA具备神经保护作用。

试验方法(2)分析18β-GA具有显著的体外抗炎活性

NO测定

将2×10⁶个/mL的BV2细胞种植于6孔培养板中，并放入二氧化碳培养箱预培养(37℃，5％CO2)。待细胞80％融合时分别加入0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL,4μg/mL，8μg/mL LPS作用24h后收集细胞培养液上清，18β-GA组细胞与含0.5μmol/L 18β-GA的培养液中预孵育6h，再加入1μg/mL LPS作用24h。按50μL/孔在96孔板中分别加入0，1，2，5，10，20，40，60，100μmol/L标准品及相应细胞上清，每孔再依次加入50μL室温Griess Reagent I和50μL室温Griess Reagent II，于540nm波长测定各孔吸光值。

结果分析(2)

NO的过量产生是炎症产生的标志。如图5A所示，图5A为不同浓度LPS作用BV2细胞的NO释放量，可以明确，1μg/mL LPS明显导致了BV2细胞NO的产生，刺激炎症发生。进一步加入18β-GA，如图5B所示，18β-GA显著降低了BV2的NO释放量，具有明显的体外抗炎活性。

试验方法(3)分析18β-GA显著抑制神经元凋亡

流式细胞凋亡检测

将2×10⁶个/mL的细胞种植于6孔培养板中，待BV2、HT22、PC12达到80％融合时加入0.5μmol/L 18β-GA培养箱孵育6h，随后BV2加入1μg/mL LPS作用24h，HT22、PC12加入LPS刺激BV2细胞24h后收集的培养液上清作用24h。0.25％含EDTA胰蛋白酶消化细胞，培养基终止消化，并用离心机1000rpm离心5min，弃去培养液。使用PBS反复吹打洗涤细胞3次并离心，加入PBS重悬细胞，400目的筛网过滤，细胞计数取1×10⁶个细胞，1000rpm离心5min，弃去PBS。加入195μL Annexin V-FITC结合液和5μL Annexin V-FITC重悬细胞，室温避光孵育10min。1000rpm离心5min弃上清，并加入190μL Annexin V-FITC结合液和10μL PI染液重悬细胞，4℃避光孵育10min，最后进行流式细胞仪检测。

结果分析(3)

如图6A所示，流式结果发现LPS处理的BV2上清液诱导了HT22和PC12细胞凋亡，凋亡细胞占总细胞比分别为12.01％和18.23％，而18β-GA显著抑制了活化的小胶质细胞释放因子对神经细胞的伤害，显著减少了HT22和PC12的细胞凋亡，18β-GA可通过抑制小胶质细胞活化介导的神经元凋亡，从而起到神经保护作用。如图6B和图6C所示，18β-GA处理的HT22和PC12凋亡细胞占总细胞比分别为1.44％和3.87％。18β-GA表现出了显著的抗凋亡活性，且18β-GA对HT22的作用较PC12比更有效，其对于海马神经元的炎症抑制和抗凋亡作用更强，基于大脑海马区主要人类负责学习和记忆功能，18β-GA具有神经性疾病的治疗潜力。

性质测定(四)

分析18β-GA调节BV2细胞炎症因子表达

以实施例1、实施例2、对比例1、对比例2得到的产品进行甘草次酸(18β-GA)组的试验。

试验方法

分析18β-GA显著抑制BV2细胞炎症因子释放且促进抗炎因子表达

ELISA检测

将IL-6标准品按照250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9、0pg/mL；IL-1β、IL-10标准品按照2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/mL；IL-4标准品按照1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0pg/mL进行稀释。用去离子水将20倍浓缩洗涤液稀释成1倍洗涤工作液，用检测稀释液将100倍抗体浓缩液稀释成1倍应用工作液。分别收集0、0.125、0.25、0.5、1μmol/L18β-GA预处理的BV2活化细胞上清。96孔反应板中分别加入100μL各浓度标准品与待测样品，封板后置于37℃孵箱中孵育90min后弃去，洗涤工作液反复洗板3～5次并拍干。加入100μL生物素化抗体工作液，封板后37℃孵箱孵育60min，洗板3～5次并拍干。随后加入100μL酶结合物工作液，封板后37℃孵箱孵育30min，洗板5次，加入100μL显色底物并封板，于37℃避光显色15min，加入50μL终止液，于5分钟内在酶标仪450nm波长下测量OD值。

结果分析

小胶质细胞接受外界化学因素刺激后M1型被激活，并释放大量IL-6,IL-1β等促炎因子，导致炎症反应。如图7A、7B所示，LPS促进BV2细胞过度激活，释放大量IL-6,IL-1β促炎因子，诱导炎症发生。小胶质细胞的过度激活会引起神经元细胞死亡，致使神经功能紊乱。如图7所示，不同浓度18β-GA干预后BV2细胞的促炎因子表达减少，炎症改善，且18β-GA显著增加了抗炎因子；IL-10和IL-4的表达，表现出良好的抗炎活性，抑制炎症反应，从而起到神经保护作用。

性质测定(五)

利用Chronic social defeat stress(CSDS)抑郁症动物模型评价18β-GA抗抑郁作用

试验方法

①建立(Chronic social defeat stress(CSDS))

3月龄CD1小鼠及2月龄的C57BL/6小鼠从广东省医学实验动物中心购得。在室温25℃、湿度为45％的动物房适应性饲养一周，自由饮水，标准饮食。实验前将C57BL/6小鼠随机分为对照组和应急组，每天将应急组C57BL/6小鼠作为侵入者放入长期单独饲养CD1小鼠笼中，进行身体接触10分钟。10分钟内C57BL/6小鼠将受到CD1小鼠攻击并表现出逃跑、恐惧、顺从等从属性特征。10分钟身体接触后，使用透明并且有很多小孔的有机玻璃挡板将二者隔离开进行心理应激24小时，保证C57BL/6小鼠能看到CD1小鼠，听到CD1小鼠声音，并且能闻到CD1小鼠气味，应激持续10天。应激结束后对C57BL/6小鼠单独饲养，进行行为学评价。对照组则使用等量的鼠笼饲养，2只对照组C57BL/6小鼠成对隔开，并且每天将每只小鼠至于掌心30秒钟。待应激结束后，对照组小鼠也单独饲养。

社会交互实验(Social interaction test(SIT))，SIT分为2个阶段，每个阶段2.5分钟。实验在42cm×42cm×25cm开场内进行。第一阶段将C57BL/6小鼠随机放置到所预定义的交互区域远端的两个角落处，交互区域内放置一个3cm×6cm×25cm的布满小孔的塑料透明小盒，盒内不放置CD1小鼠。第二阶段，向透明小盒内放置一只CD1小鼠，再将C57BL/6小鼠放回到开场内，观察C57BL/6小鼠与CD1小鼠交互情况。实验过程使用摄像系统记录，并使用秒表对小鼠在预定义的交互区域内(塑料透明小盒周围8cm)的停留时间进行分析，用小鼠第二阶段在预定义的交互区域内停留时间比小鼠第一阶段在预定义的交互区域内停留时间，如果小于1则认定为“敏感性”，如果大于1则认定为“不敏感性”。

②运动实验

运动实验箱是一个用灰色聚氯乙烯制成的正方形盒子，尺寸为60*60*40cm，其地板分割为144个小矩形(5*5cm)。里面有一台摄像机，一个屏蔽噪声的扬声器以及一个红色灯泡(25W),放置于设备中心上方180厘米处。在实验中，将小鼠轻轻放入矿场中心，让其自由探索30分钟。用Ethovision XT 14.0(Noldus)软件采集小鼠运动距离。

③强迫游泳实验(forced swimming test(FST))

强迫游泳实验是在一个透明玻璃材质的圆筒状水缸(高45厘米，直径19厘米)中进行的，在玻璃缸内装入23厘米高的水，水温需要控制在22-25℃，实验持续6分钟。小鼠的不动持续时间需要被记录

④糖水偏好实验(sucrose preference test(SPT))

将单笼的小鼠至于安静的正常生长环境中，分别在饲养1、2、3、4周后给予具有刻度的A、B两个水瓶，其中A为水，B瓶为等体积的1％的蔗糖溶液，同时监测1h内其左右两边喝水的情况。分别读取A、B所剩溶液体积，计算体积差，利用公式:100*(VolB/(VolA+VolB)计算出每只小鼠的糖水偏好值。

结果分析

利用CSDS抑郁症模型我们研究发现18β-GA具有明显的抗抑郁作用，SIT实验发现Target实验中(图8A)，压力刺激的小鼠与对照组小鼠相比较，社会交互时间明显减少，这种现象可被18β-GA逆转，并具有剂量依存关系(图8B)。运动实验发现高剂量的18β-GA可减少小鼠运动能力(图8C)。FST实验发现压力刺激的小鼠与对照组小鼠相比较，游泳不动时间明显延长，这种现象可被18β-GA逆转，并具有剂量依存关系(图8D)。SPT实验发现压力刺激的小鼠与对照组小鼠相比较，糖水摄取率明显减少，这种现象也可被18β-GA逆转，并也具有剂量依存关系(图8E)。综上研究所示：18β-GA可改善CSDS抑郁症模型小鼠抑郁样行为，提示18β-GA具有抗抑郁作用。

性质测定(六)

18β-甘草次酸可以激活抑郁症的核转录因子Nrf-2启动脑源性神经生长因子转录翻译而发挥神经元细胞保护作用

试验方法

利用离体实验探讨18β-GA和Nrf2与BDNF转录的关系，通过原代神经细胞以及荧光素酶报告实验，Chip实验，qPCR和Western-blot实验探讨18β-GA与BDNF转录的关系；进一步通过CSDS小鼠抑郁症模型，在明确18β-GA的抗抑郁效果基础上，利用ChiP-PCR实验探讨18β-GA处理后，Nrf2与BDNF外显子I启动序列结合情况，利用Western-blot实验检测18β-GA处理后，Nrf2,BDNF,MeCP2蛋白水平表达情况。

结果分析

如图9所示，研究发现在原代神经细胞上18β-GA可促进Nrf2与BDNF外显子I启动序列结合，启动BDNF转录。如图10所示，qPCR和Western-blot实验结果显示18β-GA可促进Nrf2与BDNF mRNA和蛋白表达升高，抑制MeCP2 mRNA和蛋白表达。因此，18β-GA可通过激活Nrf2启动BDNF转录翻译。

进一步，如图11所示，在抑郁模型动物上发现18β-GA可逆转CSDS小鼠抑郁样行为，利用ChiP-PCR实验显示18β-GA可促进Nrf2与BDNF启动子I结合。如图12所示，利用Western-blot实验发现18β-GA可逆转慢性压力刺激引起的Nrf2蛋白表达下降，MeCP2蛋白表达升高。通过离体在体实验均说明18β-GA通过激活Nrf2抑制MeCP2表达，导致Nrf2与BDNF外显子I启动序列结合启动BDNF转录翻译进而发挥神经元细胞保护作用。

综上，本申请提供的18β-甘草次酸在制备治疗抑郁相关神经元保护药物中的应用，基于对抑郁相关小胶质细胞和/或促炎因子、抗炎因子表达的调节，显著减少神经元细胞凋亡，提高对神经元细胞的保护；通过激活抑郁症中的核转录因子Nrf-2启动脑源性神经生长因子转录的调节剂而发挥神经元细胞保护作用。18β-甘草次酸能够针对性地对抑郁引起的神经元细胞损伤具有较好的作用，为天然组分，效果好，无明显副作用，适于广泛应用。

以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (7)

1.18β-甘草次酸在制备治疗抑郁相关神经元保护药物中的应用；所述18β-甘草次酸的结构式如下：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述18β-甘草次酸通过抑制抑郁症相关小胶质细胞活化介导的神经元凋亡，发挥神经元保护作用。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述18β-甘草次酸通过激活抑郁症相关的核转录因子Nrf-2启动脑源性神经生长因子转录的调节剂而发挥神经元细胞保护作用。

4.根据权利要求1中所述的应用，其特征在于，所述18β-甘草次酸的有效浓度为5.0-50mg/kg。

5.一种用于治疗抑郁相关神经元保护药物的药物组合物，其特征在于，所述药物组合包括18β-甘草次酸和药学上可接受的辅助剂。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物作为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、液剂、乳剂、悬浮剂、软膏剂、注射剂、皮肤贴剂的口服或非口服用药物制备。

7.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述辅助剂包括填充剂、崩解剂、粘合剂、乳化剂、润滑剂、助流剂、着色剂中的一种或几种。

Images