具体实施方式
制备例1:制备知母总皂苷
知母药材粉碎成粗粉,加70%乙醇先浸泡4小时,然后常温超声提取三次,溶剂倍数为4∶4∶3,提取时间每次3小时,提取液合并过滤,滤液减压浓缩至乙醇含量30%左右,浓缩液上处理好的AB-8大孔吸附树脂,上样后的AB-8大孔吸附树脂分别用30%乙醇洗脱2个柱体积,50%乙醇洗脱1个柱体积,95%乙醇洗脱2个柱体积,95%乙醇洗脱液减压浓缩至浓膏,将浓膏真空干燥得知母总皂苷;其总皂苷含量54%,菝蓣皂苷元的含量32.3%。
制备例2:制备知母总皂苷
知母药材粉碎成粗粉,加70%乙醇先浸泡4小时,然后常温超声提取三次,溶剂倍数为4∶4∶3,提取时间每次3小时,提取液合并过滤,滤液减压浓缩至乙醇含量30%左右,浓缩液上处理好的AB-8大孔吸附树脂,上样后的AB-8大孔吸附树脂分别用30%乙醇洗脱2个柱体积,50%乙醇洗脱1个柱体积,95%乙醇洗脱2个柱体积,95%乙醇洗脱液减压浓缩至浓膏,将浓膏真空干燥得知母总皂苷;其总皂苷含量84%,菝蓣皂苷元的含量52.3%。
试验例一:对α-葡萄糖苷酶的体外抑制实验
1.材料:
知母总皂苷:按制备例1制备;
大鼠:山东省天然药物工程技术研究中心提供
拜糖苹:德国拜耳医药保健有限公司,批号:101181
2.方法:
取大白鼠上端小肠20g,加4℃预冷的PH6.8磷酸缓冲液60ml,匀浆,4℃、4000rpm离心20min,取上清分装入试管中,-20℃冷冻保存备用;取酶液(小肠匀浆液)0.2ml加PH6.8磷酸缓冲液0.7ml,37℃水浴10min,加入0.5mol/L蔗糖0.1ml,反应20min后,加入1ml0.1mol/LNaCO3终止反应;酶法测定葡萄糖浓度,分3组,空白对照组,知母总皂苷组和拜糖苹组,每组三管,平行测定;将在37℃,每分钟1L溶液中生成0.01mmol葡萄糖定义为一个酶活力单位,见表1。
表1知母总皂苷对α-葡萄糖苷酶活性的体外抑制
组别 |
吸光值(平均数±标准差) |
抑制率(%) |
空白对照组知母总皂苷组拜糖苹组 |
0.253±0.040.118±0.020.099±0.03 | 73.0992.99 |
试验例二:对正常小鼠血糖的影响实验
1.材料:
小白鼠:山东省天然药物工程技术研究中心提供;
知母总皂苷:按制备例2方法制备;
2.方法:
取小白鼠50只,雌雄各半,体重24-28g,测空腹血糖,随机分为5组:正常对照组,知母总皂苷4个剂量组(50mg/Kg、150mg/Kg、450mg/Kg、1350mg/Kg)。连续灌胃7天,末次给药7h后断尾采血,测血糖浓度;然后断头处死小鼠,取血液离心分离血清,置-20℃冰箱保存,做胰岛素放射免疫测定备用;小鼠剖腹,自肝内门静脉按10ml/只的剂量,用注射器将生理盐水缓慢注入肝脏,将肝脏中残留血液冲洗掉,取出肝脏,称重,按1g肝加入PH7.4等渗磷酸盐缓冲液50ml用组织研磨器制备匀浆,取匀浆液0.5ml,加入4%的磺基水杨酸溶液0.5ml,充分混匀,离心,弃沉淀,蒽酮法测定肝糖原含量,见表2。
表2知母总皂苷对正常小鼠血糖、血胰岛素水平和肝糖原含量的影响
组别 |
剂量(mg/Kg) |
血糖(mmol/L) |
血浆胰岛素(103μU/L) |
肝糖原含量(mg/g) |
正常对照组知母总皂苷组 | 501504501350 |
6.51±0.415.53±0.12*4.15±0.15**3.44±0.33**3.53±0.15** |
24.24±4.0624.72±2.6827.21±3.04*28.33±2.63**28.25±3.01* |
9.84±1.2310.12±2.0011.94±1.77*12.34±0.99**11.66±1.12* |
与正常对照组相比:*P<0.05,**P<0.01
试验例三:对糖尿病模型小鼠血糖的影响实验
1.材料:
小白鼠:山东省天然药物工程技术研究中心提供;
知母总皂苷:按制备例方法制备;
优降糖:天津力生制药厂产品,批号990304
2.方法
取小白鼠150只,雌雄各半,体重24-28g,10只为正常对照组,其余尾静脉注射四氧嘧啶55mg/Kg,72h后测空腹血糖,选取血糖值>11mmo/L的高血糖小鼠60只,按血糖高低随机分为6组:糖尿病模型对照组、优降糖组和知母总皂苷4个剂量组(50mg/Kg,150mg/Kg,450mg/Kg,1350mg/Kg),使各组的血糖无显著性差异。灌胃给药10d,于末次给药后7h,断尾采血,测血糖浓度;然后断头处死小鼠,取血液离心分离血清,置-20℃冰箱保存,做胰岛素放射免疫测定备用;小鼠剖腹,自肝内门静脉按10ml/只的剂量,用注射器将生理盐水缓慢注入肝脏,将肝脏中残留血液冲洗掉,取出肝脏,称重,按1g肝加入PH7.4等渗磷酸盐缓冲液50ml用组织研磨器制备匀浆,取匀浆液0.5ml,加入4%的磺基水杨酸溶液0.5ml,充分混匀,离心,弃沉淀,蒽酮法测定肝糖原含量,见表3。
表3知母总皂苷对四氧嘧啶高血糖小鼠血糖、血胰岛素水平和肝糖原含量的影响
组别 |
剂量(mg/Kg) |
血糖(mmol/L) |
血浆胰岛素(μIU) |
肝糖原含量(mg/g) |
正常对照组模型对照组优降糖组知母总皂苷组 | 501504501350 |
6.14±0.5813.61±2.12△10.47±0.58**9.84±2.33*8.81±2.27**6.42±2.01**6.51±1.98** |
24.15±2.297.41±1.55△9.35±1.87*9.21±2.31*10.18±1.13**11.04±2.01**10.96±1.17** |
9.46±1.412.14±1.51△3.13±1.71*3.27±1.65*4.03±2.07**5.11±2.21**5.32±3.11** |
与正常对照组相比:△P<0.05,△△P<0.01;与模型对照组相比:*P<0.05,**P<0.01
试验例四:对正常小鼠糖耐量的影响实验
1.材料:
知母总皂苷:按制备例1制备;
大鼠:山东省天然药物工程技术研究中心提供
拜糖苹:德国拜耳医药保健有限公司,批号:101181
2.方法:
取小白鼠60只,雌雄各半,体重24-28g,测空腹血糖,随机分为6组:正常对照组、拜糖苹组和知母总皂苷4个剂量组(50mg/Kg、150mg/Kg、450mg/Kg、1350mg/Kg),使各组的血糖无显著性差异。给药后,以10g/Kg剂量淀粉灌胃,分别于给淀粉后0.5h、1h、2h测血糖,见表4。
表4知母总皂苷对正常小鼠糖耐量的影响
组别 |
剂量(mg/Kg) |
空腹血糖(mmol/L) |
0.5h血糖(mmol/L) |
1h血糖(mmol/L) |
2h血糖(mmol/L) |
正常对照组知母总皂苷组拜糖苹组 | 501504501350 |
3.16±0.123.51±0.453.08±0.833.33±0.553.17±0.633.31±0.56 |
15.3±3.089.05±2.01**6.80±2.21**5.34±2.11**5.13±2.43**4.08±0.60** |
16.12±3.589.94±2.42**7.01±2.58**5.99±2.33**5.43±2.01**5.12±1.03** |
9.18±1.516.2±2.11**5.45±1.93**4.22±2.01**4.01±1.99**3.7±0.79** |
与正常对照组相比:*P<0.05,**P<0.01
试验例五:对糖尿病小鼠糖耐量的影响实验
1.材料:
知母总皂苷:按制备例1制备;
大鼠:山东省天然药物工程技术研究中心提供
拜糖苹:德国拜耳医药保健有限公司,批号:101181
2.方法:
取小白鼠150只,雌雄各半,体重24-28g,10只作为正常对照组,其余尾静脉注射四氧嘧啶55mg/Kg,72h后测空腹血糖,选取血糖值>11mmo/L的高血糖小鼠50只,随机分为5组:拜糖苹组和知母总皂苷4个剂量组(50mg/Kg、150mg/Kg、450mg/Kg、1350mg/Kg),使各组的血糖无显著性差异。给药后,以10g/Kg剂量淀粉灌胃,分别于给淀粉后0.5h、1h、2h测血糖,见表5。
表5知母总皂苷对四氧嘧啶模型小鼠糖耐量的影响
组别 |
剂量(mg/Kg) |
空腹血糖(mmol/L) |
0.5h血糖(mmol/L) |
1h血糖(mmol/L) |
2h血糖(mmol/L) |
模型对照组知母总皂苷组拜糖苹组 | 501504501350 |
13.86±2.3313.51±2.1413.94±2.1713.41±2.2213.64±2.3114.01±2.25 |
29.3±3.1122.7±3.15**18.95±2.08**16.53±2.23**16.23±3.11**14.23±0.46** |
30.12±2.6121.91±2.98**19.22±3.01**17.04±2.57**16.44±2.14**15.3±1.22** |
21.08±2.1718.36±3.24**15.34±2.03**14.96±2.32**14.77±1.97**14.83±0.79** |
与模型对照组相比:*P<0.05,**P<0.01