CN1911272A - 高含量丹参多酚酸盐粉针剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高含量丹参多酚酸盐粉针剂，该粉针剂中丹参乙酸镁的含量为50％－95％，多酚酸盐有效部位含量近100％。临床前药理、毒理以及临床试验结果表明它是一个高效、低毒的心血管药物，优于现有的丹参制剂。本发明还提供了制备方法，确保了制剂的质量，克服了现有丹参注射剂的缺点，有较大的应用价值。

Description

高含量丹参多酚酸盐粉针剂及其制备方法

技术领域：

本发明属于中药技术领域。具体涉及一种高含量丹参多酚酸盐粉针剂及其制备方法。

背景技术：

近年，心血管疾病的发病率逐年增加，据统计目前中国有高血压患者1亿多人，冠心病患者一千多万。心血管疾病逐渐成为危害人民健康的“第一杀手”。寻找和研制有效的心血管疾病治疗药一直是药物研究领域的重点。传统中药在本领域已显示了很强的优越性，其中较为著名的是丹参及其制剂。丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)是传统的活血化瘀中药之一，有长期的临床应用基础。丹参注射液是临床上治疗冠心病、心绞痛、心肌梗塞、缺血性中风等疾病的常用药物，但现有的注射剂因有效成分不明确、质量控制指标不严格导致临床疗效不稳定，不良反应时常出现，已不符合中药现代化和走向国际化的要求。这些问题的出现，关键是丹参的有效成分未能完全阐明。

本发明人开展了丹参的水溶性成分的系统研究，发现丹参的水溶性有效成分均以盐的形式存在于生药材中，这些成分主要为丹参乙酸镁及其同系物：紫草酸镁、迷迭香酸钠、丹参乙酸二钾、异丹参乙酸二钾、丹参素钾和紫草酸二钾等。通过活性筛选和药理学研究发现：丹参乙酸镁和它的同系物均为活性成分，其中以丹参乙酸镁药理作用最强，它是丹参的主要活性成分，并首次阐明以丹参乙酸镁为主要成分的多酚酸盐是丹参中最重要的有效活性部位。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题在于克服现有丹参制剂的不足之处，研究设计新的有效的丹参多酚酸盐制剂。

本发明提供了一种高含量丹参多酚酸盐粉针剂。

在本发明的高含量多丹参多酚酸盐粉针剂中丹参乙酸镁的含量为50％-95％，丹参多酚酸盐有效部位含量接近100％。

本发明另一目的是提供高含量丹参多酚酸盐粉针剂的制备方法。

为解决制备问题，本发明人进行了制备方法的方案设计，

1、提取溶剂的选定

丹参多酚酸盐的有效成分为丹参乙酸盐及其同系物，本发明人以丹参乙酸盐作为原料的质量控制指标，该类多酚酸盐化合物均为水溶性成分，因此，最有效的提取溶剂为水和含水醇。选择水，70％的含水甲醇或乙醇分别提取，提取液用HPLC分析所含丹参乙酸盐的含量(如表1)

                    表1不同提取的溶剂的提取效率

提取方法	水				70％甲醇	70％乙醇
							1	2	3	4
	提取率(％)归一法含量(％)实测含量(％)	15.055.8824.40	14.163.1029.53	15.253.2225.62							13.549.1030.49	12.862.4930.98	10.271.7044.12

生药量均为20克，100ml提取液回流提取三次，每次2小时，合并提取液浓缩至无有机溶剂后，上大孔树脂初步去除糖、肽类杂质后，50％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至干，称量计算提取率。配置成一定浓度样品溶液后，分别进行HPLC定量分析，计算丹参乙酸盐含量。

表1中的归一法含量可以反映丹参乙酸盐在总的多酚酸盐类化合物中的含量，而实测含量则是获得的提取物中丹参乙酸盐的含量。尽管70％乙醇提取液，无论归一法含量还是实际含量均优于其它提取法，但从经济角度考虑，水提法作为一种常用的中草药提取法也具有着优势，另外，水提取液可直接吸附于下一步的大孔树脂，省略了减压浓缩的步骤，而且水提物中含有的杂质大多为在下一步大孔树脂层析中用水可以洗脱的糖、蛋白质等杂质，而且提取得率也相对较好，因此，本发明将提取方法确定为水提法。

2、分离方法的选定

分离的目的主要是为了获得合乎注射用药质量要求的产品。传统的草药针剂精制主要依靠醇沉法，醇沉法可以去除较多大分子量的树脂、蛋白质和多糖等，但难以去除小分子的核苷酸及糖类，这只能是一种粗提浸膏，其有效成分含量往往不高，它的质量也会受生药材的质量所左右。

利用现代色谱技术可以获得高纯度的产品，可以保留丹参多酚酸盐类化合物有机盐的存在形式，而且可以将同一多酚酸的不同盐分离，非常适合本产品的分离精制，但是，在实验室研究中采用的反相层析担体，如MCI GEL CHP20P或者Toyopearl HW40F等大多价格昂贵，不适合于大规模、经济性的生产。大孔树脂是近年来较多用于工业化植物成分分离精制的层析担体，它是一种聚二乙烯苯多孔性聚合物，对水溶性酚性化合物的吸附能力要大于水溶性中性成分，可用于植物成分的初步分离及脱糖和脱无机盐。而且，在试验中本发明人发现，大孔吸附树脂的层析行为和MCI GEL CHP20P相似(图1)。

由图1可知，丹参提取物中的不同化合物在1300-I大孔吸附树脂层析柱上的吸附能力各不相同，其中糖、蛋白质及无机盐等无法被树脂吸附，这非常有利于大分子类杂质的去除；而丹参酮等极性相对较低的化合物则被牢固地吸附，需要用100％的乙醇才能将它们洗脱，同样可以有效去除；而丹参多酚酸盐类化合物的吸附能力由弱至强依次为丹参素钾、紫草酸二钾、丹参乙酸二钾、紫草酸镁、丹参乙酸镁及迷迭香酸钠，尤其是丹参乙酸二钾先于丹参乙酸镁从层析柱上洗脱，这就为保证最终产品富含丹参乙酸盐，主要为丹参乙酸镁，这就使在洗脱液收集过程中根据薄层检测，能有目的地收集富含丹参乙酸盐(主要为丹参乙酸镁)的流份，从而保证丹参乙酸盐的含量达到质量要求。

但是，单用大孔吸附树脂进行分离精制获得的产品不符合注射剂的树脂检查规定，本发明人进行具体对照试验结果见表2

                      表2不同分离方法试验结果

精制方法	成品得量(g)	成品薄层检测3	树脂检查4
				醇沉法2大孔树脂法2大孔树脂法+醇沉法	13.14.62.1	原点呈棕黑色，除丹参乙酸盐外，尚有其它棕红色斑点原点呈棕红色，主含丹参乙酸盐斑点原点基本不显色，主含丹参乙酸盐斑点	-+-

1)200g生药粉，水提取三次，过滤浓缩至300ml后，分别取100ml依各法精制。

2)醇沉法采用常规90％及95％乙醇两次沉淀法，大孔树脂法则采用水洗，20％及50％乙醇洗脱，收集50％乙醇洗脱液。

3)薄层检测条件为：苯一甲酸乙酯一甲酸(8∶7∶2)，硅胶板，硫酸一茴香醛显色。

4)醇沉后浓缩至干的样品配制成5mg/ml溶液，取5ml加浓HCl一滴，半小时后观察树脂状物析出的情况。

从表2中可见，单用醇沉法，固体得量较高，产品中含有大量在薄层检测中位于原点的呈棕黑色显色的糖类，另外含有较多的非丹参乙酸盐棕红色斑色，即丹参乙酸盐的同系物；大孔树脂法获得的产品，尽管主含丹参乙酸盐，但原点显棕红色的大分子聚合物明显，树脂检查不合格；两种方法的结合则可以综合两法的优点，既去除了中性的糖类，又去除了大分子酚性聚合物，薄层检测主要显示丹参乙酸盐斑点，产品纯度远优于两法的单独使用，从而确定本发明的精制方法采用大孔树脂法十醇沉法是切实可行的。

3、洗脱方法研究

本发明人选择了乙醇作为洗脱剂，分别用不同浓度的乙醇进行洗脱，薄层跟踪检测洗出情况，具体结果见表3

                            表3不同浓度乙醇的洗脱结果

乙醇浓度	0％	10％	20％	30％	40％	50％	60％	70％
									洗脱液体积(ml)薄层检测有无丹参乙酸盐斑点固体得量(mg)	120无-	120无-	120有少量-	150有无512	90有无503	55有无519	50有无524	50有无517

1)200g生药粉末，热水提取过滤，浓缩成300ml溶液，各取30ml经60ml大孔树脂吸附后，用上述溶剂洗脱，控制流速为2ml/min，洗脱液体积为流出液在薄层检测中发现丹参乙酸盐斑点的总体积，固体得量为该洗脱液浓缩至干后的称重。

2)水及10％、20％乙醇洗脱剂用量为120ml，水及10％乙醇流分薄层检测没有发现丹参乙酸盐，20％流分仅含少量丹参乙酸盐，故未进一步加大体积进行考察。

3)薄层检测条件：苯一甲酸乙酯一甲酸(8∶7∶2)，硫酸一茴香醛显色。

由上表可见，0-10％乙醇不能将丹参乙酸盐洗脱下来；但可以将糖、蛋白质、无机盐以及非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物去除，20％乙醇洗脱液虽含有丹参乙酸盐，但以紫草酸盐为主，根据丹参多酚酸盐类化合物在1300-I树脂上的层析行为，该丹参乙酸盐应用丹参乙酸二钾，而30-40％乙醇可以洗脱丹参乙酸盐，但出峰拖尾严重，造成收集体积增大，且洗脱时间较长；50-70％洗脱则丹参乙酸盐流出较为集中。考虑工厂生产成本，洗脱体积增大将增加溶剂消耗量和回收动力成本，洗脱时间的延长则使生产周期延长，同样增加生产成本。不同浓度洗脱这后获得产品的固体得量没有明显区别。综合考虑，先以6倍生药量的水去除糖、蛋白质及无机盐，再以6倍生药量的20％乙醇去除丹参素钾、紫草酸盐及少是量的丹参乙酸盐(该盐应为丹参乙酸二钾)，最后以3倍生药量的50％乙醇作洗脱剂来获得主含丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐流分，实际操作可根据薄层检测跟踪来确定洗脱剂的用量及合并富含丹参乙酸盐的部分。

4、醇沉条件选择

醇沉的目的是为了除去有效部位中的残留大分子物质如树脂等，以减少注射剂的刺激性，提高产品的安全性。产品的主要有效成分丹参乙酸盐可溶于水和含水醇，但在无水乙醇中溶解度不大，因此考虑使用含水乙醇进行醇沉，而选择合适浓度的乙醇是能否获得合格产品的关键。

研究结果表明，95％醇沉产品收率比90％醇沉损失将近1/3，而90％醇沉产品树脂检查显示，树脂状物析出相对较少，其损失主要为95％醇沉时，沉淀物太粘，大量滤液包夹于沉淀中所致。因此，考虑进行分级沉淀，首先用90％乙醇沉淀去除大部分树脂，并尽可能滤出较多滤液，再用95％乙醇彻底去除树脂，试验结果显示，二次醇沉可减少醇沉过程中的有效成分损失，提高产品收率。

5、剂型的选择

注射用丹参多酚酸盐为丹参水溶性活性部位，其活性指标成分为丹参乙酸盐(主要为丹参乙酸镁，另包括少量丹参乙酸二钾)，丹参乙酸镁的结构如下：

                      丹参乙酸镁的化学结构式

该化合物为淡黄无定形粉末，易溶于水，微溶于醇，难溶于丙酮。

其分子结构中有两个酯键，在水溶液中不太稳定，易降解，在室温条件下放置4天，丹参乙酸镁(Rt 5.428)在水溶液中降解成紫草酸盐(Rt 1.828)及丹参素盐(Rt3.249)；酚羟基在溶液状态也极易氧化，因此作为水针剂的原料是不太合适的。这也是市场上丹参注射液中丹参乙酸盐含量较低，颜色呈深棕色的原因之一。由于针剂起效速度远较口服制剂快，因此，粉针剂是理想的剂型。

另外，丹参多酚酸盐易溶于水，不易吸潮，普通干燥粉碎或喷雾干燥所得的粉剂在溶解时，易于黏结成团，完全溶解需激烈搅拌，且耗时较长，不利于临床使用，另外，如前所述，本品的活性指标成分丹参乙酸盐在水溶液中不稳定，选择冷冻干燥工艺可以尽可能地减少其降解。

本发明的另一目的是提供了高含量丹参多酚酸盐粉针剂的制备方法，该方法包括下列步骤：

(1)丹参煎煮提取：

丹参药材粉碎后，依次以丹参生药重量的4倍量、2倍量和2倍量的水先后煎煮三次，每次2小时，合并三次提取液，冷至室温，离心过滤，滤液备用；

(2)树脂分离：

将滤液缓缓流过装有丹参生药重量的3倍量的1300-I大孔树脂吸附柱，吸附完毕后，先用丹参生药重量的6倍量水洗去糖、蛋白质及无机盐；再以丹参生药重量的6倍量20％乙醇除去非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物，用薄层检测控制收集富含丹参乙酸盐的50％乙醇洗脱液；

(3)二次醇沉：

将富含丹参乙酸盐的50％乙醇洗脱液，减压浓缩至1/10的丹参生药量后，搅拌下徐徐加入9/10丹参生药量的无水乙醇，静置两小时后，离心弃去沉淀；滤液浓缩至1/20的丹参生药量后，加入相当于19/20丹参生药量的无水乙醇，静置两小时，作为第二次醇沉，离心弃去沉淀，滤液减压浓缩至干，制得丹参多酚酸盐；

(4)丹参多酚酸盐粉针剂制备：

丹参多酚酸盐粉末溶于40倍量水，通过0.2-0.4μm的超滤膜，滤液灌装于瓶内，冷冻干燥后即得产品。

在本发明的方法中，树脂除了1300-I大孔树脂外，还可应用D101型、AB-8型和RA型等树脂。

本发明高含量丹参多酚酸盐粉针剂在制备过程中，有严格的质量标准检测，采用指纹图谱技术对丹参药材、原料药和制剂的质量进行全面控制，从而确保了产品的质量稳定，克服了现有注射剂的缺点。本发明的方法获得了高含量丹参多酚酸盐，经检测丹参乙酸镁含量为50％-95％，其余成分为紫草酸镁，迷迭香酸钠以及少量丹参素，多酚酸盐有效部位含量近100％。

本发明根据丹参多酚酸盐的药效学研究结果，狗的有效剂量1，3，10mg/kg，折算相应的人体剂理量分别为0.53，1.59，5.31mg/kg，相应的临床用量(按人体重70kg)为分别37，111，371mg，所以我们取本品静脉注射每次50-100mg，每日1-2次，作为推荐临床用治疗剂量；或本品200mg加5％生理盐水500ml(或5％葡萄糖溶液500ml)静脉滴注，每天1次，作为推荐临床用治疗剂量。基于此，确定本品的规格为50mg/瓶、100mg/瓶、200mg/瓶、300mg/瓶、400mg/瓶。

由于本品的静脉注射浓度为5.0mg/ml，因此制剂瓶至少容量至少为10ml。

本发明的高含量丹参多酚酸盐的临床前药理及临床结果如下：

丹参多酚酸盐临床前药理学研究显示：丹参多酚酸盐对狗冠状动脉结扎造成心肌梗塞模型和离体大鼠心脏再灌注损伤，能使心肌缺血程度显著下降，心肌缺血范围缩小，减轻心肌缺血时的细胞损害，具有显著的抗心肌缺血作用。同时丹参多酚酸盐可降低心脏耗氧量，并能对抗ADP诱导的血小板聚集和抑制血栓形成。其特点是在治疗剂量范围内不影响心脏血液动力学功能。

丹参多酚酸盐粉针剂I、II、III期临床试验研究结果显示：

在I期临床试验中，单次给药组及多次(累积)给药组共30例健康受试者，在初始剂量及临床推荐剂量的2倍范围内，观察过程中均未出现不良反应，并在停药后随访3天也未见不良反应；

在II期临床试验中，采用多中心、随机对照法的实验方案对丹参多酚酸盐粉针剂治疗冠心病、心绞痛进行临床研究。结果显示：注射用丹参多酚酸盐试药组心绞痛总有效率为92.2％，心电图疗效总有效率61.2％；中医症状疗效总有效率为92.2％。疾病综合疗效：注射用丹参多酚酸盐试药组总有效率为86.2％，阳性对照组丹参注射液为55.3％。两组间比较有统计学意义(P＜0.01)。II期临床试验结果表明：注射用丹参多酚酸盐治疗冠心病、心绞痛(心血瘀阻症)疗效确切，是安全的。

采用多中心、随机、阳性药对照、三组平行的试验方法，III期临床试验研究结果显示：(1)注射用丹参多酚酸盐试药组1心绞痛总有效率为88.085％，试验组2总有效率为89.744％，对照组丹参注射液总有效率为67.257％，试验组1、试验组2与对照组总有效率比较差异有高度统计意义(P＜0.01)(2)中医症状疗效：试验组1总有效率为80.426％，试验组2总有效率为80.342％，对照组丹参注射液总有效率为58.407％，试验组1、试验组2与对照组比较差异均有高度统计意义(P＜0.01)；(3)心电图疗效：试验组1总有效率为44.444％，试验组2总有效率为53.086％，对照组丹参注射液总有效率为32.530％，试验组2与对照组心电图总疗效、总有效率比较差异有统计意义(P＜0.01或P＜0.05)(4)运动试验心电图疗效：注射用丹参多酚酸盐临床推荐剂量组(200mg)试验前后在运动级别、运动当量、试验结束后2分钟及4分钟12导联ST段下降幅度之和等指标有明显改善，自身前后比较，差异有统计意义(P＜0.01或P＜0.05)。

通过I、II、III期临床试验研究结果和临床前药理毒理研究显示：注射用丹参多酚酸盐及其粉针是一个安全、高效、质量稳定可控的心血管药物，具有良好的发展和应用前景。

附图说明：

图1不同丹参多酚酸盐类化合物在1300-I大孔吸附树脂上的层析行为。

具体实施方式：

实例1：

1份丹参药材粉碎后，依次以4倍量水，2倍量水，2倍量水，煎煮提取三次，每次提取时间为2小时。合并三次提取液，冷至室温后，离心过滤，滤液缓缓流过装有3倍量的1300-I大孔树脂的吸附柱。吸附完毕后，用6倍量水洗去糖、蛋白质及无机盐，再以6倍量20％乙醇去除去非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物，最后以3倍量50％乙醇洗脱丹参多酚酸盐。根据薄层检测收集富含丹参乙酸盐的50％乙醇洗出液，减压浓缩至1/10的生药量后，于搅拌下徐徐加入9/10生药量的无水乙醇，静置两小时后，离心弃去沉淀；滤液浓缩至1/20的生药量，加入19/20生药量的无水乙醇，静置两小时，离心过滤，滤液减压浓缩至干，粉碎即可获成品。按生药材计丹参多酚酸盐的得率为1％，成品中丹参乙酸镁含量可达82％。丹参多酚酸盐粉末溶于40倍量水，通过0.2-0.4μm的超滤膜，滤液灌装于瓶内，冷冻干燥后即得注射用丹参多酚酸盐粉针剂。

实例2：

1份丹参药材粉碎后，依次以4倍量水，2倍量水，2倍量水，煎煮提取三次，每次提取时间为2小时。合并三次提取液，冷至室温后，离心过滤，滤液缓缓流过装有3倍量的D101型大孔树脂的吸附柱。吸附完毕后，用6倍量水洗去糖、蛋白质及无机盐，再以6倍量20％乙醇去除去非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物，最后以3倍量50％乙醇洗脱丹参多酚酸盐。根据薄层检测收集富含丹参乙酸盐的50％乙醇洗出液，减压浓缩至1/10的生药量后，于搅拌下徐徐加入9/10生药量的无水乙醇，静置两小时后，离心弃去沉淀；滤液浓缩至1/20的生药量，加入19/20生药量的无水乙醇，静置两小时，离心过滤，滤液减压浓缩至干，粉碎即可获成品。按生药材计丹参多酚酸盐的得率为2％，成品中丹参乙酸镁含量可达90％。丹参多酚酸盐粉末溶于40倍量水，通过0.2-0.4μm的超滤膜，滤液灌装于瓶内，冷冻干燥后即得注射用丹参多酚酸盐粉针剂。

Claims (4)

1、一种高含量丹参多酚酸盐粉针剂，其特征在于该粉针剂中丹参乙酸镁的含量为50％-95％，多酚酸盐有效部位含量近100％。

2、根据权利要求书1所述一种高含量丹参多酚酸盐粉针剂，其特征在于制剂规格为50mg/瓶、100mg/瓶、200mg/瓶、300mg/瓶、400mg/瓶。

3、一种高含量丹参多酚酸盐粉针剂的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

(1)丹参煎煮提取：

丹参药材粉碎后，依次以丹参生药重量的4倍量、2倍量和2倍量的水先后煎煮三次，每次2小时，合并三次提取液，冷至室温，离心过滤，滤液备用；

(2)树脂分离：

将滤液缓缓流过装有丹参生药重量的3倍量的1300-I大孔树脂吸附柱，吸附完毕后，先用丹参生药重量的6倍量水洗去糖、蛋白质及无机盐；再以丹参生药重量的6倍量20％乙醇除去非丹参乙酸盐的丹参多酚酸盐类化合物，用薄层检测控制收集富含丹参乙酸盐的50％乙醇洗脱液；

(3)二次醇沉：

将富含丹参乙酸盐的50％乙醇洗脱液，减压浓缩至1/10的丹参生药量后，搅拌下徐徐加入9/10丹参生药量的无水乙醇，静置两小时后，离心弃去沉淀；滤液浓缩至1/20的丹参生药量后，加入相当于19/20丹参生药量的无水乙醇，静置两小时，作为第二次醇沉，离心弃去沉淀，滤液减压浓缩至干，制得丹参多酚酸盐；

(4)丹参多酚酸盐粉针剂制备：

丹参多酚酸盐粉末溶于40倍量水，通过0.2-0.4μm的超滤膜，滤液灌装于瓶内，冷冻干燥后即得产品。

4、根据权利要求3所述的一种高含量丹参多酚酸盐粉针剂的制备方法，其特征在于其中所述步骤(2)的树脂为1300-I大孔树脂、D101型、AB-8型或RA型树脂。