CN111732624A - 新甾体皂苷类化合物及其制备方法和在制备治疗2型糖尿病药物中的应用 - Google Patents
新甾体皂苷类化合物及其制备方法和在制备治疗2型糖尿病药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，涉及从韭菜子中提取新甾体皂苷类化合物，尤其是韭菜子苷A(Alliumin A)、韭菜子苷B(Alliumin B)、韭菜子苷C(Alliumin C)、韭菜子苷D(Alliumin D)、韭菜子苷E(Alliumin E）；其结构通式如下所示，
Description
技术领域
本发明属于药学技术领域，具体涉及五种新的甾体皂苷类化合物及其制备方法和在制备2型糖尿病药物中的应用。
背景技术
2型糖尿病是一种复杂的慢性代谢紊乱性疾病，病因主要是胰岛素抵抗和胰岛素缺乏引起的胰腺β-cell功能障碍；其特点是糖、脂类和蛋白质代谢紊乱，临床症状为血糖升高、多饮、多尿、多食和消瘦，疲乏无力。2型糖尿病可引起多种脏器损伤，从而产生多种并发症，已成为全球主要的健康问题。2型糖尿病的发病率日益升高成为21世纪全球公共卫生关注的问题，环境因素和遗传因素等导致了糖尿病的流行加速。目前，饮食和运动与药物治疗相结合是治疗糖尿病的常用策略，临床上药物治疗主要是口服降糖药和胰岛素注射。然而，目前大多数降糖药对人体产生毒副作用，长期注射胰岛素也可增强胰岛素抵抗，因此寻找新的治疗或预防2型糖尿病的药物或保健品迫在眉睫。
韭菜子(Semen Allii Tuberose)是百合科葱属多年生植物韭菜(Alliiumtuberosum Rottl.exSpreng.)的干燥成熟种子，为药食同源的中药，具有补肝益肾、健脾提神、行气理血、润肠通便等功效，用于肝肾亏虚，腰膝酸痛，阳痿遗精等，收载于《中国药典》。研究表明韭菜子化学成分主要有生物碱类、硫化物、黄酮类等化合物。现代药理研究证明韭菜子具有温肾壮阳、加强免疫、抗氧化、抗衰老、抑菌等作用。韭菜子为药食同源的中药，并为韭菜生产的附属产品，韭菜种植面积广泛、货源充足。但目前从韭菜子中大量提取甾体皂苷的报道较少，尚无从韭菜子提取获得的新甾体皂苷类化合物以及其对2型糖尿病小鼠治疗的相关报道。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一新的甾体皂苷类化合物及其制备方法，本发明经试验发现：该甾体皂苷类化合物可用于制备预防和治疗2型糖尿病的药物、食品或保健品等。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
新甾体皂苷类化合物，其结构通式如下所示，
式中，R为H或OH，R2为H或OH，R3为H或OH，R4为CH3或OH，R5为H、OH或CH3，
R1为
R6为
其中，GLC为葡萄糖，RHA为鼠李糖，XYL为木糖。
进一步优选，上述的新甾体皂苷类化合物，其包括韭菜子苷A(Alliumin A)、韭菜子苷B(Alliumin B)、韭菜子苷C(Alliumin C)、韭菜子苷D(Alliumin D)和韭菜子苷E(Alliumin E)，具体结构式如下所示：
以及韭菜子苷B
本发明提供了上述新甾体皂苷类化合物的制备方法，其具体包括如下步骤：
1)将粉碎后的韭菜子、炒韭菜子或者盐炙韭菜子的干粉，用30-40％乙醇加热回流提取1-2小时，提取2-3次，合并提取液，减压回收乙醇，获得水提液；
2)水提液用大孔吸附树脂吸附，然后依次用水(水洗脱液弃掉)、30％乙醇、60％乙醇梯度洗脱，分别收集30％乙醇洗脱液、60％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，分别得到组分A和组分B；
3)组分A经ODS开放柱纯化，用30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇梯度洗脱，收集50％甲醇洗脱液和70％甲醇洗脱液，合并后减压回收溶剂，得到组分A1；
4)组分A1经ODS开放柱纯化，用35％甲醇、55％甲醇、75％甲醇梯度洗脱，分别收集55％甲醇洗脱液、75％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，分别得到组分A1-1和A1-2；
5)组分A1-1经制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、63％甲醇水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷A和韭菜子苷B；
6)组分A1-2经半制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、21％乙腈水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷E和韭菜子苷C；
7)组分B经ODS开放柱纯化，用40％甲醇、50％甲醇、70％甲醇梯度洗脱，收集50％甲醇洗脱液、70％甲醇洗脱液，合并后减压回收溶剂，以TLC薄层色谱检测合并，得到四个组分，按照所得组分极性由大到小依次标记为组分B1～B4；将组分B2经半制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、23％乙腈水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷D。
进一步的，步骤2)中，所述大孔吸附树脂的型号为HPD100、HPD600、HPD400、D101、AB-8、ADS-17或DM130等。
本发明还提供了上述新甾体皂苷类化合物在制备预防和治疗2型糖尿病药物、功能性食品、保健品等中的应用。
和现有技术相比，本发明的有益效果：
1)本发明化合物结构稳定，属于甾体皂苷类化合物，且其提取原料来自食用韭菜的种子，广泛分布于我国大部分地区，资源十分丰富。本发明化合物提取制备条件温和、技术难度小、生产成本低、环境污染小；同时其原料丰富、属于天然可再生资源；提取分离技术难度小，溶剂可回收使用，不会造成生态环境污染；提取量大、可工业化生产并且韭菜子来源广泛，取材便利；
2)经试验发现：本发明新甾体皂苷类化合物在治疗2型糖尿病方面有着显著的治疗效果，可用于制备预防和治疗2型糖尿病药物、功能性食品、保健品等。
附图说明
图1为韭菜子苷A的HR-ESI-MS谱；
图2为韭菜子苷A的1H NMR谱；
图3为韭菜子苷A的13C NMR谱；
图4为韭菜子苷A的HSQC谱；
图5为韭菜子苷A的HMBC谱；
图6为韭菜子苷A的HSQC-TOCSY谱；
图7为韭菜子苷A的NOESY谱；
图8为韭菜子苷B的HR-ESI-MS谱；
图9为韭菜子苷B的1H NMR谱；
图10为韭菜子苷B的13C NMR谱；
图11为韭菜子苷B的HSQC谱；
图12为韭菜子苷B的HMBC谱；
图13为韭菜子苷B的NOESY谱；
图14为韭菜子苷C的HR-ESI-MS谱；
图15为韭菜子苷C的1H NMR谱；
图16为韭菜子苷C的13C NMR谱；
图17为韭菜子苷C的HSQC谱；
图18为韭菜子苷C的HMBC谱；
图19为韭菜子苷C的NOESY谱；
图20为韭菜子苷D的HR-ESI-MS谱；
图21为韭菜子苷D的1H NMR谱；
图22为韭菜子苷D的13C NMR谱；
图23为韭菜子苷D的HSQC谱；
图24为韭菜子苷D的HMBC谱；
图25为韭菜子苷D的HSQC-TOCSY谱；
图26为韭菜子苷D的NOESY谱；
图27为韭菜子苷E的HR-ESI-MS谱；
图28为韭菜子苷E的1H NMR谱；
图29为韭菜子苷E的13C NMR谱；
图30为韭菜子苷E的HSQC谱；
图31为韭菜子苷E的HMBC谱；
图32为韭菜子苷E的HSQC-TOCSY谱；
图33为韭菜子苷E的NOESY谱。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
本发明新甾体皂苷类化合物的提取原料为韭菜(Alliium tuberosumRottl.exSpreng.)的干燥成熟种子，于2017年9月购于河南省禹州药材市场，由河南大学丛悦教授鉴定，标本储存在河南大学药学院标本馆。
下述实施例中，如无特殊说明，甲醇、乙醇、乙腈均指的是体积百分比浓度。
实施例1
本发明新甾体皂苷类化合物的结构式分别如下所示：
韭菜子苷A
韭菜子苷B
韭菜子苷C
韭菜子苷D
韭菜子苷E
上述新甾体皂苷类化合物的制备方法，其具体包括如下步骤：
1)将5kg粉碎后的韭菜子干粉，用35％乙醇(2×50L)加热回流提取1h，提取2次，合并提取液，提取结束后减压回收乙醇，获得水提液；
2)将水提液用大孔吸附树脂D101吸附，然后依次用水、30％乙醇、60％乙醇梯度洗脱，分别收集30％乙醇洗脱液、60％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，分别得到组分A和组分B；
3)组分A经ODS开放柱纯化，用30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、100％甲醇梯度洗脱，收集50％甲醇洗脱液和70％甲醇洗脱液，合并后减压回收溶剂，得到组分A1；
4)组分A1经ODS开放柱纯化，用35％甲醇、55％甲醇、75％甲醇梯度洗脱，分别收集55％甲醇洗脱液、75％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，分别得到组分A1-1和A1-2；
5)组分A1-1经制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、63％甲醇水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷A(26mg，tR＝30min)和韭菜子苷B(43mg，tR＝43min)；
6)组分A1-2经半制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、21％乙腈水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷E(39mg，tR＝38min)和韭菜子苷C(33mg，tR＝41min)；
7)组分B经ODS开放柱纯化，用40％甲醇、50％甲醇、70％甲醇梯度洗脱，收集50％甲醇洗脱液、70％甲醇洗脱液，合并后减压回收溶剂，以TLC薄层色谱检测合并，得到四个组分，按照所得组分极性由大到小依次标记为组分B1～B4；
8)将组分B2经半制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、23％乙腈水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷D(41mg，tR＝48min)。
下述给出了实施例1制备所得新甾体皂苷类化合物韭菜子苷A、B、C、D、E的相关试验数据(具体可见图1至图33)。
韭菜子苷A：白色粉末，m.p.:240～243℃，[α]20 D–63.80(c＝0.001，H2O)HR-ESI-MS:m/z795.4169[M+Na]+(calcd for 795.4137)，确定出其分子式为C39H64O15。核磁共振数据见表1。
结构解析(详见图1至7)：
1H-NMR(C5D5N)谱中显示出：四个甲基氢信号δ0.81(3H，s，H-18)，1.12(3H，s，H-19)，1.14(3H，d，J＝6.8Hz，H-C21)，δ1.70(3H，d，J＝6.2Hz，H-Rha-6)；两个糖的端基氢信号δ5.03(1H，d，J＝7.8Hz，H-Glc-1)，5.88(1H，s，H-Rha-1)；母核6位羟基取代的氢信号δ4.03(1H，m)；27位羟基取代的氢信号δ3.65(m)，3.73(m)。13C-NMR(C5D5N)谱中显示有39个碳信号，低场区给出了两个糖的端基碳信号δ101.6(C-Glc-1)，102.5(C-Rha-1)；母核中5、6位有羟基取代的碳信号δ72.8(C-5)、δ65.9(C-6)；27位羟基取代的碳信号为δ64.2(C-27)。通过2DNMR(HSQC、HMBC、HSQC-TOCSY)，将碳和氢的信号进行了归属(表1)，在HMBC谱中可以看出，葡萄糖的端基氢信号δ5.03(1H，d，J＝7.8Hz，H-Glc-1)与δ78.8(C-3)位远程相关，所以葡萄糖连在母核的C-3位；鼠李糖的端基氢信号δ6.01(1H，s，H-Rha-1)与δ77.9(C-Glc-4)远程相关，因此鼠李糖连在葡萄糖的C-4位；母核中的δ4.03(H-6)与δ35.6(C-7)、δ34.7(C-4)远程相关，C-19上的氢信号δ1.12(s)与δ35.4(C-1)、72.8(C-5)、65.9(C-6)、42.8(C-10)、44.3(C-9)远程相关，C-18上的氢信号δ0.81(s)与δ62.7(C-17)、41.9(C-20)、109.4(C-22)远程相关，C-3上的氢δ4.64(brs)与72.8(C-5)远程相关，由此推测出C-5和C-6位被羟基取代，δ3.91(H-26)与109.4(C-22)远程相关，由此可知母核是螺甾烷醇类结构，δ3.65(H-27)与63.9(C-26)、39.0(C-25)、23.9(C-24)远程相关，所以推测C-27位有羟基取代。以上数据归属与已知化合物(25S)-螺甾烷-3β，5β，6α-三羟基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1-4)-β-D-吡喃葡萄糖苷的核磁数据进行对比，根据质谱数据，该化合物比(25S)-螺甾烷-3β，5β，6α-三羟基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1-4)-β-D-吡喃葡萄糖苷多一个氧。从NOESY谱中可以看到，H-C(3)与H-C(4)δ2.23有NOE效应，Me(18)和H-C(20)存在NOE效应，Me(19)和H-C(4)δ2.12、H-C(6)存在NOE效应，CH2(27)与H-C(26)呈NOE效应，因而可以推测出H-C(4)δ2.12、H-C(6)、H-C(20)处在同一平面上，且和Me(18)与Me(19)一样处于β键，H-C(3)、H-C(4)处于α键，母核3位碳相连的葡萄糖是β位取代。Me(19)碳信号δ17.3，进一步证明5位羟基为β位取代。葡萄糖端基氢信号耦合常数为J＝7.8Hz，推测葡萄糖为β构型；鼠李糖5位碳信号δ70.2，推测鼠李糖为α构型。经scifinder数据库查询，推测化合物1为新化合物，结构为：(25S)-螺甾烷-3β，5β，6α，27-四羟基-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为韭菜子苷A。
表1韭菜子苷A的100MHz碳谱和400MHz氢谱数据
韭菜子苷B：白色粉末，[α]20 D–6.80(c＝0.001，H2O)。HR-ESI-MS:m/z 663.3370[M+Na]+(calcd for 663.3351)，确定出其分子式为C33H52O12。
结构解析(详见图8至13)：
1H-NMR(C5D5N)谱中给出，两个糖的端基氢信号δ5.08(1H，d,J＝7.8Hz，H-Glc-1)，6.37(1H，s，H-Rha-1)；一个烯烃氢信号δ6.56(1H，s，H-C-16)；一个乙酰基上的甲基氢信号δ2.21(3H，s，H-21)；三个甲基氢信号δ0.87(3H，s，H-18)，0.87(3H，s，H-19)，1.70(3H，d，J＝6.2Hz，H-Rha-6)；母核中2位羟基取代的氢信号δ4.11(m，H-C-2)；3位羟基取代的氢信号δ3.87(m，H-C-3)。13C-NMR(C5D5N))谱中给出，低场区给出一个羰基碳信号δ196.1(C-20)；两个烯烃碳信号δ144.5(C-16)，155.1(C-17)；两个糖的端基碳信号δ100.9(C-Glc-1)，102.0(C-Rha-1)；母核中2和3位羟基取代的碳信号δ70.4(C-2)，85.0(C-3)。通过2DNMR(HMQC、HMBC)，将碳和氢的信号进行了归属(表2)，在HMBC谱中给出，母核中δ0.87(3H，s，H-18)分别与δ34.9(C-12)、46.3(C-13)、56.0(C-14)、155.1(C-17)远程相关，δ6.56(1H，br s，H-16)分别与δ46.3(C-13)、196.1(C-20)、155.1(C-17)远程相关，这说明C-16与C-17有不饱和双键；葡萄糖的端基氢信号δ5.08(1H，d,J＝7.8Hz，H-Glc-1)与δ85.0(C-3)呈远程相关，所以葡萄糖连在母核C-3位上；鼠李糖的端基氢信号δ6.37(1H，s，H-Rha-1)与δ77.6(C-Glc-2)远程相关，δ77.6(C-Glc-2)与δ4.30(1H，m，H-Glc-3)远程相关，所以鼠李糖连在葡萄糖的C-2位上。通过与已知化合物对比碳谱和氢谱数据，推测该化合物与2α,3β-二羟基-5α-20-酮-孕甾-16-烯-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的结构相似，母核基本一致，推测化合物2连糖部分比已知化合物少一个氧。从NOESY谱中可以看出，H-C(3)与H-C(4)δ2.06、H-C(5)均有相关信号峰，H-C(9)与H-C(5)、H-C(14)存在NOE效应，Me(19)与H-C(1)δ1.13、H-C(2)、H-C(8)存在NOE效应，H-C(8)与Me(18)存在NOE效应，由此可以判断出H-C(1)δ1.13、H-C(2)、H-C(8)处在同一个平面上，即β键；H-C(3)、H-C(4)δ2.06、H-C(5)、H-C(9)、H-C(14)处于同一平面，处于同一个平面上，且都处于α键。根据文献报道，5位H处于α位，C-5、C-9、C-19的化学位移分别处于43–46、54–56、11–14ppm范围内，5位H处于β位，C-5、C-9、C-19的化学位移分别处于35–36、40、24ppm范围内，该化合物C-5、C-9、C-19的化学位移分别为44.6、54.7、13.2，证明5位H处于α位，与NOESY谱结果一致。经scifinder数据库查询，推测化合物2为新化合物，命名为：2α，3β-二羟基-5α-20-酮-孕甾-16-烯-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为韭菜子苷B。核磁数据见表2。
表2韭菜子苷B的100MHz碳谱和400MHz氢谱数据
韭菜子苷C：白色粉末，[α]20 D–82.30(c＝0.001，H2O)。HR-ESI-MS m/z 1073.5059[M+Na]+(calcd for 1073.5145)，确定出其分子式为C50H82O23。核磁共振数据见表3。
结构解析(详见图14至19)：
1H-NMR(C5D5N)谱中可以看出，四个糖的端基氢信号δ5.01(1H，d，J＝7.8Hz，H-Glc-1)，δ4.84(1H，d，J＝7.8Hz，H-Glc’-1)，δ6.24(1H，s，H-Rha-1)，δ5.01(1H，d，J＝7.6Hz，H-Xyl-1)；一个烯烃氢信号δ4.51(1H，m，H-23)；五个甲基氢信号δ0.85(3H，s，H-18)，δ0.89(3H，s，H-19)，δ1.05(3H，d，J＝6.2Hz，H-27)，δ1.68(3H，s，H-21)，δ1.69(3H，d，J＝5.2Hz，H-Rha-6)；母核2位有羟基取代时的氢信号δ4.11(m，H-2)。13C-NMR(C5D5N)谱中显示，低场区给出两个烯烃碳信号δ163.4(C-22)和91.0(C-23)；四个糖的端基碳信号δ100.2(C-Glc-1)，δ104.9(C-Glc’-1)，101.9(C-Rha-1)，δ105.5(C-Xyl-1)。通过2DNMR(HMQC、HMBC)，将碳和氢的信号进行了归属(表3)，在HMBC谱中给出：δ4.83(1H，d，J＝7.8Hz，H-Glc’-1)与δ75.1(C-26)远程相关，说明26位连有一个葡萄糖；δ5.01(1H，d，J＝7.8Hz，H-Glc-1)与δ84.7(C-3)远程相关，说明3位连有一个葡萄糖；木糖端基氢信号δ5.01(1H，d，J＝7.6Hz，H-Xyl-1)与母核3位相连的葡萄糖δ81.1(C-Glc-2)呈远程相关，这说明木糖连在葡萄糖的2位；鼠李糖的端基氢信号δ6.24(1H，s，H-Rha-1)母核3位相连的葡萄糖δ77.5(C-Glc-4)呈远程相关，所以鼠李糖连在葡萄糖的4位上；母核中的δ0.89(H-19)与δ45.7(C-1)、44.4(C-5)、54.0(C-9)、36.6(C-10)远程相关，δ0.85(H-18)与δ39.2(C-12)、δ40.4(C-13)、δ56.4(C-14)、δ67.7(C-17)远程相关，δ1.68(H-21)与δ67.7(C-17)、76.5(C-20)、163.4(C-22)呈远程相关，δ1.05(H-27)与29.4(C-24)、34.6(C-25)、75.1(C-26)呈远程相关，对比碳谱数据和氢谱数据，推测母核结构与已知化合物26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20R)-5α-呋甾-22(23)-en-2α，3β，20，26-四羟基-3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-1→2-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷相似，比这个已知化合物少一个亚甲基(-CH2)。从NOESY谱中可以看出，H-C(5)与H-C(3)、H-C(9)存在相关信号峰，H-C(9)与H-C(14)有NOE相关，Me(19)与H-C(2)存在NOE效应，Me(21)与H-C(23)存在NOE相关，由此可以判断出H-C(2)、Me(18)、Me(19)处在同一平面上，且均为β键，H-C(3)、H-C(5)、H-C(9)和H-C(14)处于同一平面，且都是α键。经scifinder数据库查询，推测该化合物为新化合物，结构为：26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20S)-5α-呋甾-22(23)-en-2α，3β，20β，26-四羟基-3-O-[O-β-D-吡喃木糖基-1→2)]-[α-L-鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为韭菜子苷C。
表3韭菜子苷C的100MHz碳谱和400MHz氢谱数据
韭菜子苷D：白色结晶，[α]20 D–51.20(c＝0.001，H2O)，HR-ESI-MS:m/z 941.4677[M+H]+(calcd for 941.4722)，确定出其分子式为C45H74O19。
结构解析(详见图20至26)：
1H-NMR(C5D5N)谱中可以看出，三个糖的端基氢信号为δ5.01(1H,d,J＝8.0Hz,H-Glc-1)，δ4.88(1H,d,J＝8.0Hz,H-Glc’-1)，δ6.22(1H,s,H-Rha-1)；一个烯烃氢信号δ4.66(1H，m，H-C-23)；五个甲基质籽信号峰δ0.88(3H，s，H-18)，δ0.92(3H，s，H-19)，δ1.15(3H，d，J＝6.3Hz，H-27)，δ1.81(3H，s，H-21)，δ1.76(3H，d，J＝6.2Hz，H-Rha-6))；母核2位有羟基取代氢信号δ4.15(m，H-2)。13C-NMR(C5D5N))谱中显示，低场区给出一个烯烃碳信号δ162.9(C-22)；三个糖的端基碳信号为δ100.2(C-Glc-1)，δ104.5(C-Glc’-1)，102.2(C-Rha-1)；母核2、3、16、20位有氧取代的碳信号δ70.4(C-2)、83.8(C-3)、84.1(C-16)、76.9(C-20)。通过2DNMR(HMQC、HMBC、HSQC-TOCSY)，将碳和氢的信号进行了归属(表4)，在HMBC谱中可以看出：母核3位碳上的氢信号δ4.04(m)与葡萄糖δ100.2(C-Glc-1)呈远程相关，说明葡萄糖连在了母核的3位上；鼠李糖的端基氢信号δ6.22(1H,s,H-Rha-1)与葡萄糖δ78.6(C-Glc-2)呈远程相关，这说明鼠李糖连在葡萄糖的2位上；母核26位上的氢信号δ4.22(1H,m,H-26)，3.61(1H,m,H-26)与26位葡萄糖δ104.5(C-Glc’-1)远程相关，说明此葡萄糖连在母核的26位上；此外，母核中的δ0.92(CH3-19)与δ45.3(C-1)、44.2(C-5)、53.7(C-9)、36.6(C-10)远程相关；δ0.88(CH3-18)与δ39.1(C-12)、40.5(C-13)、56.3(C-14)、67.2(C-17)远程相关；δ1.81(CH3-18)与δ67.2(C-17)、76.9(C-20)、162.9(C-22)呈远程相关，C-27上的甲基信号δ1.15(CH3-27)与δ29.3(C-24)、34.5(C-25)、75.3(C-26)呈远程相关，推测该化合物母核结构为呋甾类。以上数据归属通过与已知化合物的核磁数据进行对比，发现该化合物比26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20R)-5α-呋甾-22(23)-en-2α，3β，20，26-四羟基-3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-1→2-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷的分子量少146.06，推测少一个鼠李糖。从NOESY谱中可以看出，Me(19)与H-C(2)有相关信号峰，H-C(5)与H-C(3)和H-C(9)存在NOE效应，H-C(14)与H-C(9)、H-C(16)存在NOE效应，Me(18)与Me(21)存在NOE效应，由此可以推断出H-C(2)和Me(21)处于β键，H-C(3)、H-C(5)、H-C(9)、H-C(14)、H-C(16)且都处于α键。经scifinder数据库查询，推测该化合物为新化合物，结构为：26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20R)-5α-呋甾-22(23)-en-2α，3β，20α，26-四羟基-3-O-[α-L-鼠李糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为韭菜子苷D。核磁数据见表4。
表4韭菜子苷D的100MHz碳谱和400MHz氢谱数据
韭菜子苷E：白色粉末，[a]20 D–80.20(c＝0.001，H2O)。根据化合物的高分辨质谱数据HR-ESI-MSm/z 1087.5277[M+Na]+(calcd for 1087.5301)及13C-NMR数据(表5)，可以确定出其分子式为C51H84O23。
结构解析(详见图27至33)：
1H-NMR(C5D5N+D2O)谱中可以看出，四个糖的端基氢信号4.91(1H，d，J＝7.0Hz，H-Glc-1)，δ5.49(1H，d，J＝8.0Hz，H-Glc’-1)，δ4.85(1H，d，J＝8.0Hz，H-Glc”-1)，δ5.77(1H，s，H-Rha-1)；一个烯烃氢信号δ4.61(1H，m，H-23)；五个甲基氢信号δ0.90(3H，s，H-18)，δ1.00(3H，s，H-19)，δ1.11(3H，d，J＝6.0Hz，H-27)，δ1.80(3H，s，H-21)，δ1.68(3H，d，J＝6.4Hz，H-Rha-6)。13C-NMR(C5D5N+H2O)谱中显示，低场区给出两个烯烃碳信号δ163.1(C-22)和91.5(C-23)；四个糖的端基碳信号δ101.0(C-Glc-1)，δ104.5(C-Glc’-1)，δ104.6(C-Glc”-1)，102.2(C-Rha-1)。通过2D-NMR(HMQC、HMBC、HSQC-TOCSY)，将碳和氢的信号进行了归属(表5)，在HMBC谱中给出：δ4.85(1H，d，J＝8.0Hz，H-Glc”-1)与δ75.2(C-26)远程相关，说明26位连有一个葡萄糖；δ4.91(1H，d，J＝7.0Hz，H-Glc-1)与δ75.2(C-3)远程相关，说明3位连有一个葡萄糖；另一个葡萄糖端基氢信号δ5.49(1H，d，J＝8.0Hz，H-Glc’-1)与母核3位相连的葡萄糖δ81.1(C-Glc-2)呈远程相关，这说明此葡萄糖连在3位葡萄糖的2位；鼠李糖的端基氢信号δ5.77(1H，s，H-Rha-1)与母核3位相连的葡萄糖δ76.7(C-Glc-4)呈远程相关，所以鼠李糖连在3位葡萄糖的4位；母核中的δ1.00s(H-19)与δ30.6(C-1)、36.3(C-5)、39.8(C-9)、34.9(C-10)远程相关，δ0.90s(H-18)与δ39.4(C-12)、δ40.6(C-13)、δ56.5(C-14)、δ67.4(C-17)远程相关，δ1.80s(H-21)与δ67.4(C-17)、76.2(C-20)、163.1(C-22)呈远程相关，δ1.11(H-27)与29.4(C-24)、34.6(C-25)、75.2(C-26)呈远程相关，推测母核结构与已知化合物26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20S)-5α-呋甾-22(23)-en-3β，20，26-三羟基-3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-1→2]-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷相似。对比碳谱数据和氢谱数据，推测出该化合物比26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20S)-5α-呋甾-22(23)-en-3β，20，26-三羟基-3-O-[α-L-吡喃鼠李糖基-1→2]-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷多一个氧(O)。根据文献报道，C-5、C-9、C-19的化学位移分别处于35–36、40、24ppm范围内，5位H处于β位，该化合物C-5、C-9、C-19的化学位移分别为36.3、39.8、23.7，证明5位H处于β位。由于C-25(34.6)，C-26(75.2)和C-27(17.2)与文献数据对照，进一步确定25位为S构型。从NOESY谱中可以看出，H-C(5)与δ1.92m H-C(4)存在相关信号峰，H-C(3)与δ1.85m H-C(1)、δ1.85m H-C(4)有NOE相关，H-C(14)与H-C(9)、H-C(16)、H-C(17)有NOE相关，Me(19)与δ1.50m H-C(1)、H-C(5)存在NOE效应，由此可以判断出δ1.50m H-C(1)、δ1.92m H-C(4)、H-C(5)与Me(19)处在同一平面上，且均为β键，δ1.85mH-C(1)、δ1.85mH-C(4)、H-C(3)、H-C(9)、H-C(14)、H-C(16)和H-C(17)处于同一平面，且都是α键。经scifinder数据库查询，推测该化合物为新化合物，结构为：26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S，20S)-5β-呋甾-22(23)-双键-3β，20β，26-三羟基-3-O-[α-L-鼠李糖基-(1→4)]-[α-L-吡喃葡萄糖基-(1→2)]-β-D-吡喃葡萄糖苷，命名为韭菜子苷E。
表5韭菜子苷E的100MHz碳谱和400MHz氢谱数据
应用试验：下面对本发明新甾体皂苷类化合物进行降血糖作用试验。
实验原料：实施例1制备所得甾体皂苷化合物作为实验原料。
实验动物：昆明种小鼠，体重23±2g，SPF级，由河南省实验动物中心提供，生产批号：SCXK(豫)2018-0001。
实验试剂：链脲佐菌素(STZ)：Sigma-Aldrich公司。高脂饲料：北京博爱港生物技术有限公司；达乐自动码血糖仪；糖化血清蛋白(GSP)、甘油三酯(TG)由南京建成生物工程研究所提供。
小鼠2型糖尿病模型建立：78只SPF级的昆明雄性小鼠适应性饲养一周(温度25±2℃，光照12h/d，湿度40-45％)，喂养标准饲料，自由饮水。一周后，除正常空白对照组(n＝6)喂养标准饲料外，其他小鼠均喂养高脂饲料。喂养4周后，高脂小鼠腹腔注射剂量为100mg/kg的STZ溶液，两周后筛选空腹血糖值＞16.0mmol/L的糖尿病小鼠。
给药方法：将糖尿病小鼠随机分为12组，每组6只(n＝6)：模型对照组、阳性对照组、韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E的高剂量组、低剂量组。空白对照组和模型对照组按0.15mL/10g灌胃生理盐水，阳性对照组灌胃二甲双胍(350mg/kg，0.15mL/10g)，韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E的高、低剂量组分别以18mg/kg和6mg/kg(0.15mL/10g)灌胃给药。灌胃给药3周，禁食不禁水12-14h，摘眼球取血，于4℃、4000rpm/min离心10min取血清，检测小鼠糖化血清蛋白GSP、甘油三酯TG。
采用Graphpad Prism 6统计学软件进行处理分析，结果以
表示，组间比较采用One-way ANOVA单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。结果见表6和7。
表6、甾体皂苷类化合物对2型糖尿病小鼠空腹血糖的影响
与空白对照组比较：#P<0.01
与模型对照组比较：*P＜0.05；**P＜0.01
表6的结果表明：链脲佐菌素造模后，通过对小鼠空腹血糖水平的测定，与空白对照组相比，模型对照组和各给药组小鼠的初始血糖水平明显高于空白对照组，说明造模成功(P＜0.01)。与模型对照组相比，在给药第12天后，韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E的高、低剂量组血糖水平开始缓慢下降，其中高剂量组血糖水平下降显著(P＜0.05)；在给药第21天后，韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E的高、低剂量组血糖水平都下降显著(P＜0.05；P＜0.01)。以上结果说明韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E的高、低剂量组均具有降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖水平作用。
表7、甾体皂苷类化合物对2型糖尿病小鼠GSP和TG的影响
与空白对照组比较：#P<0.01
与模型对照组比较：*P＜0.05；**P＜0.01
由表7可知：与空白对照组相比，模型对照组小鼠血清中TG和GSP水平显著升高(P＜0.01)。给药治疗后，与模型对照组相比，韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E的高、低剂量组TG和GSP水平都不同程度显著下降(P＜0.05；P＜0.01)。
综上说明：本发明所述新甾体皂苷类化合物，尤其是韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D、韭菜子苷E对2型糖尿病具有一定的治疗作用，可用于制备预防和治疗2型糖尿病的药物、食品、保健品等。
Claims (5)
1.新甾体皂苷类化合物，其特征在于，结构通式如下所示，
式中，R为H或OH，R2为H或OH，R3为H或OH，R4为CH3或OH，R5为H、OH或CH3，
R1为
、
、
或
；
R6为
或
；
其中，GLC为葡萄糖，RHA为鼠李糖，XYL为木糖。
2.如权利要求1所述的新甾体皂苷类化合物，其特征在于，包括韭菜子苷A、韭菜子苷B、韭菜子苷C、韭菜子苷D和韭菜子苷E，具体结构式如下所示：
以及韭菜子苷B 
。
3.权利要求2所述新甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）将粉碎后的韭菜子、炒韭菜子或者盐炙韭菜子的干粉，用30-40%乙醇加热回流提取1-2小时，提取2-3次，合并提取液，减压回收乙醇，获得水提液；
2）水提液用大孔吸附树脂吸附，然后依次用水、30%乙醇、60%乙醇梯度洗脱，分别收集30%乙醇洗脱液、60%乙醇洗脱液，减压回收溶剂，分别得到组分A和组分B；
3）组分A经ODS开放柱纯化，用30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇梯度洗脱，收集50%甲醇洗脱液和70%甲醇洗脱液，合并后减压回收溶剂，得到组分A1；
4）组分A1经ODS开放柱纯化，用35%甲醇、55%甲醇、75%甲醇梯度洗脱，分别收集55%甲醇洗脱液、75%甲醇洗脱液，减压回收溶剂，分别得到组分A1-1和A1-2；
5）组分A1-1经制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、63%甲醇水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷A和韭菜子苷B；
6）组分A1-2经半制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、21%乙腈水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷E和韭菜子苷C；
7）组分B经ODS开放柱纯化，用40%甲醇、50%甲醇、70%甲醇梯度洗脱，收集50%甲醇洗脱液、70%甲醇洗脱液，合并后减压回收溶剂，以TLC薄层色谱检测合并，得到四个组分，按照所得组分极性由大到小依次标记为组分B1-B4；将组分B2经半制备型高效液相，以流速6ml/min、波长203nm、23%乙腈水混合液进行等度洗脱，得到韭菜子苷D。
4.如权利要求3所述新甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述大孔吸附树脂的型号为HPD100、HPD600、HPD400、D101、AB-8、ADS-17或DM130。
5.权利要求1或2所述新甾体皂苷类化合物在制备预防和治疗2型糖尿病药物中的应用。
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