CN113372407B - 甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113372407B
CN113372407B CN202110450031.7A CN202110450031A CN113372407B CN 113372407 B CN113372407 B CN 113372407B CN 202110450031 A CN202110450031 A CN 202110450031A CN 113372407 B CN113372407 B CN 113372407B
Authority
CN
China
Prior art keywords
water
volume ratio
mixed solvent
methanol
steroid saponin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110450031.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113372407A (zh
Inventor
李宁
周地
陈刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenyang Pharmaceutical University
Original Assignee
Shenyang Pharmaceutical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenyang Pharmaceutical University filed Critical Shenyang Pharmaceutical University
Priority to CN202110450031.7A priority Critical patent/CN113372407B/zh
Publication of CN113372407A publication Critical patent/CN113372407A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113372407B publication Critical patent/CN113372407B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
    • C07J71/0005—Oxygen-containing hetero ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/256—Polyterpene radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J9/00—Normal steroids containing carbon, hydrogen, halogen or oxygen substituted in position 17 beta by a chain of more than two carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, coprostane

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了甾体皂苷类化合物及其制备方法和医药用途，属于医药技术领域。首先使用乙醇水溶液提取天冬获得粗提物，然后依次通过大孔树脂吸附、ODS色谱柱、HPLC YMCODS‑A色谱多级分离，获得甾体皂苷类化合物，本发明的甾体皂苷类化合物的制备方法简单，易操作，设备价格低廉，使用的溶剂环境友好，便于工业放大生产，本发明所制备的甾体皂苷类化合物对肺癌细胞NCI‑H460有显著的细胞毒性，有望作为肺癌治疗的潜在药物。

Description

甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用，具体涉及天冬干燥根茎中的甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
传统中药天冬为百合科(Liliaceae)天门冬属(Asparagus)植物天冬(Asparaguscochinchinensis(Lour.)Merr.)的干燥块根，其味甘、苦，性寒，归肺、肾两经，主要功效为养阴清热，润肺滋肾，传统用于治疗阴虚发热、肺痈、消渴等病症。天冬主要分布于温带至热带地区，约有300种，我国有24种和一些外来栽培品种，主要生长于阴湿的山野林边、草丛或灌木丛中，也有栽培种植，主产于华东、中南、西南等地，其中以贵州所产品质最佳，最早记载于《神农本草经》，之后历代本草皆有记载。虽然国内外研究学者已对天冬的化学成分和药理作用进行了部分研究，现仍急需进一步研究开发中药天冬中的功能活性成分以便更好地开发其药用价值。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一系列甾体皂苷类化合物及其制备方法和医药用途。
本发明所提供的甾体皂苷类化合物，其结构通式如下：
Figure BDA0003038374690000011
R1为α-L-Rha-(1→4)-β-D-Glc；R2为α-L-Rha-(1→4)-β-D-Glc或α-L-Rha-(1→2)-[α-L-Rha-(1→4)]-β-D-Glc；R3、R4、R5为-H或-OH；R6为-CH3；R7为α-L-Rha-(1→4)-β-D-Glc或β-D-Glc-(1→2)-[α-L-Rha-(1→4)]-β-D-Glc。
进一步地，所述甾体皂苷类化合物的结构如下：
Figure BDA0003038374690000021
本发明进一步提供了所述甾体皂苷类化合物1～8的制备方法，主要包括如下步骤：
(1)用乙醇水溶液提取天冬，回收提取溶剂，得粗提物；
(2)将步骤(1)所得粗提物加水溶解，上样至大孔吸附树脂色谱柱，梯度洗脱，洗脱液为乙醇-水体积比由0:100逐渐增加至100:0的混合溶剂，收集乙醇-水体积比为70:30～95:5 的洗脱物；
(3)将步骤(2)所得的洗脱物上样到硅胶柱色谱柱，梯度洗脱，洗脱液为石油醚和乙酸乙酯体积比由100:10逐渐降低到1:2的混合溶剂，或者石油醚和丙酮体积比由100:10逐渐降低到1:2的的混合溶剂，或者二氯甲烷和丙酮体积比由100:0逐渐降低到1:1的混合溶剂，或者氯仿和丙酮体积比由100:4逐渐降低到2:1的混合溶剂，或者二氯甲烷和甲醇体积比由 100:0逐渐降低到1:1的混合溶剂，或者氯仿和甲醇体积比由100:0逐渐降低到1:1的的混合溶剂，收集体积比为100:8～1:2的洗脱物；
(4)将步骤(3)所得的洗脱物上样到ODS柱色谱，梯度洗脱，洗脱液为甲醇-水体积比由20:80逐渐增加至100:0的混合溶剂或乙腈-水体积比由20:80逐渐增加至100:0的混合溶剂，收集甲醇-水体积比为2:8～8:2或乙腈-水体积比为2:8～8:2的洗脱物；
(5)将步骤(4)所得的洗脱物，上样到HPLC YMC ODS-A色谱柱，用甲醇-水的体积比为5:5～9:1的混合溶剂或者乙腈-水的体积比为2:8～7:3的混合溶剂为流动相进行洗脱，得到甾体皂苷化合物。
进一步地，步骤(1)中所述提取为加热回流提取或加热超声提取1～6次，乙醇水溶液的体积百分比浓度为50％～99％，天冬与乙醇水溶液的重量体积比为1:5～1:20g/mL。
进一步地，乙醇的体积百分比浓度为70～95％，天冬与乙醇的重量体积比为1:10-1:15 g/mL。
进一步地，步骤(2)中所述的大孔吸附树脂色谱柱采用水溶解后全拌样的上样方法，具体步骤为将粗提物溶解于水中，粗提物与水的重量体积比为1:1～1:8，得到粗提物的水溶液，加入3～10倍粗提物重量的大孔吸附树脂搅拌均匀，滤干。
进一步地，粗提物与水的重量体积比为1:2～1:4；加入3～6倍粗提物重量的大孔吸附树脂。
进一步地，所述大孔吸附树脂为D101、D101B、HPD-100中的任意一种。
进一步地，步骤(3)中所述洗脱液为石油醚和乙酸乙酯体积比由100:15逐渐降低到1:2 的混合溶剂，或者石油醚和丙酮体积比由100:15逐渐降低到1:2的的混合溶剂，或者二氯甲烷和丙酮体积比由100:10逐渐降低到2:1的的混合溶剂，或者氯仿和丙酮体积比由100:10逐渐降低到2:1的混合溶剂，或者二氯甲烷和甲醇体积比由100:8逐渐降低到4:1的混合溶剂，或者氯仿和甲醇体积比由100:8逐渐降低到4:1的的混合溶剂，收集体积比为100:15～4:1的洗脱物。
进一步地，步骤(4)中所述洗脱液为甲醇-水体积比由40:60逐渐增加至80:20的混合溶剂或乙腈-水体积比由40:60逐渐增加至80:20的混合溶剂，收集甲醇-水体积比为4:6～8:2 或乙腈-水体积比为4:6～8:2的洗脱物。
进一步地，步骤(5)中使用甲醇-水的体积比为60:40～85:15的混合溶剂或者乙腈-水的体积比为35:75～65:35的混合溶剂为流动相。
本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含所述的甾体皂苷类化合物及其药学上可接受的盐和药学上可接受的辅料、稀释剂和载体。
本发明进一步提供了所述甾体皂苷类化合物及其药学上可接受的盐或所述的药物组合物在制备预防和治疗癌症的药物中的应用，通过体外癌细胞进行细胞毒活性测试，对制备得到的甾体皂苷类1～8的抗癌活性进行了评价。
进一步地，所述的癌细胞为肺癌细胞NCI-H460。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
1.本发明的甾体皂苷化合物1～8的制备方法简单，易操作，设备价格低廉，使用的溶剂环境友好，便于工业放大生产。
2.本发明的甾体皂苷1-8对肺癌细胞NCI-H460细胞系均显示细胞毒性，甾体皂苷化合物8对肺癌细胞NCI-H460细胞系有显著的细胞毒性，有望作为肺癌治疗的潜在药物。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的实施方式不限于此，显而易见地，下面描述中的实施例仅是本发明的部分实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，获得其他的类似的实施例均落入本发明的保护范围。
实施例1
一类甾体皂苷类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：
(1)天冬干燥根茎500g用70％乙醇提取3次(每次用量为10L，每次提取2h)，合并后减压蒸馏回收提取液，得到粗提物；
(2)上述步骤(1)所得粗提物加水溶解(粗提物和水重量体积比＝1:1)，经D101大孔树脂吸附(粗提物:大孔树脂质量比＝1:3)，依次用水、20％乙醇水、50％乙醇水、70％乙醇水和90％乙醇水梯度洗脱，得到不同极性的洗脱物；
(3)上述步骤(2)中所得的90％乙醇水洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以石油醚和乙酸乙酯体积比100:10，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2的混合溶剂梯度洗脱；
(4)上述步骤(3)所得的石油醚：乙酸乙酯体积比6:1～1:2的洗脱物经ODS色谱柱，依次用体积比为40:60，60:40，80:20，100:0甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(40:60～80:20)的洗脱物经HPLC YMCODS-A 色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝65:35(v/v)，得到甾体皂苷1(tR＝52min) (收率为0.00054％)，得到甾体皂苷2(tR＝71min)(收率为0.00030％)，得到甾体皂苷6(tR＝67min)(收率为0.00039％)。
(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝78:22(v/v)，得到甾体皂苷3(tR＝105min)(收率为0.00060％)，得到甾体皂苷4(tR＝39min)(收率为0.00046％)。
(7)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝64:36(v/v)，得到甾体皂苷5(tR＝24min)(收率为0.00049％)。
(8)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝81:19(v/v)，得到甾体皂苷7(tR＝71min)(收率为0.00026％)，得到甾体皂苷8(tR＝66min)(收率为0.00031％)。
根据甾体皂苷1～8的理化性质和波谱数据鉴定了其结构。
甾体皂苷1的结构鉴定数据如下：
白色无定形粉末(CH3OH)。HRESI-MS给出准分子离子峰为HRESI-MS m/z 767.4227[M-H]-(calcd.for C40H63O14,767.4218)，可知其分子式为C40H64O14。1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)中，高场区可见7个甲基氢信号：δH 0.85(3H,s,CH 3-28),0.96(3H,s,CH 3-18),0.89 (3H,s,CH 3-19),1.10(3H,d,J＝6.8Hz,CH 3-21),1.24(3H,s,CH 3-26/27),1.44(3H,s,CH 3-26/27),1.75(3H,d,J＝6.8Hz,CH 3-6”)。低场区提供2个糖端基氢信号：δH 4.99(1H,m,H-1')，5.92(1H,br.s,H-1”)和1个双键氢信号δH 5.37(1H,d,J＝5.5Hz,H-11)。13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)谱中共给出40个碳信号，包含27个变形螺甾烷醇型甾体母核碳信号和2组糖上碳信号，其中包括2个糖端基碳信号δC 102.5(C-1'),103.2(C-1”)和1个甲基碳信号δC 19.0 (CH3-6”)；根据化合物1的1D NMR数据，并结合文献和化合物1糖端基氢信号的偶合常数，可推测化合物结构为F环为五元环的变形螺甾烷醇型甾体皂苷，且含有的糖片段为1个β-葡萄糖基和1个α-鼠李糖基，并根据HSQC和1H-1H COSY谱的相关信息对氢碳数据进行归属 (见表2)。
HMBC谱中，δH 4.99(H-1')与δC 77.9(C-3),δH 6.41(H-1”)与δC 78.8(C-4')的远程相关，提示糖片段连接在甾体母核片段的C-3位，且鼠李糖连接在葡萄糖的C-4'位。δH0.85(3H,s, CH 3-28)与δC 43.5(C-13),49.8(C-14),41.1(C-15),δH 1.24(3H,s,CH 3-26/27)和45.4(C-24),78.3 (C-25)，31.8(C-27/26),δH 1.44(3H,s,CH3-27/26)和45.4(C-24),78.3(C-25)的远程相关，提示 CH3-28连接在C-14位，CH3-26,27连接在C-25位，且结构中存在一个五元氧环，即F环。 NOESY谱中，δH 3.17(H-2β)与δH 3.80(H-6),2.08(CH3-19)相关，δH 1.53(H-2α)与δH 3.99(H-3), 1.27(H-5)相关，δH 0.85(CH3-28)和4.93(H-23)相关，δH2.67(H-20)与δH 0.96(CH 3-18),4.38 (H-23)相关，提示C-16位和C-23位上的两个-OH和C-14上的-CH3均为α取向，3位上的糖取代为β取向，且A/B环为反式骈合。综上，鉴定化合物1的结构为： furospirost-5-ene-3β,6α,23α-triol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyrano-side.经检索，该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为asparagusoside A。
甾体皂苷2的结构鉴定数据如下：
白色无定形粉末(CH3OH)。HRESI-MS给出准分子离子峰为HRESI-MS m/z 741.4439[M-H]-(calcd.for C39H65O13,741.4425)，可知其分子式为C39H66O13，1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)谱中，在高场区可见6个甲基氢信号：δH 1.15(3H,s,CH 3-18),0.95(3H,s,CH 3-19), 1.37(3H,d,J＝6.8Hz,CH 3-21),1.01(3H,d,J＝6.7Hz CH 3-26/27),1.03(3H,d,J＝6.5Hz, CH 3-26/27),1.76(3H,d,J＝6.1Hz,CH 3-6”)。在低场区提供2个糖端基氢信号：δH4.98(1H,m, H-1')，5.95(1H,br.s,H-1”)和1个双键氢信号δH 5.35(1H,d,J＝4.9Hz,H-6)。13C-NMR(150 MHz,pyridine-d5)谱中共给出39个碳信号，包含27个呋甾烷醇型甾体母核碳信号和2组糖上碳信号，其中包括2个糖端基碳信号δC 102.9(C-1'),103.2(C-1”)和1个甲基碳信号δC 19.0 (CH3-6”)；根据化合物2的1D NMR数据，并结合文献和化合物2糖端基氢信号的偶合常数，可推测化合物结构为E环开环的呋甾烷醇型甾体皂苷，且含有的糖片段为1个β-葡萄糖基和 1个α-鼠李糖基，根据HSQC和1H-1H COSY谱的相关信息对氢碳数据进行归属(见表2)。
HMBC谱中，δH 4.98(H-1')与δC 78.7(C-3),δH 5.95(H-1”)与δC 78.7(C-4')的远程相关，提示糖片段连接在甾体母核片段的C-3位，且鼠李糖连接在葡萄糖的C-4'位，δH1.37(3H,d,J＝ 6.8Hz,CH 3-21)与δC 61.7(C-17),35.3(C-20),79.0(C-22),δH 1.01(3H,d,J＝6.7Hz CH 3-26/27) 和45.8(C-24),25.6(C-25)，23.0(C-27/26),δH 1.03(3H,d,J＝6.5Hz,CH 3-27/26)和45.8(C-24), 24.3(C-26/27)的远程相关，提示化合物2为E、F环开环以侧链形式连接在C-17位上的呋甾烷醇型甾体皂苷。NOESY谱中，δH 0.95(H-14)与δH 4.87(H-16),1.46(H-17)相关，提示C-16 位和C-17位上所连接的长侧链均为β取向，但因为侧链的自由旋转，无法确定侧链上C-20, C-21,C-22的构型，现仅可确定化合物2的侧链平面结构。综上，鉴定化合物2的结构为： 16β,22,23-trihydroxycholest-5-ene-3β-yl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside。经检索，该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为asparagusoside B。
甾体皂苷3的结构鉴定数据如下：
白色无定形粉末(CH3OH)。HRESI-MS给出准分子离子峰为HRESI-MS m/z 797.4315[M+CH3COOH-H]-(calcd.for C41H65O15,797.4323)，可知其分子式为C39H62O13。1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)谱中，高场区可见5个甲基氢信号：δH 0.87(3H,s,CH 3-18),0.89(3H,s,CH 3-19),1.14(3H,d,J＝6.9Hz,CH 3-21),0.71(3H,d,J＝5.2Hz,CH 3-27),1.75(3H,d,J＝6.2Hz,CH 3-6”)。低场区提供2个糖端基氢信号：δH 4.97(1H,m,H-1')，5.94(1H,br.s,H-1”)和1个双键氢信号δH 5.82(1H,d,J＝4.0Hz,H-6)。13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)谱中共给出39个碳信号，包含27个异螺甾烷醇型甾体母核碳信号和2组糖上碳信号，其中包括2个糖端基碳信号δC 103.2(C-1'),103.2(C-1”)和1个甲基碳信号δC 19.1(CH3-6”)；根据化合物3的1DNMR数据，并结合文献和化合物3糖端基氢信号的偶合常数，可推测化合物结构中的糖片段为1个β-葡萄糖基和1个α-鼠李糖基，且与已知化合物prosapogrnin B对比发现，主要差异为化合物3在C-7位上有一个羟基取代基的存在。当H-7为β构型时，H-7与H-8之间的二面角约为60°，为α构型时，H-7和H-8二面角约为180°，同时根据δH 5.82(1H,d,J＝4.0 Hz,H-6),3.28(1H,t,J＝7.4,4.0Hz,H-7),3.34(1H,m,H-8)间的偶合情况，可知H-7与H-8间的偶合常数为J＝7.4Hz，因此推测H-7为β构型。并根据HSQC谱的相关信息对氢碳数据进行归属(见表2)。
HMBC谱中，δH 4.97(H-1')与δC 78.6(C-3),δH 5.94(H-1”)与δC 78.7(C-4')的远程相关，提示糖片段连接在甾体母核片段的C-3位，且鼠李糖连接在葡萄糖的C-4'位，δH5.82(1H,d,J＝ 4.0Hz,H-6)与δC 74.0(C-7),37.5(C-1),δH 3.28(1H,t,J＝7.4,4.0Hz,H-7)和43.5(C-9)的远程相关，提示化合物3的C-7位上有一个羟基取代基。NOESY谱中，δH2.80(H-4)与δH 3.28(H-7) 相关，提示C-7位上的羟基为α取向。综上，鉴定化合物3的结构为7-hydroxy prosapogenin B，经检索，该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为asparagusoside C。
甾体皂苷4的结构鉴定数据如下：
白色无定形粉末(CH3OH)。HRESI-MS给出准分子离子峰为HRESI-MS m/z 883.4704[M-H]-(calcd.for C45H71O17,883.4691)，可知其分子式为C45H72O17。1H-NMR(400MHz,pyridine-d5)中，高场区可见6个甲基氢信号：δH 0.82(3H,s,CH 3-18),1.05(3H,s,CH 3-19),1.19 (3H,d,J＝6.9Hz,CH 3-21),1.33(3H,d,J＝6.9Hz,CH 3-27),1.78(3H,d,J＝6.2Hz,CH 3-6”), 1.65(3H,d,J＝6.1Hz,CH 3-6”')。低场区提供3个糖端基氢信号：δH 4.96(1H,m,H-1'),6.43(1H, br.s,H-1”),5.89(1H,br.s,H-1”')和1个双键氢信号δH 5.32(1H,d,J＝3.8Hz,H-6)。13C-NMR (100MHz,pyridine-d5)谱中共给出45个碳信号，包含27个螺甾烷醇型甾体母核碳信号和3组糖上碳信号，其中包括3个糖端基碳信号δC 100.6(C-1'),102.4(C-1”),103.2(C-1”')和2个甲基碳信号δC 19.0(CH3-6”)和18.7(CH3-6”')；根据化合物4的1D NMR数据，并结合文献和化合物4糖端基氢信号的偶合常数，可推测化合物结构中的糖片段为1个β-葡萄糖基和2个α-鼠李糖基，且与已知化合物polygonoside 6对比，主要区别为F环不同。并根据HSQC谱的相关信息对氢碳数据进行归属(见表2)。
HMBC谱中，δH 4.96(H-1')与δC 78.4(C-3),δH 6.43(H-1”)与δC 78.3(C-2'),δH5.89(H-1”') 与δC 78.9(C-4')远程相关，提示糖片段连接在甾体母核片段的C-3，两个鼠李糖基分别连接在葡萄糖基的C-2'和C-4'位。δH 2.16(H-23)与δC 111.8(C-22),δC 66.8(C-24),δH 4.64(H-24)与δC 10.1(C-27)的远程相关，提示F环上的C-24位有羟基取代。NOESY谱中，δH 4.57(H-16)与δH 1.18(H-14),1.19(CH3-21),4.64(H-24)相关，δH 2.01(H-20)与δH 0.82(CH3-18),1.33(CH3-27) 相关，且与已知化合物polygonoside 6,(24S,25S)-spirost-5-ene-3β, 24-diol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)]-β-D-glucopyranoside相比，H3-27的构型对比δH 0.95(3H,d,J＝6.6Hz H3-27)/δC 13.5(C-27)，提示C-24和C-25构型分别为24S,25R。综上，鉴定化合物4的结构为 (24S,25R)-spirost-5-ene-3β,24-diol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→ 4)]-β-D-glucopyranoside。经检索，该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为 asparagusoside D。
甾体皂苷5的结构鉴定数据如下：
白色无定形粉末(CH3OH)。HRESI-MS给出准分子离子峰为HRESI-MS m/z 737.4122[M-H]-(calcd.for C39H61O13,737.4112)，可知其分子式为C39H62O13。1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)谱中，高场区给出5个甲基氢信号：δH 0.84(3H,s,CH 3-18),0.91(3H,s,CH 3-19), 1.18(3H,d,J＝7.0Hz,CH 3-21),1.11(3H,d,J＝6.5Hz,CH 3-27),1.76(3H,d,J＝6.2Hz,CH 3-6”)。低场区提供2个糖端基氢信号：δH 4.98(1H,d,J＝7.9Hz,H-1'),5.94(1H,br.s,H-1”) 和1个双键氢信号δH 5.32(1H,d,J＝5.0Hz,H-6)。13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)谱中共给出39个碳信号，包含27个异螺甾烷醇型甾体母核碳信号和2组糖上碳信号，其中包括2个糖端基碳信号δC 102.8(C-1'),103.1(C-1”)和1个甲基碳信号δC 19.0(CH3-6”)；根据化合物5 的1D NMR数据，并结合文献和化合物5糖端基氢信号的偶合常数，可推测化合物结构中的糖片段为1个β-葡萄糖基和2个α-鼠李糖基，并与已知化合物polygonoside 6进行对比，二者母核相同，主要区别糖取代基的不同。并根据HSQC谱相关信息对氢碳数据进行归属(见表2)。
HMBC谱中，δH 4.98(H-1')与δC 78.6(C-3),δH 5.95(H-1”)与δC 78.6(C-4')的远程相关，提示糖片段连接在甾体母核片段的C-3位，且鼠李糖连接在葡萄糖的C-4'位，δH3.62(H-26)与δC 71.0(C-25),δH 1.11(3H,d,J＝6.5Hz,CH 3-27)和71.0(C-24),40.4(C-25),65.7(C-26)的远程相关，提示化合物5的C-24位有羟基取代。NOESY谱中，H3-18/H-20,H-20/H-25,H-17/H3-27, H-15α/H-24的相关，并且对比polygonoside 6证明24S,25S构型。综上，鉴定化合物5的结构为：(24S,25S)-spirost-5-ene-3β,24-diol-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside，经检索，该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为asparagusoside E。
甾体皂苷6的结构鉴定数据如下：
白色无定形粉末(CH3OH)。HRESI-MS给出准分子离子峰为HRESI-MS m/z 753.4071[M-H]-(calcd.for C39H61O14,753.4061)，可知其分子式为C39H62O14。1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)谱中，高场区可见5个甲基氢信号：δH 1.06(3H,s,CH 3-18),0.86(3H,s,CH 3-19), 1.22(3H,d,J＝7.0Hz,CH 3-21),1.12(3H,d,J＝6.5Hz,CH 3-27),1.75(3H,d,J＝6.1Hz,CH 3-6”)，低场区提供2个糖端基氢信号：δH 4.97(1H,m,H-1'),5.94(1H,br.s,H-1”)和1个双键氢信号δH 5.30(1H,d,J＝4.4Hz,H-6)。13C-NMR(150MHz,pyridine-d5)谱共给出39个碳信号，包含27个异螺甾烷醇型甾体母核碳信号和2组糖上碳信号，其中包括2个糖端基碳信号：δC 102.8(C-1'),103.2(C-1”)和1个甲基碳信号δC 19.0(C-6”)；根据化合物6的1D NMR数据，并结合文献和化合物6糖端基氢信号的偶合常数，可推测化合物结构中的糖片段为1个β-葡萄糖基和1个α-鼠李糖基，并与已知化合物(23S,24R, 25S)-23,-24-dihydroxyspirost-5-en-3β-yl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside对比发现，二者母核相同，其主要区别在糖取代基不同。根据HSQC谱相关信息对氢碳数据进行归属(见表2)。
在HMBC谱中，lδH 5.94(H-1”)与δC 78.6(C-4')，δH 4.97(H-1')与δC 78.6(C-3)的相关说明了糖链的连接顺序为rha-(1→4)-glc，连接位置在C-3。综上，鉴定化合物6的结构为： (23S,24R,25S)-23,-24-dihydroxyspirost-5-en-3β-yl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyra noside。经检索，该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为asparagusoside F。
甾体皂苷7的结构鉴定数据如下：
白色无定型粉末(CH3OH)。HRESI-MS给出准分子离子峰为HRESI-MS m/z 723.4332[M-H]-(calcd.for C39H63O12,723.4320)，可知其分子式为C39H64O12。1H-NMR(600MHz,pyridine-d5)谱中，高场区可见5个甲基氢信号：δH 0.84(3H,s,CH 3-18),0.84(3H,s,CH 3-19), 1.16(3H,d,J＝6.8Hz,CH 3-21),0.70(3H,d,J＝4.9Hz,CH 3-27),1.73(3H,d,J＝6.1Hz,CH 3-6”)。低场区提供2个糖端基氢信号：δH 4.97(1H,m,H-1'),5.94(1H,br.s,H-1”)。13C-NMR (150MHz,pyridine-d5)谱中共给出39个碳信号，包含27个异螺甾烷醇型甾体母核碳信号和2 组糖上碳信号，其中包括2个糖端基碳信号：δC 103.0(C-1'),103.3(C-1”)和1个甲基碳信号δC 18.9(C-6”)；根据化合物7的1D NMR数据，并结合文献NMR数据和化合物7糖端基氢信号的偶合常数，可推测化合物结构中的糖片段为1个β-葡萄糖基和1个α-鼠李糖基，并根据 HSQC谱的相关信息对氢碳数据进行归属(见表1和表2)。
在HMBC谱中，δH 5.94(H-1”)toδC 78.6(C-4')的相关，说明了糖链的连接顺序为rha-(1→4)-glc。在NOESY谱中，H-4/H-9和H-5/H3-18说明H-3为α取向，H-5为β取向。
综上，鉴定化合物7的结构为：smilagenin(25R)-5β-spirostan-3β -ol-3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranoside，经检索，该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为asparagusoside G。
甾体皂苷8的结构鉴定数据如下：
白色无定形粉末(CH3OH)。HRESI-MS给出准分子离子峰为HRESI-MS m/z 885.4868[M-H]-(calcd.for C45H73O17,885.4848)，可知其分子式为C46H76O17。1H-NMR(400MHz,pyridine-d5)谱中，高场区给出5个甲基氢信号：δH 0.84(3H,s,CH 3-18),0.97(3H,s,CH 3-19), 1.15(3H,d,J＝6.9Hz,CH 3-21),0.71(3H,d,J＝5.3Hz,CH 3-27),1.67(3H,d,J＝6.1Hz,CH 3-6”')。低场区提供3个糖端基氢信号：δH 4.86(1H,d,J＝7.2Hz,H-1'),5.43(1H,d,J＝7.6Hz, H-1”),5.90(1H,br.s,H-1”')。13C-NMR(100MHz,pyridine-d5)谱中个碳信号，包含27个异螺甾烷醇型甾体母核碳信号和3组糖上碳信号，其中包括3个糖端基碳信号：δC102.3(C-1'),106.0 (C-1”),102.8(C-1”')和1个甲基碳信号δC 18.9(C-6”')；根据化合物8的1D NMR数据，并结合文献NMR数据和化合物8糖端基氢信号的偶合常数，可推测化合物结构中的糖片段为2个β- 葡萄糖基和1个α-鼠李糖基，并根据HSQC谱的相关信息对氢碳数据进行归属(见表1和 2)。通过对比1H和13CNMR数据发现化合物8与已知化合物shatavarin IV基本相同，主要区别在于F环中的C-25的构型不同。
在NOESY谱中，H-17/H-14,H-14/H-16,H-16/H-26α,H-26α/H3-27相关说明这些质子在同侧。结合C-23/24/25的化学位移值从25～28到29～30ppm说明C-25为R。综上，鉴定化合物8的结构为：3-O-{[β-D-glucopyranosyl-(1→2)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→ 4)]-β-D-glucopyranosyl}-(25R)-5β-spirostan-3β-ol，经检索，该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为asparagusoside H。
甾体皂苷1～8的NMR数据归属见表1和2。
表1.化合物的1-8的1H NMR数据(pyridine-d5，δin ppm J in Hz)
Figure BDA0003038374690000101
Figure BDA0003038374690000111
a Measured at 600 MHz
b Measured at 400 MHz
表2.化合物的1-8的13C NMR数据(pyridine-d5,δin ppm)
position 1<sup>a</sup> 2<sup>a</sup> 3<sup>a</sup> 4<sup>b</sup> 5<sup>a</sup> 6<sup>a</sup> 7<sup>a</sup> 8<sup>b</sup>
1 36.7 37.9 37.5 37.9 37.8 37.8 31.2 31.1
2 30.1 30.7 30.5 30.5 30.6 30.6 27.3 27.4
3 77.9 78.7 78.6 78.4 78.6 78.6 74.8 75.8
4 30.42 39.8 39.9 39.3 39.7 39.7 30.9 31.3
5 50.5 141.3 146.7 141.1 141.2 141.3 37.3 37.2
6 68.9 122.4 121.8 122.1 122.1 122.2 27.3 27.2
7 38.0 32.6 74.0 32.6 32.6 32.6 27.1 27.1
8 41.2 32.3 56.8 32.0 32.0 31.9 35.9 35.9
9 145.9 50.8 43.5 50.6 50.6 50.6 40.5 40.7
10 39.5 37.4 38.4 37.5 37.4 37.4 35.6 35.6
11 117.5 21.6 21.4 21.4 21.5 21.5 21.5 21.5
12 37.5 41.0 40.0 40.2 40.2 40.6 40.6 40.6
13 43.5 43.8 40.7 40.8 40.8 41.3 41.2 41.3
14 49.8 55.2 49.6 57.0 57.0 57.1 56.8 56.9
15 41.1 37.2 32.6 32.5 32.5 32.5 32.5 32.6
16 82.2 73.1 81.6 81.9 81.8 82.4 81.6 81.7
17 59.1 61.7 63.3 62.7 62.9 62.3 63.4 63.6
18 19.7 13.8 16.5 16.6 16.7 17.0 16.9 17.0
19 20.8 19.9 18.7 19.8 19.8 19.7 24.2 24.4
20 36.7 35.3 42.5 42.9 42.6 37.9 42.3 42.4
21 15.2 16.8 15.5 15.2 15.4 15.0 15.4 15.4
22 118.0 79.0 109.7 111.8 112.2 113.7 109.6 109.6
23 72.5 69.6 32.3 36.4 42.2 74.2 32.2 32.3
24 45.4 45.8 29.8 66.8 71.0 76.5 29.6 29.7
25 78.3 25.6 31.1 36.3 40.4 39.7 30.8 31.0
26 31.8/30.3 24.3/23.0 67.3 64.9 65.7 64.9 67.2 67.3
27 31.8/30.3 24.3/23.0 17.8 10.1 14.0 14.1 17.7 17.7
S 3-O-glc 3-O-glc 3-O-glc 3-O-glc 3-O-glc 3-O-glc 3-O-glc 3-O-glc
1' 102.5 102.9 103.2 100.6 102.8 102.8 103.0 102.3
2' 76.0 76.0 76.0 78.3 76.0 76.0 75.9 83.2
3' 77.2 77.2 77.6 78.1 77.1 77.1 77.1 76.8
4' 78.8 78.7 78.7 78.9 78.6 78.6 78.6 77.8
5' 77.5 77.6 77.2 77.3 77.6 77.6 77.5 77.4
6' 62.0 62.0 61.9 61.6 61.9 61.9 61.9 61.7
S 2'-rha 2'-rha 2'-rha 2'-rha 2'-rha 2'-rha 2'-rha 2'-glc
1” 102.4 106.0
2” 72.9 77.4
3” 73.1 78.3
4” 74.5 72.3
5” 69.9 78.9
6” 19.0 63.3
S 4'-rha 4'-rha 4'-rha 4'-rha 4'-rha 4'-rha 4'-rha 4'-rha
1”' 103.2 103.2 103.2 103.2 103.1 103.2 103.3 102.8
2”' 73.1 73.1 73.1 72.9 73.1 73.1 73.0 72.9
3”' 73.3 73.3 73.3 73.3 73.2 73.2 73.2 73.2
4”' 74.5 74.5 74.5 74.3 74.4 74.4 74.4 74.4
5”' 70.8 70.8 70.8 70.7 70.8 70.8 70.7 70.6
6”' 19.0 19.0 19.1 18.9 19.0 19.0 18.9 18.9
-CH<sub>3</sub> 19.7
a Measured at 150MHz；
b Measured at 100MHz.
实施例2
一类甾体皂苷类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：
(1)天冬干燥根茎1000g用85％乙醇提取3次(每次用量为15L，每次提取4h)，合并后减压蒸馏回收提取液，得到粗提物；
(2)上述步骤(1)所得粗提物加水溶解(粗提物和水重量体积＝1:3)，经D101B大孔树脂吸附(粗提物:大孔树脂＝1:5)，依次用水，20％乙醇-水、50％乙醇-水、70％乙醇-水和90％乙醇-水梯度洗脱，得到不同极性的洗脱物；
(3)步骤(2)中所得的90％乙醇水洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以石油醚和丙酮体积比100:10，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1，1:2混合溶剂洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的石油醚：丙酮8:1～1:2的洗脱物经ODS色谱柱，依次用体积比为40:60，60:40，80:20，100:0甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)的洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离制备，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝65:35(v/v)，得到甾体皂苷1(tR＝52min)(收率为0.00051％)，得到甾体皂苷2(tR＝71min)(收率为0.00037％)，得到甾体皂苷6(tR＝67min)(收率为0.00045％)。
(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝78:22(v/v)，得到甾体皂苷3(tR＝105min)(收率为0.00066％)，得到甾体皂苷4(tR＝39min)(收率为0.00054％)。
(7)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝64:36(v/v)，得到甾体皂苷5(tR＝24min)(收率为0.00045％)。
(8)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝81:19(v/v)，得到甾体皂苷7(tR＝71min)(收率为0.00032％)，得到甾体皂苷8(tR＝66min)(收率为0.00041％)。
甾体皂苷1～8的结构鉴定方法见实施例1。
实施例3
一类甾体皂苷类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：
(1)天冬干燥根茎1200g用95％乙醇提取3次(每次用量为12L，每次提取6h)，合并后减压蒸馏回收提取液，得到粗提物；
(2)上述步骤(1)所得粗提物加水溶解(粗提物和水重量体积比＝1:5)，经HPD-100大孔树脂吸附(粗提物:大孔树脂＝1:6)，依次用水，30％乙醇-水、50％乙醇-水、70％乙醇-水和90％乙醇-水梯度洗脱，得到不同极性的洗脱物；
(3)步骤(2)中所得的90％乙醇水洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以二氯甲烷和丙酮体积比100:4，100:6，100:8，100:10，8:1，6:1，4:1，2:1的混合溶剂洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的二氯甲烷：丙酮100:8～4:1洗脱物经ODS色谱，依次用20:80，40:60，60:40，80:20甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)的洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离制备，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝65:35(v/v)，得到甾体皂苷1(tR＝52min)(收率为0.00055％)，得到甾体皂苷2(tR＝71min)(收率为0.00038％)，得到甾体皂苷6(tR＝67min)(收率为0.00049％)。
(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝78:22(v/v)，得到甾体皂苷3(tR＝105min)(收率为0.00058％)，得到甾体皂苷4(tR＝39min)(收率为0.00060％)。
(7)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝64:36(v/v)，得到甾体皂苷5(tR＝24min)(收率为0.00053％)。
(8)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝81:19(v/v)，得到甾体皂苷7(tR＝71min)(收率为0.00024％)，得到甾体皂苷8(tR＝66min)(收率为0.00055％)。
甾体皂苷1～8的结构鉴定方法见实施例1。
实施例4
一类甾体皂苷类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：
(1)天冬干燥根茎500g用70％乙醇提取4次(每次用量为10L，每次提取2h)，合并后减压蒸馏回收提取液，得到粗提物；
(2)上述步骤(1)所得粗提物加水溶解(粗提物和水重量体积比＝1:1)，经HPD-100大孔树脂吸附(粗提物:大孔树脂＝1:3)，依次用水，20％乙醇-水、50％乙醇-水、70％乙醇-水和90％乙醇-水梯度洗脱，得到不同极性的洗脱物；
(3)步骤(2)中所得的90％乙醇水洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以氯仿和丙酮体积比100:4，100:6，100:8，100:10，8:1，6:1，4:1，2:1的混合溶剂洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的氯仿：丙酮100:10～2:1流分经ODS色谱，依次用50:50，60:40，70:30，80:20，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(50:50～80:20)的洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离制备，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝65:35(v/v)，得到甾体皂苷1(tR＝52min)(收率为0.00050％)，得到甾体皂苷2(tR＝71min)(收率为0.00035％)，得到甾体皂苷6(tR＝67min)(收率为0.00042％)。
(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝78:22(v/v)，得到甾体皂苷3(tR＝105min)(收率为0.00054％)，得到甾体皂苷4(tR＝39min)(收率为0.00049％)。
(7)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝64:36(v/v)，得到甾体皂苷5(tR＝24min)(收率为0.00043％)。
(8)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝81:19(v/v)，得到甾体皂苷7(tR＝71min)(收率为0.00028％)，得到甾体皂苷8(tR＝66min)(收率为0.00047％)。
甾体皂苷1～8的结构鉴定方法见实施例1。
实施例5
一类甾体皂苷类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：
(1)天冬干燥根茎1000g用85％乙醇提取4次(每次用量为15L，每次提取6h)，合并后减压蒸馏回收提取液，得到粗提物；
(2)上述步骤(1)所得粗提物加水溶解(粗提物和水重量体积比＝1:1)，经D101B大孔树脂吸附(粗提物:大孔树脂＝1:5)，依次用水，20％乙醇-水、50％乙醇-水、70％乙醇-水和 90％乙醇-水梯度洗脱，得到不同极性的洗脱物；
(3)步骤(2)中所得的90％乙醇水洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以二氯甲烷和丙酮体积比100:0，100:4，100:6，100:8，100:10，8:1，6:1，4:1，2:1的混合溶剂洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的二氯甲烷：丙酮100:10～2:1洗脱物经ODS色谱，依次用40:60，60:40，80:20，100:0甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)的洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离制备，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝65:35(v/v)，得到甾体皂苷1(tR＝52min)(收率为0.00058％)，得到甾体皂苷2(tR＝71min)(收率为0.00044％)，得到甾体皂苷6(tR＝67min)(收率为0.00051％)。
(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝78:22(v/v)，得到甾体皂苷3(tR＝105min)(收率为0.00062％)，得到甾体皂苷4(tR＝39min)(收率为0.00057％)。
(7)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝64:36(v/v)，得到甾体皂苷5(tR＝24min)(收率为0.00058％)。
(8)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝81:19(v/v)，得到甾体皂苷7(tR＝71min)(收率为0.00039％)，得到甾体皂苷8(tR＝66min)(收率为0.00046％)。
甾体皂苷1～8的结构鉴定方法见实施例1。
实施例6
一类甾体皂苷类化合物的制备方法，主要包括如下步骤：
(1)天冬干燥根茎2000g用70％乙醇提取4次(每次用量为20L，每次提取2h)，合并后减压蒸馏回收提取液，得到粗提物；
(2)上述步骤(1)所得粗提物加水溶解(粗提物和水重量体积比＝1:1)，经D101大孔树脂吸附(粗提物:大孔树脂＝1:3)，依次用水，20％乙醇-水、50％乙醇-水、70％乙醇-水和90％乙醇-水梯度洗脱，得到不同极性的洗脱物；
(3)步骤(2)中所得的90％乙醇水洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以二氯甲烷和甲醇体积比100:0，100:4，100:6，100:8，100:10，8:1，6:1，4:1，2:1的混合溶剂洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的二氯甲烷：甲醇100:6～4:1洗脱物经ODS色谱，依次用20:80,40:60，60:40，,80:20，100:0甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(40:60～80:20)的洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离制备，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝65:35(v/v)，得到甾体皂苷1(tR＝52min)(收率为0.00049％)，得到甾体皂苷2(tR＝71min)(收率为0.00028％)，得到甾体皂苷6(tR＝67min)(收率为0.00035％)。
(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝78:22(v/v)，得到甾体皂苷3(tR＝105min)(收率为0.00051％)，得到甾体皂苷4(tR＝39min)(收率为0.00049％)。
(7)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝64:36(v/v)，得到甾体皂苷5(tR＝24min)(收率为0.00046％)。
(8)上述步骤(4)中所得甲醇-水体积比(60:40～80:20)洗脱物经HPLC YMC ODS-A色谱分离，流速为3mL/min，流动相为甲醇：水＝81:19(v/v)，得到甾体皂苷7(tR＝71min)(收率为0.00030％)，得到甾体皂苷8(tR＝66min)(收率为0.00029％)。
甾体皂苷1～8的结构鉴定方法见实施例1。
实施例7
实施例1-6中制备所得的甾体皂苷1-8的抗肿瘤活性研究
(1)实验原理
MTT法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumro mide，MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50％的N，N-二甲基甲酰胺和20％的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。
(2)实验方法
NCI-H460使用1640完全培养基(含10％胎牛血清)培养，维持温度37℃，CO2含量为5％。使用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化，NCI-H460细胞系1:4传代，1日传代。
取对数生长期细胞消化成单细胞悬液，调节细胞浓度为105/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，每组3个平行孔。NCI-H460细胞接种24小时后，细胞贴壁生长，弃上清，分别加入浓度分别为100μM、50μM、10μM、1μM的甾体皂苷1-8，继续培养24小时。24 小时后，每孔加入50μL MTT储备液，终浓度为2mg/mL。继续培养4小时后，弃去上清，每孔加DMSO 100μL，10min后用自动酶标仪于490nm测定各孔吸光度A。
(3)实验结果
甾体皂苷化合物1～8的细胞毒性实验结果如表3所示。
表3.甾体皂苷化合物1～8的细胞毒性
Figure BDA0003038374690000181
由表3结果可知，实施例1-6中制备得到的甾体皂苷1-8对肺癌细胞NCI-H460细胞系均显示细胞毒性，其中，甾体皂苷8对肺癌细胞NCI-H460细胞系有显著的细胞毒性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (5)

1.一种甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，主要包括如下步骤：
(1)用乙醇水溶液提取天冬，回收提取溶剂，得粗提物；
(2)将步骤(1)所得粗提物加水溶解，上样至大孔吸附树脂色谱柱，梯度洗脱，洗脱液为乙醇-水体积比由0:100逐渐增加至100:0的混合溶剂，收集乙醇-水体积比为70:30～95:5的洗脱物；
(3)将步骤(2)所得的洗脱物上样到硅胶柱色谱柱，梯度洗脱，洗脱液为石油醚和乙酸乙酯体积比由100:15逐渐降低到1:2的混合溶剂，或者石油醚和丙酮体积比由100:15逐渐降低到1:2的混合溶剂，或者二氯甲烷和丙酮体积比由100:10逐渐降低到2:1的混合溶剂，或者氯仿和丙酮体积比由100:10逐渐降低到2:1的混合溶剂，或者二氯甲烷和甲醇体积比由100:8逐渐降低到4:1的混合溶剂，或者氯仿和甲醇体积比由100:8逐渐降低到4:1的混合溶剂，收集体积比为100:15～4:1的洗脱物；
(4)将步骤(3)所得的洗脱物上样到ODS柱色谱，梯度洗脱，洗脱液为甲醇-水体积比由20:80逐渐增加至100:0的混合溶剂或乙腈-水体积比由20:80逐渐增加至100:0的混合溶剂，收集甲醇-水体积比为2:8～8:2或乙腈-水体积比为2:8～8:2的洗脱物；
(5)将步骤(4)所得的洗脱物，上样到HPLC YMC ODS-A色谱柱，用甲醇-水的体积比为5:5～9:1的混合溶剂或者乙腈-水的体积比为2:8～7:3的混合溶剂为流动相进行洗脱，得到甾体皂苷化合物；
所得的甾体皂苷类化合物的结构如下：
Figure FDA0003535295380000021
2.根据权利要求1所述甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述提取为加热回流提取或加热超声提取1～6次，乙醇水溶液的体积百分比浓度为50％～99％，天冬与乙醇水溶液的重量体积比为1:5～1:20g/mL。
3.根据权利要求1所述甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的大孔吸附树脂色谱柱采用水溶解后全拌样的上样方法，具体步骤为将粗提物溶解于水中，粗提物与水的重量体积比为1:1～1:8，得到粗提物的水溶液，加入3～10倍粗提物重量的大孔吸附树脂搅拌均匀，滤干。
4.根据权利要求1所述甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述洗脱液为甲醇-水体积比由40:60逐渐增加至80:20的混合溶剂或乙腈-水体积比由40:60逐渐增加至80:20的混合溶剂，收集甲醇-水体积比为4:6～8:2或乙腈-水体积比为4:6～8:2的洗脱物。
5.根据权利要求1所述甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(5)中使用甲醇-水的体积比为60:40～85:15的混合溶剂或者乙腈-水的体积比为35:75～65:35的混合溶剂为流动相。
CN202110450031.7A 2021-04-25 2021-04-25 甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用 Active CN113372407B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110450031.7A CN113372407B (zh) 2021-04-25 2021-04-25 甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110450031.7A CN113372407B (zh) 2021-04-25 2021-04-25 甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113372407A CN113372407A (zh) 2021-09-10
CN113372407B true CN113372407B (zh) 2022-04-15

Family

ID=77570093

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110450031.7A Active CN113372407B (zh) 2021-04-25 2021-04-25 甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113372407B (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160116480A1 (en) * 2013-05-13 2016-04-28 Institut Gustave Roussy Prognosis and predictive biomarkers and biological applications thereof
CN105985585A (zh) * 2015-02-06 2016-10-05 天津毅兴彩科技有限公司 一种可降解塑料母料及制造方法
CN111303238A (zh) * 2018-12-11 2020-06-19 沈阳药科大学 甾体皂苷类化合物及其制备方法和医药用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160116480A1 (en) * 2013-05-13 2016-04-28 Institut Gustave Roussy Prognosis and predictive biomarkers and biological applications thereof
CN105985585A (zh) * 2015-02-06 2016-10-05 天津毅兴彩科技有限公司 一种可降解塑料母料及制造方法
CN111303238A (zh) * 2018-12-11 2020-06-19 沈阳药科大学 甾体皂苷类化合物及其制备方法和医药用途

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Comparative Tissue-specific Metabolite Analysis and Determination of Protodioscin Content in Asparagus Species used in Traditional Chinese Medicine and Ayurveda by use of Laser Microdissection, UHPLC–QTOF/MS and LC–MS/MS;Yogini Jaiswal et al.;《Phytochem.Anal.》;20140316;第25卷;第514-528页 *
Bioactive Constituents from Asparagus cochinchinensis;Hong-Jie Zhang et al.;《J. Nat. Prod.》;20040121;第67卷;第194-200页 *
Cholestane and spirostane glycosides from the rhizomes of Dioscorea septemloba;Xue-Ting Liu et al.;《Phytochemistry》;20080214;第69卷;第1411-1418页 *
Yogini Jaiswal et al..A Comparative Tissue-specific Metabolite Analysis and Determination of Protodioscin Content in Asparagus Species used in Traditional Chinese Medicine and Ayurveda by use of Laser Microdissection, UHPLC–QTOF/MS and LC–MS/MS.《Phytochem.Anal.》.2014,第25卷第514-528页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113372407A (zh) 2021-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. Two new nortriterpenoid saponins from Salicornia bigelovii Torr. and their cytotoxic activity
CN110627861B (zh) 一种知母甾体皂苷化合物及其制备方法和应用
CN109912680B (zh) 一种齐墩果烷型三萜皂苷及其提取分离方法和应用
CN112300242B (zh) 一种呋甾皂苷类化合物单体的制备方法
Xue et al. Cardenolide glycosides from root of Streptocaulon juventas
CN111732624B (zh) 甾体皂苷类化合物及其制备方法和在制备治疗2型糖尿病药物中的应用
CN113072608B (zh) 三萜皂苷类化合物及其用途
CN110028535B (zh) 连钱草中的二萜苷类化合物及其提取分离方法
CN105601693B (zh) 人参皂苷f1的制备及其抗肿瘤作用
CN112028959A (zh) 无柄灵芝中具有抗糖尿病活性的三萜化合物的制备方法及应用
CN113372407B (zh) 甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用
CN113214214B (zh) 关苍术中一种萜类化合物的制备方法和应用
CN111303238B (zh) 甾体皂苷类化合物及其制备方法和医药用途
CN107474027A (zh) 草菇子实体活性成分2(5h)‑呋喃酮‑4‑丙酸及应用
CN108586559B (zh) 一种羊毛甾烷型三萜类化合物及其制备方法和用途
CN113336649A (zh) 麻疯树烷型二萜类化合物及其制备方法和用途
CN111303231B (zh) 甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用
CN113336822B (zh) 麦冬-甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用
CN115651055B (zh) 一种齐墩果烷型三萜皂苷化合物及其制备方法和应用
CN114133424B (zh) 三萜类化合物及其制备方法和应用
CN115724900B (zh) 达玛烷型三萜皂苷类化合物及其制备方法和在制备降血糖药物中的应用
CN115160396B (zh) 从中华雪胆中提取的具有抗肠炎活性的葫芦烷型四环三萜类化合物及其制备方法与应用
CN115677816B (zh) 一种新的呋甾皂苷单体及其制备方法
CN114920796B (zh) 一种从具柄重楼中提取的甾体皂苷类化合物和制备及用途
CN115583930B (zh) 一种新红曲黄素化合物及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant