CN111303238B - 甾体皂苷类化合物及其制备方法和医药用途 - Google Patents

甾体皂苷类化合物及其制备方法和医药用途 Download PDF

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CN111303238B CN201910268515.2A CN201910268515A CN111303238B CN 111303238 B CN111303238 B CN 111303238B CN 201910268515 A CN201910268515 A CN 201910268515A CN 111303238 B CN111303238 B CN 111303238B
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Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及甾体皂苷类化合物及其制备方法和用途，具体涉及所述的甾体皂苷类化合物结构及其制备方法和在制备预防和治疗癌症的药物领域中的应用，所述化合物的结构如下：
Figure DDA0002017595620000011
R1为氢或β‑D‑Glc；R2为β‑D‑Gal‑(4→1)‑[β‑D‑Xyl‑(1→3)‑β‑D‑Glc‑(2→1)‑β‑D‑Glc]；R3、R4为氢或羟基；R5为氢、羟基或O‑β‑D‑Glc；R6为氢、羟基或乙酰氧基；R7为甲基或羟甲基。

Description

甾体皂苷类化合物及其制备方法和医药用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及玉竹干燥根茎中的甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
玉竹(Polygonatum odoratum)是百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)植物。黄精属植物在全球有60余种，中国有31种，主要分布于除南方热带地区以外的广大地区。
玉竹为圆柱形根茎，具有养阴润燥、生津止咳的功效，长于清热生津。目前研究表明，玉竹配糖体对离体蛙心还有强心作用，玉竹浸膏腹腔注射，可增强烧伤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬作用，提高血清溶血素抗体水平，改善脾淋巴细胞对ConA的增殖反应。近年来，国内外学者对黄精属植物研究不断深入，已经从该属植物中分离得到多种化学成分，主要包括多糖、甾体皂苷、三萜、生物碱、木脂素、黄酮、醌类、植物甾醇及挥发油等，其中多糖和甾体皂苷类成分在黄精属中含量较大，为其主要药效成分。生物活性方面，黄精属植物在抗衰老、调节免疫力、调血脂、改善记忆力、抗肿瘤、抗菌等方面显示出潜在的药用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一系列甾体皂苷类化合物及其制备方法和医药用途。
本发明所提供的甾体皂苷类化合物及其盐，其具有以下结构通式：
Figure BDA0002017595610000011
R1为氢或β-D-Glc；R2为β-D-Gal-(4→1)-[β-D-Xyl-(1→3)-β-D-Glc-(2→1)-β-D-Glc]；R3、R4为氢或羟基；R5为氢、羟基或O-β-D-Glc；R6为氢、羟基或乙酰氧基；R7为甲基或羟甲基；
本发明具体公开了如下8个具体化合物：
Figure BDA0002017595610000021
本发明还提供了所述甾体皂苷类化合物1～8的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)玉竹(Polygonatum odoratum)干燥根茎用乙醇提取，回收提取液得乙醇粗提物；
(2)步骤(1)所得乙醇粗提物经水溶解后，经大孔吸附树脂色谱法分离，以体积比为 0:100～90:10乙醇-水的混合溶剂梯度洗脱，得到不同极性部位的醇洗脱物；
(3)上述步骤(2)中所得的洗脱物经硅胶柱色谱，用石油醚和乙酸乙酯混合溶剂100： 10～1：1，石油醚和丙酮混合溶剂100：10～1：1，二氯甲烷和丙酮混合溶剂100：4～2：1，氯仿和丙酮混合溶剂100：4～2：1，二氯甲烷和甲醇混合溶剂100：2～5：2或氯仿和甲醇的混合溶剂100：2～5：2梯度洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的流分经ODS柱色谱，用甲醇-水混合溶剂5:5～10:0或乙腈-水混合溶剂5:5～10:0梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)所得的洗脱物，经HPLC-UV或者HPLC-RID色谱分离，以甲醇- 水混合溶剂6:4～9:1，或以乙腈和水3:7～5:5为流动相洗脱，得到甾体皂苷1～8；
本发明提供的所述的甾体皂苷1～8的制备方法，步骤(1)中所述的提取方法为加热回流乙醇或加热超声乙醇提取1～3次。所用乙醇体积浓度为50％～95％，优选70％乙醇。玉竹：溶剂的重量体积比为1:8～1:20g/mL，优选1:10～1:15。
本发明提供的所述甾体皂苷类1～8的制备方法，上述步骤(2)中所述的大孔树脂吸附法，采用水溶解拌样的方法，将粗提物溶解于水中(粗提物与水的重量体积比W/V,1:1～1:6，优选为1:2～1:4)得该粗提物的水溶液，加入1:3～1:10(优选1:3～1:5)倍量的大孔树脂搅拌均匀，减压浓缩至干。
所述的大孔吸附树脂为D101、HPD-100、或D101B中的一种。
本发明提供的所述的甾体皂苷类1～8的制备方法，步骤(3)中所述的石油醚和乙酸乙酯，石油醚和丙酮的混合溶剂体积比例为100:10～1:1，优选100:15～1:1；二氯甲烷和丙酮，氯仿和丙酮的混合溶剂的体积比例为100:4～2:1，优选100:10～2:1；二氯甲烷和甲醇，氯仿和甲醇的混合溶剂的体积比例为100:2～5:2，优选100:6～5:1。
本发明提供的所述的甾体皂苷类1～8的制备方法，步骤(4)中所述的甲醇-水的混合溶剂体积比例为5:5～10:0，优选55:45～90:10，乙腈-水的混合溶剂的体积比例为3:7～7:3，优选 35:65～55:45。
本发明提供的所述新的甾体皂苷类1～8的制备方法，步骤(5)中所述甲醇-水的混合溶剂的体积比例为6:4～9:1，优选70:30～80:20，乙腈-水的混合溶剂的体积比例为3:7～5:5，优选 35:75～45:55。
本发明以体外MCF-7细胞进行了细胞毒活性测试，对制备得到的甾体皂苷1～8的抗肿瘤活性进行了评价。结果显示，这些甾体皂苷类化合物具有显著的细胞毒活性，可用于开发癌症化学预防剂或癌症治疗药物，所述癌症优选为乳腺癌。
本发明首次提供了以玉竹干燥根茎为原料，制备、鉴定八个甾体皂苷的方法，并且系统评价了抗肿瘤的活性，阐述了其在开发癌症化学预防、治疗药物方面的应用，所述癌症优选为乳腺癌。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此限制本发明。
实施例1
(1)玉竹干燥根茎300g用70％乙醇提取3次(用量为4.5L)，减压回收提取液的粗提物；
(2)上述步骤(1)所得70％乙醇粗提物经D101大孔树脂吸附(粗提物:水＝1:2，粗提物:大孔树脂＝1:3)，用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇梯度洗脱，得到不同极性部位的洗脱物；
(3)步骤(2)中90％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂100:10，8:1，6:1，4:1，2:1，1:1洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的石油醚：乙酸乙酯4:1～2:1流分经ODS色谱，用50:50，60:40，70:30，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(70:30～90:10)流分经HPLC RID-10A色谱分离制备，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝70:30，得到甾体皂苷1(tR＝40min)(收率为0.00023％)，得到甾体皂苷3(tR＝64min)(收率为0.00033％)，得到甾体皂苷4(tR＝74min)(收率为0.00031％)，得到甾体皂苷6(tR＝94min)(收率为0.00008％)，得到甾体皂苷7(tR＝104min)(收率为0.00029％)。
(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水(70:30～90:10)流分经HPLC RID-10A色谱分离，流速为4mL/min，以72:28甲醇-水的混合溶剂为流动相，得到甾体皂苷2(tR＝95min)(收率为0.00025％)、甾体皂苷5(tR＝64min)(收率为0.00024％)和甾体皂苷8(tR＝54min) (收率为0.00033％)。
根据甾体皂苷1～8的理化性质和波谱数据鉴定了其结构。
甾体皂苷1的结构鉴定数据如下：
白色粉末(MeOH)。HRESI-MS给出准分子离子峰[M-H]-m/z:1121.4989(calcd.1121.5022 for C52H81O26)，可知其分子式为C52H82O26，1H NMR(600MHz,pyridine-d5)谱中，高场区提供 5个甲基质子氢信号：δH 1.02(3H,s,Me-19)，1.07(3H,s,Me-18)，1.12(3H,d,J＝6.6Hz, Me-27)，1.22(3H,d,J＝6.0Hz,Me-21)，2.06(3H,s,-COC3)，低场区给出4个糖端基氢信号：δH 4.90(1H,d,J＝7.2Hz,H-1')，5.16(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”)，5.62(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”')， 5.26(1H,d,J＝7.8Hz,H-1””)，并根据与文献数据对比为D-半乳糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖和 D-木糖，δH 5.46(1H,m,H-6)提供一个双键氢信号；13C NMR(150MHz,pyridine-d5)谱中，低场区提供4个糖端基碳信号：δC 102.8(C-1')，105.1(C-1”)，104.8(C-1”')，104.9(C-1””)；除去4组糖碳信号外，尚有一个组乙酰基碳信号和27个甾体母核碳信号；进一步根据HSQC对氢碳数据进行归属(表1和2)。
在HMBC谱中，可以观测到δH 4.90(H-1')与δC 74.0(C-3)，δH 5.16(H-1”)与δC79.7(C-4')，δH 5.62(H-1”')与δC 81.1(C-2”)，δH 5.26(H-1””)与δC 86.4(C-3”)远程相关，确定了糖片段的连接方式以及在甾体母核上的连接位置，δH 4.85(H-1)和δC 169.8(OCH3)的远程相关表明乙酰基连接在甾体母核C-1位。另外，根据δC 113.1(C-22)与δH 3.90(H-23)，δC 70.0(C-23)与δH 4.00 (H-24)，δC 37.7(C-25)与δH 4.00(H-24)、3.68(H-26)远程相关，表明F环上23和24位分别有羟基取代，进一步通过NOESY谱确定了23位、24位和25位的构型。NOESY谱中，δH 1.07 (Me-18)与δH 3.08(H-20)相关，δH 4.00(H-24)与δH 2.07(H-25)相关，δH 3.90(H-23)与δH 3.08 (H-20)和δH 1.12(Me-27)相关，δH 1.84(H-17)与δH4.00(H-24)、1.22(Me-21)相关，确定其构型为23S,24R,25R，δH 4.85(H-1)与3.97(H-3)的NOESY相关表明C-1位的乙酰基取代为β构型。经文献检索为一未见报道的新化合物，命名为polygonatumoside H。
甾体皂苷2的结构鉴定数据如下：
白色粉末(MeOH)。HRESI-MS给出准分子离子峰[M-H]-m/z:1121.4989(calcd.1121.5022 for C52H81O26)，可知其分子式为C52H82O26，1H NMR(600MHz,pyridine-d5)谱中，高场区提供5个甲基质子氢信号：δH 1.02(3H,s,Me-19)，1.07(3H,s,Me-18)，1.11(3H,d,J＝6.6Hz, Me-27)，1.22(3H,d,J＝6.0Hz,Me-21)，2.06(3H,s,-COC3)，低场区给出4个糖端基氢信号：δH 4.89(1H,d,J＝7.2Hz,H-1')，5.17(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”)，5.63(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”')， 5.26(1H,d,J＝7.8Hz,H-1””)，并根据与文献数据对比为D-半乳糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖和 D-木糖，δH 5.44(1H,m,H-6)提供一个双键氢信号；13C NMR(150MHz,pyridine-d5)谱中，低场区提供4个糖端基碳信号：δC 102.6(C-1')，105.0(C-1”)，104.7(C-1”')，104.6(C-1””)；除去4组糖碳信号外，尚有一组乙酰基碳信号和27个甾体母核碳信号；进一步根据HSQC对氢碳数据进行归属(表1和2)。
在HMBC谱中，可以观测到δH 4.89(H-1')与δC 74.0(C-3)，δH 5.17(H-1”)与δC79.7(C-4')，δH 5.63(H-1”')与δC 81.1(C-2”)，δH 5.26(H-1””)与δC 86.4(C-3”)远程相关，确定了糖片段的连接方式以及在甾体母核上的连接位置，δH 4.85(H-1)和δC 169.8(OCH3)的远程相关表明乙酰基连接在甾体母核C-1位。另外，根据δC 113.1(C-22)与δH 3.90(H-23)，δC 73.0(C-23)与δH 4.00 (H-24)，δC 37.2(C-25)与δH 4.00(H-24)、3.67(H-26)远程相关，表明F环上23和24位分别有羟基取代，进一步通过NOESY谱确定了23位、24位和25位的构型。NOESY谱中，δH 1.07 (Me-18)与δH 3.02(H-20)相关，δH 3.02(H-20)与δH 2.08(H-25)相关，δH 1.19(Me-21)和δH 4.00 (H-24)、δH 3.90(H-23)相关，δH 3.90(H-23)与δH 1.88(H-17)、1.11(Me-27)相关，确定其构型为23R,24R,25S，δH 4.85(H-1)与3.97(H-3)的NOESY相关表明C-1位的乙酰基取代为β构型。经文献检索为一未见报道的新化合物，命名为polygonatumoside I。
甾体皂苷3的结构鉴定数据如下：
白色粉末(MeOH)。HRESI-MS给出准分子离子峰[M-H]-m/z:1209.5549(calcd.1209.5546 for C56H89O28)，可知其分子式为C56H90O28，1H NMR(600MHz,pyridine-d5)谱中，高场区提供3个甲基质子氢信号：0.88(3H,s,Me-19)，0.88(3H,s,Me-18)，1.33(3H,d,J＝6.6Hz, Me-21)，丢失了一个C-27位甲基氢信号，低场区给出5个糖端基氢信号：δH 4.91(1H,d,J＝7.2 Hz,H-1')，5.21(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”)，5.60(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”')，5.26(1H,d,J＝7.8Hz, H-1””)，4.92(1H,d,J＝7.8Hz,H-1””')，并根据与文献数据对比为D-半乳糖、D-葡萄糖、D- 葡萄糖、D-木糖和D-葡萄糖；还有一个双键氢信号：δH 5.45(1H,m,H-6)。13C NMR(150MHz, pyridine-d5)谱中，低场区提供5个糖端基碳信号：102.8(C-1')，105.2(C-1”)，104.9(C-1”')， 105.0(C-1””)，104.0(C-1””')；除去5组糖碳信号外，尚有27个碳信号。进一步根据HSQC 对所有氢碳数据进行归属(表1和2)。
在HMBC谱中，可以观测到δH 4.91(H-1')与δC 78.2(C-3)，δH 5.21(H-1”)与δC79.9(C-4')，δH 5.60(H-1”')与δC 81.2(C-2”)，δH 5.26(H-1””)与δC 86.7(C-3”)远程相关，以及δH 4.92(H-1””') 与δC 72.1(C-27)，确定了糖片段的连接方式以及在甾体母核上的连接位置。经文献检索为一未见文献报道的新化合物，命名为polygonatumoside J。
甾体皂苷4的结构鉴定数据如下：
白色粉末(MeOH)。HRESI-MS给出准分子离子峰[M-H]-m/z:1209.5549(calcd.1209.5546 for C56H89O28)，可知其分子式为C56H90O28，1H NMR(600MHz,pyridine-d5)谱中，高场区提供4个甲基质子氢信号：0.96(3H,s,Me-19)，0.98(3H,s,Me-18)，1.04(3H,d,J＝6.6Hz, Me-27)，1.70(3H,s,Me-21)，低场区给出5个糖端基氢信号：δH 4.89(1H,d,J＝7.2Hz,H-1')， 5.19(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”)，5.59(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”')，5.25(1H,d,J＝7.8Hz,H-1””)，4.85 (1H,d,J＝7.8Hz,H-1””')，并根据与文献数据对比为D-半乳糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖、D-木糖和D-葡萄糖；还有一个双键氢信号：δH 5.39(1H,m,H-6)。13C NMR(150MHz,pyridine-d5) 谱中，低场区提供5个糖端基碳信号：102.4(C-1')，104.9(C-1”)，104.6(C-1”')，104.6(C-1””)， 105.0(C-1””')；除去5组糖碳信号外，尚有27个碳信号。进一步根据HSQC对所有氢碳数据进行归属(表1和2)。
在HMBC谱中，δH 1.78(H-15a)，0.98(Me-18)与δC 86.4(C-14)的远程相关表明羟基的取代位置在C-14，另外可以观测到δH 4.89(H-1')与δC 78.5(C-3)，δH 5.19(H-1”)与δC79.7(C-4')，δH 5.59(H-1”')与δC 81.1(C-2”)，δH 5.25(H-1””)与δC 86.4(C-3”)远程相关，以及δH 4.85(H-1””') 与δC 74.8(C-26)，确定了糖片段的连接方式以及在甾体母核上的连接位置。经文献检索为一未见报道的新化合物，命名为(25R)-14α-hydroxyl-typaspidoside L。
甾体皂苷5的结构鉴定数据如下：
白色粉末(MeOH)。HRESI-MS给出准分子离子峰[M-H]-m/z:1209.5549(calcd.1209.5546 for C56H89O28)，可知其分子式为C56H90O28，1H NMR(600MHz,pyridine-d5)谱中，高场区提供 4个甲基质子氢信号：0.96(3H,s,Me-19)，0.98(3H,s,Me-18)，1.04(3H,d,J＝6.6Hz,Me-27)， 1.70(3H,s,Me-21)，低场区给出5个糖端基氢信号：δH 4.89(1H,d,J＝7.2Hz,H-1')，5.18(1H, d,J＝7.2Hz,H-1”)，5.63(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”')，5.26(1H,d,J＝7.8Hz,H-1””)，4.92(1H,d, J＝7.8Hz,H-1””')，并根据与文献数据对比为D-半乳糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖、D-木糖和D- 葡萄糖；还有一个双键氢信号：δH 5.37(1H,m,H-6)。13C NMR(150MHz,pyridine-d5)谱中，低场区提供5个糖端基碳信号：102.4(C-1')，104.7(C-1”)，104.6(C-1”')，104.6(C-1””)，105.0 (C-1””')；除去5组糖碳信号外，尚有27个碳信号。进一步根据HSQC对所有氢碳数据进行归属(表1和2)。
在HMBC谱中，δH 1.78(H-15a)，0.98(Me-18)与δC 86.4(C-14)的远程相关表明羟基的取代位置在C-14，另外可以观测到δH 4.89(H-1')与δC 78.5(C-3)，δH 5.18(H-1”)与δC79.7(C-4')，δH 5.63(H-1”')与δC 81.1(C-2”)，δH 5.26(H-1””)与δC 86.4(C-3”)远程相关，以及δH 4.92(H-1””') 与δC 74.8(C-26)，确定了糖片段的连接方式以及在甾体母核上的连接位置。该化合物与化合物4的一维谱和二维谱很相似，不同之处在于H-26：δH 3.64(H-26a)、3.98(H-26b)和δH 3.51 (H-26a)、4.00(H-26b)，分别为25R和25S。经文献检索为一未见文献报道的新化合物，命名为(25S)-14α-hydroxyl-Typaspidoside L。
甾体皂苷6的结构鉴定数据如下：
白色粉末(MeOH)。HRESI-MS给出准分子离子峰[M-H]-m/z:1227.5629(calcd.1227.5652 for C56H91O29)，可知其分子式为C56H92O29，1H NMR(600MHz,pyridine-d5)谱中，高场区提供 4个甲基质子氢信号：1.13(3H,s,Me-18)，0.97(3H,s,Me-19)，1.38(3H,d,J＝6.6Hz,Me-21)， 1.02(3H,d,J＝6.6Hz,Me-27)，低场区给出5个糖端基氢信号：δH4.91(1H,d,J＝7.2Hz,H-1')， 5.21(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”)，5.60(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”')，5.26(1H,d,J＝7.8Hz,H-1””)，4.92 (1H,d,J＝7.8Hz,H-1””')，并根据与文献数据对比为D-半乳糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖、D-木糖和D-葡萄糖；还有一个双键氢信号：δH 5.45(1H,m,H-6)。13C NMR(150MHz,pyridine-d5) 谱中，低场区提供5个糖端基碳信号：102.7(C-1')，105.3(C-1”)，104.9(C-1”')，105.0(C-1””)， 105.1(C-1””')；除去5组糖碳信号外，尚有27个碳信号。进一步根据HSQC对所有氢碳数据进行归属(表1和2)。
在HMBC谱中，1.13(Me-18),1.45(H-15)与86.2(C-14)远程相关，表明羟基的取代位置在C-14，可以观测到δH 4.91(H-1')与δC 78.8(C-3)，δH 5.21(H-1”)与δC 79.9(C-4')，δH 5.60(H-1”') 与δC 81.8(C-2”)，δH 5.26(H-1””)与δC 86.7(C-3”)远程相关，以及δH4.85(H-1””')与δC 75.3 (C-26)，确定了糖片段的连接方式以及在甾体母核上的连接位置。经文献检索为一未见文献报道的新化合物，命名为polygonatumoside K。
甾体皂苷7的结构鉴定数据如下：
白色粉末(MeOH)。HRESI-MS给出准分子离子峰[M-H]-m/z:1189.5271(calcd.1189.5284 for C56H85O27)，可知其分子式为C56H86O27，1H NMR(600MHz,pyridine-d5)谱中，高场区提供 3个甲基质子氢信号：0.93(3H,s,Me-19)，1.07(3H,s,Me-18)，1.32(3H,d,J＝6.6Hz,Me-21)，低场区给出5个糖端基氢信号：δH 4.90(1H,d,J＝7.2Hz,H-1')，5.19(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”)， 5.57(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”')，5.24(1H,d,J＝7.8Hz,H-1””)，4.81(1H,d,J＝7.8Hz,H-1””')，并根据与文献数据对比为D-半乳糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖、D-木糖和D-葡萄糖；还有一个双键氢信号：δH 5.39(1H,m,H-6)。13C NMR(150MHz,pyridine-d5)谱中，低场区提供5个糖端基碳信号：102.8(C-1')，105.3(C-1”)，104.9(C-1”')，105.0(C-1””)，105.0(C-1””')；除去5 组糖碳信号外，尚有27个碳信号，以及δC 140.5(C-5)和121.5(C-6)两个双键碳信号。进一步根据HSQC对所有氢碳数据进行归属(表1和2)。
在HMBC谱中，δH 1.32(Me-21)与δC 210.4(C-22)及δH 2.57(H-24)与δC 210.4(C-22)的远程相关提示羰基取代的位置为C-22；δH 5.32,5.30(H-27)与δC 27.9(C-24)，71.9(C-26)的远程相关提示环外双键的位置在C-25(27)。另外可以观测到δH 4.90(H-1')与δC78.5(C-3)，δH 5.19 (H-1”)与δC 79.9(C-4')，δH 5.57(H-1”')与δC 81.4(C-2”)，δH 5.24(H-1””)与δC 86.7(C-3”)远程相关，以及δH 4.81(H-1””')与δC 71.9(C-26)，确定了糖片段的连接方式以及在甾体母核上的连接位置。经文献检索为一未见文献报道的新化合物，命名为Δ25,27-ene-polygonatumoside A。甾体皂苷8的结构鉴定数据如下：
白色粉末(MeOH)。HRESI-MS给出准分子离子峰[M-H]-m/z:1225.5470(calcd.1225.5495 for C56H89O29)，可知其分子式为C56H90O29。1H NMR(600MHz,pyridine-d5)谱中，高场区提供 4个甲基质子氢信号：δH 0.95(3H,s,Me-19)，1.04(3H,s,Me-18)，1.40(3H,s,Me-27)，1.10(3H, d,J＝6.6Hz,Me-21)，低场区给出5个糖端基氢信号：δH 4.89(1H,d,J＝7.2Hz,H-1')，5.18(1H, d,J＝7.2Hz,H-1”)，5.57(1H,d,J＝7.2Hz,H-1”')，5.24(1H,d,J＝7.8Hz,H-1””)，4.85(1H,d, J＝7.2Hz,H-1””')，并根据与文献数据对比为D-半乳糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖、D-木糖和D- 葡萄糖；还有一个双键氢信号：δH 5.37(1H,m,H-6)。13CNMR(150MHz,pyridine-d5)谱中，低场区提供5个糖端基碳信号：102.7(C-1')，105.2(C-1”)，104.9(C-1”')，105.0(C-1””)，105.3 (C-1””')；除去5组糖碳信号外，尚有27个碳信号，进一步根据HSQC对所有氢碳数据进行归属(表1和2)。
在HMBC谱中，δH 3.88(H-26a)和δC 24.4(C-27)，δC 33.1(C-23)，δC 33.9(C-24)，83.8(C-25)，δH 1.40(H-27)和δC 77.2(C-26)，33.9(C-24)，83.8(C-25)，δH 2.29(H-20)与δC 120.6(C-22)的远程相关，表明F环为一个五元环，δH 1.78(H-15a)，1.04(Me-18)与δC86.2(C-14)的远程相关表明羟基的取代位置在C-14，另外可以观测到δH 4.89(H-1')与δC78.4(C-3)，δH 5.18(H-1”) 与δC 79.9(C-4')，δH 5.57(H-1”')与δC 81.4(C-2”)，δH 5.24(H-1””)与δC 86.7(C-3”)远程相关，以及δH 4.85(H-1””')与δC 77.2(C-26)，确定了糖片段的连接方式以及在甾体母核上的连接位置。在NOESY谱中，可以观测到δH 1.10(Me-21)与δH1.40(Me-27)和2.73(H-17)相关，δH 2.29 (H-20)与δH 1.04(Me-18)和3.88,4.16(H-26)相关，δH 1.40(Me-27)与δH 2.73(H-17)相关，表明 C-25的构型为R，经文献检索为一未见报道的新化合物，命名为polygonatumoside L。
甾体皂苷1～8的NMR数据归属见表1和2
表1化合物1-8的碳谱数据(150MHz,pyridine-d5)
Figure BDA0002017595610000091
Figure BDA0002017595610000101
表2化合物1-8的氢谱数据(600MHz,pyridine-d5)
Figure BDA0002017595610000102
Figure BDA0002017595610000111
实施例2
(1)玉竹干燥根茎600g用75％乙醇提取3次(用量为12L)，减压回收提取液的粗提物；
(2)上述步骤(1)所得乙醇粗提物经D101大孔树脂吸附(粗提物:水＝1:2，粗提物:大孔树脂＝1:5)，用20％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇梯度洗脱，得到不同极性部位的洗脱物；
(3)步骤(2)中90％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以二氯甲烷和甲醇混合溶剂100:2，100:4，100:6，100:10，8:1，6:1，5:1洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的二氯甲烷：甲醇10:1～8:1流分经ODS色谱，用50:50，60:40， 70:30，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(70:30～90:10)流分经HPLC RID-10A色谱分离制备，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝68:32，得到甾体皂苷1(tR＝45min)(收率为0.00023％)，得到甾体皂苷3(tR＝64min)(收率为0.00033％)，得到甾体皂苷4(tR＝78min)(收率为0.00031％)，得到甾体皂苷6(tR＝94min)(收率为0.00008％)，得到甾体皂苷7(tR＝107min)(收率为0.00024％)。
(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水(70:30～90:10)流分经HPLC RID-10A色谱分离，流速为4mL/min，以72:28甲醇-水的混合溶剂为流动相，得到甾体皂苷2(tR＝95min)(收率为0.00023％)、甾体皂苷5(tR＝64min)(收率为0.00022％)和甾体皂苷8(tR＝54min) (收率为0.00032％)。
根据甾体皂苷1～8的结构鉴定方法见实施例1。
实施例3
(1)玉竹干燥根茎1200g用70％乙醇提取3次(用量为12L)，减压回收提取液的粗提物；
(2)上述步骤(1)所得70％乙醇粗提物经HPD-100大孔树脂吸附(粗提物:水＝1:1，粗提物:大孔树脂＝1:4)，用水、30％乙醇、50％乙醇和90％乙醇梯度洗脱，得到不同极性部位的洗脱物；
(3)步骤(2)中90％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以氯仿和甲醇混合溶剂100:2，100:4，100:8，100:10，8:1，6:1，5:1洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的氯仿：甲醇10:1～8:1流分经ODS色谱，用50:50，60:40，70:30，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(70:30～90:10)流分经HPLC RID-10A色谱分离制备，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝70:30，得到甾体皂苷1(tR＝40min)(收率为0.00023％)，得到甾体皂苷3(tR＝64min)(收率为0.00033％)，得到甾体皂苷4(tR＝74min)(收率为0.00030％)，得到甾体皂苷6(tR＝94min)(收率为0.00008％)，得到甾体皂苷7(tR＝104min)(收率为0.00029％)。
(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水(50:50～90:10)流分经HPLC RID-10A色谱分离，流速为4mL/min，以72:28甲醇-水的混合溶剂为流动相，得到甾体皂苷2(tR＝95min)(收率为0.00022％)、甾体皂苷5(tR＝64min)(收率为0.00024％)和甾体皂苷8(tR＝54min) (收率为0.00031％)。
根据甾体皂苷1～8的结构鉴定方法见实施例1。
实施例4
(1)玉竹干燥根茎1500g用70％乙醇提取3次(用量为18L)，减压回收提取液的粗提物；
(2)上述步骤(1)所得乙醇粗提物经HPD-100大孔树脂吸附(粗提物:水＝1:2，粗提物:大孔树脂＝1:4)，用30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇梯度洗脱，得到不同极性部位的洗脱物；
(3)步骤(2)中乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以氯仿和丙酮混合溶剂100:5， 100:8，100:10，8:1，6:1，2:1洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的氯仿：丙酮8:1～6:1流分经ODS色谱，用50:50，60:40，70:30，80:20，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(80:20～90:10)流分经HPLC RID-10A色谱分离制备，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝70:30，得到甾体皂苷1(tR＝40min)(收率为0.00023％)，得到甾体皂苷3(tR＝64min)(收率为0.00033％)，得到甾体皂苷4(tR＝74min)(收率为0.00031％)，得到甾体皂苷6(tR＝94min)(收率为0.00007％)，得到甾体皂苷7(tR＝104min)(收率为0.00029％)。
(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水(70:30～80:20)流分经HPLC RID-10A色谱分离，流速为4mL/min，以72:28甲醇-水的混合溶剂为流动相，得到甾体皂苷2(tR＝85min)(收率为0.00025％)、甾体皂苷5(tR＝74min)(收率为0.00024％)和甾体皂苷8(tR＝64min) (收率为0.00031％)。
根据甾体皂苷1～8的结构鉴定方法见实施例1。
实施例5
(1)玉竹干燥根茎600g用70％乙醇提取3次(用量为9L)，减压回收提取液的粗提物；
(2)上述步骤(1)所得乙醇粗提物经D101大孔树脂吸附(粗提物:水＝1:3，粗提物:大孔树脂＝1:5)，用20％乙醇、50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇梯度洗脱，得到不同极性部位的洗脱物；
(3)步骤(2)中乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以二氯甲烷和丙酮混合溶剂100:5， 100:8，100:10，8:1，6:1，4:1，2:1洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的二氯甲烷：丙酮8:1～6:1流分经ODS色谱，用50:50，60:40， 70:30，90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(70:30～90:10)流分经HPLC RID-10A色谱分离制备，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝72:28，得到甾体皂苷1(tR＝35min)(收率为0.00022％)，得到甾体皂苷3(tR＝60min)(收率为0.00033％)，得到甾体皂苷4(tR＝74min)(收率为0.00031％)，得到甾体皂苷6(tR＝90min)(收率为0.00008％)，得到甾体皂苷7(tR＝99min)(收率为0.00029％)。
(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水(70:30～90:10)流分经HPLC RID-10A色谱分离，流速为4mL/min，以35:75乙腈-水的混合溶剂为流动相，得到甾体皂苷2(tR＝85min)(收率为0.00023％)、甾体皂苷5(tR＝64min)(收率为0.00025％)和甾体皂苷8(tR＝44min) (收率为0.00030％)。
根据甾体皂苷1～8的结构鉴定方法见实施例1。
实施例6
(1)玉竹干燥根茎2000g用70％乙醇提取3次(用量为25L)，减压回收提取液的粗提物；
(2)上述步骤(1)所得70％乙醇粗提物经D101大孔树脂吸附(粗提物:水＝1:1，粗提物:大孔树脂＝1:3)，用50％乙醇、70％乙醇和90％乙醇梯度洗脱，得到不同极性部位的洗脱物；
(3)步骤(2)中90％乙醇洗脱物，经硅胶柱色谱分离，依次以二氯甲烷和甲醇混合溶剂100:3，100:8，100:10，8:1，6:1，5:1洗脱；
(4)上述步骤(3)中所得的二氯甲烷：甲醇8:1～6:1流分经ODS色谱，用60:40，70:30， 90:10甲醇-水的混合溶剂梯度洗脱；
(5)上述步骤(4)中所得甲醇-水(70:30～90:10)流分经HPLC RID-10A色谱分离制备，流速为4mL/min，流动相为甲醇：水＝66:34，得到甾体皂苷1(tR＝50min)(收率为0.00023％)，得到甾体皂苷3(tR＝74min)(收率为0.00033％)，得到甾体皂苷4(tR＝94min)(收率为0.00031％)，得到甾体皂苷6(tR＝104min)(收率为0.00008％)，得到甾体皂苷7 (tR＝110min)(收率为0.00029％)。
(6)上述步骤(4)中所得甲醇-水(50:50～90:10)流分经HPLC RID-10A色谱分离，流速为4mL/min，以70:30甲醇-水的混合溶剂为流动相，得到甾体皂苷2(tR＝95min)(收率为0.00025％)、甾体皂苷5(tR＝64min)(收率为0.00026％)和甾体皂苷8(tR＝64min) (收率为0.00034％)。
根据甾体皂苷1～8的结构鉴定方法见实施例1。
实施例7实施例1-6中制备所得甾体皂苷1-8的抗肿瘤活性研究
(1)实验原理
MTT法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50％的N，N-二甲基甲酰胺和20％的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。
(2)实验方法
乳腺癌细胞系MCF-7使用1640完全培养基(含10％胎牛血清)培养，维持温度37℃，CO2含量为5％。使用0.25％胰蛋白酶-EDTA消化，MCF-7细胞系1:4传代，1日传代。取对数生长期细胞消化成单细胞悬液，细胞浓度为105/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，每组3个平行孔。MCF-7细胞接种24小时后，细胞贴壁生长，弃上清，按照实验所需浓度加入浓度分别为100μM、50μM、10μM、1μM的受试单体继续培养24小时。24小时后，用MTT法测定细胞生长状况：每孔加入50μL MTT储备液，终浓度为2mg/mL。继续培养 4小时后,弃去上清，每孔加DMSO 100μL，10min后用自动酶标仪于490nm测定各孔吸光度A。
(3)实验结果
实验结果见表3
表3玉竹粗提物和化合物1～8的细胞毒活性
Figure BDA0002017595610000151
结果可知，玉竹粗提物即70％乙醇提取物和实施例1-6中制备得到的甾体皂苷1-8对乳腺癌细胞MCF-7有显著的细胞毒活性。

Claims (11)

1.甾体皂苷类化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于，具有如下结构通式：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
R1为氢或β-D-Glc；
R2为β-D-Gal-(4→1)-[β-D-Xyl-(1→3)-β-D-Glc-(2→1)-β- D-Glc。
2.如下的甾体皂苷类化合物及其药学上可接受的盐，其特征在于，其为以下结构中的一种或几种：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
。
3.按照权利要求2所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）植物玉竹Polygonatum odoratum用乙醇溶剂提取，回收提取液得粗提物；
（2）步骤（1）所得粗提物用水溶解，经大孔吸附树脂色谱，以乙醇-水或甲醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，得到不同极性的洗脱物；
（3）步骤（2）所得洗脱物经硅胶柱色谱法分离，以石油醚和乙酸乙酯混合溶剂、石油醚和丙酮混合溶剂、氯仿和丙酮混合溶剂、二氯甲烷和丙酮混合溶剂、氯仿和甲醇混合溶剂、二氯甲烷和甲醇混合溶剂梯度洗脱；
（4）步骤（3）中所得流分经ODS柱色谱分离，以甲醇-水或乙腈-水混合溶剂梯度洗脱；
（5）步骤（4）中所得甲醇-水、乙腈-水洗脱物经制备型HPLC色谱分离，
（6）步骤（5）中所得的洗脱物以甲醇-水混合溶剂，或以乙腈-水混合溶剂为流动相梯度洗脱，得到甾体皂苷类化合物7、8。
4.按照权利要求3所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中的提取方法为加热回流提取或加热超声提取1~3次，乙醇的体积浓度为50%~95%，玉竹：乙醇的重量体积比为1: 8~1: 20 g/mL。
5.按照权利要求3所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中的大孔吸附树脂色谱法，采用全拌样的方法，粗提物溶解于重量体积比1:1~1:6的水中，按照粗提物和拌样大孔树脂的重量比1:3~1:10的比例在溶液中加入空白大孔吸附树脂，减压回收水至干后上样，所用的洗脱溶剂乙醇-水或甲醇-水的混合溶剂的体积比例为0:100~90:0。
6.按照权利要求3所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的石油醚和乙酸乙酯，或石油醚和丙酮混合溶剂的体积比例为100:10~1:1；二氯甲烷和丙酮，或氯仿和丙酮的混合溶剂的体积比例为100:4~2:1；二氯甲烷和甲醇，或氯仿和甲醇的混合溶剂的体积比例为100:2~5:2。
7.按照权利要求3所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（4）中所述的甲醇-水混合溶剂的体积比例为5:5~10:0，乙腈-水的混合溶剂的体积比例为3:7~7:3。
8.按照权利要求3所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于：步骤（5）中所述的甲醇-水的混合溶剂的体积比例为6:4~9:1，乙腈-水的混合溶剂的体积比例为3:7~5:5。
9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1或2所述的甾体皂苷类化合物及其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
10.权利要求1或2所述的甾体皂苷类化合物及其药学上可接受的盐或权利要求9所述的药物组合物在制备预防和治疗癌症的药物中的应用。
11.按照权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的癌症为乳腺癌。
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